中国组织工程研究与临床康复
第 13 卷 第 32 期 2009–08–06 出版
August 6, 2009 Vol.13, No.32
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research
基础医学
人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性**☆◆
徐 燕1，李长虹1，孟恒星2，郝 牧1，邱录贵1
，2
Optimization of culture condition and biological characteristics of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
Xu Yan1, Li Chang-hong1, Meng Heng-xing2, Hao Mu1, Qiu Lu-gui1,2
Abstract
1
BACKGROUND: It is necessary to find other sources of mesenchymal stem cells (MSCs) due to the difficulty in obtaining enough bone marrow derived cells as well as the decreased number and differentiation potential of bone marrow derived-MSCs (BM-MSCs) with increasing age. OBJECTIVE: To optimize the isolation and expansion system of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs), and to explore the biological characteristics of UC-MSCs. DESIGN, TIME AND SETTING: The in vitro cytology experiments were performed at the State Key Laboratory of Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union of Medical College from September 2006 to March 2008. MATERIALS: Seventeen samples of human umbilical cords were obtained from healthy full-term neonates from Tianjin Central Hospital of Gynaecology and Obstetrics. METHODS: Human umbilical cords were processes within 6 hours with explantation technique, collagenase digestion and enzymes combination digestion after harvested, and followed by counted colony numbers. A colony contains more than 50 cells. When the cells reached 70%-80% confluency, cells were recovered using trypsin-EDTA and were passaged at a density of (2.5-5.0)×103/cm2. MAIN OUTCOME MEASURES: Cell morphological feature and cell yields with different isolation and expansion system were compared. Then the proliferation capability and immunophenotype of UC-MSCs were analyzed by flow cytometry. The differentiation potential of UC-MSCs was studied by specific staining methods. RESULTS: At 6-10 days after explantation, the fibroblast-like cells were sprawled out from the edge of the little cubes as scattered or formed little clones, and morphology of which was similar to that of BM-derived MSCs, an 0.5 cm umbilical cord tissues contained (5.2±1.7) ×105 adhesive cells were harvested at the primary culture, which could steady passage for 15 passages, with 6.2 folds amplication in per passage. The cell yields, passage time and doubling times in explantation technique group were higher than those in collagenase digestion group (P
Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union of Medical College, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Tianjin 300020, China; 2 Umbilical Cord Blood Bank of Tianjin, Tianjin 300384, China Xu Yan☆, Doctor, Attending physician, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union of Medical College, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Tianjin 300020, China [email protected] Correspondence to: Qiu Lu-gui, Master, Chief physician, Doctoral supervisor, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union of Medical College, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Tianjin 300020, China; Umbilical Cord Blood Bank of Tianjin, Tianjin 300384, China drqiu99@medmail. com Supported by: the Science and Technology Development Program of Tianjin, No.06YFSYSF01900*; the Innovation Foundation of Tianjin, No.08FDZDSH03000* Received: 2009-03-25 Accepted: 2009-05-05
摘要
背景：由于大量获取骨髓细胞存在困难，并且骨髓间充质干细胞随年龄的增加出现数量及分化潜能下降，因此需要寻找其 他间充质干细胞来源。 目的：优化人脐带间充质干细胞的分离培养条件，进一步明确其生物学特性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于 2006-09/2008-03 在中国医学科学院血液学研究所国家重点实验室完成。 材料：17 份脐带标本取自健康足月新生儿，由天津市中心妇产医院提供。 方法：脐带采集后在 6 h 内分别用植块法、胶原酶消化法、胶原酶与胰酶联合消化法进行分离培养，于培养第 14 天计数集 3 2 落数，超过 50 个细胞计为集落。当细胞达 70%~80%融合时，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合消化，以(2.5~5.0)×10 /cm 密 度传代培养。 主要观察指标：比较不同培养方法所获贴壁细胞的形态学特征、细胞产率，应用流式细胞技术分析细胞增殖活性、免疫表 型，特异性染色方法鉴定细胞的多向分化潜能。 结果：植块法培养 6~10 d 可见成纤维样细胞从植块边缘爬出，形态与骨髓间充质干细胞相似，散在分布或形成小克隆，原 5 代可获得(5.2±1.7)×10 个贴壁细胞/0.5 cm 脐带组织，至少可稳定传 15 代，平均每代扩增 6.2 倍，在原代细胞克隆数、细 胞产率、传代时间及扩增倍数上与胶原酶消化法比较存在明显差异(P
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
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1 中国医学科学院 北京协和医学院 血液学研究所血 液病医院， 实验血 液学国家重点实 验室，天津市 300020；2 天津市 脐带血造血干细 胞库，天津市 300384
徐燕，等.人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性
实验方法： 0 引言 目前成体干细胞的研究多集中于骨髓来源 的间充质干细胞
[1-7]
人脐带间充质干细胞的培养 [14-15， 19， 26] ： 脐带
采集后在6 h内进行处理，切除双侧带夹痕及 淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲 洗脐带外周以及脐静脉内腔，用以下3种方法 进行分离培养， 3种方法均于培养的第14天计 数集落数，超过50个细胞计为集落。当细胞 达 70%~80%融 合 时 ， 以 含 1.25 g/L胰 蛋 白 酶-1 g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以 (2.5~5.0)×103/cm2 密度接种传代培养，计为 第1代(P1)细胞。 植块法：沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥 离脐静脉内膜，将剩余组织切成3.0~5.0 mm3 小块，贴于预先用1 mL完全培养基(含体积分 数为2%胎牛血清、40% MCDB201、10 µg/L 血小板衍生生长因子、10 µg/L碱性成纤维细 胞生长因子、 µg/L表皮生长因子的DF12培 10 养基)润湿的T25培养瓶底壁，底壁朝上，置 于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱 中， 过夜后翻转。 每24 h加入1 mL上述培养基， 72 h全量换液，以后每周换液2次。观察贴块 周围贴壁细胞爬出情况。2周后去贴块。 1 材料和方法 设计：细胞学体外观察。 时间及地点： 于2006-09/2008-03在中国医 学科学院血液学研究所国家重点实验室完成。 材料：17份脐带标本取自健康足月顺产或 剖宫产的新生儿， 由天津市中心妇产医院提供， 产妇及家属对实验均知情同意，并经医院伦理 委员会批准。
主要试剂及仪器：
试剂与仪器 DF12 培养基 血小板衍生生长因子、碱性成纤维 细胞生长因子、表皮生长因子 BD Cycle TEST
TM
，但由于获取大量骨髓细胞
用于细胞组织工程存在一定困难，并且骨髓间 充质干细胞随年龄的增加会出现数目及分化潜 能下降等问题 。 课题组此前研究已经证明， 脐 带血中存在多能成体干/祖细胞，其生物学特性 以及功能特征与骨髓间充质干细胞类似，但分 离间充质干细胞的过程以丢失造血干细胞为代 价，而且个体差异大
[9-12] [8]
徐 燕☆，女， 1975 年生，浙江 省常山县人，汉 族，2007 年中国 医学科学院北京 协和医学院血液 学研究所毕业， 博 士，主治医师，主 要从事间充质干 细胞及造血与淋 巴系统疾病方面 的研究。 yanzi_zjyl@163. com 通讯作者：邱录 贵，硕士，主任医 师，博士生导师， 中国医学科学院 北京协和医学院 血液学研究所血 液病医院， 实验血 液学国家重点实 验室，天津市 300020；天津市 脐带血造血干细 胞库，天津市 300384 drqiu99@ medmail.com 天津市科技发展 计 划 项 目 （06YFSYSF019 00）*；天津市科 技创新专项资金 （ 08FDZDSH03 000）*
中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2009)32-06289-06 收稿日期： 2009-03-25 修回日期： 2009-05-05 ([1**********]/ ZS·Z)
。 。 不同的培养方法导
最近报道认为， 人脐带的结缔组织是间充质 干细胞丰富的组织来源
[13-25]
致人脐带来源的细胞表现为神经元表型[16-17，20]、 胰岛样细胞表型[21]、 内皮细胞表型或表达心肌细 胞标记[8，18]，提示这类细胞具有多向分化潜能。 实验比较了不同培养方法对人脐带间充质 干细胞培养结果的影响，以期优化脐带间充质 干细胞的培养条件及体系，并进一步明确脐带 间充质干细胞的生物学特性。
胶原酶消化法：夹闭脐静脉一端，灌入 1 g/L胶原酶Ⅱ3.0~5.0 mL， 置于含双抗的PBS 中，37 ℃孵育0.5 h，收集酶液，并用PBS反 复灌洗，收集灌洗液，与酶液同时离心洗涤弃 上清后，以完全培养基重悬，1×106/cm2接种 于T25培养瓶中，3 d后全量换液，以后每周换 液2次。观察贴壁细胞生长。 胶原酶与胰酶联合消化法：将脐带组织切 成1.0~2.0 mm3小块，直接加入1 g/L胶原酶Ⅱ 于37 ℃孵育16 h，以PBS洗涤后加入25 g/L胰 酶于37 ℃孵育0.5 h；加入含体积分数为20%
来源 美国 GIBCO 公司 英国 Peprotech 公司 美国 BD Biosciences 公司
胎牛血清的培养基中和胰酶，以100 µm的滤器 过滤细胞，收集滤液；PBS洗涤弃上清后，以 完全培养基重悬， 按1×106/cm2接种于T25培养 瓶中，3 d后全量换液，以后每周换液2次。观 察贴壁细胞生长。
人脐带间充质干细胞生长曲线分析 [26] ： 将第
PLUS DNA
Reagent Kit、小鼠抗人 PE 或 FITC 标记的单抗 CD14，CD31， CD34，CD44，CD45，CD62E， CD73，CD90，CD95，CD105， CD133，HLA-DR，KDR 及同 型对照、vWF 单抗、流式细胞仪 胎牛血清
2~8代细胞以5×103/孔接种于24孔培养板中， 培养体系同上。每隔24 h以含1.25 g/L胰蛋白 酶-1 g/L乙二胺四乙酸的消化液消化3个孔， 收 集细胞计数。 按Patterson公式计算对数生长期 细胞群体倍增时间：Td=T×lg2/lg(Nt/N0)。Td： 倍增时间(h)；T：细胞数由N0增至Nt所用时间 (h)；N：细胞数。
人脐带间充质干细胞周期检测[26]：按BD Cycle
美国 Hyclone 公司 MCDB201、胶原酶Ⅱ、胰酶-乙二胺 Sigma 公司 四乙酸、地塞米松、3-磷酸甘油、 2-磷酸抗坏血酸、胰岛素、异丁基 甲基黄嘌呤、吲哚美辛
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TESTTM PLUS DNA Reagent Kit操作方法进行周期检 测：在细胞生长的对数期消化细胞，取5×105个细胞先 后加入A液(trypsin buffer)250 µL、B液(trypsin inhibitor and RNase buffer)200 µL，用手轻拍混匀后，分别室 温反应10 min；最后直接加入冰的(2~8 ℃)C液(PI染 液)200 µL，拍打混匀，冰上孵育10 min；流式细胞仪 检测。
人脐带间充质干细胞免疫表型检测[9-10，26] ：以1.25 g/L
胰蛋白酶-1 g/L乙二胺四乙酸消化收集P2细胞，磷酸 盐缓冲液洗涤2次，分成每管含5×10 细胞，分别加小 鼠抗人PE或FITC标记的单抗CD14，CD31，CD34， CD44， CD45， CD62E， CD73， CD90， CD95， CD105， CD133，HLA-DR，KDR及同型对照等10 µL，4 ℃避 光孵育30 min， 磷酸盐缓冲液洗涤后用10 g/L多聚甲醛 固定。vWF采用间接免疫荧光标记法，流式细胞仪检 测分析。
细胞的多向分化潜能及分化后鉴定[9-10]：消化体外扩增
5
a: At 6-10 days after explantation, the fibroblast-like cells were found sprawled out from the edge of the little cubes as scattered or formed little clones (×50)
的P2细胞，以5×103/cm2密度接种于预先放置无菌消毒 盖玻片的6孔板中，制备细胞爬片，每孔加2 mL上述培 养基。在细胞达到60%~70%融合时，分别更换为成骨 及成脂诱导分化培养基，诱导后行茜素红、油红O染色 进行鉴定。 主要观察指标：①不同培养方法对人脐带间充质干 细胞培养结果的影响。②细胞生长曲线分析、细胞周期 特征。③细胞免疫表型特征。④诱导分化后特异性染色 结果。 设计、实施、评估者：设计为第五作者，实施与评 估为全部作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 统计学方法：由第一作者采用SPSS 13.0软件包进 行统计处理分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用 不配对t 检验或ANOVA分析，P
_
b: UCMSCs of passage 2 were fibroblast-like and homogeneous which arranged in parallel or whirlpool (×200)
Figure 1
Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSCs) isolated by explantation technique 图 1 植块法培养获得的人脐带间充质干细胞
胶原酶消化法原代培养主要有3种形态的贴壁细 胞，即梭形、多角形、宽大扁平形，但所获细胞易变形， 增殖能力迅速下降；传代后以多角形的类内皮样细胞为 主，见图2。
a: Three types of attached cells were observed in primary culture: fibroblast-like, polygon and flattened
或单个核细胞应用完全培养基进行培养。 植块法培养6~10 d可见成纤维样细胞从植块边缘 爬出，形态与骨髓间充质干细胞相似，散在分布或形成 小克隆，见图1a；3周左右细胞达70%~80%融合，细胞 呈平行或漩涡状排列。 原代可获得(5.2±1.7)×105个贴壁 细胞/0.5 cm脐带组织，细胞至少可稳定传15代，平均 每代扩增6.2倍。 按照每根脐带中位长30 cm计算，原代平均可获 3.12×10 个贴壁细胞。传代后细胞呈均一的梭形，平行 或漩涡状排列，见图1b。
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b: The majority cells of passage 1 were polygon which were endothelial-like
Figure 2
Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells isolated by collagenase digestion (×100) 图 2 胶原酶消化法获得的人脐带间充质干细胞(×100)
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胶原酶与胰酶联合消化法接种后未见明显贴壁细 胞。在原代细胞克隆数、细胞产率、传代时间及扩增倍 数上，植块法与胶原酶消化法比较存在明显差异(P
内皮细胞标记KDR，CD31和vWF，而整合素和黏附分 子CD44，CD90，CD95以及常用的人间充质干细胞标 记CD73(SH-3)，CD105(SH-2)则均呈高表达，见图4。
表 1 不同培养方法所获人脐带间充质干细胞的比较 Table 1 Human umbilical cord-derived mesenchymal stem _ cells isolated by different methods (x±s)
Succeed/ Total 9/9 4/4 0/4 Colony numbers of primary passage per flask (number) 28±4a 7±3 0 Time of cell primary culture (d) 18±3a 27±5 -
Culture method
Explantation Collagenase digestion Enzymes combination digestion
Culture method
Number of primary cell (×105)/0.5 cm umbilical cord 5.20±1.70a 0.03±0.01 -
Passage period (d) 4.5±1.5a 9.0±2.9 -
Folds of amplification 6.2±2.3a 3.1±1.8 -
Explantation Collagenase digestion Enzymes combination digestion
a
P
2.2
人脐带间充质干细胞的生长曲线及细胞周期情况
生长曲线显示：人脐带间充质干细胞接种后0~3 d处于 潜伏期，细胞无明显增殖；第4天进入对数增长期，维 持至第8天；之后进入平台期，倍增时间为45 h，且基 本保持稳定。 对 处 于 对 数 增 长 期 的 细 胞 按 BD Cycle TESTTM PLUS DNA Reagent Kit操作法进行周期检测，72.09% 细胞处于G0/G1期，约20%细胞处于增殖的S+G2+M期， 见图3。
Figure 3 图3
Cell cycle of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells 人脐带间充质干细胞的细胞周期分析
2.3
人脐带间充质干细胞的免疫表型特征
流式细胞
Figure 4
学检测显示，人脐带间充质干细胞不表达造血细胞标记 CD34，CD45，CD14，HLA-DR和CD133，也不表达
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Phenotye of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells 图 4 人脐带间充质干细胞的表型特征
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2.4 人脐带间充质干细胞的分化潜能 体外诱导2周， 第2代人脐带间充质干细胞可以形成成骨细胞和脂肪细 胞，茜素红染色发现前者细胞浆中有大量的钙沉积，见 图5a；油红O染色发现后者细胞浆充满了油滴空泡，见 图5b。
验则比较了不同培养方法对分离培养脐带间充质干细 胞成功率、产率的影响，结果显示通过植块培养法及胶 原酶消化脐静脉内膜法均从脐带组织中成功地分离培 养出梭形或纺锤形的贴壁细胞，其中以植块培养法的细 胞产率最高，传代后细胞形态及增殖活性最稳定。这与 Lu等[26]报道的联合酶消化法相当；而Ma等[19]采用的也 是植块法，但对于影响其临床应用的关键因素分离培养 成功率没有报道。Sarugaser等[14]发现，脐带组织中成 纤维细胞集落形成单位的频率相当高(1∶333)，每根脐 带可以产生(2~5)×106个人脐带血管周细胞。Lu等[26]应 用胶原酶与胰酶联合消化法的成纤维细胞集落形成单 位频率虽然相对较低(1∶1 609)，但其每根脐带消化后 获得的单个核细胞明显高于Sarugaser等[14]的报道，因 此最终获得的原代细胞数也高于后者。实验所采用的植
a: Cells were positive to alizarin red S-staining (×200)
块法未进行脐带组织的消化，因此没有计算单个核细胞 中成纤维细胞集落形成单位的频率，但培养后所获得的 原代细胞数高于上述2项报道，因此细胞产率极高。而 且不需进行酶消化或磁珠分选，使操作更加简单，更节 约了成本，而培养效率更高。实验同时也采用了Lu等[26] 报道的联合酶消化法，结果显示所获得的单个核细胞在 相同的培养条件下并不能贴壁，考虑可能与酶作用时间 过长影响了细胞的活力以及贴壁能力有关。此外，实验 还尝试了胶原酶消化脐静脉内膜法，贴壁成功率虽达
b: Cells were positive to oil red O-staining (×1 000)
100%(4份脐带均成功贴壁)，但原代细胞的产率极低， 而且细胞均一性较差，以内皮样细胞为主，估计胶原酶 消化后获得的脐静脉内皮层及内皮下层的单个核细胞 中含有大量的内皮细胞，间充质干细胞样细胞仅占极少 数。 实验所获得的脐带间充质干细胞具有与既往报道 的脐带来源间充质干细胞相似的性质，包括细胞形态、 免疫表型、增殖活性、细胞周期状态，同时也发现了一
Figure 5 图5
Differentiation potential of passage 2 umbilical cord-derived mesenchymal stem cells 2 weeks after induction in vitro 体外诱导 2 周后第 2 代脐带间充质干细胞的多向分化 潜能
3
讨论 目前多个研究小组已成功地从脐带组织中分离出
些差别。 细胞的倍增时间略长于Sarugaser等[14，26]报道， 分析可能是培养体系的差别影响了细胞的增殖能力，但 本体系中细胞平均4.5 d即可传1代，细胞平均倍增6.18 倍，因此短期培养也可获得足够的细胞数进行细胞治 疗。流式细胞学检测发现，与骨髓间充质干细胞相似， 脐带间充质干细胞不表达造血细胞标记，也不表达内皮 细胞标记CD31，KDR和vWF，而整合素和黏附分子 CD44，CD90，CD95，CD73，CD105的表达率均达 95%以上。而Ma等[19]同样经植块法所获细胞的CD44表 达率仅76.7%，到第8代仅52.1%，他们没有报道CD73 与CD105的表达情况； Lu等[19]的报道中虽然提示CD73， CD105呈强阳性，但仅>75%。因此实验所分离培养的 脐带间充质干细胞可能更均一，在本培养体系中性质更 稳定。 对于这类细胞的分化潜能研究发现，与骨髓间充质 干细胞相似，脐带间充质干细胞在特定的诱导条件下也
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具有间充质干细胞性质的干细胞，分离方法主要包括酶 消化脐静脉内膜法或联合消化脐带Wharton’s Jelly组 织等方法
[13-18，20-21]
， 个别研究小组则应用植块法
[19]
。 根
据研究小组及培养方法的不同，将所获得的贴壁细胞称 为间充质干细胞、类间充质干细胞、人脐带血管周细胞 或基质干细胞
[11-12，27]
。 早期研究主要通过胰酶或胶原酶
消化脐静脉内膜，收集消化液获得单个核细胞后进行贴 壁培养，认为脐带间充质干细胞来源于脐静脉内皮下 层，但都没有成纤维细胞集落形成单位及细胞产率方面 的 报 道 [20-22 ， 28] 。 此 后 研 究 发 现 在 脐 带 血 管 周 围 的 Wharton’s Jelly组织中含有大量的间充质细胞，通过植 块法或酶消化法进行培养可以获得更高增殖活性的具有 间充质干细胞性质的干细胞，而且产量更高
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[14-15，26]
。实
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徐燕，等.人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性
能向成骨细胞、脂肪细胞等基质细胞分化。实验在培养 中还发现，随着细胞的传代，部分细胞自发聚集成团形 成肉眼可见的白色结节样结构，这与Sarugaser等[14]所 报道的骨结节形态极其相似，对于这种结构的具体性质 目前正在进一步的鉴定中。因此，设想实验分离的脐带 间充质干细胞中同样含有更多的成骨祖细胞，这个发现 可能使脐带间充质干细胞成为矫形与组织工程策略中 更合适的来源[29-30]。
[18]
[19] [20]
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[10]
[11] [12]
来自本文课题的更多信息-实验设计与文章构思：课题受天津市科技发展计划项目
（ 06YFSYSF01900 ）； 天 津 市 科 技 创 新 专 项 资 金 （08FDZDSH03000）资助，现阶段成果显示应用简单的植 块培养法可以从脐带组织中获得一群形态学及免疫表型类似 于骨髓间充质干细胞的非造血、非内皮的细胞群。由于人脐 带易于获得、供者无痛苦、可作为自体细胞治疗的来源及低 病毒感染率等优势，人脐带似乎可以替代骨髓而作为间充质 干细胞的来源。 后续试验会进一步将脐带间充质干细胞与骨髓、脐血来 源的间充质干细胞进行比较，并分析其向血管神经细胞的分 化潜能及基因表达情况等生物学特征。
[13] [14] [15] [16]
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中国组织工程研究与临床康复
第 13 卷 第 32 期 2009–08–06 出版
August 6, 2009 Vol.13, No.32
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research
基础医学
人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性**☆◆
徐 燕1，李长虹1，孟恒星2，郝 牧1，邱录贵1
，2
Optimization of culture condition and biological characteristics of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
Xu Yan1, Li Chang-hong1, Meng Heng-xing2, Hao Mu1, Qiu Lu-gui1,2
Abstract
1
BACKGROUND: It is necessary to find other sources of mesenchymal stem cells (MSCs) due to the difficulty in obtaining enough bone marrow derived cells as well as the decreased number and differentiation potential of bone marrow derived-MSCs (BM-MSCs) with increasing age. OBJECTIVE: To optimize the isolation and expansion system of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs), and to explore the biological characteristics of UC-MSCs. DESIGN, TIME AND SETTING: The in vitro cytology experiments were performed at the State Key Laboratory of Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union of Medical College from September 2006 to March 2008. MATERIALS: Seventeen samples of human umbilical cords were obtained from healthy full-term neonates from Tianjin Central Hospital of Gynaecology and Obstetrics. METHODS: Human umbilical cords were processes within 6 hours with explantation technique, collagenase digestion and enzymes combination digestion after harvested, and followed by counted colony numbers. A colony contains more than 50 cells. When the cells reached 70%-80% confluency, cells were recovered using trypsin-EDTA and were passaged at a density of (2.5-5.0)×103/cm2. MAIN OUTCOME MEASURES: Cell morphological feature and cell yields with different isolation and expansion system were compared. Then the proliferation capability and immunophenotype of UC-MSCs were analyzed by flow cytometry. The differentiation potential of UC-MSCs was studied by specific staining methods. RESULTS: At 6-10 days after explantation, the fibroblast-like cells were sprawled out from the edge of the little cubes as scattered or formed little clones, and morphology of which was similar to that of BM-derived MSCs, an 0.5 cm umbilical cord tissues contained (5.2±1.7) ×105 adhesive cells were harvested at the primary culture, which could steady passage for 15 passages, with 6.2 folds amplication in per passage. The cell yields, passage time and doubling times in explantation technique group were higher than those in collagenase digestion group (P
Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union of Medical College, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Tianjin 300020, China; 2 Umbilical Cord Blood Bank of Tianjin, Tianjin 300384, China Xu Yan☆, Doctor, Attending physician, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union of Medical College, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Tianjin 300020, China [email protected] Correspondence to: Qiu Lu-gui, Master, Chief physician, Doctoral supervisor, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union of Medical College, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Tianjin 300020, China; Umbilical Cord Blood Bank of Tianjin, Tianjin 300384, China drqiu99@medmail. com Supported by: the Science and Technology Development Program of Tianjin, No.06YFSYSF01900*; the Innovation Foundation of Tianjin, No.08FDZDSH03000* Received: 2009-03-25 Accepted: 2009-05-05
摘要
背景：由于大量获取骨髓细胞存在困难，并且骨髓间充质干细胞随年龄的增加出现数量及分化潜能下降，因此需要寻找其 他间充质干细胞来源。 目的：优化人脐带间充质干细胞的分离培养条件，进一步明确其生物学特性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于 2006-09/2008-03 在中国医学科学院血液学研究所国家重点实验室完成。 材料：17 份脐带标本取自健康足月新生儿，由天津市中心妇产医院提供。 方法：脐带采集后在 6 h 内分别用植块法、胶原酶消化法、胶原酶与胰酶联合消化法进行分离培养，于培养第 14 天计数集 3 2 落数，超过 50 个细胞计为集落。当细胞达 70%~80%融合时，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合消化，以(2.5~5.0)×10 /cm 密 度传代培养。 主要观察指标：比较不同培养方法所获贴壁细胞的形态学特征、细胞产率，应用流式细胞技术分析细胞增殖活性、免疫表 型，特异性染色方法鉴定细胞的多向分化潜能。 结果：植块法培养 6~10 d 可见成纤维样细胞从植块边缘爬出，形态与骨髓间充质干细胞相似，散在分布或形成小克隆，原 5 代可获得(5.2±1.7)×10 个贴壁细胞/0.5 cm 脐带组织，至少可稳定传 15 代，平均每代扩增 6.2 倍，在原代细胞克隆数、细 胞产率、传代时间及扩增倍数上与胶原酶消化法比较存在明显差异(P
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
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1 中国医学科学院 北京协和医学院 血液学研究所血 液病医院， 实验血 液学国家重点实 验室，天津市 300020；2 天津市 脐带血造血干细 胞库，天津市 300384
徐燕，等.人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性
实验方法： 0 引言 目前成体干细胞的研究多集中于骨髓来源 的间充质干细胞
[1-7]
人脐带间充质干细胞的培养 [14-15， 19， 26] ： 脐带
采集后在6 h内进行处理，切除双侧带夹痕及 淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲 洗脐带外周以及脐静脉内腔，用以下3种方法 进行分离培养， 3种方法均于培养的第14天计 数集落数，超过50个细胞计为集落。当细胞 达 70%~80%融 合 时 ， 以 含 1.25 g/L胰 蛋 白 酶-1 g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以 (2.5~5.0)×103/cm2 密度接种传代培养，计为 第1代(P1)细胞。 植块法：沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥 离脐静脉内膜，将剩余组织切成3.0~5.0 mm3 小块，贴于预先用1 mL完全培养基(含体积分 数为2%胎牛血清、40% MCDB201、10 µg/L 血小板衍生生长因子、10 µg/L碱性成纤维细 胞生长因子、 µg/L表皮生长因子的DF12培 10 养基)润湿的T25培养瓶底壁，底壁朝上，置 于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱 中， 过夜后翻转。 每24 h加入1 mL上述培养基， 72 h全量换液，以后每周换液2次。观察贴块 周围贴壁细胞爬出情况。2周后去贴块。 1 材料和方法 设计：细胞学体外观察。 时间及地点： 于2006-09/2008-03在中国医 学科学院血液学研究所国家重点实验室完成。 材料：17份脐带标本取自健康足月顺产或 剖宫产的新生儿， 由天津市中心妇产医院提供， 产妇及家属对实验均知情同意，并经医院伦理 委员会批准。
主要试剂及仪器：
试剂与仪器 DF12 培养基 血小板衍生生长因子、碱性成纤维 细胞生长因子、表皮生长因子 BD Cycle TEST
TM
，但由于获取大量骨髓细胞
用于细胞组织工程存在一定困难，并且骨髓间 充质干细胞随年龄的增加会出现数目及分化潜 能下降等问题 。 课题组此前研究已经证明， 脐 带血中存在多能成体干/祖细胞，其生物学特性 以及功能特征与骨髓间充质干细胞类似，但分 离间充质干细胞的过程以丢失造血干细胞为代 价，而且个体差异大
[9-12] [8]
徐 燕☆，女， 1975 年生，浙江 省常山县人，汉 族，2007 年中国 医学科学院北京 协和医学院血液 学研究所毕业， 博 士，主治医师，主 要从事间充质干 细胞及造血与淋 巴系统疾病方面 的研究。 yanzi_zjyl@163. com 通讯作者：邱录 贵，硕士，主任医 师，博士生导师， 中国医学科学院 北京协和医学院 血液学研究所血 液病医院， 实验血 液学国家重点实 验室，天津市 300020；天津市 脐带血造血干细 胞库，天津市 300384 drqiu99@ medmail.com 天津市科技发展 计 划 项 目 （06YFSYSF019 00）*；天津市科 技创新专项资金 （ 08FDZDSH03 000）*
中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2009)32-06289-06 收稿日期： 2009-03-25 修回日期： 2009-05-05 ([1**********]/ ZS·Z)
。 。 不同的培养方法导
最近报道认为， 人脐带的结缔组织是间充质 干细胞丰富的组织来源
[13-25]
致人脐带来源的细胞表现为神经元表型[16-17，20]、 胰岛样细胞表型[21]、 内皮细胞表型或表达心肌细 胞标记[8，18]，提示这类细胞具有多向分化潜能。 实验比较了不同培养方法对人脐带间充质 干细胞培养结果的影响，以期优化脐带间充质 干细胞的培养条件及体系，并进一步明确脐带 间充质干细胞的生物学特性。
胶原酶消化法：夹闭脐静脉一端，灌入 1 g/L胶原酶Ⅱ3.0~5.0 mL， 置于含双抗的PBS 中，37 ℃孵育0.5 h，收集酶液，并用PBS反 复灌洗，收集灌洗液，与酶液同时离心洗涤弃 上清后，以完全培养基重悬，1×106/cm2接种 于T25培养瓶中，3 d后全量换液，以后每周换 液2次。观察贴壁细胞生长。 胶原酶与胰酶联合消化法：将脐带组织切 成1.0~2.0 mm3小块，直接加入1 g/L胶原酶Ⅱ 于37 ℃孵育16 h，以PBS洗涤后加入25 g/L胰 酶于37 ℃孵育0.5 h；加入含体积分数为20%
来源 美国 GIBCO 公司 英国 Peprotech 公司 美国 BD Biosciences 公司
胎牛血清的培养基中和胰酶，以100 µm的滤器 过滤细胞，收集滤液；PBS洗涤弃上清后，以 完全培养基重悬， 按1×106/cm2接种于T25培养 瓶中，3 d后全量换液，以后每周换液2次。观 察贴壁细胞生长。
人脐带间充质干细胞生长曲线分析 [26] ： 将第
PLUS DNA
Reagent Kit、小鼠抗人 PE 或 FITC 标记的单抗 CD14，CD31， CD34，CD44，CD45，CD62E， CD73，CD90，CD95，CD105， CD133，HLA-DR，KDR 及同 型对照、vWF 单抗、流式细胞仪 胎牛血清
2~8代细胞以5×103/孔接种于24孔培养板中， 培养体系同上。每隔24 h以含1.25 g/L胰蛋白 酶-1 g/L乙二胺四乙酸的消化液消化3个孔， 收 集细胞计数。 按Patterson公式计算对数生长期 细胞群体倍增时间：Td=T×lg2/lg(Nt/N0)。Td： 倍增时间(h)；T：细胞数由N0增至Nt所用时间 (h)；N：细胞数。
人脐带间充质干细胞周期检测[26]：按BD Cycle
美国 Hyclone 公司 MCDB201、胶原酶Ⅱ、胰酶-乙二胺 Sigma 公司 四乙酸、地塞米松、3-磷酸甘油、 2-磷酸抗坏血酸、胰岛素、异丁基 甲基黄嘌呤、吲哚美辛
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徐燕，等.人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性
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TESTTM PLUS DNA Reagent Kit操作方法进行周期检 测：在细胞生长的对数期消化细胞，取5×105个细胞先 后加入A液(trypsin buffer)250 µL、B液(trypsin inhibitor and RNase buffer)200 µL，用手轻拍混匀后，分别室 温反应10 min；最后直接加入冰的(2~8 ℃)C液(PI染 液)200 µL，拍打混匀，冰上孵育10 min；流式细胞仪 检测。
人脐带间充质干细胞免疫表型检测[9-10，26] ：以1.25 g/L
胰蛋白酶-1 g/L乙二胺四乙酸消化收集P2细胞，磷酸 盐缓冲液洗涤2次，分成每管含5×10 细胞，分别加小 鼠抗人PE或FITC标记的单抗CD14，CD31，CD34， CD44， CD45， CD62E， CD73， CD90， CD95， CD105， CD133，HLA-DR，KDR及同型对照等10 µL，4 ℃避 光孵育30 min， 磷酸盐缓冲液洗涤后用10 g/L多聚甲醛 固定。vWF采用间接免疫荧光标记法，流式细胞仪检 测分析。
细胞的多向分化潜能及分化后鉴定[9-10]：消化体外扩增
5
a: At 6-10 days after explantation, the fibroblast-like cells were found sprawled out from the edge of the little cubes as scattered or formed little clones (×50)
的P2细胞，以5×103/cm2密度接种于预先放置无菌消毒 盖玻片的6孔板中，制备细胞爬片，每孔加2 mL上述培 养基。在细胞达到60%~70%融合时，分别更换为成骨 及成脂诱导分化培养基，诱导后行茜素红、油红O染色 进行鉴定。 主要观察指标：①不同培养方法对人脐带间充质干 细胞培养结果的影响。②细胞生长曲线分析、细胞周期 特征。③细胞免疫表型特征。④诱导分化后特异性染色 结果。 设计、实施、评估者：设计为第五作者，实施与评 估为全部作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 统计学方法：由第一作者采用SPSS 13.0软件包进 行统计处理分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用 不配对t 检验或ANOVA分析，P
_
b: UCMSCs of passage 2 were fibroblast-like and homogeneous which arranged in parallel or whirlpool (×200)
Figure 1
Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSCs) isolated by explantation technique 图 1 植块法培养获得的人脐带间充质干细胞
胶原酶消化法原代培养主要有3种形态的贴壁细 胞，即梭形、多角形、宽大扁平形，但所获细胞易变形， 增殖能力迅速下降；传代后以多角形的类内皮样细胞为 主，见图2。
a: Three types of attached cells were observed in primary culture: fibroblast-like, polygon and flattened
或单个核细胞应用完全培养基进行培养。 植块法培养6~10 d可见成纤维样细胞从植块边缘 爬出，形态与骨髓间充质干细胞相似，散在分布或形成 小克隆，见图1a；3周左右细胞达70%~80%融合，细胞 呈平行或漩涡状排列。 原代可获得(5.2±1.7)×105个贴壁 细胞/0.5 cm脐带组织，细胞至少可稳定传15代，平均 每代扩增6.2倍。 按照每根脐带中位长30 cm计算，原代平均可获 3.12×10 个贴壁细胞。传代后细胞呈均一的梭形，平行 或漩涡状排列，见图1b。
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b: The majority cells of passage 1 were polygon which were endothelial-like
Figure 2
Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells isolated by collagenase digestion (×100) 图 2 胶原酶消化法获得的人脐带间充质干细胞(×100)
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胶原酶与胰酶联合消化法接种后未见明显贴壁细 胞。在原代细胞克隆数、细胞产率、传代时间及扩增倍 数上，植块法与胶原酶消化法比较存在明显差异(P
内皮细胞标记KDR，CD31和vWF，而整合素和黏附分 子CD44，CD90，CD95以及常用的人间充质干细胞标 记CD73(SH-3)，CD105(SH-2)则均呈高表达，见图4。
表 1 不同培养方法所获人脐带间充质干细胞的比较 Table 1 Human umbilical cord-derived mesenchymal stem _ cells isolated by different methods (x±s)
Succeed/ Total 9/9 4/4 0/4 Colony numbers of primary passage per flask (number) 28±4a 7±3 0 Time of cell primary culture (d) 18±3a 27±5 -
Culture method
Explantation Collagenase digestion Enzymes combination digestion
Culture method
Number of primary cell (×105)/0.5 cm umbilical cord 5.20±1.70a 0.03±0.01 -
Passage period (d) 4.5±1.5a 9.0±2.9 -
Folds of amplification 6.2±2.3a 3.1±1.8 -
Explantation Collagenase digestion Enzymes combination digestion
a
P
2.2
人脐带间充质干细胞的生长曲线及细胞周期情况
生长曲线显示：人脐带间充质干细胞接种后0~3 d处于 潜伏期，细胞无明显增殖；第4天进入对数增长期，维 持至第8天；之后进入平台期，倍增时间为45 h，且基 本保持稳定。 对 处 于 对 数 增 长 期 的 细 胞 按 BD Cycle TESTTM PLUS DNA Reagent Kit操作法进行周期检测，72.09% 细胞处于G0/G1期，约20%细胞处于增殖的S+G2+M期， 见图3。
Figure 3 图3
Cell cycle of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells 人脐带间充质干细胞的细胞周期分析
2.3
人脐带间充质干细胞的免疫表型特征
流式细胞
Figure 4
学检测显示，人脐带间充质干细胞不表达造血细胞标记 CD34，CD45，CD14，HLA-DR和CD133，也不表达
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Phenotye of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells 图 4 人脐带间充质干细胞的表型特征
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2.4 人脐带间充质干细胞的分化潜能 体外诱导2周， 第2代人脐带间充质干细胞可以形成成骨细胞和脂肪细 胞，茜素红染色发现前者细胞浆中有大量的钙沉积，见 图5a；油红O染色发现后者细胞浆充满了油滴空泡，见 图5b。
验则比较了不同培养方法对分离培养脐带间充质干细 胞成功率、产率的影响，结果显示通过植块培养法及胶 原酶消化脐静脉内膜法均从脐带组织中成功地分离培 养出梭形或纺锤形的贴壁细胞，其中以植块培养法的细 胞产率最高，传代后细胞形态及增殖活性最稳定。这与 Lu等[26]报道的联合酶消化法相当；而Ma等[19]采用的也 是植块法，但对于影响其临床应用的关键因素分离培养 成功率没有报道。Sarugaser等[14]发现，脐带组织中成 纤维细胞集落形成单位的频率相当高(1∶333)，每根脐 带可以产生(2~5)×106个人脐带血管周细胞。Lu等[26]应 用胶原酶与胰酶联合消化法的成纤维细胞集落形成单 位频率虽然相对较低(1∶1 609)，但其每根脐带消化后 获得的单个核细胞明显高于Sarugaser等[14]的报道，因 此最终获得的原代细胞数也高于后者。实验所采用的植
a: Cells were positive to alizarin red S-staining (×200)
块法未进行脐带组织的消化，因此没有计算单个核细胞 中成纤维细胞集落形成单位的频率，但培养后所获得的 原代细胞数高于上述2项报道，因此细胞产率极高。而 且不需进行酶消化或磁珠分选，使操作更加简单，更节 约了成本，而培养效率更高。实验同时也采用了Lu等[26] 报道的联合酶消化法，结果显示所获得的单个核细胞在 相同的培养条件下并不能贴壁，考虑可能与酶作用时间 过长影响了细胞的活力以及贴壁能力有关。此外，实验 还尝试了胶原酶消化脐静脉内膜法，贴壁成功率虽达
b: Cells were positive to oil red O-staining (×1 000)
100%(4份脐带均成功贴壁)，但原代细胞的产率极低， 而且细胞均一性较差，以内皮样细胞为主，估计胶原酶 消化后获得的脐静脉内皮层及内皮下层的单个核细胞 中含有大量的内皮细胞，间充质干细胞样细胞仅占极少 数。 实验所获得的脐带间充质干细胞具有与既往报道 的脐带来源间充质干细胞相似的性质，包括细胞形态、 免疫表型、增殖活性、细胞周期状态，同时也发现了一
Figure 5 图5
Differentiation potential of passage 2 umbilical cord-derived mesenchymal stem cells 2 weeks after induction in vitro 体外诱导 2 周后第 2 代脐带间充质干细胞的多向分化 潜能
3
讨论 目前多个研究小组已成功地从脐带组织中分离出
些差别。 细胞的倍增时间略长于Sarugaser等[14，26]报道， 分析可能是培养体系的差别影响了细胞的增殖能力，但 本体系中细胞平均4.5 d即可传1代，细胞平均倍增6.18 倍，因此短期培养也可获得足够的细胞数进行细胞治 疗。流式细胞学检测发现，与骨髓间充质干细胞相似， 脐带间充质干细胞不表达造血细胞标记，也不表达内皮 细胞标记CD31，KDR和vWF，而整合素和黏附分子 CD44，CD90，CD95，CD73，CD105的表达率均达 95%以上。而Ma等[19]同样经植块法所获细胞的CD44表 达率仅76.7%，到第8代仅52.1%，他们没有报道CD73 与CD105的表达情况； Lu等[19]的报道中虽然提示CD73， CD105呈强阳性，但仅>75%。因此实验所分离培养的 脐带间充质干细胞可能更均一，在本培养体系中性质更 稳定。 对于这类细胞的分化潜能研究发现，与骨髓间充质 干细胞相似，脐带间充质干细胞在特定的诱导条件下也
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具有间充质干细胞性质的干细胞，分离方法主要包括酶 消化脐静脉内膜法或联合消化脐带Wharton’s Jelly组 织等方法
[13-18，20-21]
， 个别研究小组则应用植块法
[19]
。 根
据研究小组及培养方法的不同，将所获得的贴壁细胞称 为间充质干细胞、类间充质干细胞、人脐带血管周细胞 或基质干细胞
[11-12，27]
。 早期研究主要通过胰酶或胶原酶
消化脐静脉内膜，收集消化液获得单个核细胞后进行贴 壁培养，认为脐带间充质干细胞来源于脐静脉内皮下 层，但都没有成纤维细胞集落形成单位及细胞产率方面 的 报 道 [20-22 ， 28] 。 此 后 研 究 发 现 在 脐 带 血 管 周 围 的 Wharton’s Jelly组织中含有大量的间充质细胞，通过植 块法或酶消化法进行培养可以获得更高增殖活性的具有 间充质干细胞性质的干细胞，而且产量更高
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[14-15，26]
。实
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徐燕，等.人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性
能向成骨细胞、脂肪细胞等基质细胞分化。实验在培养 中还发现，随着细胞的传代，部分细胞自发聚集成团形 成肉眼可见的白色结节样结构，这与Sarugaser等[14]所 报道的骨结节形态极其相似，对于这种结构的具体性质 目前正在进一步的鉴定中。因此，设想实验分离的脐带 间充质干细胞中同样含有更多的成骨祖细胞，这个发现 可能使脐带间充质干细胞成为矫形与组织工程策略中 更合适的来源[29-30]。
[18]
[19] [20]
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来自本文课题的更多信息-实验设计与文章构思：课题受天津市科技发展计划项目
（ 06YFSYSF01900 ）； 天 津 市 科 技 创 新 专 项 资 金 （08FDZDSH03000）资助，现阶段成果显示应用简单的植 块培养法可以从脐带组织中获得一群形态学及免疫表型类似 于骨髓间充质干细胞的非造血、非内皮的细胞群。由于人脐 带易于获得、供者无痛苦、可作为自体细胞治疗的来源及低 病毒感染率等优势，人脐带似乎可以替代骨髓而作为间充质 干细胞的来源。 后续试验会进一步将脐带间充质干细胞与骨髓、脐血来 源的间充质干细胞进行比较，并分析其向血管神经细胞的分 化潜能及基因表达情况等生物学特征。
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