治疗性抗体的研究现状与未来_葛良鹏

DOI ：10.13523/j.cb.20130913

中国生物工程杂志China Biotechnology ，2013，33（9）：85-93

治疗性抗体的研究现状与未来

葛良鹏

1，2，3

丁宁

兰国成

邹贤刚

刘作华

1，2，3＊＊

（1重庆市畜牧科学院重庆4024602农业部养猪科学重点实验室重庆402460）剑桥

CB20RE ）

（3养猪科学重庆市市级重点实验室重庆4024604剑桥大学癌症研究所

摘要从全人源化抗体的研究进展，当前治疗性抗体的临床研究现状及未来治疗性抗体发展展

望三方面介绍治疗性抗体的研究现状，分析未来发展趋势。首先比较了不同方式生产的全人源化抗体及其与部分人源化抗体之间的差异，详细阐述了噬菌体展示技术和转基因技术两种全人源化抗体生产关键技术的研究进展，各自的优势、不足及今后的发展方向; 然后分析探讨当前治疗性抗体的临床现状、治疗性抗体的作用机制、治疗性抗体研究中靶抗原选择以及目前治疗用抗体生产和临床应用方面面临的关键技术问题; 最后对未来治疗性抗体发展进行展望分析，指出小Fc 改造抗体、型化抗体、免疫偶联物、双功能抗体、细胞内抗体、抗体糖基化改造及治疗性多克隆抗体将是未来抗体的重要发展方向。关键词

治疗性抗体

Q511

间的差异1．1

［7-8］

全人源化抗体噬菌体展示抗体

中图分类号

自1986年第一个治疗性抗体进入临床以来，治疗性FDA 共批准45个抗体得到了迅速的发展，截止2012年，治疗性抗体，其已成为现代生物医药的重要组成部分。伴随现代科技的发展，治疗性抗体经历了鼠源性抗体，嵌改性抗体和表面重塑抗体（部分人源化抗体），以合抗体，

及全人源化抗体等不同发展阶段

［1-6］

。

generating 噬菌体展示抗体（phage display-antibody ）

1990年McCAffery 等［9］首次证明抗体DNA 片段可

在噬菌体表面展示，随后利用噬菌体来进行基因工程抗体的研究取得了长足的进展。噬菌体展示抗体技术是将通过PCR 扩增出淋巴细胞中整套编码人抗体的基克隆到噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式表因序列，

达到噬菌体表面，再通过表型筛选确定抗体的基因型，并利用噬菌体的DNA 突变特性获得大量的突变体，再通过基因工程技术获得特异的全人源化抗体。利用这一技术目前已成功构建了多个不同类型的scFv ，Fab 和sdAb 抗体文库，用于人源化抗体的研究开发

［10］

。全人源化抗体因

全部由人类基因编码的蛋白组成，其免疫原性小（副作用临床药效好，是当前和未来抗体工程的主要发展方小），

向。本文重点对全人源化抗体研究现状进行分析，并对未来治疗用抗体的发展趋势进行展望。

1全人源化抗体研究进展

全人源化抗体是指全部由人类抗体基因编码而成

的抗体，克服了鼠源抗体和部分人源化抗体含有异种是当前研究和应用最为广泛的抗体类型。蛋白的问题，

目前生产全人源化抗体主要有噬菌体展示重组人抗体文库技术和转基因动物技术两种方法，表1分析了不同方式生产的全人源化抗体及其与部分人源化抗体之

05-1607-10收稿日期：2013-修回日期：2013-*国家国际科技合作专项（S2013ZR0398）、重庆市基础与前沿研

究（cstc2013jcyjC80001）、重庆市农发资金（12402）资助项目＊＊通讯作者，电子信箱：liuzuohua66@163．com

。该

技术能够绕过免疫动物和细胞融合等过程，并能通过抗体片段的克隆选择，理论上能够分离得到几乎所有抗原的人源性抗体，但在实际研究过程中，抗体的亲合力和抗体库的容量问题是影响噬菌体展示技术应用的重要因素。

为提高噬菌体技术生产的抗体的亲合力，早期大多采用经抗原免疫的淋巴细胞进行基因扩增以获得高亲合力抗体，但获得经免疫的人淋巴细胞存在伦理和技术障

PBL-SCID 嵌合体小鼠技术，碍，最近利用Hu-直接将人PBL ）移植给SCID 小鼠，的外周血淋巴细胞（Hu-经抗原刺激后，再分离人的淋巴细胞经噬菌体展示技术获得高可解决无法对人类直接进行抗原免疫的亲和力的抗体，难题

［11］

因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的

［8］

。利用转基因动物

生产全人源化抗体相比其他技术具有十分明显的优势：利用一种人源化抗体动物品系可以针对不同抗原产生不同的抗体，无需针对每种抗体进行一对一的改造，使得抗体生产成本减少，开发周期缩短。此外在紧利用转基因动物在短时间内可以生产大量急状况下，

的特异抗体（如：SARS 和H1N1病毒抗体），在保障公共卫生安全方面具有重要的作用和意义。此外，由于突变和筛选，利用该方法经历了动物体内的基因重排，

易获得高亲合力的抗体。但其不足之处是是培育人源化转基因动物技术难度大，周期长，费用高。

编码抗体的基因包括抗体重链基因和轻链基因，轻Ig λ/Igк在血在小鼠中，链基因又分为к轻链和λ轻链，

Ig λ/Igк约为40∶而在人类血清中，清中比例约为5∶95，

60。理论上，只要在小鼠体内导入人抗体重链和轻链基因，就能在小鼠中表达出人类抗体，但小鼠内源性抗体基因此培育人因的存在会抑制人抗体基因的重排和表达，

源化抗体转基因小鼠至少需要对动物基因组进行至少四种修饰：即小鼠IgH 和Ig к基因座的基因敲除，人IgH 和Ig к基因座的转基因表达。此外，尽管小鼠Ig λ在血清中但如果要排出这部分抗体的干扰，也必须对小仅占5%，

而人的Ig λ约占血清抗体的鼠Ig λ基因座进行基因灭活，

40%，因此要在小鼠中表达人的Ig λ，则必须在人源化抗体转基因小鼠中同时转入人Ig λ基因座。

1989年，Bruggemann 首先报道人类抗体基因能在转基因动物体内进行重排和表达，证明了利用转基因动物生产人类抗体的可行性

［21］

。噬菌体展示技术的一个重大技术局限是真核

生物的基因很难在原核生物中得到完全表达，外源基因因此其获得高亲合力抗体和针对稀有抗原的转化率低，

同时噬菌体展示技术难以使抗体抗体的机率相对要低，

获得正确的折叠和表达后修饰，其产生的大多数抗体是只有5%左右的抗体以融合抗体形以包涵体形式出现，

式存在并进行正确的折叠。为克服上述技术障碍，在噬菌体展示技术基础上又发展了一系列新的展示技术如真RNA-核糖体展示技术、多肽融核酵母菌表面展示技术、

合技术等，利用上述技术，可使抗体亲合力获得数千倍的并实现正确的折叠和翻译后修饰提升，

［15］

为噬菌体文库的0．1%～1%。

［12-14］

。但酵母等

真核生物的展示文库容量相对较小，通常为10～10，仅

抗体文库的容量是影响噬菌体展示技术制备全人源化抗体的另一个关键问题。只有抗体库的库容（多样性）足够大，才能更好的在体外模拟体内对于不同抗原的反应而获得特异性抗体。影响抗体库容的因素很其中最为重要的是抗体重链和轻链的连接问题。多，

cre 酶介导的轻重链连接技目前细胞内PCR 装配技术、

术，双载体共转染技术以及CDR 步行技术等广泛用于抗体重链和轻链的连接研究，以增加抗体的多样性。此外，利用近年来出现的基因深度测序技术，可以集合数百人脐带血形成抗体可变区基因池，以此来开发抗体展示文库，可以最大限度的在体外展现抗体可变区基因特性

［16-19］

，Nils 随后在1994年，

。Lonberg 小组和Green 小组分别成功培育出了能生产全人源化抗体的转基因小鼠（小鼠内源性抗体重链和к轻链基因敲除，同时转入了人抗体重链和к轻链基因）

［22-23］

在临床研究方面，利用噬菌体技术目前共开发了35种不同的治疗性抗体。10个已完成临床试验的抗体中有3个获得FDA 批准（adalimumab ，raxibacumab ，belimumab ），通过率30%，另外还有3个处于I 期临床，19个处于II 期临床，3个处于III 期临床。噬菌体技术生产的单克隆抗体在I 期到II 期以及II 期到III 期的临床分期间的转化率相对较高，但从III 期临床到市场要低于用转基因动物技术生产准入的比例约为50%，的抗体1．2

［20］

。抗体基因结构复杂性和基因片段超大性是

人源化抗体转基因动物培育的主要技术障碍，人IgH Ig κ轻链约1800kb ，Ig λ轻链约重链约有1300kb ，

900kb ，是一般转基因动物目的基因的200～500倍，因此要在体外获得如此之长的基因片段并将其完整导入实现稳定遗传具有较高的技术难度。目到动物体内、

前主要利用小鼠胚胎干细胞技术，BAC 和YAC 技术相结合培育人源化抗体转基因小鼠，另外，利用核移植技术也成功获得全人源化抗体转基因牛

［24］

。

转基因动物全人源化抗体（transgenic humanized antibody ）

转基因动物生产全人源化抗体是指通过转基因或

。由于人源化

抗体转基因动物培育技术要求较高，截止目前，全球仅有五家单位成功培育出能生产全人源化抗体的转基因

转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基

动物：分别是Dr．Marianne Bruggemann 实验室培育的BABmouse 小鼠品系［25］，Abgenix 公司培育的XenoMouse 小鼠品系［26］；Medarex 公司培育的UltiiAb 小鼠品系因牛

［24］

［22］

BAC 和YAC 载体究工作。通过利用小鼠胚胎干细胞、

技术，目前已分别成功获得了抗体轻链基因敲除小鼠和转人轻链的转基因小鼠，同时正在开展抗体重链基因敲除小鼠和转人重链链的转基因小鼠培育工作，有望使我国在人源化抗体转基因动物培育方面取得重要为我国全人源化抗体的研发提供核心工具动物。突破，

利用转基因动物目前共开发了56种治疗性抗体，主要针对肿瘤、免疫疾病及抗感染治疗。在已完成的21个临床试验的抗体中，7个获得FDA 批准（panitumumab ，golimumab ，canakinumab ，ustekinumab ，ofatumumab ，denosumab ，Ipilimumab ）。相对于其他抗体开发技术，转基因动物技术开发的抗体在II 期到III 期以及III 期到批准上市的转化率较高

［29］

；Regeneron 公司培养的Velocimmune 小

鼠品系和日本Kyowa Hakko Kirin 培育的全人源化转基

，其他抗体研发公司基本上都是与以上单位进

行合作利用转基因动物研制人源化抗体。此外，Therapeutic Human Polyclonals Inc （THP ），Ablynx ，OMT ，Origen Therapeutics ，revivicor 公司等目前也在利用兔、骆驼、大鼠、鸡和猪开展人源化抗体转基因动物的研究

［27-28］

。

国内方面，重庆市畜牧科学院通过与国内外专家合作条件下，正在进行人源化抗体转基因动物方面研

表1

Table 1

人源化抗体

方法

CDR 移植和表面可变区嵌合、

氨基酸修饰。

1．可用已有的动物源性抗体进行改造。

2．用成熟DNA 技术和蛋白质技术对抗体进行改造。3．技术成熟。

1．动物部分蛋白质的免疫反应（即副作用大，不宜长期和多次使用）；

2．只能一个一个地改造。

转基因动物

。

人源化抗体和全人源化抗体的比较

Comparison of humanized antibody and fully humanized antibody

全人源化抗体

噬菌体展示

1．用已有的人源抗体细胞或人的淋巴细胞进行改造。2．技术成熟。

3．可以与转基因小鼠的平台结合。

优点

1．可以从一个人源化抗体小鼠品系可以获得多个单克隆抗体。

2．可从动物血液中直接提取人免疫球蛋白，在紧急状况

在短时间内生产大量的特异抗体（如：SARS 和H1N1下，

病毒抗体）。

3．在全人源化抗体转基因动物平台建立后，抗体开发的周

成本少。期短、

人源化抗体转基因动物研究阶段的投资大，时间长，一般10年左右。需要5-

缺点

1．噬菌体展示能力有限，抗体

亲和力不高；

2．只能一个一个地改造。

2．1

治疗性抗体的临床研究现状

治疗性抗体临床概况

IMGT 网站（http ：//www．imgt．org /mAb-DB /index）

前FDA 和SFDA 批准的治疗性抗体及其应用范围。2．2

治疗性抗体的作用机制

目前进入临床研究阶段的抗体包括经典的抗体，小型化抗体以及药物偶联抗体等各种不同的形式，其主要通过以下五种不同的机制发挥治疗作用：1）配体阻断：如全Infliximab ，Adalimumab ，Certolizumab pegol ，Etanercept 等通过与配体结合，阻断配体与细胞表面的受体相结合产生抗体治疗作用；2）受体阻断：与配体阻断的作用机制类似，通过与细胞表面受体结合，产生占位效应，从而组织患者体内配体与受体的结合，目前临Efalizumab 等抗体就是采用这一床使用的Toclizumab ，

作用原理；3）受体下调：Omalizumab 等抗体即通过与细胞表面受体结合，形成抗原抗体复合物，促进细胞表面的受体内化，从而降低细胞表面的受体密度起到治疗的作用；4）靶细胞删除：如Muromonab 等抗体通过抗体或补体介导的细胞毒作用直接清除靶细胞，

收录了目前大部分治疗性单克隆抗体的临床试验信共收录鼠源性抗体70个（小鼠来源的息。截止目前，

68个，大鼠来源的2个），嵌合抗体37个，人源化抗体172个，全人源化抗体149个。其内容涵盖了抗体的基靶抗原、临床信息、适应症等多个方面。通过本特性、

对数据库资料的统计分析，发现肿瘤，免疫相关疾病（器官移植，自身免疫性疾病）及感染性疾病（慢性病毒感染、炭疽等）是目前抗体治疗的主要适应症，此外针对骨质疏松，呼吸系统疾病，眼科疾病，肌营养不良，阿兹海默综合征及疼痛等的抗体治疗也是近年研究热点。FDA 共批准了45个治疗性抗体，截至2012年底，中国SFA 批准了17个治疗性抗体，表2和表3分别列出了目

Tositumomab 等抗体通过抗体偶联药物直接杀灭靶细胞；5）信号诱导：如Teplizumab 等抗体通过与T 细胞受CD3结合，体复合物TCR-可诱导TCR-介导的信号传递，从而改变T 细胞的分化和功能，达到治疗目的。需一种抗体可能会利用不同的作用机制来要注意的是，达到治疗的目的2．3

［30］

选了一批在靶细胞表面高表达以及与疾病发生发展相关的突变基因作为抗体治疗新靶点，如针对肿瘤治疗的EGFRvIII ，MET ，CTLA4和FAP 等2．4

［31］

。

目前治疗用抗体面临的主要问题

治疗性抗体是近30年来生物医药发展最快的领

。域，但目前在研发过程中仍然存在一些问题需要不断改进完善。一是目前治疗性抗体的工业化生产的产能生产成本较高，限制了抗体的临床应用。涉及工有限，

业化生产的大规模细胞培养、抗体纯化和抗体生产质量控制技术有待进一步提高。二是确切可用的作用靶点有限，以及靶抗原的异质性，限制了新的治疗性抗体的开发，需要利用新的技术和方法寻找新的抗体作用靶点。三是抗体的药代动力学问题。为维持高的血药目前抗体药物的使用剂量一般为5～20mg /kg体浓度，

重，但到达一些实体肿瘤中的抗体药物浓度仅为0．001%～0．01%，因此延长抗体药物的半衰期，增加减少在非靶组织中蓄积等是抗体在靶组织中的浓度，

需要重点解决的问题，其对改善抗体药物的安全性和有效性意义重大。此外，由于常规抗体分子量较大，不能通过血脑屏障，而一些小分子抗体片段在体内的半衰期较短，因此开发中枢神经系统等一些特殊作用部同时口服性等非注射位的抗体面临重大的技术挑战，类抗体也是目前抗体药物需要关注的内容

［30］

靶抗原的选择

抗体治疗的效果（安全性和有效性）与靶抗原的选

择密切相关。理想的靶抗原应该在靶细胞表面高效特异性表达，且分泌量较小，以避免抗原在血液中与抗体结合从而减少抗体与肿瘤细胞的直接作用。但不同作用机制的抗体对靶抗原的选择也存在不同的要求，如利用补体或抗体依赖的细胞毒作用进行治疗的抗体，希望抗原抗体复合物能在靶细胞表面长期存在，而通过抗体介导药物治疗则希望抗原抗体复合物能快速内化到靶细胞内。目前靶抗原的研究主要集中在以下几个方面：细胞表面抗原决定簇（如CD20，CD30，CD33，CD52等），生长因子或生长因子受体（如CEA2，EGFR ，ERBB2，ERBB3

，MET ，IGF1REPHA3，

TRAILR1，TRAILR2，RANKL 等），血管生成相关因子（如VEGF ，VEGFR ，integrin αV β3，integrin α5β1等）Tenascin 等）。近年来利用及细胞外基质抗原（如FAP ，

血清学、基因组学、蛋白组学及生物信息学数据库，筛

表2

Table 2

年份[1**********]5

抗原CD3Glycoprotein II Glycoprotein EpCAM

CD20

1997

CD25CD25RSV F protein

[**************]2

TNF-α

HER2TNFr2-Fc CD33CD52CD20TNF-αCD20

2003

IgE-Fc CDll αCD2

。

FDA 批准的治疗性抗体

Therapeutic antibodies approved by FDA

抗体名称Muromomab Abciximab Edrecolomab Rituximab Daclizumab Basiliximab Palivizumab Infliximab Trastuzumab Etanercept Gemtuzumab Alemtuzumab Ibritumomab （放射线标记）Adalimumab Tositumomab （放射线标记）Omalizumab Efalizumab Alefacept

抑制器官急性排斥

抗血液凝固

直肠癌（效果不明显，取消销售）淋巴瘤，器官移植，自身免疫。器官移植器官移植

人呼吸道合胞病毒自身免疫乳腺癌自身免疫急性髓系白血病淋巴瘤

淋巴瘤，器官移植，自身免疫自身免疫

淋巴瘤，器官移植，自身免疫严重哮喘

银屑病（效果不明显，取消销售）银屑病

应用范围

续表2

年份2004

抗原EGFr VEGF Q a 4-Integrin EGFr

抗体名称Cetuximab Bevacizumab Natalizumab Nimotuzumab Abatacept Tocilizumab Ranibizumab Panitumumab Eculizumab rilonacept romiplostim tocilizumab certolizumab Catumaxomab Ustekinumab Rilonacept Romiplostim Certolizumab Belatacept Motavizumab Raxibacumab Belimumab Ipilimumab Brentuximab mogamulizumab pertuzumab raxibacumab

直肠癌，头颈癌各种癌症

应用范围

多发性硬化症和克罗恩病

头颈癌，神经胶质瘤和恶性星形细胞瘤等关节炎关节炎

各种癌症头颈癌，神经胶质瘤和恶性星形细胞瘤等阵发性睡眠性血红蛋白尿

家族性寒冷自身免疫综合征；穆克勒阱综合征和新生儿多系统炎症性疾病发病增加血小板自身免疫自身免疫

抑制器官急性排斥银屑病

家族性寒冷自身免疫综合征；穆克勒阱综合征和新生儿多系统炎症性疾病发病慢性淋巴细胞白血病骨质疏松，关节炎和骨癌组织和细胞移植人呼吸道合胞病毒炭疽病

系统性红斑狼疮转移性黑色素瘤

霍奇金淋巴瘤和复发性间变性大细胞淋巴瘤白血病乳腺癌炭疽

2005

CD80和CD86

Il-6r VEDF-αEGFr C5IL-1R1

20062007

2008

thrombopoietin receptor

IL-6R TNF CD3IL-12和IL-23

2009IL-1B CD20RANKL CD80RSV F Bacillius anthracis

BLyS

2010

2011CTLA-4CD30CCR4

2012ERBB2PA

表3

Table 3

抗体名称

[***********]4

鼠抗人CD3单抗Rituximab Daclizumab 鼠抗人CD3单抗8单抗乳膏抗人IL-Trastuzumab Basiliximab Cetuximab

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体

－抗体融合蛋白（益赛普）131I ］肿瘤细胞核人鼠嵌合碘［

单克隆抗体注射液（唯美生）131I ］美妥昔单抗注射液（利碘［卡汀）

Infliximab /RemicabeNimotuzumab （泰欣生）Bevacizumab

中国SFDA 批准的治疗性抗体

Therapeutic antibodies approved by SFDA

生产厂家

古巴CIMAB S A Roche /GenentechRoche /Genentech武汉生物制品研究所东莞宏远逸士生物技术药业有限公司Roche /GenentechNovartis

Merck /ImCloneLLC 上海中信国健上海美恩生物

第四军医大学/成都华神集团

Johnson＆Johnson百泰生物药业有限公司Roche

抗体类型鼠源嵌合人源化鼠源鼠源人源化嵌合嵌合人源化嵌合鼠源嵌合人源化人源化

批准年份[***********][***********][***********]10

应用范围

器官移植非霍奇金淋巴瘤器官移植器官移植牛皮癣乳腺癌器官移植结肠癌

类风湿性关节炎肺癌肺癌

类风湿性关节炎，强直性

克罗恩氏病脊柱炎，结肠癌转移性结肠癌

续表3

抗体名称

151617

Adalimumab Etanercept

生产厂家

Abbott Amgen 上海中信国健

抗体类型人源化全人源化人源化

批准年份[1**********]1

应用范围

类风湿性关节炎慢性类风湿性关节炎，强

牛皮癣直性脊柱炎，器官移植

重组抗CD25人源化单克隆抗体

注射液（健尼哌）

3．1

未来治疗性抗体展望分析

小型化抗体

小型化抗体是指利用遗传工程技术制备的重组抗

3．2．1免疫偶联物（immunoconjugates ）将化疗药物、

毒物、放射性核素、酶、活性多肽等对具有强大的杀伤作用细胞毒性物质与抗体或抗体片段偶联可制备多种免疫偶联物或抗体融合蛋白。免疫偶联物目前主要用于肿瘤治疗，其能利用抗体的特异性识别抗原的特点，将治疗药物精确输送到肿瘤组织，因此相对传统的化疗药物，效果更好，毒副作用更低。目前至少有10余并且有3种免疫偶种抗体偶联物进入临床试验阶段，

联物（ibritumomab tiuxetan ，tositumomab ，gemtuzumab ozogamicin ）获得批准进入临床使用，尽管抗体偶联物原理简单，但实际研究过程还面临诸多的技术挑战，如偶联药物在传递到靶细胞之前面临的降解问题，偶联抗体的药代动力学和生物分布问题，药物和抗体的结合以及偶联可能造成的干扰抗体与靶抗原结合的问题，

药物不能有效释放的问题等。需要重点研究3．2．2

双功能抗体（bispecific antibodies ）

［38］

原结合片段，也称之为治疗性抗体片段（therapeutic antibody fragments ），binding 包括抗原结合片段（antigen-Fabs ）和单链可变片段（single-chain variable fragments ，

fragments ，scFvs ）［32］。这类抗体可以通过定向修饰改变抗体的粘附性、免疫原性、半衰期及免疫机制，此外还可设计能同时结合两种不同抗原的双向抗体片段，通过其可实现肿瘤和免疫细胞的相互连接，实现肿瘤的免疫治疗

［33］

。小型抗体也可以通过改变或去除重链恒

定区的第一个外显子来实现（单一重链抗体（heavy-chain-only antibody ），参考了骆驼的单一重链抗体的特经过基因工程改征而实现）。人的免疫球蛋白重链，

造，改变或去除重链的恒定区（包括C γ/Cμ）第一外显子，这样表达的重链就缺少恒定区的第一外显子，重链的分子量减少，并且不与轻链结合，形成单链抗体

［34］

。

双特异性

抗体是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，其能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤和炎性疾病的免疫治疗中具有广阔的应用前景。根据组合类型的不同，双功能抗体可分为双特异性微抗体，双链抗体，单链双价抗体以及多价双特异性抗体．Blinatumo-mab 是目前研究其利用CD19和CD3作最为成功的一个双功能抗体，

为靶抗原，用于非霍奇金淋巴瘤的治疗，目前已进入临其最大优点是使用仅为传统抗体药物的万分床II 期，

之一，但在体内的半衰期很短，需要使用微泵系统精确控制药物的注射剂量。双功能抗体需要精确的连接设计以保留原始单体状态的抗体效价。同时如何提高双特异性抗体在体外细胞生产过程中的表达量、纯化和以及改善双功能抗体的溶解性、稳定性，聚回收效率，

将是未来双功集性及半衰期等理化和药代动力特性，能抗体重点研究方向3．2．3

［30］

。

由于其分子片段较小，容易快速抵达组织和肿瘤在间隙压的作用下易聚集在血管壁周围形成的内部，

结合位点屏障（binding site barrier ），此外，其可以结合全尺寸大小抗体不能结合的隐藏的抗原决定簇，包括免疫回避的病原糖蛋白以及酶活性口袋

［35-37］

。不足之

易被肾脏清除，难以达到药物作用的处是半衰期较短，

必须浓度，此外由于缺少Fc 段，不能介导抗体依赖性细胞毒作用和补体依赖性细胞毒作用。目前共开发了54个治疗性抗体片段，其中30个为Fabs （56%），19个是scFvs （35%），另外5个为小型化抗体（9%）。其中的3个已获得FDA 批准，一个获得中国SFDA 批准（Licartin ），19个（35%）正在进行临床试验，31个已终止试验（57%）3．2

［20］

。

功能优化的抗体

优化抗体功能分为抗体结合功能优化和抗体效应

。

细胞内

细胞内抗体（Intracellular antibodies ）

具体包括免疫偶联物，双功能抗体，抗体Fc 功能优化，

突变，细胞内抗体，改变抗体糖基化等。

抗体是指细胞内合成并作用于细胞内组分的一类新的工程抗体，它们能在细胞内表达并被定位于胞核、胞浆

或细胞器等亚细胞区室，与特定的靶分子作用，发挥生物学功能。作为一种新的基因治疗手段，主要应用在1复制、抑制病毒复制特别是HIV-肿瘤基因治疗、老年痴呆症等方面

［19］

期

［41］

。

抗体的糖基化

糖基化是蛋白质的一种重要

3．2．5

的翻译后修饰，对抗体的结构和功能有重要影响。正常人单克隆抗体的糖基化发生在抗体重链Fc 片段的第297位天门冬氨酸位点上，不同的低聚糖在该位点通过影响Fc γRI ，与抗体结合形成不同的蛋白糖基，

Fc γRII ，Fc γRIII 和c1q 的作用位点空间结构而产生不同的抗体效应。多克隆抗体除了在Fc 片段的第297位还有约30%的多天门冬氨酸位点上存在糖基化修饰，

克隆抗体在Fab 区也存在糖基化修饰。抗体的糖基化CDC ）以外，除了影响抗体效应功能（ADCC ，最近研究发现不含岩藻糖的抗体可以产生更强的ADCC 作用，还对抗体的稳定性和溶解性产生影响。重组基因工程NS0和Sp2/0等几个细胞系抗体目前主要利用CHO ，

3）半乳进行生产，这些细胞能产生人类所没有的α（1-3）N-糖和α（2-羟乙酰神经氨酸连接，而且可以在单克隆抗体的Fab 区产生类似于多克隆的糖基化修饰，因此利用未经改造的上述细胞系生产的抗体在临床应用中具有潜在的免疫原性和其他副作用的风险。目前抗体糖基化改造主要依赖细胞工程和糖基化工程两项关键技术。细胞工程主要是对生产抗体的细胞系的糖基化酶系统进行改造，如lonza 公司开发的删除了岩藻糖K1细胞系，转移酶的CHO-用于生产不含岩藻糖的抗体。而蛋白质糖基化工程是针对蛋白质表面的糖链进添加或删除不同的糖基化基团，如Roche 公司行改造，

开发的Glycart 技术也可以生产不含岩藻糖的抗体。总之，抗体的糖基化修饰为抗体产业的发展提供了一个通过糖基化改造，将会产生一系列重要的机遇和挑战，

符合临床要求的新型抗体药物3．3

重组多克隆抗体

目前治疗性抗体的重点放在单克隆抗体上，导致多克隆抗体的治疗价值被忽视。实际上，多克隆抗体今天仍广泛用于病毒和毒素的中和，如地高辛中毒，蛇以及免疫球蛋白缺乏症患者的替代治毒和蜘蛛毒等，

疗。过去20年的临床使用表明，多克隆抗体在许多疾病中都表现出较好的免疫调节和抗炎作用。此外，多克隆抗体具有可大量生产，能识别多个抗原表位，对复杂靶抗原的治疗效果好，对于易变的抗原也能有效等优点，将是未来治疗性单克隆抗体的重要补充

［44］

［42-43］

。目前主要通过三种技术途径实现细

胞内抗体表达，一是移植经过体外遗传改造的自体细胞，二是微囊化的转导细胞，三是直接注射携带抗体基如腺病毒、腺相关病毒以及慢病毒等。整合因的载体，

而利用位点病毒介导抗体基因存在插入突变的风险，

特异性整合和非整合性病毒则可降低这种风险。此以非分裂细胞如肌肉细胞作为靶细胞可延长抗体外，

基因的体内表达时间。3．2．4

抗体Fc 改造

抗体Fc 段包括Fc γR 和FcRn

两个不同区域。Fc γR 主要介导ADCC 和CDC 作用，而FcRn 主要与抗体的药代动力学密切相关。针对Fc γR 的改造分为两个方面，一是增强抗体介导的效应功能，即提高抗体介导的ADCC 和CDC 作用，另外在一些自身免疫性疾病和炎性疾病的治疗过程中，只需发挥抗而抗体的效应作用是不需体阻断配体受体结合作用，

要的，甚至会引起副作用，针对这种类型的抗体，则需要对Fc γR 进行改造以降低或灭活抗体的效应功能。目前Fc γR 改造主要有三种技术方法：1）点突变技术。如teplizumab 利用点突变技术将234位和235位的亮otelixizumab 将297位的天冬氨酸氨酸突变为丙氨酸，

突变为丙氨酸降低抗体的效应功能。利用计算机辅助设计和噬菌体展示技术相结合，可用于Fc 片段点突变的改造和筛选，利用这一技术，已发现将239位丝氨酸330位的谷氨酸突变为亮氨酸，突变为天冬氨酸，以及332位的异亮氨酸突变为谷氨酸可将抗体介导的ADCC 作用增加100倍左右［30］。2）不同亚型的IgG 杂交改造技术。如eculizumab 就是将IgG2和IgG4的恒定区进行杂交，将IgG2的CH1区和IgG4的CH2和CH3区进行融合以灭活Fc γR 片段对补体的结合和活化作用

［40］

。

。3）Fc 片段的糖基化改造。如增加Fc 段N-

乙酰葡糖胺的修饰和降低Fc 段的岩藻糖含量均可增加抗体介导的ADCC ，针对FcRn 的改造主要是为了增加抗体的稳定性，延长抗体在体内的半衰期。采用点突变技术将250位的苏氨酸突变为谷氨酰胺，将428位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，可增加人抗体FcRn 和人IgG 在酸性条件下（pH6．0）的粘附性，而不改变在中性条件（pH7．4）下的粘附力，因此可逃避细胞内涵体介导的清除作用，延长抗体半衰期。此外，利用PEG 修饰技术和连接一些半衰期长的白蛋白也可延长抗体的半衰

。

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Nature

Current Situation and Prospects of Therapeutic Antibody

2，3

GE Liang-peng 1，

DING Ning 1LAN Guo-cheng 4ZOU Xian-gang 42，3

LIU Zuo-hua 1，

（1Chongqing Academy of Animal Sciences ，Chongqing 402460，China ）

（2Key Laboratory of Pig Industry Sciences ，Ministry of Agriculture ，Chongqing 402460，China ）

（3Chongqing Key Laboratory of Pig Industry Sciences ，Chongqing 402460，China ）（4Cancer Research UK /CambridgeResearch Institute ，Cambridge

CB20RE ）

Abstract The paper reviewed the current situation and prospects of human therapeutic antibodies in the

aspect of the progress of fully humanized antibody ，the clinical research situation and future development of therapeutic antibody．Firstly ，we compare the difference between fully humanized antibody and humanized antibody ，and introduce the progress ，advantage and disadvantage ，and develop direction of fully humanized antibody produced by Phage Display technology and transgenic animal technology in detail．Then we also discuss several key technical problems of therapeutic antibodies in clinic research ，including the current clinic research situation ，therapeutic antibodies mechanism ，the choice of target antigen ，and challenge in antibodies production and application etc．Finally ，we outlined the future trends for therapeutic antibody development in small therapeutic antibody ，immunoconjugates ，bispecific antibodies ，Intracellular antibodies ，Fc-modified antibody ，antibody glycosylation and polyclonal antibody．

Key words

Therapeutic antibody

Humanized antibody

Plage display-generating antibody