控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程
1. 目的
建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范QC控制菌大肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。
2. 范围
适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材料的控制菌大肠埃希菌的检测。
3. 责任者
QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部
4. 内容
4.1检测准备
4.1.1 QC人员接到控制菌大肠埃希菌检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备工作。
4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。
4.2 供试液的制备
4.2.1 供试液 供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。
4.2.2 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。
4.2.2.1 可溶性液体供试品
取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。
4.2.2.2 非水溶性液体供试品
油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。
4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品
称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
4.2.2.4 非水溶性供试品
取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。
4.2.2.5肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10 g，加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。
4.2.2.7具抑菌成分供试品
当供试品抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查，一般使用培养基稀释法，取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。取低稀释级供试液（原液或1:10的供试液）2份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或
4.2.2.8 供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃，时间为30min。
4.3检验操作
4.3.1 操作程序
4.3.2培养基选择与标记
4.3.2.1 增菌培养使用胆盐乳糖（BL）培养基，标记符号为BL
4.3.2.2 快速生化试验使用4-甲基伞形酮葡萄苷酸蛋白胨培养基，标记符号为MUG
4.3.2.3 分离培养使用曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）或麦康凯琼脂培养基（MacC）
4.3.2.4 纯培养使用营养琼脂（YY）培养基，标记符号为YY
4.3.2.5 乳糖发酵试验使用乳糖（RT）培养基、5%乳糖培养基，标记符号为RT
4.3.2.6 靛基质试验（I）使用蛋白胨水培养基，标记符号为RT标记符号为I
4.3.2.7 甲基红试验（M）使用磷酸盐葡萄糖胨水培养基，标记符号为M
4.3.2.8 乙酰甲基甲醇生产试验（V-P）使用磷酸盐葡萄糖胨水培养基，标记符号为V-P
4.3.2.9 枸橼酸盐利用试验（C）使用枸橼酸盐培养基，标记符号为C
4.3.3 阳性对照与阴性对照
4.3.3.1阳性对照试验 对各供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验，加菌量为10~100cfu，培养、检查等方法按照供试品的各控制菌检查同法进行，阳性对照试验应检出相应的控制菌；已做验证试验的供试品，在该供试品检查时可不必再做阳性对照。
4.3.3.2 阴性对照试验 取稀释剂10ml加入100ml（或200ml）相应控制菌检查用的相应培养基中，培养，应无菌生长。
4.3.4 增菌培养
取胆盐乳糖（BL）培养基2份，每份各100ml。一份加入10ml供试液（相当于供试品1g或1ml），另一份加入与供试液等量的稀释剂作为阴性对照。温度36℃，培养8~24hr，必要时可延至48hr。阴性对照应无菌生长。
4.3.5 快速生化试验
4.3.5.1取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，温度36℃培养，于5hr和24hr时在366nm紫外灯光下观察，同时用未接种的MUG培养基作为本底对照。在紫外光下若管内培养物呈蓝白色荧光，则为MUG阳性；不呈现荧光，则为MUG阴性。
4.3.5.2 观察后，沿着培养管的管壁加入数滴靛基质试液，若液面呈玫瑰红色，则为靛基质阳性；若呈试剂本色，则为靛基质阴性。本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。
4.3.5.3 如果MUG阳性、靛基质阳性，则判供试品检出大肠埃希菌；如果MUG阴性、靛基质阴性，则判供试品未检出大肠埃希菌。
4.3.6 分离培养
4.3.6.1如果呈现MUG阳性、靛基质阴性或者MUG阴性、靛基质阳性时，则应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环蘸取1~2环培养液划线于EMB或MacC平板上，温度36℃培养18~24hr。
4.3.6.2 观察平板，若EMB或MacC平板上无菌落生长或生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征不符，则判供试品未检出大肠埃希菌。
4.3.6.3 观察平板，当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，若EMB或MacC平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征相符或疑似时，应挑取可疑菌落2~3个以上菌落分别进行分离、纯化、染色镜检和IMViC试验，确认大肠埃希菌。
4.3.6.4 大肠埃希菌菌落形态特征
4.3.7 纯培养
4.3.7.1 如果EMB或MacC平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征相符或疑似时，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，蘸取培养物，应挑选2~3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，温度36℃培养18~24hr，进行以下检查。
4.3.7.2 如果平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（如呈紫黑色或有金属光泽），则应蘸取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于EMB或MacC平板，温度36℃培养18~24hr，再挑选单个疑似菌落，纯培养，进行以下检查。
4.3.8 革兰氏染色、镜检
4.3.8.1 以接种环蘸取无菌水于洁净无划痕的载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2~3次固定。
4.3.8.2 在载玻片的菌斑上滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。
4.3.8.3 滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。
4.3.8.4 滴加95%乙醇，严格控制时间脱色20~30s，水洗。
4.3.8.5 滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。
4.3.8.6 镜检结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色；大肠埃希菌为革兰氏阴性短杆菌或球杆菌。
4.3.9 生化（IMViC）试验
4.3.9.1 乳糖发酵试验 取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，温度36℃培养24~48hr，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色，指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。为了避免迟缓发酵产生假阴性，也可接种5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24hr出现阳性，或适当延长培养时间。
4.3.9.2 靛基质试验（I） 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，温度36℃培养24~48hr，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般24Hr即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1ml或2ml培养液进行检查，如靛基质阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24hr，做靛基质试验。
4.3.9.3 甲基红试验（M） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，温度36℃培养48±2hr，于培养液中加入甲基红指示液2~3滴（约每1ml培养液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。
4.3.9.4 乙酰甲基甲醇生产试验（V-P） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，温度36℃培养48±2hr，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4hr（通常在30min时）内出现红色判为阳性，无红色判为阴性。
4.3.9.5 枸橼酸盐利用试验（C） 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，温度36℃培养2~4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时，判为阳性，培养基颜色无变化、无菌苔生长，判为阴性。
4.4 结果判定
4.4.1 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；供试品MUG阴性、靛基质阴性，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。
4.4.2当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为“- + - -”、革兰氏阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；供试品MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为“+ + - -”、革兰氏阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。
4.4.3 供试品培养物检查不符合上条中的任一项，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。
4.4.4 当阴性对照有菌生长或阳性对照未有菌生长或有菌生长但非大肠埃希菌，不能做出检验报告。
5．培训
5.1 培训对象：QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部QA审核人员。
5.2 培训时间：八小时。
控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程
1. 目的
建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范QC控制菌大肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。
2. 范围
适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材料的控制菌大肠埃希菌的检测。
3. 责任者
QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部
4. 内容
4.1检测准备
4.1.1 QC人员接到控制菌大肠埃希菌检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备工作。
4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。
4.2 供试液的制备
4.2.1 供试液 供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。
4.2.2 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。
4.2.2.1 可溶性液体供试品
取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。
4.2.2.2 非水溶性液体供试品
油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。
4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品
称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
4.2.2.4 非水溶性供试品
取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。
4.2.2.5肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10 g，加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。
4.2.2.7具抑菌成分供试品
当供试品抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查，一般使用培养基稀释法，取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。取低稀释级供试液（原液或1:10的供试液）2份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或
4.2.2.8 供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃，时间为30min。
4.3检验操作
4.3.1 操作程序
4.3.2培养基选择与标记
4.3.2.1 增菌培养使用胆盐乳糖（BL）培养基，标记符号为BL
4.3.2.2 快速生化试验使用4-甲基伞形酮葡萄苷酸蛋白胨培养基，标记符号为MUG
4.3.2.3 分离培养使用曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）或麦康凯琼脂培养基（MacC）
4.3.2.4 纯培养使用营养琼脂（YY）培养基，标记符号为YY
4.3.2.5 乳糖发酵试验使用乳糖（RT）培养基、5%乳糖培养基，标记符号为RT
4.3.2.6 靛基质试验（I）使用蛋白胨水培养基，标记符号为RT标记符号为I
4.3.2.7 甲基红试验（M）使用磷酸盐葡萄糖胨水培养基，标记符号为M
4.3.2.8 乙酰甲基甲醇生产试验（V-P）使用磷酸盐葡萄糖胨水培养基，标记符号为V-P
4.3.2.9 枸橼酸盐利用试验（C）使用枸橼酸盐培养基，标记符号为C
4.3.3 阳性对照与阴性对照
4.3.3.1阳性对照试验 对各供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验，加菌量为10~100cfu，培养、检查等方法按照供试品的各控制菌检查同法进行，阳性对照试验应检出相应的控制菌；已做验证试验的供试品，在该供试品检查时可不必再做阳性对照。
4.3.3.2 阴性对照试验 取稀释剂10ml加入100ml（或200ml）相应控制菌检查用的相应培养基中，培养，应无菌生长。
4.3.4 增菌培养
取胆盐乳糖（BL）培养基2份，每份各100ml。一份加入10ml供试液（相当于供试品1g或1ml），另一份加入与供试液等量的稀释剂作为阴性对照。温度36℃，培养8~24hr，必要时可延至48hr。阴性对照应无菌生长。
4.3.5 快速生化试验
4.3.5.1取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，温度36℃培养，于5hr和24hr时在366nm紫外灯光下观察，同时用未接种的MUG培养基作为本底对照。在紫外光下若管内培养物呈蓝白色荧光，则为MUG阳性；不呈现荧光，则为MUG阴性。
4.3.5.2 观察后，沿着培养管的管壁加入数滴靛基质试液，若液面呈玫瑰红色，则为靛基质阳性；若呈试剂本色，则为靛基质阴性。本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。
4.3.5.3 如果MUG阳性、靛基质阳性，则判供试品检出大肠埃希菌；如果MUG阴性、靛基质阴性，则判供试品未检出大肠埃希菌。
4.3.6 分离培养
4.3.6.1如果呈现MUG阳性、靛基质阴性或者MUG阴性、靛基质阳性时，则应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环蘸取1~2环培养液划线于EMB或MacC平板上，温度36℃培养18~24hr。
4.3.6.2 观察平板，若EMB或MacC平板上无菌落生长或生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征不符，则判供试品未检出大肠埃希菌。
4.3.6.3 观察平板，当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，若EMB或MacC平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征相符或疑似时，应挑取可疑菌落2~3个以上菌落分别进行分离、纯化、染色镜检和IMViC试验，确认大肠埃希菌。
4.3.6.4 大肠埃希菌菌落形态特征
4.3.7 纯培养
4.3.7.1 如果EMB或MacC平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征相符或疑似时，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，蘸取培养物，应挑选2~3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，温度36℃培养18~24hr，进行以下检查。
4.3.7.2 如果平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（如呈紫黑色或有金属光泽），则应蘸取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于EMB或MacC平板，温度36℃培养18~24hr，再挑选单个疑似菌落，纯培养，进行以下检查。
4.3.8 革兰氏染色、镜检
4.3.8.1 以接种环蘸取无菌水于洁净无划痕的载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2~3次固定。
4.3.8.2 在载玻片的菌斑上滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。
4.3.8.3 滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。
4.3.8.4 滴加95%乙醇，严格控制时间脱色20~30s，水洗。
4.3.8.5 滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。
4.3.8.6 镜检结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色；大肠埃希菌为革兰氏阴性短杆菌或球杆菌。
4.3.9 生化（IMViC）试验
4.3.9.1 乳糖发酵试验 取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，温度36℃培养24~48hr，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色，指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。为了避免迟缓发酵产生假阴性，也可接种5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24hr出现阳性，或适当延长培养时间。
4.3.9.2 靛基质试验（I） 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，温度36℃培养24~48hr，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般24Hr即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1ml或2ml培养液进行检查，如靛基质阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24hr，做靛基质试验。
4.3.9.3 甲基红试验（M） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，温度36℃培养48±2hr，于培养液中加入甲基红指示液2~3滴（约每1ml培养液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。
4.3.9.4 乙酰甲基甲醇生产试验（V-P） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，温度36℃培养48±2hr，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4hr（通常在30min时）内出现红色判为阳性，无红色判为阴性。
4.3.9.5 枸橼酸盐利用试验（C） 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，温度36℃培养2~4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时，判为阳性，培养基颜色无变化、无菌苔生长，判为阴性。
4.4 结果判定
4.4.1 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；供试品MUG阴性、靛基质阴性，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。
4.4.2当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为“- + - -”、革兰氏阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；供试品MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为“+ + - -”、革兰氏阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。
4.4.3 供试品培养物检查不符合上条中的任一项，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。
4.4.4 当阴性对照有菌生长或阳性对照未有菌生长或有菌生长但非大肠埃希菌，不能做出检验报告。
5．培训
5.1 培训对象：QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部QA审核人员。
5.2 培训时间：八小时。