《细胞生物学实验》指导
一、实验课名称：细胞生物学实验 Experiment of Cell Biology
二、实验课性质：独立设课
三、适用专业：生物技术和水产养殖
四、采用教材及参考书：
教 材：安利国主编．细胞生物学实验教程．北京：科学出版社，2004
参考书：1. 杨汉民主编．细胞生物学实验（第二版）．北京：高等教育出版社，1997.7
2. 徐承水，党本元主编．现代细胞生物学技术．青岛：青岛海洋大学出版社，1995
3. 王金发主编．细胞生物学实验教程．北京：科学出版社，2003
五、学时学分：课程总学时：36； 课程总学分：1
七、实验课考核方式：
1.实验课考核成绩确定：本课程考核成绩由平时成绩（占30%）、实验报告成绩（占30%）和终期考核成绩（占40%）三部分构成。
2.平时成绩确定：由任课教师根据实验操作、问题回答和出勤情况确定，按A（优）、B（良）、C（及格）、D（不及格）四个等级评分。
3.实验报告成绩：本课程要求学生实验报告应包括以下内容：①实验目的及原理：简明；②方法与步骤：具体操作步骤、注意事项等；③结果：详细每一步的结果以及计算方法和计算结果；④分析与讨论：根据所学知识对结果进行分析讨论，阐明所得结果说明了什么问题；如果结果与理论不符，应说明可能的原因。实验报告成绩由任课教师根据学生实验报告写作是否符合规范要求、试验结果及分析的具体情况给出。每次报告均按A（优）、B（良）、C（及格）、D（不及格）四个等级评分，实验报告成绩为各次报告成绩的平均值。
4.终期考核成绩：实验课结束后进行笔试、口试或现场操作考核，按A（优）、B（良）、C（及格）、D（不及格）四个等级评分。
实验项目
实验一、显微镜的技术参数及特殊光镜的演示实验
一、要求：了解普通光镜及各种特殊光镜的构造、成像原理及应用；掌握正确的使用方法；理解显微镜的技术参数和特殊光镜的结构特点；掌握实验报告的写法。
二、实验内容：
普通光学显微镜的结构及技术参数：由光学和机械两大系统构成。
1、光学系统及成像原理：
（1）光学系统的构成：物镜、目镜、聚光器、光源部件等
（2）成像原理：根据透镜成像的原理，对微小物体进行放大（二次成像）。当被检物体放在物镜前方的1－2倍焦距之间，光线通过物镜在镜筒中形成一个倒立的放大实像，这个实像恰好位于目镜的焦平面之内，通过目镜后形成一个放大的倒立虚像。通过调焦装置使A2B2落在人眼睛的明视距离（25mm）处，使眼睛看到的物体最清晰。
2、机械系统：（从下往上）
（1）镜座－位于最底部，是整台显微镜的基座，用于支持和稳定镜体。有的在镜座内装有照明光源；
（2）载物台－也称镜台，位于物镜转换器下方的方形平台，用于放置被观察的玻片标本。中央有圆形的通光孔，来自下方的光线经此折射到标本上。
（3）镜臂－支持镜筒和镜台的弯曲状结构，是取用显微镜时握持的部位。
（4）调焦螺旋－调节焦距的装置，可使载物台升降，调好焦距，使物像呈现在视野中。
（5）物镜转换器－装载不同放大倍数的物镜。转动旋转盘可使不同物镜达到工作位置（与光路合轴），使用时注意凭手感使所需物镜准确到位。
（6）镜筒－上端装有目镜，下端与物镜转换器相连物镜转换器。
3、显微镜的技术参数：
（1）分辨率（resolution）：指在25CM的明视距离处能区分开被检物体上两个相近质点的最小距离（显微镜能将邻近的两个质点分辨清楚的能力）。
R=0.61λ/N.A =0.61λ/n·sin(α/2) λ-照明光线波长； N.A－物镜的数值孔径；n为介质的折射率；α为镜口角。
思考：如何提高显微镜的分辨能力？
通常2θ最大值可达140°，θ角最大为70， Sin70°=0.94；λ一般0.45μm（蓝色光），由公式可知当λ和Sin值均不变时，介质折射率n越大，能区分的二点之间的距离就越短，物镜的分辩率越好。
n=1（空气中），分辨率R=0.29um；
n=1.52（油镜下）R＝0.19um，油镜下分辨率更好。R=0.2um 光镜的分辨极限
（2）放大率：放大倍数。M=Mob×Moc = △/f1×250/f2 Mob－物镜放大倍数；Moc－目镜放大倍数；△－光学筒长（单位：mm）； f1－物镜焦距（mm）；250－明视距离（mm）；f2－目镜焦距(mm).
物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的，镜筒长度的变化不仅导致放大率的变化，而且成像质量也受到影响。因此，显微镜的镜筒长度是一定的。适宜的总放大率是所用物镜数值孔径的500－1000倍，在此范围内称为有效放大倍数。
（3）清晰度：显微镜形成轮廓明显物像的能力。影响物像清晰度的主要因素是物镜。同一光学系统中，放大倍数越高，像差就越大。要提高物像的清晰度，必须使用高数值孔径的物镜，并匹配低倍的目镜，而不应单纯增加目镜的放大倍数。（盖玻片的厚薄都会导致光学筒长的变化，国际同一标准盖玻片厚度为0.17mm）
（4）焦点深度：当显微镜对标本的某一点或平面聚焦时，焦点平面上下物像清晰的距离或深度。T=K·n/M·NA M-显微镜的总放大倍数；K-常数，约等于0.24；n=被检测物体周围介质的折射率；NA=物镜的数值孔径
4、显微镜的使用：（以普通光学显微镜为例，严格按照正确的操作规程进行）
注意事项：
1、使用前一定要检查上一组的同学是否规范的放置好显微镜：断电源、开关处于关的状态、视场光阑最小、载物台位置是否处于最低的状态、任何物镜都不与光路合轴。如果放置规范，可以进行后续的操作，否则，请按照上述要求调整显微镜的状态；
2、光路合轴－将照明光束与显微镜的光轴调整到同一轴线上，使光源均匀的照明视场。具体操作：转动聚光器的升降旋钮，把聚光器升至最高位置。打开电源灯开关，将标本放置在载物台上，用低倍镜聚焦。缩小视场光阑，在视场中可见边缘模糊的视场光阑图像，稍微降低聚光器，到视场光阑的图像清晰为止。旋转聚光器上的两个调中螺杆，将视场光阑图像调至视场中心；打开视场光阑，使图像周边与视场边缘相接。反复缩放视场光阑，确认光阑与视场完全重合即可。（一般学生用镜是事先调好的，所以此步略）
3、光阑的调节
孔径光阑－把孔径光阑缩小到所用物镜数值孔径的70％－80％为宜。
视场光阑－适宜大小应以光阑的内缘线外切孔径光阑或孔径光阑外边内接视场光阑为度。
4、油镜的使用：用香柏油或石蜡油作为介质。减少光线的折射，增加视野亮度，提高分辨能力。
正确的操作规程：
1、将标本在载物台上固定好；
2、插上电源，打开电源灯；
3、旋转物镜转换器，将低倍物镜与光路合轴；
4、慢慢调大视场光阑，眼睛从侧面注视载物台，转动粗准焦螺旋，将载物台升至最高；然后眼睛注视目镜，慢调粗准焦螺旋是载物台慢慢下降，直至在目镜中能看到标本模糊的图像；再选择用细调，调至清晰；
5、使用物镜转换器调至高倍镜，调节细准焦螺旋至标本图像最清晰；
6、进一步调整视场光阑，使视野中光线亮度及图像亮度达到最适为止；
7、观察完后，转动粗调螺旋使载物台下降，后小心取下玻片标本（防止用力过猛将玻片摔碎，防止玻片擦坏物镜和目镜），擦净载物台；
8、旋转物镜转换器，不让任何物镜与光路合轴（防止物镜不慎跌落砸坏载物台及通光孔）； 将视场光阑调至最小；
9、关掉电源灯；
10、小心拔下电源插头；
11、摆正显微镜，将其放到桌上安全的地方，套上防护罩。
（三）几种特殊类型的光学显微镜：暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜
发展方向：使用波长较短的光作为光源，不断提高显微镜的分辨率。
1、 暗视野显微镜－照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，
视野背景是黑的，物体边缘是亮的。
原理：暗场显微镜与普通镜的区别，在于装配了一套特殊的聚光器——暗视场聚光器。暗场聚光器的中央有一较大的园形光档，外周是一圈透光光阑，当光射入时，由于光档作用，挡住了进入视野中的直射光，所以看到的视野一片黑暗，但光档外圈光阑可射入环状光束，这些光束经聚光镜抛物面反射汇聚于样品处，并斜向照明样品，使被照明的样品发出反射光和散射光进入物镜，使看到的物体明亮，而背景是暗的。该法虽看不清微粒的结构，但可分辩出0.004μm小微粒的存在和运动。
主要用途：
观察活细胞的几何轮廓及其运动，如鞭毛、染色体、纺锤体，但不能辨清其微细结构。 放射自显影得到的银颗粒进行定量计数。提高物象与背景间的反差，提高分辨率40多倍，可观察4-200nm的微粒。
2、荧光显微镜－高发光效率的点光源，经过滤色系统，发出一定波长的光作为激发光，能激发标本的荧光物质发出一定的荧光，再通过物镜和目镜放大后观察。
原理：利用被长较短的蓝紫光或紫补光照射样本，使样本中分子、原子的外层电子从低能态轨道跃迁，即从较低能整进入较高能态，在这种高能态不稳定，在很短时间后，电子就要返回原来的稳态轨道，这种回归释放出的能量就是荧光。放出的荧光波长较原来激发光的波长要长，荧光比较柔和。
荧光有二种：一种是自发荧光，它是胞内某些天然物质经紫外光照射后发出的光，如植物叶绿体中的叶绿素，就能发出血红色的荧光。另一种是诱发荧光。诱发荧光是将荧光染料物质（荧光色素，如酸性品红、甲基绿、中性红、丫啶橙、丫啶黄，刚果红等）加入细胞中，经过染色后产生的荧光。标本经固定后，用丫啶橙染色，可使细胞内的RNA发出红色荧光，使DNA发出绿色荧光。荧光染色剂的浓度很低，不毒害细胞，可进行活体观察。
光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性、定位的有力工具。
用途：切片或活体染色的细胞免疫荧光观察，研究组织、细胞中物质的吸收、运输及化
学物质的分布、定位，基因定位，疾病诊断。
3、相差显微镜－1935年，荷兰籍德国人F. Zermike成功设计了相差显微镜（phase contrast microscope)，并因此获1953年诺贝尔物理奖。
原理：利用光干涉、衍射现象把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的明暗对比度，使各种结构变得清晰可见，使肉眼得以观察到无色透明物体中的细节。
构造：相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。
（1）环形光阑（annular diaphragm）：转盘聚光器上有一系列的透光的、大小不一的明亮圆环，调节进光量，光线通过其通光孔进入放大倍数与物镜匹配。
（2）相位板（annular phaseplate）：物镜中的后焦面加了相位板，其上为一暗环。相板上涂有氟化镁，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ，从而造成振幅叠加或抵消，引起正反差或负反差。
4、倒置显微镜
物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞或细菌
（四）特殊光镜的正确操作（略）。
五、思考题：
怎样提高显微镜的分辨率？
简述普通光学显微镜的操作注意事项。
列表说明暗视野显微镜、相差显微镜及荧光显微镜的工作原理及其应用。
实验二：测微尺的使用及细胞大小的测量
一、内容：安装并用镜台测微尺标定目镜测微尺，然后用目镜测微尺测量装片细胞的大小。
二、要求：掌握目镜测微尺和镜台测微尺的使用方法，学会显微测量细胞的大小。
三、仪器与材料：普通光学显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、鱼血细胞装片、马蛔虫子宫细胞装片。
四、实验内容：
目镜测微尺是一块圆形的玻片，中心刻有一尺，长5－10mm,分成50－100格，每格实际长度因不同物镜的放大率和不同镜筒长度而异。镜台测微尺是在一块载玻片中央，用树胶封固一圆形的测微尺，长1或2mm,分成100或200格，每格的实际长度为0.01mm(10μm)。当用目镜测微尺来测量细胞的大小时，必须先用镜台测微尺换算出目镜测微尺每一格的长度。方法如下：
1、调好显微镜，使其处于工作状态；
2、在显微镜载物台上放置镜台测微尺，转动显微镜镜筒并移动镜台测微尺，调整目镜测微尺的纵线与镜台测微尺刻度线平行并重合的位置，将目镜测微尺的一条细线与镜台测微尺的一条细线重合在一起（使两尺左边的一直线重合），然后由左向右找出两尺另一重合的直线并记录两条重合线间两尺的格数；
3、按照下列公式计算目镜测微尺每格等于多少微米， X=na/M X—目镜测微尺每格的实际刻度值；a—镜台测微尺每格的刻度值（通常为10um）；n－镜台测微尺的刻度数；M－目镜测微尺的刻度数。举例：如果 镜台测微尺4格＝目镜测微尺6格，那么 目镜测微尺每格代表的长度为 X= na/M=4 × 10/6＝6.7 μm
4、细胞大小的测量：将待测细胞装片放在载物台上，调清物象后，用目镜测微尺测量其各径所占格数，并根据标定结果计算径的实际长度。（注意：测量和标定时物镜放大倍数应一致）
5、计算：根据测量结果计算各种细胞及细胞核的体积
椭球形：V＝4πab2/3 a－长半径， b－短半径
圆球形：V＝4/3πr3 r－半径
圆柱形：V＝πr2h r－半径， h－高
五、作业
分别测量10个马蛔虫子宫细胞和10个鱼血细胞大小，对其大小差异形成直观概念。（要求记录标定数据、原始测量数据、标定和计算过程）
实验三：血涂片制备及瑞氏染色显示白细胞
一、内容：采血并制备血涂片；瑞氏染色法显示血涂片中的白细胞
二、要求：掌握正确的采血及涂片制备方法；掌握瑞氏染液成分组成；掌握瑞氏染色原理、过程，熟悉染色结果的分析。
三、仪器与材料：普通光学显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、鱼血细胞装片、载玻片、采血针、酒精棉球
瑞氏染液：由酸性染料伊红（E-）和碱性染料亚甲蓝（M+）组成。伊红通常为钠盐，有色部分为阴离子。亚甲蓝（又名美蓝）为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝，有色部分为阳离子。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料（即天青）。将适量伊红、美蓝溶解在甲醇中，即为瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解美蓝和伊红；二是固定细胞形态。
瑞氏粉0.1g置洁净研钵中，加入10~20ml甲醇，充分研磨，将已溶部分移入试剂瓶中，未溶部分加适量甲醇研磨，直至全部溶解。24h后即可使用，保存时间越久，染色能力越强。
四、实验内容：
（一）血涂片的制备：
1、准备两张经过脱脂的干净载玻片。
2、用70％酒精棉球消毒指腹或耳垂。
3、用消毒过的针刺破指腹或耳垂的皮肤，挤去第一滴血不要（因含单核白细胞较多），用载玻片的一端与血滴接触。取另一张载玻片，斜置血滴左缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以45°为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄），轻轻将沾有血液的载玻片向前推进，速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀（初学者可把玻片放在桌上操作）。
4、使涂片在空气中自然干燥备用。制作不理想者需要重新制备。
（二）瑞氏染色法显示白细胞：
原理：既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。 步骤：
1、待血涂片干燥后加瑞氏染色液5~8滴覆盖整个血膜，1min；
2、直接清水冲洗，水流不宜过大，至水中无色即可。不可先倒掉染液，防止染液残渣留在细胞中影响染色结果。
3、纱布擦干或吸水纸吸干玻片下端（无细胞面）的水，然后置于载物台上进行观察，先用低倍镜查找，后用高倍镜观察细节。
4、绘图并进行结果分析：
红细胞不着色，白细胞有核，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。
实验四：血细胞的计数
一、内容：指尖采血并对红细胞进行计数。
二、要求：掌握正确的采血方法；掌握血球计数板计数细胞的方法
三、仪器与材料：普通光学显微镜、血球计数板、血盖片（2盒）、采血针（每人1只）、75％酒精、消毒棉球、100×10毫米玻璃试管（25只）、试管架（4个）、吸管（25支）、血球计数板（25块）、擦镜纸。
试剂：生理盐水（0.9％NaCl液）：称取4.5克氯化钠，溶于500毫升蒸馏水
四、实验内容：
（一）细胞计数板的结构：
血细胞计数板为一块特制的长方形厚载玻片，在中部1／3面积处有4条槽。内侧2条槽之间还有1条横槽相通，因此在中部构成2块长方形平台。此平台比整个载玻片的平面低0.1 mm。平台中部各刻有1个含9个大方格的方格网，为计数室。每1个大方格边长1 mm，面积为1mm2，体积为0.1 mm3。四角的每1个大方格又被分为16个中方格，适用于白细胞、血小板和培养细胞的计数。中央的大方格则由双线划分为25个中方格，每个中方格又分成16个小方格，适用于红细胞、微生物细胞的计数。
细胞计数时，先按照一定比例将细胞稀释，取适量稀释液加入计数板的计数室，然后准确计数，最后换算出单位体积的细胞数。计算公式如下：
白细胞：白细胞个数/mm3 =四角的4个大方格（共4×16中格）内细胞数 /4 ×10×稀释倍数 红细胞：红细胞数/mm3 =中央大方格中的四角和中央的中方格（共5个中方格）内红细胞总数 /5 ×25×10×稀释倍数
（二）实验步骤：
1、准备细胞稀释液：准确量取5ml生理盐水加入试管中。
2、制备血细胞稀释液：
（1）用消毒干棉球醮75％酒精消毒左手无名指或耳垂边缘，待酒精挥发后用采血针刺入皮肤约2～3mm深，让血液自然流出。
★采血时必须待皮肤上的消毒酒精挥发后才能穿刺，否则流出的血液不能成滴，无法吸取。
（2）用消毒干棉球拭去第1滴血液，待流出第2滴血成大滴时，用采血管吸血至20mm3刻度处。
★吸血时应注意，不可过度挤压组织以图加速血液流出；
★吸血时应尽量利用毛细管现象使血液自动进入吸管内。
★操作要快，以防止血液凝固。
★若血柱超出规定刻度1～2mm，可用干棉球轻触管口（此时须执管于水平位置），吸去多余部分，使血液面恰至规定刻度处。拭去附着于吸管尖端外部的血液。
★若血液面超过规定刻度2mm以上或吸入气泡，则应重新吸取血液。
（3）将吸管内血液放入盛有生理盐水的小试管底部。
3、滴片：将血细胞计数板擦干净，先盖好血盖片，然后用吸管吸取已稀释的细胞悬液，滴在血盖片边缘，让细胞液自动流入计数室内。静止片刻，待细胞下沉后可计数。
★计数板和盖玻片在使用前必须用软绸或擦镜纸擦净，并在低倍镜下检查计数室是否干净，其刻度是否清晰。
★一般应一次充液使计数室内充满稀释血液，若经几次充液，易形成气泡
4、计数：将计数板放在载物台上，在低倍镜下按一定方向逐格数出细胞数。
★为防止重复计数和漏数，计数时应遵循一定的顺序进行，即“从左到右，自上而下”；对正好压在格线上的血细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数 。
5、计算：算出每立方毫米的细胞数。
白细胞：
白细胞个数/mm3 =四角的4个大方格（共4×16中格）内细胞数 /4 ×10×稀释倍数 红细胞：
红细胞数/mm3 =中央大方格中的四角和中央的中方格（共5个中方格）内红细胞总数 /5 ×25×10×稀释倍数
6、清洗血细胞计数板
盖玻片及计数板用过之后，必须立即用水冲洗，但不可用硬物刷洗。计数板晾干或吹风机吹干后，应镜检计数室是否干净，如不干净必须重复洗至干净为止。
五、作业：
1.简述细胞计数时应注意的问题
2.简要写出自己的计数流程（测哪种类型细胞，测哪个格中细胞数，计数是多少），并分别计算出每组男生、女生血液中每立方毫米的红细胞数。
实验五、线粒体的超活染色与观察
一、内容：以口腔粘膜上皮细胞为实验材料，采用詹纳斯绿染色法显示细胞中的线粒体。
二、要求：掌握口腔上皮细胞临时标本的制做方法，掌握各操作步骤的作用及注意事项。
三、仪器与药品：光学显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿、消毒牙签、吸水纸、擦镜纸。詹纳斯绿B染液、生理盐水。
四、实验内容：
原理：
线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
步骤：
（一）口腔粘膜上皮细胞涂片的制作：
1、将载玻片刷洗干净，用纱布擦干，置于实验台的适当位置；
2、蒸馏水漱口，将牙签粗的一端放入自己口腔中；
3、用力适当的在口腔颊内刮几下（用力轻重适宜，以获得活力旺盛的细胞，又不损伤）
4、将刮下的白色粘性物薄而均匀地涂在载玻片上（可用生理盐水，细胞容易展开；可不用，不用的容易贴壁）；
（二）染色：
5、在载玻片中央滴一滴中性红—詹纳斯绿B（Janus green B）染液，均匀涂于染液中，染色0.5～1 min，加盖玻片后立即观察。
6、绘图并描述现象。
低倍镜下可见成群或分散存在的口腔内粘膜上皮细胞，形态大多呈扁平状，核呈圆形或椭圆形，位于细胞中央，被染成淡蓝色。选择单个轮廓清楚的细胞，转换高倍镜观察，可见细胞质中散在一些被染成亮绿色的粒状和短棒状的颗粒，即线粒体（如下图）。
实验六、Brachet染色法显示RNA
一、内容：以洋葱鳞茎内表皮为实验材料，采用Brachet染色法显示细胞中的RNA及DNA。
二、要求：了解Brachet染色法显示RNA及DNA的原理；掌握操作过程。
三、仪器与药品：材料：洋葱
药品：甲基绿（2%）-哌洛宁（1%）混合染料 （1：9）
仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀等
四、实验内容：
原理：
• Brachet染色法又称为甲基绿-哌洛宁（mehtyl-green-pyronim）染色法----当用甲基
绿-哌洛宁混合染料染细胞时，DNA被染成绿色而RNA被染成红色。
• 1899年由 Pappenheim 首创，1902年 Unna 对其进行了改良。
• 1940年 Brachet 研究证明了其原理：
• DNA分布于细胞核的染色质上，RNA分布于细胞质及细胞核的核仁内。虽然DNA
和RNA在结构上具有很多相似之处，但两者聚合程度不同，DNA聚合程度较高，RNA聚合程度较低。
• 甲基绿和派洛宁都是碱性染料：甲基绿属于三芳基甲烷，芳环的对位上有氨基，甲
基连在N原子上；派洛宁是氧杂蒽衍生物。
• PH4.6时，甲基绿与派洛宁跟核酸发生竞争性结合。甲基绿与DNA双螺旋外侧的磷
酸根基团结合力强，结合后阻止派洛宁从碱基之间插入-----DNA被甲基绿染成绿色。派洛宁与RNA结合力强，RNA结构松散，派洛宁可以插入，从而中和磷酸基团，阻止甲基绿染色-----RNA被哌洛宁染成红色。这样就能使细胞中两种核酸分别显示出来。
• 此反应对PH敏感，染料的纯度和染料的结合力都影响染色效果。
步骤：
1、取材：用镊子撕取一小块洋葱内表皮，剪成4~5mm2的小块，置于载玻片上。
2、染色：用吸管吸取1滴甲基绿-哌洛宁混合染料（Unna 染料），滴在表皮上，染色30-40mins。
3、冲洗：清水冲洗表皮至水无色即可，并用吸水纸吸干。
4、观察：盖上盖玻片后镜检。
5、绘图并描述结果
细胞质和核仁被染成红色（富含RNA），细胞核被染成绿色（富含DNA）。证明RNA在细胞中的分布：主要集中在细胞质及细胞核内，后者又主要集中在核仁内。在染色质及染色体内也存在微量RNA。
实验七、PAS法显示多糖
一、内容：以草履虫为实验材料，采用过碘酸-希夫反应显示细胞质中的多糖成分。
二、要求：了解PAS反应的原理；了解多糖在细胞中的分布。
三、仪器与药品：材料：草履虫培养液。
仪器：离心机2台、离心管8～12支、显微镜、擦镜纸、量筒、染色缸8～12只、纱布等； 药品：0.5%过碘酸（HIO4）溶液、Schiff试剂、10%偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）水溶液、1N
盐酸、1%甲基绿水溶液，二甲苯、95%酒精、100%酒精。
1、过碘酸酒精溶液配法（新鲜配制）
过碘酸（HIO4·2H2O） 0.4g
95％酒精 35ml
0.2M乙酸钠（27.2g溶于1000ml蒸馏水） 5ml
蒸馏水 5ml
以上溶液配好后保存在0～4℃的冰箱内，瓶加黑纸，此液如显棕黄色即失效。如用CH3COONa·3H2O，则M＝136.9， 0.2M ＝27.4。 如用CH3COONa，则M＝82.04， 0.2M ＝16.4。
2、Schiff试剂原液配法
先将200ml蒸馏水煮沸，由火上取下，加入碱性品红1g，充分搅拌，有助于溶解。待溶液冷到50℃时，过滤到磨口棕色试剂瓶中。加入1 mol/L HCl（比重1.19的浓盐酸10ml，蒸馏水110ml）溶液20ml，冷却到25℃时加入1g 偏重亚硫酸钾（K2S2O5）或偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）、充分振荡后盖紧瓶塞，在室温下放置暗处过夜（至少14～24小时，有时需2～3天）。取出时，其颜色应退至淡黄色或近于无色，（溶液如呈浅红色可加一匙约0.5g中性活性炭吸色，剧烈振荡1min），过滤后即得无色品红（滤液应为无色）。
无色品红配成后须塞紧瓶塞，外包黑布或黑纸，储存在冰箱（4℃下可保存数月，冷冻可长期保存）或黑暗低温处。如果配制后的溶液颜色呈红色，除因操作步骤的差错外，多由于碱性品红或偏重亚硫酸钠质量不好。如果溶液颜色变为粉红色，则失效不能再用。
Na2S2O5
NaCl + H2SO3 + SO2
碱性品红
Schiff试剂
3、Schiff酒精溶液配法（配后如略带红色仍可使用）避光、避热、避氧气。
Schiff原液 11.5ml
1N盐酸 0.5ml
纯酒精 23ml
4、亚硫酸水溶液（漂洗液）配法
10％偏重亚硫酸钠水溶液（10克偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾、加100 ml蒸馏水）5ml，蒸馏水90ml，1 mol/L HCl 5ml，摇匀后塞紧瓶塞。新配制的漂白液二氧化硫气味很浓，至无味时即不能再用。此溶液不能保持太久，最多6～7天，最好在使用前现用现配，否则会因SO2的逸出而失效。
5、1N（1mol/L）盐酸配法：取密度为1.19的浓盐酸82.5ml，加蒸馏水至1000ml（如果密度为1.16的浓盐酸则用98.8ml，加蒸馏水至1000ml）。
6、1％甲基绿水溶液配法：1克甲基绿，99ml蒸馏水，再加1ml冰醋酸。
四、实验内容：
原理：
过碘酸是一种强氧化剂，可把多糖氧化成高分子醛化物。具体作用机理是打开多糖中葡萄糖单元的2，3位碳原子之间的连接，同时将多糖中的乙二醇基（CHOH－CHOH）氧化为两个游离醛基（－CHO）。然后，游离醛基可与Schiff试剂反应，形成红色
-紫红色的化合物，颜色深浅与多糖含量成正比。
步骤：
1、取草履虫培养液适量，纱布过滤稻草后，离心无稻草的草履虫培养液1400转/分×5min，取沉淀1~2滴滴于载玻片上；
2、95%酒精固定10min，此过程中要防止酒精完全挥发干，要不断补充酒精；
3、滴加几滴0.5% HIO4 作用15min；
4、滴加Schiff试剂（暗处室温）作用30~45min；
5、亚硫酸水漂洗三次（除去多余的无色品红），每次2min；
6、清水冲洗约1min后擦干玻片镜检。
7、绘图并描述结果。
细胞内的糖元呈红色-紫红色颗粒。显色深浅与细胞中乙二醇基含量成正比，多时呈深紫红色。
实验八、染色体玻片标本的制作
一、内容：以小鼠股骨骨髓细胞为实验材料，采用低渗滴片法制备染色体玻片标本，利用显微镜观察中期分裂相。
二、要求：掌握动物细胞染色体标本的制做方法，掌握各操作步骤的作用及注意事项。
三、仪器与药品：注射器、解剖器具(剪刀、镊子、解剖刀)、离心管、吸管、试管、水浴锅、载玻片、离心机、显微镜；秋水仙素(0.01％)、乙醇、冰醋 酸、生理盐水，0.075M KCl低渗液、Giemsa染料
四、实验内容：
（一）背景知识
染色体是基因的载体。真核细胞染色体数目和结构是重要的遗传指标之一，制备染色体标本无疑是细胞遗传学最基本的技术。优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。
染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。
在正常动物体内，精巢和骨髓均为活跃分裂的组织，可不经PHA处理和体外培养而直接用来制作染色体标本。通过骨髓制备染色体程序比较简单，一般也无需无菌操作。小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。 选用小鼠、青蛙或蟾蜍的骨髓细胞作为实验材料时，操作包括以下几个要点：
取材以前将一定剂量的秋水仙素进行腹腔注射，处理一段时间以破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期；
骨髓细胞取出后，用低渗液处理使细胞膨胀，以至于在滴片时细胞可破裂，使细胞内的染色体分散平铺到载玻片上；
空气干燥法滴片可使染色体在载玻片上展平并固定，经Giemsa染料染色后便可观察到染色体的数量和形态。
（二）实验步骤：
总流程：预处理→取骨髓细胞→低渗+预固定→离心→固定→离心→细胞悬液定容→滴片→干燥→染色→观察
具体步骤：
1、前处理：取骨髓细胞前5－8小时向小鼠腹腔内注射秋水仙素（5μg/g)。（将有丝分裂阻断在中期，增加中期分裂相的比例）
2、取材：处死小鼠剖出股骨（注意不要将股骨剪断，否则容易造成骨髓细胞的流失），将股骨上的肌肉拧擦干净后，取骨髓细胞。先剪去股骨两端，再用注射器和针头吸取生理盐水溶液，将针头插入骨髓腔，以生理盐水将骨髓细胞冲入离心管中(获得有丝分裂细胞，注意冲出骨髓细胞的动作要快，冲击量大，细胞多，并要求预温药液至25℃)。生理盐水用量大约6ml。
3、染色体制备：
（1）低渗：800-1000rpm离心8mins，去除上清液，加入6ml预温至25℃的0.075M 的KCl溶液，用吸管轻轻吹散细胞，置25℃条件下低渗20分钟。（使细胞膨胀，利于滴片时染色体分散）
（2）预固定： 800-1000rpm离心8mins，去除上清，加入6ml新制的Carnoy’s固定液（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管轻轻将细胞吹散，固定10mins。
（3）固定：离心，去上清，加入6ml新制的Carnoy’s固定液（甲醇：冰乙酸=3：1），混匀，固定10mins, (此步重复两次)。离心，去上清后，加入约0.5ml新Carnoy’s固定液，用滴管轻轻将细胞吹散，制成细胞悬液。
4、滴片：
取出预冷的干净载玻片→ 以60-75cm的高度滴片→ 自然干燥→ Giemsa染料染色10mins→流水冲洗1～2mins →镜检
5、绘图并描述结果。
五、作业：
总结影响制片效果的因素。
为什么滴片需要用冰冻的冷载玻片？
小白鼠染色体的数目是多少？请绘制一个中期分裂相。
实验九、植物细胞骨架的光镜观察
一、内容：以洋葱内表皮为实验材料，用光镜观察细胞骨架的形态与分布。
二、要求：了解细胞骨架的结构，掌握细胞装片的制片技术。
三、仪器药品与材料
水浴锅、5-10ml塑料离心管、镊子、剪 刀、载玻片、盖玻片、吸管、吸水纸等；
6 mM 磷酸缓冲液PBS、1% triton X- 100 （去垢剂）、3% 戊二醛、咪唑缓冲液、0.2% 考马斯亮兰R250染料；洋葱
（1） 6m mol/L PBS （pH 6.5）
A液：NaH2PO4. H2O 468 mg/500ml;
B液：Na2HPO4.12H2O 1074 mg/500ml；
工作液：A液68.5 ml+B液31.5 ml （用5% NaHCO3 调pH至6.5）.
（2）M缓冲液 （pH7.2）：
咪唑 3.40g、 KCl 3.71g、 MgCl2.6H2O 101.65mg、
EGTA （乙二醇双醚四乙酸）380.35mg、EDTA （乙二胺四乙酸） 29.22mg、 甘油 292ml，
加蒸馏水至1000ml （用1mol/L HCl 调pH至7.2）
（3）1% Tritno X-100：
Triton X-100 液1 ml、M缓冲液99 ml。
（4）3% 戊二醛：
25%戊二醛12 ml、 6m mol/L PBS液88ml。
（5）0.2% 考马斯亮蓝R250染液：
考马斯亮蓝R250粉末0.2g、
甲醛46.5ml、冰醋酸7 ml、蒸馏水46.5 ml。
四、实验内容：
原理：
细胞骨架是指细胞中纵横交错的纤维网络结构，它们是由各种不同成分的蛋白质组成，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。
当用适当浓度的非离子去垢剂triton X-100 处理细胞时，可以使细胞中的可溶性蛋白和脂类物质被溶解除去。而微丝束是不可溶性蛋白，不会被triton X-100破坏而留在细胞中，再用固定剂对其进行固定，然后用非特异性蛋白染料（考马斯亮蓝R250)对其进行染色，可在光镜下观察细胞骨架的网状结构。
注：考马斯亮蓝R250并不特异的显示微丝，但由于有些细胞骨架纤维（如，微管）在该实验条件下不稳定，又因某些类型的纤维太细而在光镜下无法分辨，因此看到的基本是由微丝组成的纤维束，直径在40nm左右。
步骤：
1、取材：撕取洋葱鳞茎内表皮5mm2，浸入装有6mM PBS 缓冲液的烧杯或小瓶内，使材料下沉，处理5mins；
2、抽提：吸去PBS，加去垢剂1%Triton X-100液2ml，使液体充分浸泡材料，并立即放入37℃水浴锅中处理20mins；
3、冲洗：吸去1%Triton，用M缓冲液(咪唑+螯合剂+ K+ + Mg2+ ）轻轻冲洗3次，每次3mins；
注：咪唑为缓冲剂，其中的EGTA和EDTA是螯合剂，螯合Ca2+，低Ca2+条件下，骨架纤维保持聚合状态。在Mg2+和高浓度Na+、K+条件下，球形肌动蛋白装配成微丝。）
4、固定：加3%戊二醛固定15mins；
5、冲洗：吸去3%戊二醛固定液，用6mM PBS缓冲液冲洗3次，每次3mins；
6、染色：吸去PBS缓冲液，滴几滴0.2%考马斯亮兰R250染料，染色10mins；
7、制片：吸去染料，用蒸馏水洗2-3次，将标本平铺在载玻片上，加盖片；
8、镜检：绘制洋葱表皮细胞骨架图并描述现象。
将制好的片子置于光镜的低倍镜下，可见到规则排列的长方形洋葱表皮细胞轮廓，细胞内可见到被染成蓝色的粗细不等的纤维网络结构，便是构成细胞骨架的微丝束。
选择染色较好的细胞，转高倍镜继续观察，调节细焦镙旋可见到细胞骨架的立体结构。
实验十、活细胞观察与死、活细胞鉴别
一、内容：以小鼠脾脏淋巴细胞为实验材料，台盼蓝法鉴定细胞死活。
二、要求：掌握死活细胞鉴别的原理和方法；了解细胞存活率的意义。
三、仪器与药品：
材料：小鼠脾脏淋巴细胞
仪器：镊子、剪 刀、注射器、载玻片、盖玻片、吸管、吸水纸等
药品：0.9%生理盐水 、0.4%台盼蓝（生理盐水配制）
四、实验内容：
原理：
细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用的是染色排除法和荧光排除法。染色排除法的原理：许多酸性染料如台盼蓝等不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，而活细胞不着色。以此来区分死活细胞。
细胞存活率（%）= 细胞总数—死细胞数/细胞总数
步骤：
1、取材：取小鼠脾脏，用盛有2mL生理盐水的注射器冲击脾脏，下接一个10mL离心管。
2、染色：取0.5ml细胞悬液放入干净试管中，加入约0.1ml（1~2滴）0.4%台盼蓝染液，混合，2min后立即制成临时装片，镜检。
3、绘图描述结果并计算存活率：
死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
实验十一、动物细胞微丝束的光镜观察
一、内容：以小鼠血管平滑肌细胞或成纤维细胞为实验材料，考马斯亮蓝法光镜观察细胞骨架的形态与分布。
二、要求：了解动物细胞骨架的结构，掌握动物细胞装片的制片技术。
三、仪器药品与材料
小鼠血管平滑肌细胞或成纤维细胞；
水浴锅、5-10ml塑料离心管、镊子、剪 刀、载玻片、盖玻片、吸管、吸水纸等；
1M PBS、1% triton X- 100 （去垢剂）、3% 戊二醛、咪唑缓冲液、0.2% 考马斯亮兰R250染料
四、实验内容：
原理：
显色原理基本同植物细胞骨架，只是分布与植物骨架不同，正常动物细胞中的微丝束大多以平行方式平行于细胞长轴排列。癌症细胞内细胞骨架不完整。
步骤：
1、清洗盖片：将盖玻片清洗干净并高压灭菌或酒精消毒，置于无菌六孔细胞培养板中；
2、培养细胞：原代或用传代培养冻存的平滑肌或成纤维细胞，于六孔培养板中长至50%~60%
融合；
3、洗涤：弃去培养液，PBS洗涤3次，每次2min；
4、抽提：吸去PBS，加去垢剂1%Triton X-100液1ml，室温处理20mins；
5、冲洗：吸去1%Triton，用M缓冲液(咪唑+螯合剂+ K+ + Mg2+ ）轻轻冲洗3次，每次3mins；
注：咪唑为缓冲剂，其中的EGTA和EDTA是螯合剂，螯合Ca2+，低Ca2+条件下，骨架纤维保持聚合状态。在Mg2+和高浓度Na+、K+条件下，球形肌动蛋白装配成微丝。）
6、固定：加3%戊二醛固定15mins；
7、冲洗：吸去3%戊二醛固定液，用PBS缓冲液冲洗3次，每次3mins；
8、染色：吸去PBS缓冲液，滴几滴0.2%考马斯亮兰R250染料，染色10mins；
9、制片：吸去染料，用蒸馏水洗2-3次，将长有细胞的盖片反扣在载玻片上，擦干镜检。
10、绘图并描述现象：
实验十二、细胞凝集反应
一、内容：以鸭血或鸡血为实验材料，观察细胞凝集反应。
二、要求：了解凝集反应原理，掌握实验操作过程。
三、仪器药品与材料
1 ．器材: 显微镜、天平、载玻片、滴管、离心管、烧杯、10ml移液管、试管、试管架 2 ．材料: 土豆块茎
3 ．试剂: ２％鸭血红细胞、抗凝血剂、PBS、土豆块茎。
四、实验内容：
原理：
动物细胞表面的糖蛋白、糖脂中的糖链伸向膜的表面，是细胞识别、免疫及接触抑制现象的必要组分。凝集素lectin是一类含糖的，并能与糖专一并可逆结合的蛋白质，能与细胞外被的寡糖链相连接，使细胞发生凝集并刺激细胞分裂。
步骤：
1、2％鸭血红细胞悬液制备
新鲜鸭血加抗凝剂，生理盐水洗5次，每次2000r/min，离心5min，按红细胞压积用生理盐水配成２％鸭血红细胞悬液。
2、土豆凝集素制备
土豆2克，加10ml PBS，浸泡2h
3、细胞凝集反应
土豆凝集素1滴、2％鸭血红细胞液１滴，于载玻片上混匀，静置20min，
4 、对照
PBS1滴、2％鸭血红细胞液2滴
5、镜检
6、绘图并描述现象。
《细胞生物学实验》指导
一、实验课名称：细胞生物学实验 Experiment of Cell Biology
二、实验课性质：独立设课
三、适用专业：生物技术和水产养殖
四、采用教材及参考书：
教 材：安利国主编．细胞生物学实验教程．北京：科学出版社，2004
参考书：1. 杨汉民主编．细胞生物学实验（第二版）．北京：高等教育出版社，1997.7
2. 徐承水，党本元主编．现代细胞生物学技术．青岛：青岛海洋大学出版社，1995
3. 王金发主编．细胞生物学实验教程．北京：科学出版社，2003
五、学时学分：课程总学时：36； 课程总学分：1
七、实验课考核方式：
1.实验课考核成绩确定：本课程考核成绩由平时成绩（占30%）、实验报告成绩（占30%）和终期考核成绩（占40%）三部分构成。
2.平时成绩确定：由任课教师根据实验操作、问题回答和出勤情况确定，按A（优）、B（良）、C（及格）、D（不及格）四个等级评分。
3.实验报告成绩：本课程要求学生实验报告应包括以下内容：①实验目的及原理：简明；②方法与步骤：具体操作步骤、注意事项等；③结果：详细每一步的结果以及计算方法和计算结果；④分析与讨论：根据所学知识对结果进行分析讨论，阐明所得结果说明了什么问题；如果结果与理论不符，应说明可能的原因。实验报告成绩由任课教师根据学生实验报告写作是否符合规范要求、试验结果及分析的具体情况给出。每次报告均按A（优）、B（良）、C（及格）、D（不及格）四个等级评分，实验报告成绩为各次报告成绩的平均值。
4.终期考核成绩：实验课结束后进行笔试、口试或现场操作考核，按A（优）、B（良）、C（及格）、D（不及格）四个等级评分。
实验项目
实验一、显微镜的技术参数及特殊光镜的演示实验
一、要求：了解普通光镜及各种特殊光镜的构造、成像原理及应用；掌握正确的使用方法；理解显微镜的技术参数和特殊光镜的结构特点；掌握实验报告的写法。
二、实验内容：
普通光学显微镜的结构及技术参数：由光学和机械两大系统构成。
1、光学系统及成像原理：
（1）光学系统的构成：物镜、目镜、聚光器、光源部件等
（2）成像原理：根据透镜成像的原理，对微小物体进行放大（二次成像）。当被检物体放在物镜前方的1－2倍焦距之间，光线通过物镜在镜筒中形成一个倒立的放大实像，这个实像恰好位于目镜的焦平面之内，通过目镜后形成一个放大的倒立虚像。通过调焦装置使A2B2落在人眼睛的明视距离（25mm）处，使眼睛看到的物体最清晰。
2、机械系统：（从下往上）
（1）镜座－位于最底部，是整台显微镜的基座，用于支持和稳定镜体。有的在镜座内装有照明光源；
（2）载物台－也称镜台，位于物镜转换器下方的方形平台，用于放置被观察的玻片标本。中央有圆形的通光孔，来自下方的光线经此折射到标本上。
（3）镜臂－支持镜筒和镜台的弯曲状结构，是取用显微镜时握持的部位。
（4）调焦螺旋－调节焦距的装置，可使载物台升降，调好焦距，使物像呈现在视野中。
（5）物镜转换器－装载不同放大倍数的物镜。转动旋转盘可使不同物镜达到工作位置（与光路合轴），使用时注意凭手感使所需物镜准确到位。
（6）镜筒－上端装有目镜，下端与物镜转换器相连物镜转换器。
3、显微镜的技术参数：
（1）分辨率（resolution）：指在25CM的明视距离处能区分开被检物体上两个相近质点的最小距离（显微镜能将邻近的两个质点分辨清楚的能力）。
R=0.61λ/N.A =0.61λ/n·sin(α/2) λ-照明光线波长； N.A－物镜的数值孔径；n为介质的折射率；α为镜口角。
思考：如何提高显微镜的分辨能力？
通常2θ最大值可达140°，θ角最大为70， Sin70°=0.94；λ一般0.45μm（蓝色光），由公式可知当λ和Sin值均不变时，介质折射率n越大，能区分的二点之间的距离就越短，物镜的分辩率越好。
n=1（空气中），分辨率R=0.29um；
n=1.52（油镜下）R＝0.19um，油镜下分辨率更好。R=0.2um 光镜的分辨极限
（2）放大率：放大倍数。M=Mob×Moc = △/f1×250/f2 Mob－物镜放大倍数；Moc－目镜放大倍数；△－光学筒长（单位：mm）； f1－物镜焦距（mm）；250－明视距离（mm）；f2－目镜焦距(mm).
物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的，镜筒长度的变化不仅导致放大率的变化，而且成像质量也受到影响。因此，显微镜的镜筒长度是一定的。适宜的总放大率是所用物镜数值孔径的500－1000倍，在此范围内称为有效放大倍数。
（3）清晰度：显微镜形成轮廓明显物像的能力。影响物像清晰度的主要因素是物镜。同一光学系统中，放大倍数越高，像差就越大。要提高物像的清晰度，必须使用高数值孔径的物镜，并匹配低倍的目镜，而不应单纯增加目镜的放大倍数。（盖玻片的厚薄都会导致光学筒长的变化，国际同一标准盖玻片厚度为0.17mm）
（4）焦点深度：当显微镜对标本的某一点或平面聚焦时，焦点平面上下物像清晰的距离或深度。T=K·n/M·NA M-显微镜的总放大倍数；K-常数，约等于0.24；n=被检测物体周围介质的折射率；NA=物镜的数值孔径
4、显微镜的使用：（以普通光学显微镜为例，严格按照正确的操作规程进行）
注意事项：
1、使用前一定要检查上一组的同学是否规范的放置好显微镜：断电源、开关处于关的状态、视场光阑最小、载物台位置是否处于最低的状态、任何物镜都不与光路合轴。如果放置规范，可以进行后续的操作，否则，请按照上述要求调整显微镜的状态；
2、光路合轴－将照明光束与显微镜的光轴调整到同一轴线上，使光源均匀的照明视场。具体操作：转动聚光器的升降旋钮，把聚光器升至最高位置。打开电源灯开关，将标本放置在载物台上，用低倍镜聚焦。缩小视场光阑，在视场中可见边缘模糊的视场光阑图像，稍微降低聚光器，到视场光阑的图像清晰为止。旋转聚光器上的两个调中螺杆，将视场光阑图像调至视场中心；打开视场光阑，使图像周边与视场边缘相接。反复缩放视场光阑，确认光阑与视场完全重合即可。（一般学生用镜是事先调好的，所以此步略）
3、光阑的调节
孔径光阑－把孔径光阑缩小到所用物镜数值孔径的70％－80％为宜。
视场光阑－适宜大小应以光阑的内缘线外切孔径光阑或孔径光阑外边内接视场光阑为度。
4、油镜的使用：用香柏油或石蜡油作为介质。减少光线的折射，增加视野亮度，提高分辨能力。
正确的操作规程：
1、将标本在载物台上固定好；
2、插上电源，打开电源灯；
3、旋转物镜转换器，将低倍物镜与光路合轴；
4、慢慢调大视场光阑，眼睛从侧面注视载物台，转动粗准焦螺旋，将载物台升至最高；然后眼睛注视目镜，慢调粗准焦螺旋是载物台慢慢下降，直至在目镜中能看到标本模糊的图像；再选择用细调，调至清晰；
5、使用物镜转换器调至高倍镜，调节细准焦螺旋至标本图像最清晰；
6、进一步调整视场光阑，使视野中光线亮度及图像亮度达到最适为止；
7、观察完后，转动粗调螺旋使载物台下降，后小心取下玻片标本（防止用力过猛将玻片摔碎，防止玻片擦坏物镜和目镜），擦净载物台；
8、旋转物镜转换器，不让任何物镜与光路合轴（防止物镜不慎跌落砸坏载物台及通光孔）； 将视场光阑调至最小；
9、关掉电源灯；
10、小心拔下电源插头；
11、摆正显微镜，将其放到桌上安全的地方，套上防护罩。
（三）几种特殊类型的光学显微镜：暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜
发展方向：使用波长较短的光作为光源，不断提高显微镜的分辨率。
1、 暗视野显微镜－照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，
视野背景是黑的，物体边缘是亮的。
原理：暗场显微镜与普通镜的区别，在于装配了一套特殊的聚光器——暗视场聚光器。暗场聚光器的中央有一较大的园形光档，外周是一圈透光光阑，当光射入时，由于光档作用，挡住了进入视野中的直射光，所以看到的视野一片黑暗，但光档外圈光阑可射入环状光束，这些光束经聚光镜抛物面反射汇聚于样品处，并斜向照明样品，使被照明的样品发出反射光和散射光进入物镜，使看到的物体明亮，而背景是暗的。该法虽看不清微粒的结构，但可分辩出0.004μm小微粒的存在和运动。
主要用途：
观察活细胞的几何轮廓及其运动，如鞭毛、染色体、纺锤体，但不能辨清其微细结构。 放射自显影得到的银颗粒进行定量计数。提高物象与背景间的反差，提高分辨率40多倍，可观察4-200nm的微粒。
2、荧光显微镜－高发光效率的点光源，经过滤色系统，发出一定波长的光作为激发光，能激发标本的荧光物质发出一定的荧光，再通过物镜和目镜放大后观察。
原理：利用被长较短的蓝紫光或紫补光照射样本，使样本中分子、原子的外层电子从低能态轨道跃迁，即从较低能整进入较高能态，在这种高能态不稳定，在很短时间后，电子就要返回原来的稳态轨道，这种回归释放出的能量就是荧光。放出的荧光波长较原来激发光的波长要长，荧光比较柔和。
荧光有二种：一种是自发荧光，它是胞内某些天然物质经紫外光照射后发出的光，如植物叶绿体中的叶绿素，就能发出血红色的荧光。另一种是诱发荧光。诱发荧光是将荧光染料物质（荧光色素，如酸性品红、甲基绿、中性红、丫啶橙、丫啶黄，刚果红等）加入细胞中，经过染色后产生的荧光。标本经固定后，用丫啶橙染色，可使细胞内的RNA发出红色荧光，使DNA发出绿色荧光。荧光染色剂的浓度很低，不毒害细胞，可进行活体观察。
光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性、定位的有力工具。
用途：切片或活体染色的细胞免疫荧光观察，研究组织、细胞中物质的吸收、运输及化
学物质的分布、定位，基因定位，疾病诊断。
3、相差显微镜－1935年，荷兰籍德国人F. Zermike成功设计了相差显微镜（phase contrast microscope)，并因此获1953年诺贝尔物理奖。
原理：利用光干涉、衍射现象把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的明暗对比度，使各种结构变得清晰可见，使肉眼得以观察到无色透明物体中的细节。
构造：相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。
（1）环形光阑（annular diaphragm）：转盘聚光器上有一系列的透光的、大小不一的明亮圆环，调节进光量，光线通过其通光孔进入放大倍数与物镜匹配。
（2）相位板（annular phaseplate）：物镜中的后焦面加了相位板，其上为一暗环。相板上涂有氟化镁，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ，从而造成振幅叠加或抵消，引起正反差或负反差。
4、倒置显微镜
物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞或细菌
（四）特殊光镜的正确操作（略）。
五、思考题：
怎样提高显微镜的分辨率？
简述普通光学显微镜的操作注意事项。
列表说明暗视野显微镜、相差显微镜及荧光显微镜的工作原理及其应用。
实验二：测微尺的使用及细胞大小的测量
一、内容：安装并用镜台测微尺标定目镜测微尺，然后用目镜测微尺测量装片细胞的大小。
二、要求：掌握目镜测微尺和镜台测微尺的使用方法，学会显微测量细胞的大小。
三、仪器与材料：普通光学显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、鱼血细胞装片、马蛔虫子宫细胞装片。
四、实验内容：
目镜测微尺是一块圆形的玻片，中心刻有一尺，长5－10mm,分成50－100格，每格实际长度因不同物镜的放大率和不同镜筒长度而异。镜台测微尺是在一块载玻片中央，用树胶封固一圆形的测微尺，长1或2mm,分成100或200格，每格的实际长度为0.01mm(10μm)。当用目镜测微尺来测量细胞的大小时，必须先用镜台测微尺换算出目镜测微尺每一格的长度。方法如下：
1、调好显微镜，使其处于工作状态；
2、在显微镜载物台上放置镜台测微尺，转动显微镜镜筒并移动镜台测微尺，调整目镜测微尺的纵线与镜台测微尺刻度线平行并重合的位置，将目镜测微尺的一条细线与镜台测微尺的一条细线重合在一起（使两尺左边的一直线重合），然后由左向右找出两尺另一重合的直线并记录两条重合线间两尺的格数；
3、按照下列公式计算目镜测微尺每格等于多少微米， X=na/M X—目镜测微尺每格的实际刻度值；a—镜台测微尺每格的刻度值（通常为10um）；n－镜台测微尺的刻度数；M－目镜测微尺的刻度数。举例：如果 镜台测微尺4格＝目镜测微尺6格，那么 目镜测微尺每格代表的长度为 X= na/M=4 × 10/6＝6.7 μm
4、细胞大小的测量：将待测细胞装片放在载物台上，调清物象后，用目镜测微尺测量其各径所占格数，并根据标定结果计算径的实际长度。（注意：测量和标定时物镜放大倍数应一致）
5、计算：根据测量结果计算各种细胞及细胞核的体积
椭球形：V＝4πab2/3 a－长半径， b－短半径
圆球形：V＝4/3πr3 r－半径
圆柱形：V＝πr2h r－半径， h－高
五、作业
分别测量10个马蛔虫子宫细胞和10个鱼血细胞大小，对其大小差异形成直观概念。（要求记录标定数据、原始测量数据、标定和计算过程）
实验三：血涂片制备及瑞氏染色显示白细胞
一、内容：采血并制备血涂片；瑞氏染色法显示血涂片中的白细胞
二、要求：掌握正确的采血及涂片制备方法；掌握瑞氏染液成分组成；掌握瑞氏染色原理、过程，熟悉染色结果的分析。
三、仪器与材料：普通光学显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、鱼血细胞装片、载玻片、采血针、酒精棉球
瑞氏染液：由酸性染料伊红（E-）和碱性染料亚甲蓝（M+）组成。伊红通常为钠盐，有色部分为阴离子。亚甲蓝（又名美蓝）为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝，有色部分为阳离子。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料（即天青）。将适量伊红、美蓝溶解在甲醇中，即为瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解美蓝和伊红；二是固定细胞形态。
瑞氏粉0.1g置洁净研钵中，加入10~20ml甲醇，充分研磨，将已溶部分移入试剂瓶中，未溶部分加适量甲醇研磨，直至全部溶解。24h后即可使用，保存时间越久，染色能力越强。
四、实验内容：
（一）血涂片的制备：
1、准备两张经过脱脂的干净载玻片。
2、用70％酒精棉球消毒指腹或耳垂。
3、用消毒过的针刺破指腹或耳垂的皮肤，挤去第一滴血不要（因含单核白细胞较多），用载玻片的一端与血滴接触。取另一张载玻片，斜置血滴左缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以45°为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄），轻轻将沾有血液的载玻片向前推进，速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀（初学者可把玻片放在桌上操作）。
4、使涂片在空气中自然干燥备用。制作不理想者需要重新制备。
（二）瑞氏染色法显示白细胞：
原理：既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。 步骤：
1、待血涂片干燥后加瑞氏染色液5~8滴覆盖整个血膜，1min；
2、直接清水冲洗，水流不宜过大，至水中无色即可。不可先倒掉染液，防止染液残渣留在细胞中影响染色结果。
3、纱布擦干或吸水纸吸干玻片下端（无细胞面）的水，然后置于载物台上进行观察，先用低倍镜查找，后用高倍镜观察细节。
4、绘图并进行结果分析：
红细胞不着色，白细胞有核，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。
实验四：血细胞的计数
一、内容：指尖采血并对红细胞进行计数。
二、要求：掌握正确的采血方法；掌握血球计数板计数细胞的方法
三、仪器与材料：普通光学显微镜、血球计数板、血盖片（2盒）、采血针（每人1只）、75％酒精、消毒棉球、100×10毫米玻璃试管（25只）、试管架（4个）、吸管（25支）、血球计数板（25块）、擦镜纸。
试剂：生理盐水（0.9％NaCl液）：称取4.5克氯化钠，溶于500毫升蒸馏水
四、实验内容：
（一）细胞计数板的结构：
血细胞计数板为一块特制的长方形厚载玻片，在中部1／3面积处有4条槽。内侧2条槽之间还有1条横槽相通，因此在中部构成2块长方形平台。此平台比整个载玻片的平面低0.1 mm。平台中部各刻有1个含9个大方格的方格网，为计数室。每1个大方格边长1 mm，面积为1mm2，体积为0.1 mm3。四角的每1个大方格又被分为16个中方格，适用于白细胞、血小板和培养细胞的计数。中央的大方格则由双线划分为25个中方格，每个中方格又分成16个小方格，适用于红细胞、微生物细胞的计数。
细胞计数时，先按照一定比例将细胞稀释，取适量稀释液加入计数板的计数室，然后准确计数，最后换算出单位体积的细胞数。计算公式如下：
白细胞：白细胞个数/mm3 =四角的4个大方格（共4×16中格）内细胞数 /4 ×10×稀释倍数 红细胞：红细胞数/mm3 =中央大方格中的四角和中央的中方格（共5个中方格）内红细胞总数 /5 ×25×10×稀释倍数
（二）实验步骤：
1、准备细胞稀释液：准确量取5ml生理盐水加入试管中。
2、制备血细胞稀释液：
（1）用消毒干棉球醮75％酒精消毒左手无名指或耳垂边缘，待酒精挥发后用采血针刺入皮肤约2～3mm深，让血液自然流出。
★采血时必须待皮肤上的消毒酒精挥发后才能穿刺，否则流出的血液不能成滴，无法吸取。
（2）用消毒干棉球拭去第1滴血液，待流出第2滴血成大滴时，用采血管吸血至20mm3刻度处。
★吸血时应注意，不可过度挤压组织以图加速血液流出；
★吸血时应尽量利用毛细管现象使血液自动进入吸管内。
★操作要快，以防止血液凝固。
★若血柱超出规定刻度1～2mm，可用干棉球轻触管口（此时须执管于水平位置），吸去多余部分，使血液面恰至规定刻度处。拭去附着于吸管尖端外部的血液。
★若血液面超过规定刻度2mm以上或吸入气泡，则应重新吸取血液。
（3）将吸管内血液放入盛有生理盐水的小试管底部。
3、滴片：将血细胞计数板擦干净，先盖好血盖片，然后用吸管吸取已稀释的细胞悬液，滴在血盖片边缘，让细胞液自动流入计数室内。静止片刻，待细胞下沉后可计数。
★计数板和盖玻片在使用前必须用软绸或擦镜纸擦净，并在低倍镜下检查计数室是否干净，其刻度是否清晰。
★一般应一次充液使计数室内充满稀释血液，若经几次充液，易形成气泡
4、计数：将计数板放在载物台上，在低倍镜下按一定方向逐格数出细胞数。
★为防止重复计数和漏数，计数时应遵循一定的顺序进行，即“从左到右，自上而下”；对正好压在格线上的血细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数 。
5、计算：算出每立方毫米的细胞数。
白细胞：
白细胞个数/mm3 =四角的4个大方格（共4×16中格）内细胞数 /4 ×10×稀释倍数 红细胞：
红细胞数/mm3 =中央大方格中的四角和中央的中方格（共5个中方格）内红细胞总数 /5 ×25×10×稀释倍数
6、清洗血细胞计数板
盖玻片及计数板用过之后，必须立即用水冲洗，但不可用硬物刷洗。计数板晾干或吹风机吹干后，应镜检计数室是否干净，如不干净必须重复洗至干净为止。
五、作业：
1.简述细胞计数时应注意的问题
2.简要写出自己的计数流程（测哪种类型细胞，测哪个格中细胞数，计数是多少），并分别计算出每组男生、女生血液中每立方毫米的红细胞数。
实验五、线粒体的超活染色与观察
一、内容：以口腔粘膜上皮细胞为实验材料，采用詹纳斯绿染色法显示细胞中的线粒体。
二、要求：掌握口腔上皮细胞临时标本的制做方法，掌握各操作步骤的作用及注意事项。
三、仪器与药品：光学显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿、消毒牙签、吸水纸、擦镜纸。詹纳斯绿B染液、生理盐水。
四、实验内容：
原理：
线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
步骤：
（一）口腔粘膜上皮细胞涂片的制作：
1、将载玻片刷洗干净，用纱布擦干，置于实验台的适当位置；
2、蒸馏水漱口，将牙签粗的一端放入自己口腔中；
3、用力适当的在口腔颊内刮几下（用力轻重适宜，以获得活力旺盛的细胞，又不损伤）
4、将刮下的白色粘性物薄而均匀地涂在载玻片上（可用生理盐水，细胞容易展开；可不用，不用的容易贴壁）；
（二）染色：
5、在载玻片中央滴一滴中性红—詹纳斯绿B（Janus green B）染液，均匀涂于染液中，染色0.5～1 min，加盖玻片后立即观察。
6、绘图并描述现象。
低倍镜下可见成群或分散存在的口腔内粘膜上皮细胞，形态大多呈扁平状，核呈圆形或椭圆形，位于细胞中央，被染成淡蓝色。选择单个轮廓清楚的细胞，转换高倍镜观察，可见细胞质中散在一些被染成亮绿色的粒状和短棒状的颗粒，即线粒体（如下图）。
实验六、Brachet染色法显示RNA
一、内容：以洋葱鳞茎内表皮为实验材料，采用Brachet染色法显示细胞中的RNA及DNA。
二、要求：了解Brachet染色法显示RNA及DNA的原理；掌握操作过程。
三、仪器与药品：材料：洋葱
药品：甲基绿（2%）-哌洛宁（1%）混合染料 （1：9）
仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀等
四、实验内容：
原理：
• Brachet染色法又称为甲基绿-哌洛宁（mehtyl-green-pyronim）染色法----当用甲基
绿-哌洛宁混合染料染细胞时，DNA被染成绿色而RNA被染成红色。
• 1899年由 Pappenheim 首创，1902年 Unna 对其进行了改良。
• 1940年 Brachet 研究证明了其原理：
• DNA分布于细胞核的染色质上，RNA分布于细胞质及细胞核的核仁内。虽然DNA
和RNA在结构上具有很多相似之处，但两者聚合程度不同，DNA聚合程度较高，RNA聚合程度较低。
• 甲基绿和派洛宁都是碱性染料：甲基绿属于三芳基甲烷，芳环的对位上有氨基，甲
基连在N原子上；派洛宁是氧杂蒽衍生物。
• PH4.6时，甲基绿与派洛宁跟核酸发生竞争性结合。甲基绿与DNA双螺旋外侧的磷
酸根基团结合力强，结合后阻止派洛宁从碱基之间插入-----DNA被甲基绿染成绿色。派洛宁与RNA结合力强，RNA结构松散，派洛宁可以插入，从而中和磷酸基团，阻止甲基绿染色-----RNA被哌洛宁染成红色。这样就能使细胞中两种核酸分别显示出来。
• 此反应对PH敏感，染料的纯度和染料的结合力都影响染色效果。
步骤：
1、取材：用镊子撕取一小块洋葱内表皮，剪成4~5mm2的小块，置于载玻片上。
2、染色：用吸管吸取1滴甲基绿-哌洛宁混合染料（Unna 染料），滴在表皮上，染色30-40mins。
3、冲洗：清水冲洗表皮至水无色即可，并用吸水纸吸干。
4、观察：盖上盖玻片后镜检。
5、绘图并描述结果
细胞质和核仁被染成红色（富含RNA），细胞核被染成绿色（富含DNA）。证明RNA在细胞中的分布：主要集中在细胞质及细胞核内，后者又主要集中在核仁内。在染色质及染色体内也存在微量RNA。
实验七、PAS法显示多糖
一、内容：以草履虫为实验材料，采用过碘酸-希夫反应显示细胞质中的多糖成分。
二、要求：了解PAS反应的原理；了解多糖在细胞中的分布。
三、仪器与药品：材料：草履虫培养液。
仪器：离心机2台、离心管8～12支、显微镜、擦镜纸、量筒、染色缸8～12只、纱布等； 药品：0.5%过碘酸（HIO4）溶液、Schiff试剂、10%偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）水溶液、1N
盐酸、1%甲基绿水溶液，二甲苯、95%酒精、100%酒精。
1、过碘酸酒精溶液配法（新鲜配制）
过碘酸（HIO4·2H2O） 0.4g
95％酒精 35ml
0.2M乙酸钠（27.2g溶于1000ml蒸馏水） 5ml
蒸馏水 5ml
以上溶液配好后保存在0～4℃的冰箱内，瓶加黑纸，此液如显棕黄色即失效。如用CH3COONa·3H2O，则M＝136.9， 0.2M ＝27.4。 如用CH3COONa，则M＝82.04， 0.2M ＝16.4。
2、Schiff试剂原液配法
先将200ml蒸馏水煮沸，由火上取下，加入碱性品红1g，充分搅拌，有助于溶解。待溶液冷到50℃时，过滤到磨口棕色试剂瓶中。加入1 mol/L HCl（比重1.19的浓盐酸10ml，蒸馏水110ml）溶液20ml，冷却到25℃时加入1g 偏重亚硫酸钾（K2S2O5）或偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）、充分振荡后盖紧瓶塞，在室温下放置暗处过夜（至少14～24小时，有时需2～3天）。取出时，其颜色应退至淡黄色或近于无色，（溶液如呈浅红色可加一匙约0.5g中性活性炭吸色，剧烈振荡1min），过滤后即得无色品红（滤液应为无色）。
无色品红配成后须塞紧瓶塞，外包黑布或黑纸，储存在冰箱（4℃下可保存数月，冷冻可长期保存）或黑暗低温处。如果配制后的溶液颜色呈红色，除因操作步骤的差错外，多由于碱性品红或偏重亚硫酸钠质量不好。如果溶液颜色变为粉红色，则失效不能再用。
Na2S2O5
NaCl + H2SO3 + SO2
碱性品红
Schiff试剂
3、Schiff酒精溶液配法（配后如略带红色仍可使用）避光、避热、避氧气。
Schiff原液 11.5ml
1N盐酸 0.5ml
纯酒精 23ml
4、亚硫酸水溶液（漂洗液）配法
10％偏重亚硫酸钠水溶液（10克偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾、加100 ml蒸馏水）5ml，蒸馏水90ml，1 mol/L HCl 5ml，摇匀后塞紧瓶塞。新配制的漂白液二氧化硫气味很浓，至无味时即不能再用。此溶液不能保持太久，最多6～7天，最好在使用前现用现配，否则会因SO2的逸出而失效。
5、1N（1mol/L）盐酸配法：取密度为1.19的浓盐酸82.5ml，加蒸馏水至1000ml（如果密度为1.16的浓盐酸则用98.8ml，加蒸馏水至1000ml）。
6、1％甲基绿水溶液配法：1克甲基绿，99ml蒸馏水，再加1ml冰醋酸。
四、实验内容：
原理：
过碘酸是一种强氧化剂，可把多糖氧化成高分子醛化物。具体作用机理是打开多糖中葡萄糖单元的2，3位碳原子之间的连接，同时将多糖中的乙二醇基（CHOH－CHOH）氧化为两个游离醛基（－CHO）。然后，游离醛基可与Schiff试剂反应，形成红色
-紫红色的化合物，颜色深浅与多糖含量成正比。
步骤：
1、取草履虫培养液适量，纱布过滤稻草后，离心无稻草的草履虫培养液1400转/分×5min，取沉淀1~2滴滴于载玻片上；
2、95%酒精固定10min，此过程中要防止酒精完全挥发干，要不断补充酒精；
3、滴加几滴0.5% HIO4 作用15min；
4、滴加Schiff试剂（暗处室温）作用30~45min；
5、亚硫酸水漂洗三次（除去多余的无色品红），每次2min；
6、清水冲洗约1min后擦干玻片镜检。
7、绘图并描述结果。
细胞内的糖元呈红色-紫红色颗粒。显色深浅与细胞中乙二醇基含量成正比，多时呈深紫红色。
实验八、染色体玻片标本的制作
一、内容：以小鼠股骨骨髓细胞为实验材料，采用低渗滴片法制备染色体玻片标本，利用显微镜观察中期分裂相。
二、要求：掌握动物细胞染色体标本的制做方法，掌握各操作步骤的作用及注意事项。
三、仪器与药品：注射器、解剖器具(剪刀、镊子、解剖刀)、离心管、吸管、试管、水浴锅、载玻片、离心机、显微镜；秋水仙素(0.01％)、乙醇、冰醋 酸、生理盐水，0.075M KCl低渗液、Giemsa染料
四、实验内容：
（一）背景知识
染色体是基因的载体。真核细胞染色体数目和结构是重要的遗传指标之一，制备染色体标本无疑是细胞遗传学最基本的技术。优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。
染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。
在正常动物体内，精巢和骨髓均为活跃分裂的组织，可不经PHA处理和体外培养而直接用来制作染色体标本。通过骨髓制备染色体程序比较简单，一般也无需无菌操作。小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。 选用小鼠、青蛙或蟾蜍的骨髓细胞作为实验材料时，操作包括以下几个要点：
取材以前将一定剂量的秋水仙素进行腹腔注射，处理一段时间以破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期；
骨髓细胞取出后，用低渗液处理使细胞膨胀，以至于在滴片时细胞可破裂，使细胞内的染色体分散平铺到载玻片上；
空气干燥法滴片可使染色体在载玻片上展平并固定，经Giemsa染料染色后便可观察到染色体的数量和形态。
（二）实验步骤：
总流程：预处理→取骨髓细胞→低渗+预固定→离心→固定→离心→细胞悬液定容→滴片→干燥→染色→观察
具体步骤：
1、前处理：取骨髓细胞前5－8小时向小鼠腹腔内注射秋水仙素（5μg/g)。（将有丝分裂阻断在中期，增加中期分裂相的比例）
2、取材：处死小鼠剖出股骨（注意不要将股骨剪断，否则容易造成骨髓细胞的流失），将股骨上的肌肉拧擦干净后，取骨髓细胞。先剪去股骨两端，再用注射器和针头吸取生理盐水溶液，将针头插入骨髓腔，以生理盐水将骨髓细胞冲入离心管中(获得有丝分裂细胞，注意冲出骨髓细胞的动作要快，冲击量大，细胞多，并要求预温药液至25℃)。生理盐水用量大约6ml。
3、染色体制备：
（1）低渗：800-1000rpm离心8mins，去除上清液，加入6ml预温至25℃的0.075M 的KCl溶液，用吸管轻轻吹散细胞，置25℃条件下低渗20分钟。（使细胞膨胀，利于滴片时染色体分散）
（2）预固定： 800-1000rpm离心8mins，去除上清，加入6ml新制的Carnoy’s固定液（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管轻轻将细胞吹散，固定10mins。
（3）固定：离心，去上清，加入6ml新制的Carnoy’s固定液（甲醇：冰乙酸=3：1），混匀，固定10mins, (此步重复两次)。离心，去上清后，加入约0.5ml新Carnoy’s固定液，用滴管轻轻将细胞吹散，制成细胞悬液。
4、滴片：
取出预冷的干净载玻片→ 以60-75cm的高度滴片→ 自然干燥→ Giemsa染料染色10mins→流水冲洗1～2mins →镜检
5、绘图并描述结果。
五、作业：
总结影响制片效果的因素。
为什么滴片需要用冰冻的冷载玻片？
小白鼠染色体的数目是多少？请绘制一个中期分裂相。
实验九、植物细胞骨架的光镜观察
一、内容：以洋葱内表皮为实验材料，用光镜观察细胞骨架的形态与分布。
二、要求：了解细胞骨架的结构，掌握细胞装片的制片技术。
三、仪器药品与材料
水浴锅、5-10ml塑料离心管、镊子、剪 刀、载玻片、盖玻片、吸管、吸水纸等；
6 mM 磷酸缓冲液PBS、1% triton X- 100 （去垢剂）、3% 戊二醛、咪唑缓冲液、0.2% 考马斯亮兰R250染料；洋葱
（1） 6m mol/L PBS （pH 6.5）
A液：NaH2PO4. H2O 468 mg/500ml;
B液：Na2HPO4.12H2O 1074 mg/500ml；
工作液：A液68.5 ml+B液31.5 ml （用5% NaHCO3 调pH至6.5）.
（2）M缓冲液 （pH7.2）：
咪唑 3.40g、 KCl 3.71g、 MgCl2.6H2O 101.65mg、
EGTA （乙二醇双醚四乙酸）380.35mg、EDTA （乙二胺四乙酸） 29.22mg、 甘油 292ml，
加蒸馏水至1000ml （用1mol/L HCl 调pH至7.2）
（3）1% Tritno X-100：
Triton X-100 液1 ml、M缓冲液99 ml。
（4）3% 戊二醛：
25%戊二醛12 ml、 6m mol/L PBS液88ml。
（5）0.2% 考马斯亮蓝R250染液：
考马斯亮蓝R250粉末0.2g、
甲醛46.5ml、冰醋酸7 ml、蒸馏水46.5 ml。
四、实验内容：
原理：
细胞骨架是指细胞中纵横交错的纤维网络结构，它们是由各种不同成分的蛋白质组成，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。
当用适当浓度的非离子去垢剂triton X-100 处理细胞时，可以使细胞中的可溶性蛋白和脂类物质被溶解除去。而微丝束是不可溶性蛋白，不会被triton X-100破坏而留在细胞中，再用固定剂对其进行固定，然后用非特异性蛋白染料（考马斯亮蓝R250)对其进行染色，可在光镜下观察细胞骨架的网状结构。
注：考马斯亮蓝R250并不特异的显示微丝，但由于有些细胞骨架纤维（如，微管）在该实验条件下不稳定，又因某些类型的纤维太细而在光镜下无法分辨，因此看到的基本是由微丝组成的纤维束，直径在40nm左右。
步骤：
1、取材：撕取洋葱鳞茎内表皮5mm2，浸入装有6mM PBS 缓冲液的烧杯或小瓶内，使材料下沉，处理5mins；
2、抽提：吸去PBS，加去垢剂1%Triton X-100液2ml，使液体充分浸泡材料，并立即放入37℃水浴锅中处理20mins；
3、冲洗：吸去1%Triton，用M缓冲液(咪唑+螯合剂+ K+ + Mg2+ ）轻轻冲洗3次，每次3mins；
注：咪唑为缓冲剂，其中的EGTA和EDTA是螯合剂，螯合Ca2+，低Ca2+条件下，骨架纤维保持聚合状态。在Mg2+和高浓度Na+、K+条件下，球形肌动蛋白装配成微丝。）
4、固定：加3%戊二醛固定15mins；
5、冲洗：吸去3%戊二醛固定液，用6mM PBS缓冲液冲洗3次，每次3mins；
6、染色：吸去PBS缓冲液，滴几滴0.2%考马斯亮兰R250染料，染色10mins；
7、制片：吸去染料，用蒸馏水洗2-3次，将标本平铺在载玻片上，加盖片；
8、镜检：绘制洋葱表皮细胞骨架图并描述现象。
将制好的片子置于光镜的低倍镜下，可见到规则排列的长方形洋葱表皮细胞轮廓，细胞内可见到被染成蓝色的粗细不等的纤维网络结构，便是构成细胞骨架的微丝束。
选择染色较好的细胞，转高倍镜继续观察，调节细焦镙旋可见到细胞骨架的立体结构。
实验十、活细胞观察与死、活细胞鉴别
一、内容：以小鼠脾脏淋巴细胞为实验材料，台盼蓝法鉴定细胞死活。
二、要求：掌握死活细胞鉴别的原理和方法；了解细胞存活率的意义。
三、仪器与药品：
材料：小鼠脾脏淋巴细胞
仪器：镊子、剪 刀、注射器、载玻片、盖玻片、吸管、吸水纸等
药品：0.9%生理盐水 、0.4%台盼蓝（生理盐水配制）
四、实验内容：
原理：
细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用的是染色排除法和荧光排除法。染色排除法的原理：许多酸性染料如台盼蓝等不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，而活细胞不着色。以此来区分死活细胞。
细胞存活率（%）= 细胞总数—死细胞数/细胞总数
步骤：
1、取材：取小鼠脾脏，用盛有2mL生理盐水的注射器冲击脾脏，下接一个10mL离心管。
2、染色：取0.5ml细胞悬液放入干净试管中，加入约0.1ml（1~2滴）0.4%台盼蓝染液，混合，2min后立即制成临时装片，镜检。
3、绘图描述结果并计算存活率：
死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
实验十一、动物细胞微丝束的光镜观察
一、内容：以小鼠血管平滑肌细胞或成纤维细胞为实验材料，考马斯亮蓝法光镜观察细胞骨架的形态与分布。
二、要求：了解动物细胞骨架的结构，掌握动物细胞装片的制片技术。
三、仪器药品与材料
小鼠血管平滑肌细胞或成纤维细胞；
水浴锅、5-10ml塑料离心管、镊子、剪 刀、载玻片、盖玻片、吸管、吸水纸等；
1M PBS、1% triton X- 100 （去垢剂）、3% 戊二醛、咪唑缓冲液、0.2% 考马斯亮兰R250染料
四、实验内容：
原理：
显色原理基本同植物细胞骨架，只是分布与植物骨架不同，正常动物细胞中的微丝束大多以平行方式平行于细胞长轴排列。癌症细胞内细胞骨架不完整。
步骤：
1、清洗盖片：将盖玻片清洗干净并高压灭菌或酒精消毒，置于无菌六孔细胞培养板中；
2、培养细胞：原代或用传代培养冻存的平滑肌或成纤维细胞，于六孔培养板中长至50%~60%
融合；
3、洗涤：弃去培养液，PBS洗涤3次，每次2min；
4、抽提：吸去PBS，加去垢剂1%Triton X-100液1ml，室温处理20mins；
5、冲洗：吸去1%Triton，用M缓冲液(咪唑+螯合剂+ K+ + Mg2+ ）轻轻冲洗3次，每次3mins；
注：咪唑为缓冲剂，其中的EGTA和EDTA是螯合剂，螯合Ca2+，低Ca2+条件下，骨架纤维保持聚合状态。在Mg2+和高浓度Na+、K+条件下，球形肌动蛋白装配成微丝。）
6、固定：加3%戊二醛固定15mins；
7、冲洗：吸去3%戊二醛固定液，用PBS缓冲液冲洗3次，每次3mins；
8、染色：吸去PBS缓冲液，滴几滴0.2%考马斯亮兰R250染料，染色10mins；
9、制片：吸去染料，用蒸馏水洗2-3次，将长有细胞的盖片反扣在载玻片上，擦干镜检。
10、绘图并描述现象：
实验十二、细胞凝集反应
一、内容：以鸭血或鸡血为实验材料，观察细胞凝集反应。
二、要求：了解凝集反应原理，掌握实验操作过程。
三、仪器药品与材料
1 ．器材: 显微镜、天平、载玻片、滴管、离心管、烧杯、10ml移液管、试管、试管架 2 ．材料: 土豆块茎
3 ．试剂: ２％鸭血红细胞、抗凝血剂、PBS、土豆块茎。
四、实验内容：
原理：
动物细胞表面的糖蛋白、糖脂中的糖链伸向膜的表面，是细胞识别、免疫及接触抑制现象的必要组分。凝集素lectin是一类含糖的，并能与糖专一并可逆结合的蛋白质，能与细胞外被的寡糖链相连接，使细胞发生凝集并刺激细胞分裂。
步骤：
1、2％鸭血红细胞悬液制备
新鲜鸭血加抗凝剂，生理盐水洗5次，每次2000r/min，离心5min，按红细胞压积用生理盐水配成２％鸭血红细胞悬液。
2、土豆凝集素制备
土豆2克，加10ml PBS，浸泡2h
3、细胞凝集反应
土豆凝集素1滴、2％鸭血红细胞液１滴，于载玻片上混匀，静置20min，
4 、对照
PBS1滴、2％鸭血红细胞液2滴
5、镜检
6、绘图并描述现象。