DAPI 和BrdU 等染料标记细胞都存在随细胞分裂荧光减弱的现象,荧光染料标记的方法,有一个难以克服的问题:细胞在受体内存活难以证明,因为这些经过荧光染料标记的细胞被巨噬细胞吞噬后,细胞碎片在巨噬细胞内也可以有荧光表达,有时也会导致细胞周围的其他细胞出现假阳性。所以,仅使用这样的标记方法是很难在国际杂志发表论文的。 比较可信的标记方法是Y 染色体和转基因标记,最理想的办法是GFP 基因转染。这些标记的方法不仅可以显示细胞的存活情况,还能够准确的显示细胞的定位。同时由于是表达型的标记方法,所以不存在减弱的现象和丢失的现象,也不存在假阳性的问题,所以是一种准确的细胞标记方法。
GFP 标记方法稳定,容易检测,结果权威,被国际上的科学家广泛认可.
标记方法有:
1、遗传性地改变细胞的基因,表达标志物
(1)绿色荧光蛋白(GFP )或者红色荧光蛋白(RFP )报告基因的转染。
这是目前鉴定移植细胞最常用的方法。将携带有GFP 或者RFP 基因的质粒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体转染待移植的细胞,通过荧光检测受体组织中的GFP 或者RFP ,可以对移植的细胞进行定性和定位观察。是目前最权威的一种标记方法之一。
(2) β半乳糖苷酶(β-Gal 、LacZ )基因转染细胞标记技术。
这也是目前鉴定移植细胞常用的方法。
2. 选用雄性供体和雌性宿主,利用Y 染色体作为标志物
染色体组成是雄杂合型(XY型) :雌性个体性染色体组成为XX, 雄性个体性染色体组成为XY 。移植后,通过检测雌性宿主不同组织中的Y 染色体出现的情况,来判定外源性的细胞在宿主体内的分布。
3. 利用染料标记细胞
DAPI :4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 的中文名称是4,6-联脒-2-苯基吲哚,是一种常用的荧光染料,其作用机理与溴化乙锭等染色剂的机理类似:它们与DNA 双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用,从而与DNA 的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm 而散射峰是461nm ,正好U (紫外光)的激发波长正好是356nm ,使得DAPI 成为了一种常用的荧光检测信号。
BrdU :BrdU 和DAPI 同属于DNA 结合型荧光染料,BrdU 会随着细胞分裂而不断被“稀释”,以至于最终完全不能检出。因而不适合做长时期的体内标记追踪。BrdU 标记法的基本原理是利用溴化脱氧尿嘧啶(BrdU )作为胸苷类似物可以掺入到新增殖细胞合成DNA 中的特点。
DiI :1,1’二(十八烷基)-3,3' ,3' ,3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐(1,1'-dioctadecy1-3,3,3' ,3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)是一种亲脂性碳花青染料,容易嵌进生物质膜内并在膜内做定向扩散运动从而标记整个细胞。荧光染料DiI 被认为以类似于磷脂的方式与脂蛋白结合,最初用于荧光显微镜下观察细胞结合或内吞脂蛋白,并能进行半定量分析。
用有机溶剂提取细胞膜受体结合的DiI 标记的脂蛋白或用Na0H —SDS 裂解细胞后直接进行荧光分析,可以定量检测脂蛋白受体活性,这一方法被广泛用于脂蛋白受体结构与功能关系的研究。
DAPI 和BrdU 等染料标记细胞都存在随细胞分裂荧光减弱的现象,荧光染料标记的方法,有一个难以克服的问题:细胞在受体内存活难以证明,因为这些经过荧光染料标记的细胞被巨噬细胞吞噬后,细胞碎片在巨噬细胞内也可以有荧光表达,有时也会导致细胞周围的其他细胞出现假阳性。所以,仅使用这样的标记方法是很难在国际杂志发表论文的。 比较可信的标记方法是Y 染色体和转基因标记,最理想的办法是GFP 基因转染。这些标记的方法不仅可以显示细胞的存活情况,还能够准确的显示细胞的定位。同时由于是表达型的标记方法,所以不存在减弱的现象和丢失的现象,也不存在假阳性的问题,所以是一种准确的细胞标记方法。
GFP 标记方法稳定,容易检测,结果权威,被国际上的科学家广泛认可.
标记方法有:
1、遗传性地改变细胞的基因,表达标志物
(1)绿色荧光蛋白(GFP )或者红色荧光蛋白(RFP )报告基因的转染。
这是目前鉴定移植细胞最常用的方法。将携带有GFP 或者RFP 基因的质粒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体转染待移植的细胞,通过荧光检测受体组织中的GFP 或者RFP ,可以对移植的细胞进行定性和定位观察。是目前最权威的一种标记方法之一。
(2) β半乳糖苷酶(β-Gal 、LacZ )基因转染细胞标记技术。
这也是目前鉴定移植细胞常用的方法。
2. 选用雄性供体和雌性宿主,利用Y 染色体作为标志物
染色体组成是雄杂合型(XY型) :雌性个体性染色体组成为XX, 雄性个体性染色体组成为XY 。移植后,通过检测雌性宿主不同组织中的Y 染色体出现的情况,来判定外源性的细胞在宿主体内的分布。
3. 利用染料标记细胞
DAPI :4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 的中文名称是4,6-联脒-2-苯基吲哚,是一种常用的荧光染料,其作用机理与溴化乙锭等染色剂的机理类似:它们与DNA 双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用,从而与DNA 的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm 而散射峰是461nm ,正好U (紫外光)的激发波长正好是356nm ,使得DAPI 成为了一种常用的荧光检测信号。
BrdU :BrdU 和DAPI 同属于DNA 结合型荧光染料,BrdU 会随着细胞分裂而不断被“稀释”,以至于最终完全不能检出。因而不适合做长时期的体内标记追踪。BrdU 标记法的基本原理是利用溴化脱氧尿嘧啶(BrdU )作为胸苷类似物可以掺入到新增殖细胞合成DNA 中的特点。
DiI :1,1’二(十八烷基)-3,3' ,3' ,3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐(1,1'-dioctadecy1-3,3,3' ,3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)是一种亲脂性碳花青染料,容易嵌进生物质膜内并在膜内做定向扩散运动从而标记整个细胞。荧光染料DiI 被认为以类似于磷脂的方式与脂蛋白结合,最初用于荧光显微镜下观察细胞结合或内吞脂蛋白,并能进行半定量分析。
用有机溶剂提取细胞膜受体结合的DiI 标记的脂蛋白或用Na0H —SDS 裂解细胞后直接进行荧光分析,可以定量检测脂蛋白受体活性,这一方法被广泛用于脂蛋白受体结构与功能关系的研究。