第１５卷第１期
华中师范大学研究生学报
Ｖｏｌ．１５Ｎｏ．１ＨｕａｚｈｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｓ
２００８年５月Ｍａｙ２００８
黑胸散白蚁肠道纤维素酶基因的初步探究!
杜蕾蕾，杨红b
（华中师范大学生命科学学院昆虫学研究所农药与化学生物学教育部重点实验室，武汉４３００７９）
摘要：白蚁是自然界为数不多的能消化纤维素的昆虫之一。白蚁对木质纤维素的消化作用与其体内的纤
维素酶与肠道内的共生微生物密切相关。本文报道了对广泛分布于我国的一种木食性白蚁，黑胸散白蚁（ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒ）肠道纤维素酶基因的初步研究结果。通过ＲＴ－ＰＣＲ得到五个纤维素酶基因的部分序列，由３｀ＲＡＣＥ和５｀ＲＡＣＥ技术分别得到纤维素酶基因ｃＤＮＡ３｀末端五个６２０ｂｐ左右的核苷酸序列和５｀末端八个８００ｂｐ的核苷酸序列。对序列的分析表明，黑胸散白蚁肠道纤维素酶基因与ＧＨＦ７家族具有较高的同源性。本实验为进一步研究黑胸散白蚁纤维素酶基因的多样性和功能奠定了基础。
关键词：黑胸散白蚁；肠道；纤维素酶基因中图分类号：Ｑ９３６
文献标识码：Ａ
白蚁是自然界为数不多的能消化纤维素的昆虫之一，其食物来源主要是木质纤维素类物质，如树皮、树干、朽木、干草及富含腐殖质的土壤等。纤维素是地球上最丰富的可再生生物质资源，是多个葡萄糖残基以β－１，４－糖苷键连接而成的多聚物。木质纤维素的降解需纤维素酶的参与，而纤维素酶是能将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称。据报道，自然界每年通过光合作用产生的纤维素８９％尚未被人类利用。因此对包括白蚁在内的能消化纤维素的生物体内相关纤维素酶的研究成了近年来的热点。
低等白蚁能依靠内源和外源纤维素酶将木质纤维素降解为可完全吸收利用的营养物质［１］［２］［３］。虽然很早就发现了低等白蚁共生鞭毛虫降解纤维素的现象，但有关纤维素酶基因方面的研究却开始的比较晚［４］。
１．１．１白蚁的采集和饲养
黑胸散白蚁（ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＳｎｙｄｅｒ）采集自武汉市狮子山树林内，在实验室条件下用内盛松木的塑料盒饲养，选用工蚁为实验材料。
１．１．２主要试剂和仪器
１．１．２．１试剂
磷酸缓冲液ＰＢＳ（１３６．８９ｍＭＮａＣｌR ２．６８ｍＭＫＣｌR
４．０５ｍＭＮａ２ＨＰＯ４R １．４７ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ＰＨ７．４）；Ｔｒｉｚｏｌ、
反转录酶Ｍ－ＭＬＶ均为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；ＤＮＡ序列的合成和测序由北京利嘉泰成科技有限公司完成；
２０００年日本学者Ｏｈｔｏｋｏ从栖北散白蚁
（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｓｐｅｒａｔｕｓ）
中克隆出了纤维素酶ＧＨＦ４５家族的的多种基因，荧光原位杂交显示纤维素酶基因来源于鞭毛虫［５］。
Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ均购自天源公司；克隆载体为ｐＧＥＭ－Ｔ
ｅａｓｙＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；５｀ＲＡＣＥ试剂盒为ＴＡＫＡＲＡ公司产品。
１．１．２．３仪器
ＲＣＲ仪为Ｂｉｏｒａｄ公司产品
１．２方法
１．２．１ＲＮＡ的提取和ＲＴ－ＰＣＲ
收集黑胸散白蚁工蚁３０条，依次以７０％酒精、
无菌蒸馏水清洗其表面。用尖头镊子将工蚁肠道拉出，小心刺破后肠将肠液挤入含有１ｍｌＰＢＳ的ＥＰ管中，离心去上清，沉淀物包括后肠所有的微生物。
Ｎａｋａｓｈｉｍａ等人也从台湾乳白蚁后肠中克隆出一种纤
维素酶基因。迄今为止，人们已经从白蚁肠道中得到分属于糖基水解酶家族ＧＨＦ５、ＧＨＦ７和ＧＨＦ４５的多种纤维素酶基因［６］［７］［８］。本文报道了对低等白蚁黑胸散白蚁纤维素酶基因的初步研究结果。
１．１．１
材料和方法材料
Ｔｒｉｚｏｌ法提取混合物的总ＲＮＡ。用ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）１７和
反转录酶合成ｃＤＮＡ第一条链［９］，然后以糖基水解酶家族ＧＨＦ７基因的特异性引物（ｃｆＦ５｀－ＡＡＹＣＡＲＧＣＩＧＡＲＡＡＹＣＡＹＣＣ
－３｀，
Ｆ７Ｒ
５｀－
! 基金项目：国家自然科学基金项目（３０５７００３４）通讯作者：杨红，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｙａｎｇ０２０２＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
作者简介：杜蕾蕾（１９８１－），女，山东威海人，华中师范大学生命科学学院２００５级硕士研究生，研究方向为微生物分子生物学。
１３０
ＧＣＹＴＣＣＣＡＤＡＴＲＹＣＣＡＴＹＴＣ－３）扩增纤维素酶基因的中间序列［８］。ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性３ｍｉｎ，３０
个循环（９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火３０ｓ，７２℃延伸１
采用巢式ＰＣＲ扩增纤维素酶基因的３｀末端序列，得到长度为７４０ｂｐ左右的目的条带，如图２所示。将
ｍｉｎ），最后７２℃再延伸７ｍｉｎ，目的基因连接到ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体然后测序。
１．２．２
纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的扩增
以引物ｃｆＦ、ＲＦ７Ｒ（５＇ＧＡＲＡＴＧＧＲＹＡＴＨＴＧＧＧＡＲＧＣ
ＰＣＲ产物连接到Ｔ－ｅａｓｙ载体上，测序得到五个纤维
素酶基因的３｀末端序列。经比对分析表明所得到的
序列为ＧＨＦ７基因，且序列３＇端含ｐｏｌｙＡ，说明
３＇ＲＡＣＥ已完成。
－ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ（Ｔ）１７－３＇）和接头引物（５′
）用３｀ＲＡＣＥ技术合成纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的３｀末３′
端。第一步ＰＣＲ扩增以接头引物和ｃｆＦ为引物；第二步反应以第一步ＰＣＲ产物为模板，接头引物和
ＲＦ７Ｒ为引物进一步扩增纤维素酶基因的３｀末端序
列。两步ＰＣＲ的反应体系均为：１０ｘＰＣＲ缓冲液
５μｌ，ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）０．５μｌ，引物（５０ｍＭ）各
０．５μｌ，模板ＤＮＡ５μｌ，Ｔａｑ酶１Ｕ，其余用超纯水补足
至５０μ最后将目的基因连接到ｌ。ＰＣＲ反应条件同上。
ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体测序［１３］。
依据ｃＤＮＡ３｀末端序列设计下游特异性引物（ＧＳＰ１５｀－ＡＧＴＡＡＧＴＴＧＡＧＴＣＡＡＴＴＧＧＡＣＣ－３｀，ＧＳＰ２５｀－ＧＣＴＴＴＧＡＡＧＴＣＧＴＴＣＴＴＧＴＣ－３｀），以５｀ＲＡＣＥ试剂盒扩增纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的５｀
末端序列。
图２黑胸散白蚁纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的３｀ＲＡＣＥ
Ｍ：ｍａｒｋｅｒ１：黑胸散白蚁肠液微生物的总ＲＮＡ
２．３纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ５｀末端的扩增
根据３｀ＲＡＣＥ得到的五个序列的保守区设计的特异性引物，采用５｀ＲＡＣＥ试剂盒扩增纤维素酶
２．结果和分析
２．１ＲＴ－ＰＣＲ扩增纤维素酶基因部分序列
采用兼并引物ＲＴ－ＰＣＲ得到目的基因条带长度为６３０ｂｐ左右（图１）。将目的基因连接到ｐＧＥＭ－Ｔ
，筛选出阳性克隆ｅａｓｙ载体上，转化感受态细胞ＤＨ５α
测序得到五个纤维素酶基因的中间序列。根据在
ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的５｀末端序列，得到长度为１１４５ｂｐ左右
的ＰＣＲ产物，如图３所示。经与ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体连接并转化大肠杆菌ＤＨ５α，测序得到８个核苷酸序列，经比对分析表明所得到的序列为ＧＨＦ７基因。这八个序列彼此之间的相似性高于９７％，并且与３｀末端ｃＤＮＡ序列能拼接起来。
ＮＣＢＩ数据库中ＢＬＡＳＴ搜索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）发现这五个基因与与其它散白蚁纤维素酶基因ＧＨＦ７同源性最高。
图１黑胸散白蚁纤维素酶基因的ＲＴ－ＰＣＲ
图３纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的５｀ＲＡＣＥ
Ｍ：ｍａｒｋｅｒ１：黑胸散白蚁肠液微生物的总ＲＮＡＭ：ｍａｒｋｅｒ１：纤维素酶基因５｀末端扩增条带
２．２纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ３｀末端的扩增３．讨论
以总ＲＮＡ反转录合成的第一条链ｃＤＮＡ为模板
纤维素是地球上最丰富的可再生的生物质资源，
１３１
大部分纤维素并没有得到很好的利用，充分利用纤维素不仅能有效地解决目前世界上面临的食物、饲料、以及能源短缺的问题，而且在医药领域纤维素酶的应用也越来越受到重视［１０］。本研究以黑胸散白蚁为材料克隆其肠道纤维素酶基因，初步得到了纤维素酶
Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ，Ｓｐｉｒｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ，Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ，ａｎｄｐａｒａｂａｓａｌｉａｎｓｙｍｂｉｏｎｔｓｉｎｔｈｅｈｉｎｄｇｕｔｏｆｔｅｒｍｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，４７：２４９－２５９．
［５］ＫｕｎｉｙｏＯｈｔｏｋｏ，ＭｏｒｉｙａＯｈｋｕｍａ，ｅｔａｌ，．Ｄｉｖｅｒｓｅｇｅｎｅｓｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｆａｍｉｌｙ４５ｆｒｏｍｔｈｅｓｙｍｂｉｏｔｉｃｐｒｏｔｉｓｔｓｉｎｔｈｅｈｉｎｄｇｕｔｏｆｔｈｅｔｅｒｍｉｔｅＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｓｐｅｒａｔｕｓ［Ｊ］．ｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，２０００，４：３４３－３４９．
［６］ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，ＫｅｉｓｕｋｅＮａｋａｓｈｉｍａ，ＨｉｔｏｓｈｉＳａｉｔｏｈ，ｅｔａｌ．Ｎｅｗｅｎｄｏ－β－ｇｌｕｃａｎａｓｅｓｆｒｏｍｔｈｅｐａｒａｂａｓａｌｉａｎｓｙｍｂｉｏｎｔｓ，ＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａｇｒａｓｓｉｉａｎｄＨｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓｍｉｒａｂｉｌｅｏｆＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｔｅｒｍｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ，２００２，５９：１９８３－１９９２．［７］ＴｅｔｓｕｓｈｉＩｎｏｕｅ，ＳｈｉｇｅｈａｒｕＭｏｒｉｙａ，ＭｏｒｉｙａＯｈｋｕｍａ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍａｓｙｍｂｉｏｔｉｃｐｒｏｔｉｓｔｏｆｔｈｅｌｏｗｅｒｔｅｒｍｉｔｅ，Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２００５，３４９：６７－７５．
［８］Ｋｅｉｓｕｋｅ．Ｎａｋａｓｈｉｍａ，ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，Ｊｕｎ－ｉｃｈｉＡｚｕｍａ．ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍｔｈｅｐａｒａｂａｓａｌｉａｎｓｙｍｂｉｏｎｔ
Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａｇｒａｓｓｉｉｉｎｔｈｅｈｉｎｄｇｕｔｏｆｔｈｅｗｏｏｄ－ｆｅｅｄｉｎｇｔｅｒｍｉｔｅＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．，２００２，５９：１５５４－１５６０．
［９］ＧａｋｕＴｏｋｕｄａ，ＮａｔｈａｎＬｏ，ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，ｅｔａｌ．Ｍｒｔａｚｏａｎｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍｔｅｒｍｉｔｅｓ：ｉｎｔｒｏｎ／ｅｘｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｓｉｔｅｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４４７：１４６－１５９．
［１０］陈小坚．纤维素酶的分子生物学研究及应用进展．湖北民族
学院学报．科学版２００６，２３（４）：４８１．
ＧＨＦ７家族基因ｃＤＮＡ接近全长的核苷酸序列。ＢＬＡＳＴ分析表明从黑胸散白蚁肠道得到的纤维素酶ＧＨＦ７基因与从其它白蚁如家白蚁（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ）肠道共生鞭毛虫中得到的ＧＨＦ７基因同
源性最高，说明糖基水解酶家族ＧＨＦ７类的纤维素酶在白蚁纤维素消化中起着重要的作用。白蚁肠道纤维素降解的复杂过程往往与多种纤维素酶相关［１１］，因此，对黑胸散白蚁肠道纤维素酶多样性和功能的进一步研究是必要的。
参
考
文
献
［１］Ｔｉａｎ－ｃｉＹａｎｇ，Ｊｉａｎ－ｃｈｕＭｏ，Ｊｉａ－ａｎＣｈｅｎｇｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ
ｓｏｍｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｆｒｏｍＯｄｏｎｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（Ｉｓｏｐｔｅｒａ：ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）［Ｊ］．ＥｎｔｏｍｏｌｏｇｉａＳｉｎｉｃａ，２００４，１１（１）：１－１０．［２］ＧａｋｕＴｏｋｕｄａ，ＮａｔｈａｎＬｏ，ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，，ｅｔａｌ．Ｍａｊｏｒａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｔｅｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｃｅｌｌｕｌａｓｅｓｉｎｍｅｍｂｅｒｓｏｆａｎａｐｉｃａｌｔｅｒｍｉｔｅｌｉｎｅａｇｅ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｃｏｌｏｇｙ，２００４，１３：３２１９－３２２８．
［３］ＫｅｉｓｕｋｅＮａｋａｓｈｉｍａ，ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，ＨｉｔｏｓｈｉＳａｉｔｏｈ，ｅｔａｌ．Ｄｕａｌｃｅｌｌｕｌａｓｅ－ｄｉｇｅｓｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｏｆｔｈｅｗｏｏｄ－ｆｅｅｄｉｎｇｔｅｒｍｉｔｅ，Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（Ｓｈｉｒａｋｉ）［Ｊ］．ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００２，３２：７７７－７８４．
［４］ＭｏｒｉｙａＯｈｋｕｍａ，ＫｕｎｉｙｏＯｈｔｏｋｏ，ＴｏｓｈｉｙａＩｉｄａｅｔａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｙｐｅｒｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ，
［１１］ＭａｒｓｈａＭ．Ｗｈｅｅｌｅｒ，ＸｕｇｕｏＺｈｏｕ，ＭｉｃｈａｅｌＥ．Ｓｃｈａｒｆ＿，Ｆａｉｔｈ
Ｍ．Ｏｉ１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｄｙｎａｍｉｃｓｈｉｆｔｓｏｆｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｐｒｏｔｏｚｏａｉｎＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｆｌａｖｉｐｅｓ［Ｊ］．ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，３７（２００７）：１３６６－１３７４．
ＰｒｉｍａｒｙＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅＣｅｌｌｕｌａｓｅＧｅｎｅｓｉｎｔｈｅＧｕｔｏｆ
ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒ
ＤＵＬｅｉ－ｌｅｉ，ＹＡＮＧＨｏｎｇ
（ＫｅｙｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｅｓｔｉｃｉｄｅ＆ＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎm ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅｏｆ
ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｕａｚｈｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７９，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｅｒｍｉｔｅｓａｒｅｏｎｅｏｆｔｈｅｆｅｗｉｎｓｅｃｔｓｗｈｉｃｈｃａｎｄｅｇｒａｄｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅｉｎｔｈｅｎａｔｕｒｅ．Ｔｈｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅｗａｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｅｒｍｉｔｅ＇ｓｇｕｔｓｙｍｂｉｏｎｔｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ．Ｐｒｉｍａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｏｎｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍａｗｏｏｄ－ｆｅｅｄｉｎｇｔｅｒｍｉｔｅ，ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒｗｈｉｃｈｉｓｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎＣｈｉｎａｗａｓｒｅｐｏｒｔｅｄ．ＦｉｖｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐａｒｔｉａｌｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ．Ｆｉｖｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ３＇－ｅｎｄ（６２０ｂｐ）ａｎｄｅｉｇｈｔｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ５＇－ｅｎｄ（８００ｂｐ）ｏｆｔｈｅｃＤＮＡｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙ３｀ＲＡＣＥａｎｄ５｀ＲＡＣＥ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＢｌａｓｔｓｅａｒｃｈｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｏｆＲ．ＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒｓｈａｒｅｄｈｉｇｈｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｔｏｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｗｈｉｃｈｂｅｌｏｎｇｓｔｏＧＨＦ７ｆａｍｉｌｙ．ＦｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｓｗｉｌｌｆｏｃｕｓｏｎｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｉｎＲ．ＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＳｎｙｄｅｒm ｇｕｔm ｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓ
指导老师
杨
红
责任编辑
王
媛
１３２
第１５卷第１期
华中师范大学研究生学报
Ｖｏｌ．１５Ｎｏ．１ＨｕａｚｈｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｓ
２００８年５月Ｍａｙ２００８
黑胸散白蚁肠道纤维素酶基因的初步探究!
杜蕾蕾，杨红b
（华中师范大学生命科学学院昆虫学研究所农药与化学生物学教育部重点实验室，武汉４３００７９）
摘要：白蚁是自然界为数不多的能消化纤维素的昆虫之一。白蚁对木质纤维素的消化作用与其体内的纤
维素酶与肠道内的共生微生物密切相关。本文报道了对广泛分布于我国的一种木食性白蚁，黑胸散白蚁（ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒ）肠道纤维素酶基因的初步研究结果。通过ＲＴ－ＰＣＲ得到五个纤维素酶基因的部分序列，由３｀ＲＡＣＥ和５｀ＲＡＣＥ技术分别得到纤维素酶基因ｃＤＮＡ３｀末端五个６２０ｂｐ左右的核苷酸序列和５｀末端八个８００ｂｐ的核苷酸序列。对序列的分析表明，黑胸散白蚁肠道纤维素酶基因与ＧＨＦ７家族具有较高的同源性。本实验为进一步研究黑胸散白蚁纤维素酶基因的多样性和功能奠定了基础。
关键词：黑胸散白蚁；肠道；纤维素酶基因中图分类号：Ｑ９３６
文献标识码：Ａ
白蚁是自然界为数不多的能消化纤维素的昆虫之一，其食物来源主要是木质纤维素类物质，如树皮、树干、朽木、干草及富含腐殖质的土壤等。纤维素是地球上最丰富的可再生生物质资源，是多个葡萄糖残基以β－１，４－糖苷键连接而成的多聚物。木质纤维素的降解需纤维素酶的参与，而纤维素酶是能将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称。据报道，自然界每年通过光合作用产生的纤维素８９％尚未被人类利用。因此对包括白蚁在内的能消化纤维素的生物体内相关纤维素酶的研究成了近年来的热点。
低等白蚁能依靠内源和外源纤维素酶将木质纤维素降解为可完全吸收利用的营养物质［１］［２］［３］。虽然很早就发现了低等白蚁共生鞭毛虫降解纤维素的现象，但有关纤维素酶基因方面的研究却开始的比较晚［４］。
１．１．１白蚁的采集和饲养
黑胸散白蚁（ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＳｎｙｄｅｒ）采集自武汉市狮子山树林内，在实验室条件下用内盛松木的塑料盒饲养，选用工蚁为实验材料。
１．１．２主要试剂和仪器
１．１．２．１试剂
磷酸缓冲液ＰＢＳ（１３６．８９ｍＭＮａＣｌR ２．６８ｍＭＫＣｌR
４．０５ｍＭＮａ２ＨＰＯ４R １．４７ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ＰＨ７．４）；Ｔｒｉｚｏｌ、
反转录酶Ｍ－ＭＬＶ均为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；ＤＮＡ序列的合成和测序由北京利嘉泰成科技有限公司完成；
２０００年日本学者Ｏｈｔｏｋｏ从栖北散白蚁
（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｓｐｅｒａｔｕｓ）
中克隆出了纤维素酶ＧＨＦ４５家族的的多种基因，荧光原位杂交显示纤维素酶基因来源于鞭毛虫［５］。
Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ均购自天源公司；克隆载体为ｐＧＥＭ－Ｔ
ｅａｓｙＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；５｀ＲＡＣＥ试剂盒为ＴＡＫＡＲＡ公司产品。
１．１．２．３仪器
ＲＣＲ仪为Ｂｉｏｒａｄ公司产品
１．２方法
１．２．１ＲＮＡ的提取和ＲＴ－ＰＣＲ
收集黑胸散白蚁工蚁３０条，依次以７０％酒精、
无菌蒸馏水清洗其表面。用尖头镊子将工蚁肠道拉出，小心刺破后肠将肠液挤入含有１ｍｌＰＢＳ的ＥＰ管中，离心去上清，沉淀物包括后肠所有的微生物。
Ｎａｋａｓｈｉｍａ等人也从台湾乳白蚁后肠中克隆出一种纤
维素酶基因。迄今为止，人们已经从白蚁肠道中得到分属于糖基水解酶家族ＧＨＦ５、ＧＨＦ７和ＧＨＦ４５的多种纤维素酶基因［６］［７］［８］。本文报道了对低等白蚁黑胸散白蚁纤维素酶基因的初步研究结果。
１．１．１
材料和方法材料
Ｔｒｉｚｏｌ法提取混合物的总ＲＮＡ。用ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）１７和
反转录酶合成ｃＤＮＡ第一条链［９］，然后以糖基水解酶家族ＧＨＦ７基因的特异性引物（ｃｆＦ５｀－ＡＡＹＣＡＲＧＣＩＧＡＲＡＡＹＣＡＹＣＣ
－３｀，
Ｆ７Ｒ
５｀－
! 基金项目：国家自然科学基金项目（３０５７００３４）通讯作者：杨红，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｙａｎｇ０２０２＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
作者简介：杜蕾蕾（１９８１－），女，山东威海人，华中师范大学生命科学学院２００５级硕士研究生，研究方向为微生物分子生物学。
１３０
ＧＣＹＴＣＣＣＡＤＡＴＲＹＣＣＡＴＹＴＣ－３）扩增纤维素酶基因的中间序列［８］。ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性３ｍｉｎ，３０
个循环（９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火３０ｓ，７２℃延伸１
采用巢式ＰＣＲ扩增纤维素酶基因的３｀末端序列，得到长度为７４０ｂｐ左右的目的条带，如图２所示。将
ｍｉｎ），最后７２℃再延伸７ｍｉｎ，目的基因连接到ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体然后测序。
１．２．２
纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的扩增
以引物ｃｆＦ、ＲＦ７Ｒ（５＇ＧＡＲＡＴＧＧＲＹＡＴＨＴＧＧＧＡＲＧＣ
ＰＣＲ产物连接到Ｔ－ｅａｓｙ载体上，测序得到五个纤维
素酶基因的３｀末端序列。经比对分析表明所得到的
序列为ＧＨＦ７基因，且序列３＇端含ｐｏｌｙＡ，说明
３＇ＲＡＣＥ已完成。
－ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ（Ｔ）１７－３＇）和接头引物（５′
）用３｀ＲＡＣＥ技术合成纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的３｀末３′
端。第一步ＰＣＲ扩增以接头引物和ｃｆＦ为引物；第二步反应以第一步ＰＣＲ产物为模板，接头引物和
ＲＦ７Ｒ为引物进一步扩增纤维素酶基因的３｀末端序
列。两步ＰＣＲ的反应体系均为：１０ｘＰＣＲ缓冲液
５μｌ，ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）０．５μｌ，引物（５０ｍＭ）各
０．５μｌ，模板ＤＮＡ５μｌ，Ｔａｑ酶１Ｕ，其余用超纯水补足
至５０μ最后将目的基因连接到ｌ。ＰＣＲ反应条件同上。
ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体测序［１３］。
依据ｃＤＮＡ３｀末端序列设计下游特异性引物（ＧＳＰ１５｀－ＡＧＴＡＡＧＴＴＧＡＧＴＣＡＡＴＴＧＧＡＣＣ－３｀，ＧＳＰ２５｀－ＧＣＴＴＴＧＡＡＧＴＣＧＴＴＣＴＴＧＴＣ－３｀），以５｀ＲＡＣＥ试剂盒扩增纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的５｀
末端序列。
图２黑胸散白蚁纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的３｀ＲＡＣＥ
Ｍ：ｍａｒｋｅｒ１：黑胸散白蚁肠液微生物的总ＲＮＡ
２．３纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ５｀末端的扩增
根据３｀ＲＡＣＥ得到的五个序列的保守区设计的特异性引物，采用５｀ＲＡＣＥ试剂盒扩增纤维素酶
２．结果和分析
２．１ＲＴ－ＰＣＲ扩增纤维素酶基因部分序列
采用兼并引物ＲＴ－ＰＣＲ得到目的基因条带长度为６３０ｂｐ左右（图１）。将目的基因连接到ｐＧＥＭ－Ｔ
，筛选出阳性克隆ｅａｓｙ载体上，转化感受态细胞ＤＨ５α
测序得到五个纤维素酶基因的中间序列。根据在
ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的５｀末端序列，得到长度为１１４５ｂｐ左右
的ＰＣＲ产物，如图３所示。经与ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体连接并转化大肠杆菌ＤＨ５α，测序得到８个核苷酸序列，经比对分析表明所得到的序列为ＧＨＦ７基因。这八个序列彼此之间的相似性高于９７％，并且与３｀末端ｃＤＮＡ序列能拼接起来。
ＮＣＢＩ数据库中ＢＬＡＳＴ搜索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）发现这五个基因与与其它散白蚁纤维素酶基因ＧＨＦ７同源性最高。
图１黑胸散白蚁纤维素酶基因的ＲＴ－ＰＣＲ
图３纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的５｀ＲＡＣＥ
Ｍ：ｍａｒｋｅｒ１：黑胸散白蚁肠液微生物的总ＲＮＡＭ：ｍａｒｋｅｒ１：纤维素酶基因５｀末端扩增条带
２．２纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ３｀末端的扩增３．讨论
以总ＲＮＡ反转录合成的第一条链ｃＤＮＡ为模板
纤维素是地球上最丰富的可再生的生物质资源，
１３１
大部分纤维素并没有得到很好的利用，充分利用纤维素不仅能有效地解决目前世界上面临的食物、饲料、以及能源短缺的问题，而且在医药领域纤维素酶的应用也越来越受到重视［１０］。本研究以黑胸散白蚁为材料克隆其肠道纤维素酶基因，初步得到了纤维素酶
Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ，Ｓｐｉｒｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ，Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ，ａｎｄｐａｒａｂａｓａｌｉａｎｓｙｍｂｉｏｎｔｓｉｎｔｈｅｈｉｎｄｇｕｔｏｆｔｅｒｍｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，４７：２４９－２５９．
［５］ＫｕｎｉｙｏＯｈｔｏｋｏ，ＭｏｒｉｙａＯｈｋｕｍａ，ｅｔａｌ，．Ｄｉｖｅｒｓｅｇｅｎｅｓｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｆａｍｉｌｙ４５ｆｒｏｍｔｈｅｓｙｍｂｉｏｔｉｃｐｒｏｔｉｓｔｓｉｎｔｈｅｈｉｎｄｇｕｔｏｆｔｈｅｔｅｒｍｉｔｅＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｓｐｅｒａｔｕｓ［Ｊ］．ｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，２０００，４：３４３－３４９．
［６］ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，ＫｅｉｓｕｋｅＮａｋａｓｈｉｍａ，ＨｉｔｏｓｈｉＳａｉｔｏｈ，ｅｔａｌ．Ｎｅｗｅｎｄｏ－β－ｇｌｕｃａｎａｓｅｓｆｒｏｍｔｈｅｐａｒａｂａｓａｌｉａｎｓｙｍｂｉｏｎｔｓ，ＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａｇｒａｓｓｉｉａｎｄＨｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓｍｉｒａｂｉｌｅｏｆＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｔｅｒｍｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ，２００２，５９：１９８３－１９９２．［７］ＴｅｔｓｕｓｈｉＩｎｏｕｅ，ＳｈｉｇｅｈａｒｕＭｏｒｉｙａ，ＭｏｒｉｙａＯｈｋｕｍａ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍａｓｙｍｂｉｏｔｉｃｐｒｏｔｉｓｔｏｆｔｈｅｌｏｗｅｒｔｅｒｍｉｔｅ，Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２００５，３４９：６７－７５．
［８］Ｋｅｉｓｕｋｅ．Ｎａｋａｓｈｉｍａ，ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，Ｊｕｎ－ｉｃｈｉＡｚｕｍａ．ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍｔｈｅｐａｒａｂａｓａｌｉａｎｓｙｍｂｉｏｎｔ
Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａｇｒａｓｓｉｉｉｎｔｈｅｈｉｎｄｇｕｔｏｆｔｈｅｗｏｏｄ－ｆｅｅｄｉｎｇｔｅｒｍｉｔｅＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．，２００２，５９：１５５４－１５６０．
［９］ＧａｋｕＴｏｋｕｄａ，ＮａｔｈａｎＬｏ，ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，ｅｔａｌ．Ｍｒｔａｚｏａｎｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍｔｅｒｍｉｔｅｓ：ｉｎｔｒｏｎ／ｅｘｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｓｉｔｅｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４４７：１４６－１５９．
［１０］陈小坚．纤维素酶的分子生物学研究及应用进展．湖北民族
学院学报．科学版２００６，２３（４）：４８１．
ＧＨＦ７家族基因ｃＤＮＡ接近全长的核苷酸序列。ＢＬＡＳＴ分析表明从黑胸散白蚁肠道得到的纤维素酶ＧＨＦ７基因与从其它白蚁如家白蚁（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ）肠道共生鞭毛虫中得到的ＧＨＦ７基因同
源性最高，说明糖基水解酶家族ＧＨＦ７类的纤维素酶在白蚁纤维素消化中起着重要的作用。白蚁肠道纤维素降解的复杂过程往往与多种纤维素酶相关［１１］，因此，对黑胸散白蚁肠道纤维素酶多样性和功能的进一步研究是必要的。
参
考
文
献
［１］Ｔｉａｎ－ｃｉＹａｎｇ，Ｊｉａｎ－ｃｈｕＭｏ，Ｊｉａ－ａｎＣｈｅｎｇｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ
ｓｏｍｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｆｒｏｍＯｄｏｎｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（Ｉｓｏｐｔｅｒａ：ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）［Ｊ］．ＥｎｔｏｍｏｌｏｇｉａＳｉｎｉｃａ，２００４，１１（１）：１－１０．［２］ＧａｋｕＴｏｋｕｄａ，ＮａｔｈａｎＬｏ，ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，，ｅｔａｌ．Ｍａｊｏｒａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｔｅｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｃｅｌｌｕｌａｓｅｓｉｎｍｅｍｂｅｒｓｏｆａｎａｐｉｃａｌｔｅｒｍｉｔｅｌｉｎｅａｇｅ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｃｏｌｏｇｙ，２００４，１３：３２１９－３２２８．
［３］ＫｅｉｓｕｋｅＮａｋａｓｈｉｍａ，ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，ＨｉｔｏｓｈｉＳａｉｔｏｈ，ｅｔａｌ．Ｄｕａｌｃｅｌｌｕｌａｓｅ－ｄｉｇｅｓｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｏｆｔｈｅｗｏｏｄ－ｆｅｅｄｉｎｇｔｅｒｍｉｔｅ，Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（Ｓｈｉｒａｋｉ）［Ｊ］．ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００２，３２：７７７－７８４．
［４］ＭｏｒｉｙａＯｈｋｕｍａ，ＫｕｎｉｙｏＯｈｔｏｋｏ，ＴｏｓｈｉｙａＩｉｄａｅｔａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｙｐｅｒｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ，
［１１］ＭａｒｓｈａＭ．Ｗｈｅｅｌｅｒ，ＸｕｇｕｏＺｈｏｕ，ＭｉｃｈａｅｌＥ．Ｓｃｈａｒｆ＿，Ｆａｉｔｈ
Ｍ．Ｏｉ１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｄｙｎａｍｉｃｓｈｉｆｔｓｏｆｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｐｒｏｔｏｚｏａｉｎＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｆｌａｖｉｐｅｓ［Ｊ］．ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，３７（２００７）：１３６６－１３７４．
ＰｒｉｍａｒｙＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅＣｅｌｌｕｌａｓｅＧｅｎｅｓｉｎｔｈｅＧｕｔｏｆ
ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒ
ＤＵＬｅｉ－ｌｅｉ，ＹＡＮＧＨｏｎｇ
（ＫｅｙｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｅｓｔｉｃｉｄｅ＆ＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎm ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅｏｆ
ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｕａｚｈｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７９，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｅｒｍｉｔｅｓａｒｅｏｎｅｏｆｔｈｅｆｅｗｉｎｓｅｃｔｓｗｈｉｃｈｃａｎｄｅｇｒａｄｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅｉｎｔｈｅｎａｔｕｒｅ．Ｔｈｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅｗａｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｅｒｍｉｔｅ＇ｓｇｕｔｓｙｍｂｉｏｎｔｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ．Ｐｒｉｍａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｏｎｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍａｗｏｏｄ－ｆｅｅｄｉｎｇｔｅｒｍｉｔｅ，ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒｗｈｉｃｈｉｓｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎＣｈｉｎａｗａｓｒｅｐｏｒｔｅｄ．ＦｉｖｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐａｒｔｉａｌｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ．Ｆｉｖｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ３＇－ｅｎｄ（６２０ｂｐ）ａｎｄｅｉｇｈｔｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ５＇－ｅｎｄ（８００ｂｐ）ｏｆｔｈｅｃＤＮＡｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙ３｀ＲＡＣＥａｎｄ５｀ＲＡＣＥ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＢｌａｓｔｓｅａｒｃｈｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｏｆＲ．ＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒｓｈａｒｅｄｈｉｇｈｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｔｏｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｗｈｉｃｈｂｅｌｏｎｇｓｔｏＧＨＦ７ｆａｍｉｌｙ．ＦｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｓｗｉｌｌｆｏｃｕｓｏｎｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｉｎＲ．ＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＳｎｙｄｅｒm ｇｕｔm ｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓ
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