第17卷第5期2005年9月
化 学 进 展
PROG RESS I N CHE MISTRY
Vol. 17No. 5
Sep. , 2005
蛋白质变性机理与变性时的热力学参数研究进展
卢 雁
33
3
李向荣
(河南师范大学化学与环境科学学院 新乡453007)
摘 要 生物大分子是近年来生命科学的研究热点和难点之一, 而对蛋白质变性的研究有助于深刻揭
示生命现象的机理。利用光谱学和热力学可以分别从微观和宏观角度对蛋白质变性进行研究, 并由此得到表征蛋白质变性的热力学参数。这对深入了解蛋白质的折叠与伸展、变性机理、结构稳定性及生命体的新陈代谢等问题具有很大意义。近年来, 国内外学者在此方面做了大量的工作, 主要涉及蛋白质在水溶液中的变性机理、在有变性剂存在下水溶液中的变性机理及在含有其它物质水溶液中的变性机理。用来表征蛋白质变性的热力学参数有热容、变性自由能、变性焓和变性熵等。本文对这些研究进行了概述。
关键词 蛋白质 变性 热力学参数
中图分类号:O51; O642. 1 文献标识码:A 文章编号:10052281X (2005) 0520905206
Progress in Study of Protein Denaturation
and Thermodynamic P arameters of Denaturation
Li Xiangrong
(C ollege of Chemistry and Environmental Science , Henan Normal University , X inxiang 453007, China )
Lu Yan
33
Abstract The study of biological macrom olecules has been one of the popular and difficult research area in life science in recent years. The study of protein denaturation is conductive to reveal the mechanism of living phenomenon. Using the methods of spectroscopy and therm odynamics , one can study the problems of protein denaturation from the microscopic and macroscopic aspects respectively. The therm odynamic parameters which manifest the protein denaturation can be obtained in the study. All the studies are significant to understand m ore deeply and precisely the folding and un folding , the stability and denaturation of proteins and the metabolism in living systems. In recent years , much hard w ork has been done by scholars from all over the w orld. These w ork has mainly inv olved the denaturation mechanism of proteins in water , in the s olution with denaturant and in the s olution with other matters. The therm odynamic parameters , which be used to manifest the protein denaturation , are heat capacity , G ibbs free energy , enthalpy and entropy. The recent progress in study of protein denaturation is reviewed.
K ey w ords proteins ; denaturation ; therm odynamic parameters
一、引 言
蛋白质是一类与生命直接相关的生物大分子, 在正常情况下以紧密折叠结构存在。天然蛋白质分子受到某些物理因素如加热、紫外线照射、高压、表
收稿:2004年9月, 收修改稿:2005年1月 3国家自然科学基金资助项目(N o. 20443002) 33通讯联系人 yanlu2001@sohu. com
面张力等或化学因素如有机溶剂、脲、胍、酸、碱等的
影响时, 生物活性丧失, 溶解度降低, 不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变, 这种过程称为蛋白质的变性。早在1960年代就开始使用的微观方法即光谱学方法对蛋白质变性机理的研究到目前
・906・
化 学 进 展
[7]
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仍方兴未艾。而宏观方法即热力学方法所得的热效
应只与体系的始终态有关, 所以对研究像蛋白质这样的复杂体系有独到之处。近年来用热力学参数来表征变性机理备受青睐。本文就近十几年来对蛋白质变性和变性时的热力学参数研究进行概述。等人用DSC 的方法研究了环状肠道菌素蛋白As 248伸展时的热力学性质, 发现As 248在pH =215和低离子强度时, 于102℃发生热变性, 在中性和碱性的条件下, 伸展态发生不可逆的聚集。量热研究表明As 248伸展时焓的变化非常小, 热容变化正常。25℃时吉布斯自由能相对地高, 稳定性高的原因部
二、研究状况
1. 水溶液中蛋白质变性的研究
1980年, Lilley 在含有氨基酸和肽的水溶液体
[1]
系焓效应的研究中, 对溶质2溶质间相互作用引入了
[2]
Savage 和W ood 提出的“基团加和”的方法。基团加和方法是计算展开状态蛋白质溶液热力学性质的有效方法, 即将蛋白质分成各种构成基团, 蛋白质的热力学性质可看作是各个构成基团热力学性质的加和。但任何基团加和方案的适用性都依赖于它所选择代表各个构成基团的模型化合物, 同时也依赖于
[3]
参数计算时所使用的数据可靠性。1991年,
[4]
Murphy 等依据基团加和的基本原理, 研究了固态模型化合物和蛋白质伸展的热力学性质, 分析了固态环状二聚肽溶解到水中的热力学数据, 测定了小的球形蛋白质的变性和模型化合物溶解到水中焓和
33
熵的收敛温度, 并发现在这些温度(T H 和T S ) 处, 非极性基团对相应的热力学值ΔH °和ΔS °的贡献为零。研究还发现对变性热容的贡献由两部分组成:一部分是暴露的非极性基团的正贡献; 一部分是暴露的极性基团的负贡献。结合球形蛋白的一般结构特征(残基数, 埋藏的非极性基团数, 氢键数) 和特殊基团贡献, 可以预测蛋白质的热力学特性, 其结果和文献报道有很好的一致性。
近10年来, 在蛋白质溶液体系热力学参量的测量中差示扫描量热计DSC (differential scanning calorimeter ) 的应用十分广泛。与较为贵重的绝热量热计相比,DSC 的准确性要低一些, 但对于绝大多数的量热研究, 其准确性已可满足要求, 并且DSC 成
[3][5]
本低, 量热速度也快。Haynie 和Freire 用DSC 的方法测定了蛋白质在折叠Π伸展转变时的能量, 文中第一次描述了“weighted av. enthalpy “函数, 并指出此函数同van ’t H off 焓和量热焓相比, 得到的热力学参
[6]
数和真值的差别小于5%。Calavia 和Burg os 用DSC 的方法在不同的加热速率下, 研究了绵羊的β2乳球蛋白的基因变体A 和B 在磷酸盐缓冲溶液中的热变性。发现变体A 比B 有更大的热抵抗性, 两个变体的变性焓和变性协同性没有明显的不同, van ’t H off 焓和H cal ΠH v f 的值依赖于加热速率。C obos
分归于多肽链的环状结构引起的熵的强制性
(entropic constrains ) 。
Privalov 改进差示扫描量热为高灵敏性差示扫描量热计HS 2DSC (high 2sensitivity differential scanning calorimetry ) 后,Pic ó用HS 2DSC 研究了人血清白蛋白HS A (human serum albumin ) 伸展时的热力学特性, 发现其变性过程可以用Eyring 和Lumry 模型描述:天然态Ω可逆伸展态→不可逆伸展态(native Ωun folded reversible →un folded irreversible ) , 研究表明白蛋白伸展过程中存在一个“熔球态”。G anesh 等人用HS 2DSC 结合荧光、远紫外圆二色性、近紫外圆二色性等光学技术研究了麦芽糖结合蛋白质M BP (maltose binding protein ) 的热容与其稳定性间的关系, 指出如果蛋白质的结构稳定性小, 在低温就会失去活性, 蛋白质的低温失活有两种情况即冷解离和冷变性。G anesh 等认为冷变性温度主要依赖于天然状态和展开状态间热容的差值, 差值增大冷变性温度增
[10]
大。Burova 等用HS 2DSC 在pH =210—1010之间研究了猪乳球蛋白的热变性, 结果发现pH 值会影响
E
变性温度和变性焓, 变性的过量自由能Δd G 同样也是pH 的函数。他们用侧链氢键对蛋白质稳定性
[11]
的贡献对其进行了分析。他们还用HS 2DSC 测定了K TI (K unitz s oybean trypsin inhibitor ) 和RBPC (ribulose 21,52biphosphate carboxylase ) 的热变性, 发现变性温度依赖于加热速率, 并介绍了一种发展动力学(developed kinetic ) 方法, 用来测定变性的过量自由能、变性的活化焓和熵、变性的速率常数等。
[12]
2002年, Salvetti 等在pH =215, T =293—368K 的条件下, 用温度调节扫描量热T MSC (tem perature m odulated scanning calorimetry ) 的方法测定了溶菌酶变性时的吸热效应和反应平衡。这种技术可以单独测定热的可逆焓变, 同时伴随热的不可逆焓变。结果发现溶菌酶的热变性过程为:天然态Ω伸展中间态→变性态(native state Ωun folded (intermediate ) state →denatured state ) 。这个结论符合一般的观点:认为像溶菌酶这样小的一域球蛋白, 变性的第一步应为可逆伸展过渡态, 第二步则为不可逆变性。
[8]
[9]
第5期卢 雁等 蛋白质变性机理与变性时的热力学参数研究进展・907・
21有其它溶质的水溶液中蛋白质变性的研究
现在普遍接受的观点是生物溶剂水在天然生物
聚合物的折叠和反应性上起重要作用。观察溶剂在维持大分子天然结构所起的作用常采用的方法是:加入少量的不同链长的一羟基醇改变水的结构后观察这些大分子的结构和热稳定性变化。事实上, 醇作用于生物分子的机理仍不清楚, 主要有两种观点:(1) 认为醇直接或间接键合到大分子基团上作为配
[13]
体; (2) 认为改变了溶剂水的特性。1989年
[14]
Onori 对DNA 的变性研究支持了后者的观点。
[13]
1997年Onori 等为了确定醇对蛋白质的结构稳定性的影响和溶剂特性改变之间的联系, 在pH =3时用HS 2DSC 研究了溶菌酶在水Π乙醇, 水Π叔乙醇混合液中的热变性, 测定了一系列的热力学参数, 结果发现随着醇浓度的增加, 溶菌酶的变性焓和熵逐渐达到最大值, 然后开始下降, 蛋白质和醇之间没有直接
[15]
的分子相互作用。Sirotkin 等在25℃时用量热法测定了人血清白蛋白HS A 在正丁醇、正丙醇、乙醇和甲醇中的焓变, 说明脂肪醇的链长对蛋白质结构
[16]
的影响。2001年, T anaka 等用动态光散射D LS (dynamic light scattering ) 的方法研究了鸡溶菌酶在乙醇溶液中的变性和聚集, 发现在不同浓度的乙醇溶液中蛋白质出现不同的状态, 并指出溶菌酶分子结构的变化和其分子的扩散和聚集关系密切。除了对含有醇的水溶液中蛋白质变性的研究外, 对含有其它无机物和有机物的研究也有报道。
[17]
1997年,Adeishvili 等用扫描微量量热(scanning microcalorimetry ) 研究了胰凝乳蛋白酶在不同pH 值的K Cl 溶液中的热变性, 发现在酸性和高碱性时, 变性温度和变性焓会很快下降。这符合一般的机理:即认为被滴定的蛋白质基团在强的质子化和去质子
+
化条件下都不稳定。低浓度的K 使蛋白质分子稳定, 随着浓度不断提高, 变性温度和变性焓也逐渐下降。作者指出判断蛋白质是否为两态变性的标准是
ΔH v f 看van ’t H off 焓是否等于量热焓, 即υ=ΔH cal Π的值是否为1。实验结果发现α2胰凝乳蛋白酶的变性只在个别的情况下可能是两态模型, 而在大多数
情况下蛋白质变性经过一个明显的中间态。
[18]
G rinberg 等用HS 2DSC 研究了卵白蛋白在香草醛中的热变性, 结果发现在中性和酸性pH 值下, 卵白蛋白的热变性依赖于加热速率并且是不可逆的, 变性温度和变性焓随着香草醛浓度的增加而降低。
31在变性剂溶液中蛋白质变性的研究
蛋白质可以通过两种方法变性:即热变性和化
学变性, 热变性产生了“熔球态”和蛋白质的聚集, 而化学变性在伸展态中产生了无规卷曲(randomcoil )
[19]
构造。有关尿素和盐酸胍使蛋白质变性的机理
[3]
到目前尚未研究清楚, 主要有以下3种观点:(1) 尿素和盐酸胍分子直接与蛋白质的官能团结合; (2) 通过改变水的结构, 间接引起蛋白质疏水基团周围水氢键结构的变化; (3) 以上两种作用同时起作用。
[20]
Wetlan fer 等通过实验研究认为应该排除第一种
[21]
机理的可能性; 而Vanzi 等利用随机网络模型RNM (random netw ork m odel ) 对变性机理进行了模拟, 并对水合作用相关的热容值进行了计算, 认为第二
[22]
种机理不足以造成蛋白质的变性; Qin 等在25℃用量热法研究尿素使蛋白质变性时, 认为可能是第三种机理。
[23]
1994年,Zdenka 等用C D 的方法研究了人血清白蛋白HS A 在尿素和烷基尿素中的化学变性, 发现其摩尔椭圆率[θ]λ依赖于尿素分子的烷基基团, 并推测HS A 的化学变性是一个两态过程, 变性吉布斯自由能, 焓, 熵的值比量热值小很多, 表明HS A 在水溶液中的变性可能是一个多态过程。Brain 和
[24]
Raleigh 用C D 方法测定了NT L9(N 2terminal domain of the ribos omal protein L9) 在H 2O 和D 2O 中的化学变性, 并分析了溶剂同位素效应对变性时热力学参数
[27]
的影响。Sasahara 等通过远紫外圆二色性(far 2UV C D ) 和近紫外圆二色性(near 2UV C D ) 分别在222nm 和289nm 处测定了两个伸展转变曲线, 发现其并不一致, 这就说明在天然态和伸展态之间存在着第三结构, 即“熔球态”。这对传统的认为盐酸胍诱导的鸡溶菌酶是高度协同的两态过程, 在天然态和伸展
[25,26]
态之间没有任何中间态的观点, 再次提出了质疑。文中估算了盐酸胍诱导的伸展态热力学参数, 认为从天然态到中间态是一个高度协同过程, 熵和焓的变化很大, 而从中间态到伸展态熵和焓的变化却很小, 表现出低的协同性。这个结果表明变性能垒位于天然态到中间态的过程中, 而且此过程对蛋
[28]
白质的伸展协同性有很大的贡献。Shah 等用荧光技术研究了盐酸胍诱导的bFG F (human basic fibroblast growth factor ) 的伸展, 用两态模型估算了一些热力学参数, 并研究了用透析方法将盐酸胍除去后,bFG F 的复性是否是可逆的。多数人都接受变性是可逆的概念, 认为天然构象是处于能量最低的状态, 有些蛋白质变性后之所以不能逆转, 主要是所需
[29][30]
条件不易满足的缘故。Deshpande 等用荧光光谱和C D 的方法研究了核糖核酸酶RNase R S
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化 学 进 展
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(ribonuclease R S ) 的伸展平衡态, 发现在等电点的附microcalorimeter ) 研究了鸡溶菌酶在胍溶液中重折叠(refolding ) 的动力学和热力学。这种技术可以直接
ΔG H O (没有变性剂存在时折叠态和伸展态自由近,
2
能的差值) 和D 1Π2(变性中点时变性剂的浓度) 达到最大值。这是由于等电点处, 蛋白质所带的正电荷
和负电荷恰好相等, 即净电荷为零, 蛋白质很稳定的
[30]
ΔG H O 是衡量蛋白质对变性剂稳定性的缘故。2ΔG H O 值大则表明比较稳定。大部分球蛋白的量, 2稳定性在5—15kcal Πm ol 。对同一蛋白质, 由不同
变性剂造成的变性曲线得到的ΔG H 2O 值大致相似。因此, 虽然盐酸胍是一种比尿素更强的变性[32]
剂, 但是所得的ΔG H 2O 值和尿素诱导变性的值相似
。
近年来, 对较大的蛋白质和特殊蛋白质化学变性的研究也有报道。麦芽糖结合蛋白质(M BP ) 由370个氨基酸组成, 是一种单体, 两域较大的蛋白
[30][32]
[31]
监测热量的产生和吸收, 在变性剂浓度很高时, 仍然可以测定重折叠过程中的能量(焓和热容) 和动力学量(速率常数) 。Natasa 等
[40,41]
用DSC 、UV 、C D 等方
法研究了尿素、烷基尿素、盐酸胍、pH 值对核糖核酸
酶RNase A (ribonuclease A ) 热稳定性的影响, 发现其热稳定性随变性剂浓度的增高、尿素疏水取代基的变大而降低。G abriela 等用量热法研究了尿素和牛血清白蛋白BS A (bovine serum albumin ) 之间的相互作用, 总结了在研究蛋白质的化学变性, 估测蛋白质结构稳定性(用ΔG DH O 表示) 时常用的3种模型:
2
[37]
(1) T an ford 模型 使用从氨基酸和多肽溶解性导出
的转变自由能; (2) 直线外推模型 假设在转变区域观察到的ΔG D 和变性剂的浓度之间是直线关系, 外推到变性剂浓度为零; (3) 变性剂键合模型 假设变性剂分子键合到肽基团上或一个氨基酸侧链上。C obos
[42]
质, 在中性pH 并且没有变性剂存在的条件下处于
天然态; 在pH =310时, 形成一个熔球态。Sheshadvi [33]
等用C D 技术研究了这一熔球态, 发现它没有第三圆二色性信号, 即无完整的三级结构, 其二级结构和天然态相似, 和许多小蛋白相比,M BP 熔球态的结构高度有序。PelC (pectate lyase C ) 是第一个被报道具有平行β2螺旋结构的蛋白质, 这种结构的典型特征是:二级结构主要由相对高的β2折叠片组成, 这些平行β2折叠片在多肽主链上卷拢形成大的右手性卷曲结构, 称为平行β2螺旋结构, 这便形成了一个非常简单的高度有序的拓扑结构。K amen 等用远紫外、近紫外、荧光技术研究发现, 在pH =7和5时,PelC 在盐酸胍溶液中的伸展是可逆的, 在pH =7
o
时为两态转变且ΔG H 2O =1212kcal Πm ol 。研究指出, 量热法和光谱法是估测蛋白质结构稳定性的两种分析技
Privalov 和K echinashvii 等
[35]
[34]
用C D 、DSC 方法研究AS 248在尿素、盐酸胍
溶液中的化学变性, 发现25℃时它在613m ol ΠL 盐酸胍中发生伸展, 在8m ol ΠL 尿素中不伸展。研究还发
现盐酸胍存在时ΔG w (298K ) 是纯水中和有尿素存在时的2倍, 因为结构的稳定性很大程度上依赖于离子强度, 因此盐酸胍既是变性剂又是稳定剂
[42]
。
除了对尿素与盐酸胍这两种普遍应用的变性剂相互作用的研究外, 对其他变性剂进行应用的研究也有报道。1996年M oosavi 等研究了牛血清白蛋白BS A 和DT AB (dodecyl trimethylamm onium bromide ) 相互作用的变性机理。DT AB 是一种阳离子表面活性剂, 研究发现在DT AB 低浓度, 高温度时, 相互作用焓是吸热的, 且H cal
[44]
[43]
术, 并用实验事实展示了量热法在解决蛋白质复杂体系的独到之处。他们认为在蛋白质变性过程中, 表征两态模型的最重要的热力学参数就是ΔC P , 在蛋白质伸展过程中ΔC P 显著地高, 并且是正值。认为这是由于在伸展过程中暴露的疏水残基和水的相互作用所致。但是, 在解决蛋白质和变性剂相互作用的问题上,1992年以前量热技术并没有
[37][38]
被广泛地应用。1994年Bae 等用HS 2DSC 研究了eglin C (一种小的蛋白质抑制剂) , 发现其变性温Pace
[36]
用等温滴定量热(is othermal titration calorimetry ) 、DSC 等方法研究了牛血清白蛋白BS A 与阳离子表面活性剂DT AB 和阴离子表面活性剂S DS (s odium n 2dodecyl sulphate ) 的相互作用, 结果发现DT AB 和BS A (015wt %) 的混合焓在DT AB 浓度很低时(0—17mm ol ΠL ) 为吸热, 高浓度(17—27mm ol ΠL ) 为放热, DT AB 浓度超过4mm ol ΠL 时, 由于中和了蛋白质的电
荷, 使BS A 完全变性。而S DS 和BS A (015wt %) 的混合焓在任何浓度下都放热, 当S DS 的浓度超过4mm ol ΠL 时, 同样会使BS A 发生完全变性。K ovrigin
度和焓在加入313m ol ΠL 盐酸胍后都有所下降。
[39]
Boulaich 等用滴定微量量热计(titration
和P otekhin
[45]
利用DSC 对用乙腈变性剂时溶菌酶的
第5期卢 雁等 蛋白质变性机理与变性时的热力学参数研究进展・909・
稳定性作了研究, 并充分考虑热容值改变与变性之
间的关系, 发现随着乙腈量的增加, 变性的温度是下降的。他们提出蛋白质的热力学稳定性越高, 则天然蛋白质分子伸展的可能性越小, 由此进一步提出蛋白质的热力学稳定性是一个与天然状态下的蛋白质的真实寿命直接相关的参量, 而ΔC P 值则正可以用来帮助估算一定溶液组成和温度范围内的溶菌酶的热力学稳定性情况。Aboluw oye 等测定了人血红蛋白A (human hem oglobin A , HbA ) 的衍生物在S DS 中的变性, 结果发现HbA 的衍生物在S DS 中的
[46]
值得研究的问题。
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最大稳定性ΔG D (H 2O ) 和最小稳定性ΔG D (H C ) 受pH 值ΔH D 、和温度的影响, 而变性时的热力学参数ΔG D 、ΔS D 则依赖于盐桥、氢键、范德华力、溶剂的变化、反应中心的极性、HbA 衍生物的结构变化、S DS 所在活性位置等因素。
41最新研究进展
将量热方法和各种光谱学技术相结合, 从宏观方面和微观角度全方位地对蛋白质的变性进行研究已成为热点。用Privalov 提出的简单键合模型对量
热数据进行分析, 计算键合常数k 、单个键合自由能Δg 及总的吉布斯自由能ΔG (a ) , 并可以用变性中点的直线外推方法求出表观变性焓ΔH d 。用Pace 等提出的公式分析光谱方法得到的数据, 求出伸展分数f u , 平衡常数K , 伸展吉布斯自由能ΔG u 以及衡量蛋白质对变性剂稳定性的参量ΔG H O , 衡量蛋白
2
质变性协同性的参量m , 以及变性中点D 1Π2, 用多个参数同时表征蛋白质的变性过程, 用多种实验手段对比分析实验结果, 综合地对蛋白质变性机理进行研究势必会取得更好的结果。
三、结 语
随着光谱技术和量热技术的综合应用, 对蛋白质体系的热变性、化学变性的研究在广度和深度上都在不断地拓展, 将会出现更多的理论对蛋白质的ΔG H O 是衡量蛋白质对变性剂稳定变性进行解释。
2
ΔC P 和H cal ΠH v f 值可以作为判断蛋白质的变性的量,
性为两态模型的标准。但是, 由于蛋白质的复杂结构以及不同官能团之间的非共价相互作用, 使用对其测量所得到的热力学数据的分析, 很难像一般化合物那样深入。对于这些生物大分子, 如何从定量的角度找出热力学参数与蛋白质变性机理、稳定性
及结构转变的协同性机制之间的内在联系也是一个
・910・
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第17卷第5期2005年9月
化 学 进 展
PROG RESS I N CHE MISTRY
Vol. 17No. 5
Sep. , 2005
蛋白质变性机理与变性时的热力学参数研究进展
卢 雁
33
3
李向荣
(河南师范大学化学与环境科学学院 新乡453007)
摘 要 生物大分子是近年来生命科学的研究热点和难点之一, 而对蛋白质变性的研究有助于深刻揭
示生命现象的机理。利用光谱学和热力学可以分别从微观和宏观角度对蛋白质变性进行研究, 并由此得到表征蛋白质变性的热力学参数。这对深入了解蛋白质的折叠与伸展、变性机理、结构稳定性及生命体的新陈代谢等问题具有很大意义。近年来, 国内外学者在此方面做了大量的工作, 主要涉及蛋白质在水溶液中的变性机理、在有变性剂存在下水溶液中的变性机理及在含有其它物质水溶液中的变性机理。用来表征蛋白质变性的热力学参数有热容、变性自由能、变性焓和变性熵等。本文对这些研究进行了概述。
关键词 蛋白质 变性 热力学参数
中图分类号:O51; O642. 1 文献标识码:A 文章编号:10052281X (2005) 0520905206
Progress in Study of Protein Denaturation
and Thermodynamic P arameters of Denaturation
Li Xiangrong
(C ollege of Chemistry and Environmental Science , Henan Normal University , X inxiang 453007, China )
Lu Yan
33
Abstract The study of biological macrom olecules has been one of the popular and difficult research area in life science in recent years. The study of protein denaturation is conductive to reveal the mechanism of living phenomenon. Using the methods of spectroscopy and therm odynamics , one can study the problems of protein denaturation from the microscopic and macroscopic aspects respectively. The therm odynamic parameters which manifest the protein denaturation can be obtained in the study. All the studies are significant to understand m ore deeply and precisely the folding and un folding , the stability and denaturation of proteins and the metabolism in living systems. In recent years , much hard w ork has been done by scholars from all over the w orld. These w ork has mainly inv olved the denaturation mechanism of proteins in water , in the s olution with denaturant and in the s olution with other matters. The therm odynamic parameters , which be used to manifest the protein denaturation , are heat capacity , G ibbs free energy , enthalpy and entropy. The recent progress in study of protein denaturation is reviewed.
K ey w ords proteins ; denaturation ; therm odynamic parameters
一、引 言
蛋白质是一类与生命直接相关的生物大分子, 在正常情况下以紧密折叠结构存在。天然蛋白质分子受到某些物理因素如加热、紫外线照射、高压、表
收稿:2004年9月, 收修改稿:2005年1月 3国家自然科学基金资助项目(N o. 20443002) 33通讯联系人 yanlu2001@sohu. com
面张力等或化学因素如有机溶剂、脲、胍、酸、碱等的
影响时, 生物活性丧失, 溶解度降低, 不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变, 这种过程称为蛋白质的变性。早在1960年代就开始使用的微观方法即光谱学方法对蛋白质变性机理的研究到目前
・906・
化 学 进 展
[7]
第17卷
仍方兴未艾。而宏观方法即热力学方法所得的热效
应只与体系的始终态有关, 所以对研究像蛋白质这样的复杂体系有独到之处。近年来用热力学参数来表征变性机理备受青睐。本文就近十几年来对蛋白质变性和变性时的热力学参数研究进行概述。等人用DSC 的方法研究了环状肠道菌素蛋白As 248伸展时的热力学性质, 发现As 248在pH =215和低离子强度时, 于102℃发生热变性, 在中性和碱性的条件下, 伸展态发生不可逆的聚集。量热研究表明As 248伸展时焓的变化非常小, 热容变化正常。25℃时吉布斯自由能相对地高, 稳定性高的原因部
二、研究状况
1. 水溶液中蛋白质变性的研究
1980年, Lilley 在含有氨基酸和肽的水溶液体
[1]
系焓效应的研究中, 对溶质2溶质间相互作用引入了
[2]
Savage 和W ood 提出的“基团加和”的方法。基团加和方法是计算展开状态蛋白质溶液热力学性质的有效方法, 即将蛋白质分成各种构成基团, 蛋白质的热力学性质可看作是各个构成基团热力学性质的加和。但任何基团加和方案的适用性都依赖于它所选择代表各个构成基团的模型化合物, 同时也依赖于
[3]
参数计算时所使用的数据可靠性。1991年,
[4]
Murphy 等依据基团加和的基本原理, 研究了固态模型化合物和蛋白质伸展的热力学性质, 分析了固态环状二聚肽溶解到水中的热力学数据, 测定了小的球形蛋白质的变性和模型化合物溶解到水中焓和
33
熵的收敛温度, 并发现在这些温度(T H 和T S ) 处, 非极性基团对相应的热力学值ΔH °和ΔS °的贡献为零。研究还发现对变性热容的贡献由两部分组成:一部分是暴露的非极性基团的正贡献; 一部分是暴露的极性基团的负贡献。结合球形蛋白的一般结构特征(残基数, 埋藏的非极性基团数, 氢键数) 和特殊基团贡献, 可以预测蛋白质的热力学特性, 其结果和文献报道有很好的一致性。
近10年来, 在蛋白质溶液体系热力学参量的测量中差示扫描量热计DSC (differential scanning calorimeter ) 的应用十分广泛。与较为贵重的绝热量热计相比,DSC 的准确性要低一些, 但对于绝大多数的量热研究, 其准确性已可满足要求, 并且DSC 成
[3][5]
本低, 量热速度也快。Haynie 和Freire 用DSC 的方法测定了蛋白质在折叠Π伸展转变时的能量, 文中第一次描述了“weighted av. enthalpy “函数, 并指出此函数同van ’t H off 焓和量热焓相比, 得到的热力学参
[6]
数和真值的差别小于5%。Calavia 和Burg os 用DSC 的方法在不同的加热速率下, 研究了绵羊的β2乳球蛋白的基因变体A 和B 在磷酸盐缓冲溶液中的热变性。发现变体A 比B 有更大的热抵抗性, 两个变体的变性焓和变性协同性没有明显的不同, van ’t H off 焓和H cal ΠH v f 的值依赖于加热速率。C obos
分归于多肽链的环状结构引起的熵的强制性
(entropic constrains ) 。
Privalov 改进差示扫描量热为高灵敏性差示扫描量热计HS 2DSC (high 2sensitivity differential scanning calorimetry ) 后,Pic ó用HS 2DSC 研究了人血清白蛋白HS A (human serum albumin ) 伸展时的热力学特性, 发现其变性过程可以用Eyring 和Lumry 模型描述:天然态Ω可逆伸展态→不可逆伸展态(native Ωun folded reversible →un folded irreversible ) , 研究表明白蛋白伸展过程中存在一个“熔球态”。G anesh 等人用HS 2DSC 结合荧光、远紫外圆二色性、近紫外圆二色性等光学技术研究了麦芽糖结合蛋白质M BP (maltose binding protein ) 的热容与其稳定性间的关系, 指出如果蛋白质的结构稳定性小, 在低温就会失去活性, 蛋白质的低温失活有两种情况即冷解离和冷变性。G anesh 等认为冷变性温度主要依赖于天然状态和展开状态间热容的差值, 差值增大冷变性温度增
[10]
大。Burova 等用HS 2DSC 在pH =210—1010之间研究了猪乳球蛋白的热变性, 结果发现pH 值会影响
E
变性温度和变性焓, 变性的过量自由能Δd G 同样也是pH 的函数。他们用侧链氢键对蛋白质稳定性
[11]
的贡献对其进行了分析。他们还用HS 2DSC 测定了K TI (K unitz s oybean trypsin inhibitor ) 和RBPC (ribulose 21,52biphosphate carboxylase ) 的热变性, 发现变性温度依赖于加热速率, 并介绍了一种发展动力学(developed kinetic ) 方法, 用来测定变性的过量自由能、变性的活化焓和熵、变性的速率常数等。
[12]
2002年, Salvetti 等在pH =215, T =293—368K 的条件下, 用温度调节扫描量热T MSC (tem perature m odulated scanning calorimetry ) 的方法测定了溶菌酶变性时的吸热效应和反应平衡。这种技术可以单独测定热的可逆焓变, 同时伴随热的不可逆焓变。结果发现溶菌酶的热变性过程为:天然态Ω伸展中间态→变性态(native state Ωun folded (intermediate ) state →denatured state ) 。这个结论符合一般的观点:认为像溶菌酶这样小的一域球蛋白, 变性的第一步应为可逆伸展过渡态, 第二步则为不可逆变性。
[8]
[9]
第5期卢 雁等 蛋白质变性机理与变性时的热力学参数研究进展・907・
21有其它溶质的水溶液中蛋白质变性的研究
现在普遍接受的观点是生物溶剂水在天然生物
聚合物的折叠和反应性上起重要作用。观察溶剂在维持大分子天然结构所起的作用常采用的方法是:加入少量的不同链长的一羟基醇改变水的结构后观察这些大分子的结构和热稳定性变化。事实上, 醇作用于生物分子的机理仍不清楚, 主要有两种观点:(1) 认为醇直接或间接键合到大分子基团上作为配
[13]
体; (2) 认为改变了溶剂水的特性。1989年
[14]
Onori 对DNA 的变性研究支持了后者的观点。
[13]
1997年Onori 等为了确定醇对蛋白质的结构稳定性的影响和溶剂特性改变之间的联系, 在pH =3时用HS 2DSC 研究了溶菌酶在水Π乙醇, 水Π叔乙醇混合液中的热变性, 测定了一系列的热力学参数, 结果发现随着醇浓度的增加, 溶菌酶的变性焓和熵逐渐达到最大值, 然后开始下降, 蛋白质和醇之间没有直接
[15]
的分子相互作用。Sirotkin 等在25℃时用量热法测定了人血清白蛋白HS A 在正丁醇、正丙醇、乙醇和甲醇中的焓变, 说明脂肪醇的链长对蛋白质结构
[16]
的影响。2001年, T anaka 等用动态光散射D LS (dynamic light scattering ) 的方法研究了鸡溶菌酶在乙醇溶液中的变性和聚集, 发现在不同浓度的乙醇溶液中蛋白质出现不同的状态, 并指出溶菌酶分子结构的变化和其分子的扩散和聚集关系密切。除了对含有醇的水溶液中蛋白质变性的研究外, 对含有其它无机物和有机物的研究也有报道。
[17]
1997年,Adeishvili 等用扫描微量量热(scanning microcalorimetry ) 研究了胰凝乳蛋白酶在不同pH 值的K Cl 溶液中的热变性, 发现在酸性和高碱性时, 变性温度和变性焓会很快下降。这符合一般的机理:即认为被滴定的蛋白质基团在强的质子化和去质子
+
化条件下都不稳定。低浓度的K 使蛋白质分子稳定, 随着浓度不断提高, 变性温度和变性焓也逐渐下降。作者指出判断蛋白质是否为两态变性的标准是
ΔH v f 看van ’t H off 焓是否等于量热焓, 即υ=ΔH cal Π的值是否为1。实验结果发现α2胰凝乳蛋白酶的变性只在个别的情况下可能是两态模型, 而在大多数
情况下蛋白质变性经过一个明显的中间态。
[18]
G rinberg 等用HS 2DSC 研究了卵白蛋白在香草醛中的热变性, 结果发现在中性和酸性pH 值下, 卵白蛋白的热变性依赖于加热速率并且是不可逆的, 变性温度和变性焓随着香草醛浓度的增加而降低。
31在变性剂溶液中蛋白质变性的研究
蛋白质可以通过两种方法变性:即热变性和化
学变性, 热变性产生了“熔球态”和蛋白质的聚集, 而化学变性在伸展态中产生了无规卷曲(randomcoil )
[19]
构造。有关尿素和盐酸胍使蛋白质变性的机理
[3]
到目前尚未研究清楚, 主要有以下3种观点:(1) 尿素和盐酸胍分子直接与蛋白质的官能团结合; (2) 通过改变水的结构, 间接引起蛋白质疏水基团周围水氢键结构的变化; (3) 以上两种作用同时起作用。
[20]
Wetlan fer 等通过实验研究认为应该排除第一种
[21]
机理的可能性; 而Vanzi 等利用随机网络模型RNM (random netw ork m odel ) 对变性机理进行了模拟, 并对水合作用相关的热容值进行了计算, 认为第二
[22]
种机理不足以造成蛋白质的变性; Qin 等在25℃用量热法研究尿素使蛋白质变性时, 认为可能是第三种机理。
[23]
1994年,Zdenka 等用C D 的方法研究了人血清白蛋白HS A 在尿素和烷基尿素中的化学变性, 发现其摩尔椭圆率[θ]λ依赖于尿素分子的烷基基团, 并推测HS A 的化学变性是一个两态过程, 变性吉布斯自由能, 焓, 熵的值比量热值小很多, 表明HS A 在水溶液中的变性可能是一个多态过程。Brain 和
[24]
Raleigh 用C D 方法测定了NT L9(N 2terminal domain of the ribos omal protein L9) 在H 2O 和D 2O 中的化学变性, 并分析了溶剂同位素效应对变性时热力学参数
[27]
的影响。Sasahara 等通过远紫外圆二色性(far 2UV C D ) 和近紫外圆二色性(near 2UV C D ) 分别在222nm 和289nm 处测定了两个伸展转变曲线, 发现其并不一致, 这就说明在天然态和伸展态之间存在着第三结构, 即“熔球态”。这对传统的认为盐酸胍诱导的鸡溶菌酶是高度协同的两态过程, 在天然态和伸展
[25,26]
态之间没有任何中间态的观点, 再次提出了质疑。文中估算了盐酸胍诱导的伸展态热力学参数, 认为从天然态到中间态是一个高度协同过程, 熵和焓的变化很大, 而从中间态到伸展态熵和焓的变化却很小, 表现出低的协同性。这个结果表明变性能垒位于天然态到中间态的过程中, 而且此过程对蛋
[28]
白质的伸展协同性有很大的贡献。Shah 等用荧光技术研究了盐酸胍诱导的bFG F (human basic fibroblast growth factor ) 的伸展, 用两态模型估算了一些热力学参数, 并研究了用透析方法将盐酸胍除去后,bFG F 的复性是否是可逆的。多数人都接受变性是可逆的概念, 认为天然构象是处于能量最低的状态, 有些蛋白质变性后之所以不能逆转, 主要是所需
[29][30]
条件不易满足的缘故。Deshpande 等用荧光光谱和C D 的方法研究了核糖核酸酶RNase R S
・908・
化 学 进 展
第17卷
(ribonuclease R S ) 的伸展平衡态, 发现在等电点的附microcalorimeter ) 研究了鸡溶菌酶在胍溶液中重折叠(refolding ) 的动力学和热力学。这种技术可以直接
ΔG H O (没有变性剂存在时折叠态和伸展态自由近,
2
能的差值) 和D 1Π2(变性中点时变性剂的浓度) 达到最大值。这是由于等电点处, 蛋白质所带的正电荷
和负电荷恰好相等, 即净电荷为零, 蛋白质很稳定的
[30]
ΔG H O 是衡量蛋白质对变性剂稳定性的缘故。2ΔG H O 值大则表明比较稳定。大部分球蛋白的量, 2稳定性在5—15kcal Πm ol 。对同一蛋白质, 由不同
变性剂造成的变性曲线得到的ΔG H 2O 值大致相似。因此, 虽然盐酸胍是一种比尿素更强的变性[32]
剂, 但是所得的ΔG H 2O 值和尿素诱导变性的值相似
。
近年来, 对较大的蛋白质和特殊蛋白质化学变性的研究也有报道。麦芽糖结合蛋白质(M BP ) 由370个氨基酸组成, 是一种单体, 两域较大的蛋白
[30][32]
[31]
监测热量的产生和吸收, 在变性剂浓度很高时, 仍然可以测定重折叠过程中的能量(焓和热容) 和动力学量(速率常数) 。Natasa 等
[40,41]
用DSC 、UV 、C D 等方
法研究了尿素、烷基尿素、盐酸胍、pH 值对核糖核酸
酶RNase A (ribonuclease A ) 热稳定性的影响, 发现其热稳定性随变性剂浓度的增高、尿素疏水取代基的变大而降低。G abriela 等用量热法研究了尿素和牛血清白蛋白BS A (bovine serum albumin ) 之间的相互作用, 总结了在研究蛋白质的化学变性, 估测蛋白质结构稳定性(用ΔG DH O 表示) 时常用的3种模型:
2
[37]
(1) T an ford 模型 使用从氨基酸和多肽溶解性导出
的转变自由能; (2) 直线外推模型 假设在转变区域观察到的ΔG D 和变性剂的浓度之间是直线关系, 外推到变性剂浓度为零; (3) 变性剂键合模型 假设变性剂分子键合到肽基团上或一个氨基酸侧链上。C obos
[42]
质, 在中性pH 并且没有变性剂存在的条件下处于
天然态; 在pH =310时, 形成一个熔球态。Sheshadvi [33]
等用C D 技术研究了这一熔球态, 发现它没有第三圆二色性信号, 即无完整的三级结构, 其二级结构和天然态相似, 和许多小蛋白相比,M BP 熔球态的结构高度有序。PelC (pectate lyase C ) 是第一个被报道具有平行β2螺旋结构的蛋白质, 这种结构的典型特征是:二级结构主要由相对高的β2折叠片组成, 这些平行β2折叠片在多肽主链上卷拢形成大的右手性卷曲结构, 称为平行β2螺旋结构, 这便形成了一个非常简单的高度有序的拓扑结构。K amen 等用远紫外、近紫外、荧光技术研究发现, 在pH =7和5时,PelC 在盐酸胍溶液中的伸展是可逆的, 在pH =7
o
时为两态转变且ΔG H 2O =1212kcal Πm ol 。研究指出, 量热法和光谱法是估测蛋白质结构稳定性的两种分析技
Privalov 和K echinashvii 等
[35]
[34]
用C D 、DSC 方法研究AS 248在尿素、盐酸胍
溶液中的化学变性, 发现25℃时它在613m ol ΠL 盐酸胍中发生伸展, 在8m ol ΠL 尿素中不伸展。研究还发
现盐酸胍存在时ΔG w (298K ) 是纯水中和有尿素存在时的2倍, 因为结构的稳定性很大程度上依赖于离子强度, 因此盐酸胍既是变性剂又是稳定剂
[42]
。
除了对尿素与盐酸胍这两种普遍应用的变性剂相互作用的研究外, 对其他变性剂进行应用的研究也有报道。1996年M oosavi 等研究了牛血清白蛋白BS A 和DT AB (dodecyl trimethylamm onium bromide ) 相互作用的变性机理。DT AB 是一种阳离子表面活性剂, 研究发现在DT AB 低浓度, 高温度时, 相互作用焓是吸热的, 且H cal
[44]
[43]
术, 并用实验事实展示了量热法在解决蛋白质复杂体系的独到之处。他们认为在蛋白质变性过程中, 表征两态模型的最重要的热力学参数就是ΔC P , 在蛋白质伸展过程中ΔC P 显著地高, 并且是正值。认为这是由于在伸展过程中暴露的疏水残基和水的相互作用所致。但是, 在解决蛋白质和变性剂相互作用的问题上,1992年以前量热技术并没有
[37][38]
被广泛地应用。1994年Bae 等用HS 2DSC 研究了eglin C (一种小的蛋白质抑制剂) , 发现其变性温Pace
[36]
用等温滴定量热(is othermal titration calorimetry ) 、DSC 等方法研究了牛血清白蛋白BS A 与阳离子表面活性剂DT AB 和阴离子表面活性剂S DS (s odium n 2dodecyl sulphate ) 的相互作用, 结果发现DT AB 和BS A (015wt %) 的混合焓在DT AB 浓度很低时(0—17mm ol ΠL ) 为吸热, 高浓度(17—27mm ol ΠL ) 为放热, DT AB 浓度超过4mm ol ΠL 时, 由于中和了蛋白质的电
荷, 使BS A 完全变性。而S DS 和BS A (015wt %) 的混合焓在任何浓度下都放热, 当S DS 的浓度超过4mm ol ΠL 时, 同样会使BS A 发生完全变性。K ovrigin
度和焓在加入313m ol ΠL 盐酸胍后都有所下降。
[39]
Boulaich 等用滴定微量量热计(titration
和P otekhin
[45]
利用DSC 对用乙腈变性剂时溶菌酶的
第5期卢 雁等 蛋白质变性机理与变性时的热力学参数研究进展・909・
稳定性作了研究, 并充分考虑热容值改变与变性之
间的关系, 发现随着乙腈量的增加, 变性的温度是下降的。他们提出蛋白质的热力学稳定性越高, 则天然蛋白质分子伸展的可能性越小, 由此进一步提出蛋白质的热力学稳定性是一个与天然状态下的蛋白质的真实寿命直接相关的参量, 而ΔC P 值则正可以用来帮助估算一定溶液组成和温度范围内的溶菌酶的热力学稳定性情况。Aboluw oye 等测定了人血红蛋白A (human hem oglobin A , HbA ) 的衍生物在S DS 中的变性, 结果发现HbA 的衍生物在S DS 中的
[46]
值得研究的问题。
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最大稳定性ΔG D (H 2O ) 和最小稳定性ΔG D (H C ) 受pH 值ΔH D 、和温度的影响, 而变性时的热力学参数ΔG D 、ΔS D 则依赖于盐桥、氢键、范德华力、溶剂的变化、反应中心的极性、HbA 衍生物的结构变化、S DS 所在活性位置等因素。
41最新研究进展
将量热方法和各种光谱学技术相结合, 从宏观方面和微观角度全方位地对蛋白质的变性进行研究已成为热点。用Privalov 提出的简单键合模型对量
热数据进行分析, 计算键合常数k 、单个键合自由能Δg 及总的吉布斯自由能ΔG (a ) , 并可以用变性中点的直线外推方法求出表观变性焓ΔH d 。用Pace 等提出的公式分析光谱方法得到的数据, 求出伸展分数f u , 平衡常数K , 伸展吉布斯自由能ΔG u 以及衡量蛋白质对变性剂稳定性的参量ΔG H O , 衡量蛋白
2
质变性协同性的参量m , 以及变性中点D 1Π2, 用多个参数同时表征蛋白质的变性过程, 用多种实验手段对比分析实验结果, 综合地对蛋白质变性机理进行研究势必会取得更好的结果。
三、结 语
随着光谱技术和量热技术的综合应用, 对蛋白质体系的热变性、化学变性的研究在广度和深度上都在不断地拓展, 将会出现更多的理论对蛋白质的ΔG H O 是衡量蛋白质对变性剂稳定变性进行解释。
2
ΔC P 和H cal ΠH v f 值可以作为判断蛋白质的变性的量,
性为两态模型的标准。但是, 由于蛋白质的复杂结构以及不同官能团之间的非共价相互作用, 使用对其测量所得到的热力学数据的分析, 很难像一般化合物那样深入。对于这些生物大分子, 如何从定量的角度找出热力学参数与蛋白质变性机理、稳定性
及结构转变的协同性机制之间的内在联系也是一个
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化 学 进 展
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第17卷
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