人类诱导性多能干细胞（iPS细胞）
技术指导手册
目录：
1. 前言 ............................................................................................................................ 1 2. 人类胚胎成纤维细胞培养............................................................................................. 2 3. 重编程载体构建........................................................................................................... 3 4. 病毒包装 .................................................................................................................... 4 5. 人类iPS细胞的诱导 .................................................................................................... 6 6. iPS细胞鉴定 .............................................................................................................. 8
6.1碱性磷酸酶活性检测 ........................................................................................... 8 6.2干细胞表面marker的免疫染色检测 .................................................................... 9 6.3干性因子的去甲基化程度分析 ........................................................................... 10 6.4干细胞内源基因的表达分析 .............................................................................. 13 6.5端粒酶活性检测 ................................................................................................. 14 6.6核型检测 ........................................................................................................... 15 6.7拟胚体形成 ........................................................................................................ 15 6.8畸胎瘤形成实验 ................................................................................................. 15 7．干细胞技术培训及服务一览表 ................................................................................... 15 8．附录 ......................................................................................................................... 16
1. 前言
iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。其他细胞类型，包括来自外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminili et al 2008）。2006年Yamanaka 和 Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc, 和 Klf4，Yamanaka 因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类iPS细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashi et al ;Yu et al, 2007）。 由于iPS细胞具有和ES类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，《自然》和《科学》杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。随后，
iPS细胞的研究日新月异。
. 近几年来，iPS研究方面取得的一系列的重大成果让我们欣喜不已，然而，这才刚刚开始，iPS细胞能真正用于临床惠及大众还面临着很多技术上的问题。一方面iPS产生的方法有待改进；另一方面iPS细胞的定向分化手段需继续探索。
斯丹赛干细胞生物技术公司拥有成熟稳定的胚胎干细胞/iPS细胞技术平
台，将竭力为全国各类进行干细胞/iPS研究的科研机构、高校、相关医疗机构和制药企业等提供高品质产品和优质的服务。
目前，公司提供两种人类iPS细胞系，分别由4因子和6因子所诱导，方
便科研工作者做后续的研究。
另外，对于新手提供初学者试剂盒：
这些产品都是经过严格的质控，为您科研的成功提供了基本的保证。
2. 人类胚胎成纤维细胞培养
材料：
人胚肺成纤维细胞： 货号SDSC-07，SDSC-08规格1*106/支； 人类胎儿包皮成纤维细胞： 货号SDSC-17，规格1*106/支； 0.25%trypsin：胰酶，Sidansai，货号M-005-1，M-005-2；
含10%FBS的DMEM：成纤维细胞完全培养液，Sidansai，货号：EFM-01。
实验步骤：
人类成纤维细胞培养及传代方法基本与293T细胞相同。
先吸弃废液，用0.25%Trypsin消化（一般T25瓶加1ml即可），放培养箱3－5分钟，待细胞大部分脱落时就可加含FBS 的DMEM培养液终止消化，反复吹打至细胞至单细胞悬浮液即可。传代比例为1：3－1：5。 Point
此细胞系消化时间比293T细胞稍长，请不要在加入Trypsin后马上拍打使
其脱落，否则会导致细胞结块，吹打不散。
细胞传代比例大概为1：3-1：5，不能传得太稀，否则不易生长甚至停止
生长。
传代间隔时间为3－4天。
3. 重编程载体构建
用于重编程的病毒载体，其构建方法与普通载体构建的方法基本相同，一般用慢病毒、腺病毒或逆转录病毒质粒作为质粒构建的载体：
4. 病毒包装
材料：
293T细胞：Sidansai，货号Plv-C-01 转染试剂Fugene：Roche，货号4709713001
实验步骤
1．包装细胞铺板：
①. 传代293T细胞前将T75培养瓶用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，于37°C培养箱放置10min以上。 ②. 传代293T细胞
将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL 0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37°C培养箱中3min，取出，轻轻摇晃可发现细胞开始脱离瓶底，待其全部脱落，加入3mL 37°C水浴中预热的培养液，用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准瓶口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mL eppendorf管中，加入450ul DMEM培养液，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。
③. 铺细胞前，用明胶包被的培养瓶取出，轻晃使明胶将瓶底完全覆盖，之后吸净剩余的明胶，即可将细胞铺上。细胞数量为1000万/T75，最后加新鲜培养液至总体积为10ml。）
2. 转染：第二天做转染前先观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。
做脂转complex：Opti MEM需在37°C水浴中预热，Fugene转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。 转染每瓶T75的complex成分如下： 含cDNA的lv质粒：10ug
pVSVG：5ug delta 8.91：7.5ug
opti MEM补足至1mL后，用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，加入56ul Fugene转染试剂，加至opti MEM液面之下，吹打3-4次。再用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，室温放置15min，即可加入T75瓶中。晃匀后，最好隔2-4h后再取出培养瓶晃匀一次。
3．收集病毒： 转染后12-24h，将T75瓶中的培养基弃去，加入10％ DMEM 培养液10mL，即开始收集病毒。
分别收集转染后48-96h的病毒上清，收集后可置于4°C冰箱短期保存。 4．病毒滴度测定：收集病毒后即可测病毒滴度（悬浮感染）：
①. 在24孔板中测定病毒滴度，先用明胶包被24孔板10min以上（同步骤1，
每孔加入200ul明胶）。
②. 消化293T细胞（步骤1.2），24孔板每孔铺被15万细胞。可将细胞做mix，
体积扩大到15万细胞/500ul，加入1/1000 polybrene（终浓度为10ug/mL），混匀，每孔加入500ul/ 15万细胞即可。
③. 将病毒上清4000rpm离心5min，将细胞碎片离至管底。分别取2ul或者5ul
病毒上清至上述步骤中的24孔板一孔中，摇匀后放入培养箱中。48h后即可在荧光显微镜下观察其滴度。 5．病毒滴度确定：
①. 15万293T细胞48h即可刚好长至90-100％满，此时即可固定细胞，计数确定病毒滴度。
②. 将培养基用真空泵吸去部分，务必不要将其吸净，由于293T细胞易飘，固定及DAPI染色整个过程请务必保持293T细胞处于液面之下。用PBS涮3次。加入4％ PFA室温固定30min, 24孔板每孔200ul。 ③．用PBT洗2次，每次3分钟。
④．PBS将DAPI 1000倍稀释，每孔加入200ul，避光室温静置5min。 ⑤．PBS洗2次，每次5分钟，即可在荧光显微镜下计数，取2-3处取平均值。 ⑥．病毒滴度（IU/mL）=荧光细胞占总细胞数的百分比÷加入的病毒上清体积×1.5×105×103
6．停止收集病毒上清，用75％酒精或者巴斯消毒液处理培养瓶方可弃去。 7．病毒在感染目的细胞前用0.45um滤膜过滤后，预热方可使用。
我们提供的主要包装病毒：
此外，我们还提供相关的病毒包装培训，为期1周。学成后方便迅速搭建平台。
5. 人类iPS细胞的诱导
材料：
已经测定好滴度的慢病毒(以6种为例)
体细胞（以人类胎儿包皮成纤维细胞为例）货号：Sidansai，SDSC-17 助转剂polybrene：Sidansai，货号M-020 胰酶：Sidansai，货号M-005-2
0.1% gelatin：明胶，Sidansai，货号M-004
DMEM(含10%FBS)培养液：成纤维细胞完全培养液，Sidansai，货号：
EFM-01
滋养层细胞（CF-1 MEF cells）：Sidansai，货号MEF-CF1-01 人类胚胎干细胞培养液：Sidansai，货号HESM-01-500 人类胚胎干细胞条件培养基：Sidansai，货号HESCM-01-100 基质胶：Sidansai，货号M-002
Point：
6种病毒所含基因分别为：OCT4, NANOG, SOX2, LIN28, C-MYC, KLF4; 由预实验可知，慢病毒感染MRC-5 细胞的比例为10：1（即10个病毒
颗粒对应一个细胞时所有的细胞均能被感染上）。
病毒感染可分悬浮感染和贴壁感染两种，两种方法均可行，不影响感染
效率，细胞生长不受影响，故均可用。
开始病毒感染实验以前，请先准备好滋养层细胞（MEF）。
病毒感染步骤：（悬浮感染方案）
a. 先用0.1% gelatin预包被一个T25 瓶，包被时间约为10min。
b. 待细胞生长良好时，用0.25%trypsin消化，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数（具体过程见成纤维细胞培养protocol）。之后取出用于感染实验所需的细胞量（比如1×105）。
c. 若感染1×105的细胞，以感染比例10：1计算出所需的病毒量，将所需的各个病毒量加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45um过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质，避免对后续实验的影响。
d. 然后将1×105的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5ul助转剂polybrene（使用浓度为10ug/ml），将整个体系混匀后，转移到已经预包被好的T25 瓶中, 摇匀后放入37°C培养箱中，过夜。 e. 病毒感染24小时后（第1天），将昨日感染的细胞消化下来，铺到事先准备好的MEF上。按T75瓶每瓶铺5×104的细胞，铺2个T75瓶即可。 f. 第2天，将DMEM培养液换成hESC培养液，继续培养。以后每2天换液
一次。
g. 逐日观察，待细胞长至第5－7天时，可见小的细胞聚集，细胞形态已经明显发生了改变，由梭形变圆形，生长聚集在一起。
h. 直至第12天，由于MEF使用时间过长，故培养液换成CM(conditioned medium)+HES(hESC正常培养液)的1:1混合液, 以提供给细胞充足的营养。 i. 待细胞长至第20天左右，可以挑克隆，将ES-like clone挑至新的MEF上，按hESC培养方法继续培养，扩增。IPS 克隆与正常的人类胚胎干细胞在形态上基本无异。
6.iPS细胞鉴定
iPS细胞的鉴定主要包括以下几种： 碱性磷酸酶活性检测
干细胞表面marker的免疫染色检测 干性因子的去甲基化分析 干细胞内源基因的表达分析 端粒酶活性检测 核型检测 拟胚体形成 畸胎瘤形成实验
下面分述各种鉴定的方法以及详细的操作步骤：
6.1．碱性磷酸酶活性检测
材料
PBS buffer
4% Paraformaldehyde
Alkaline Phosphatase Detection Kit：Sidansai，货号AP-1kit
1 x Rinse Buffer (e.g. TBST: 20mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.05%
Tween-20)
碱性磷酸酶染色步骤：
a. Aspirate media and fix ES or iPS cells with a fixative (e.g. 4% Paraformaldehyde
in PBS) for 1-2 minutes. Note: Do not overfix. Fixing cells longer than 2 minutes will result in the inactivation of alkaline phosphatase. b. Aspirate fixative and rinse with PBS buffer.
c. Aspirate and rinse with 1 X Rinse Buffer. DO NOT allow wells to dry.
d. Prepare reagents for Alkaline Phosphatase staining (BufferA: BufferB: BufferC=100:38:28)
e. Add enough stain solution to cover each well (e.g. 0.5mL for a well of a 24-well
plate). Incubate in dark at room temperature for 15 minutes.
f. Aspirate staining solution and rinse wells with 1 X Rinse Buffer. Cover cells with
1 X PBS to prevent drying and then count the number of colonies expressing AP
(red stem cell colonies), versus the number of differentiated colonies (colorless).
6.2. 干细胞表面marker的免疫染色检测
可用的试剂盒包括：
表达于人类ES/iPS细胞中的标志物包括：
Stage-specific embryonic antigen-3(SSEA3) Stage-specific embryonic antigen-4(SSEA4) Tumor-related antigen-1-60(TRA-1-60) Tumor-related antigen-1-81(TRA-1-81) OCT4 SOX2 Nanog
表达于小鼠ES/iPS细胞中的标志物包括： Stage specific embryonic antigen-1(SSEA-1) OCT4 SOX2 Nanog
免疫染色步骤：
1. 首先把细胞固定在4％多聚甲醛（4％PFA）中，室温放置30min; 2. 在无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或3次，10min/次）
注意：此步骤仅限于核蛋白，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白如SSEA 和Tra等
3. 将上述溶液吸干，先用1X PBS洗涤一次，再用抗体稀释液（0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于PBS）洗涤两次；
4. （此步骤可不操作，进行此步骤是为了更好的封闭非特异反应）用封闭液（含1%BSA+4% normal serum+0.4%TritonX100的PBS溶液）封闭细胞；
5. 将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或4度放置过夜； 6. 用PBT（0.1%TritonX100）洗涤细胞3－5次；
7. 将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到细胞样品上，室温放置1h; 注意：从步骤7开始，样品要注意避光！ 8. 用PBT洗涤3次；
9. 将DAPI (1mg/ml in PBS)母液以1:1000 用PBS稀释, 室温放置5min;
OR: 将JASMIN（hochest）母液以1:1000用PBS稀释，室温放置5min; 10. 用PBS洗涤5min,两次；
11. 再用4％多聚甲醛室温固定30min； 12. 最后再用PBS洗涤两次，每次5min.
6.3干性因子的去甲基化程度分析
Bisulphite Squencing 法分析甲基化状态
（一）Bisulphite 处理基因组DNA
1、 将基因组DNA置于冰上，液体石蜡冰上预冷。
2、 给每个样品准备6个Ep管，每管加300ul液体石蜡。
3、 准备样品：
1）每个样品取210ng的DNA，稀释到21ul。
2）新配2M的NaOH（用超纯水配，1.6g NaOH/20ml水），每管样品中加4ul（使之终浓度为0.3M）NaOH。
3）50℃，15min。
4、准备2％ 低熔点argrose：0.02g/ml，用双蒸水配。100℃ 5min，之后置于50℃待用。
5、向3中的DNA液中加入50ul 2％ 低熔点argrose，混匀（保持50℃）。
6、吸取上述argose和DNA混合液，加10ul/管 于第二步预冷的矿物油中。冰上至少30min，使beads坚硬。
7、向beads中加入500ul （新配），摇匀，使beads位于分层上。离心甩一下。
8、50℃避光反应4h～12h，不超过16h～18h（一般12h）。
附： 总体积：20ml
I. Hydroquinone 220mg
H2O 2ml
50℃避光溶解（黄红色）
II. Sodium bisulphate 7.6g
H2O 8ml
2M NaOH 5ml
50℃避光溶解，每隔10min晃一次，溶30min
I，II分别配好后，在暗处混合，混合后颜色变浅，降为室温即可使用。
终止反应，洗脱：
1、1ml TE ph8.0洗3次，10min/次。
2、0.5ml 0.2M NaOH 洗2次，每次15min（时间不可缩短）。
3、1ml TE ph8.0洗3次，10min/次。
4、每管beads加100ul TE，4℃保存。
（二）Bisulphite PCR
方式：巢式PCR
引物：2对
第一轮 outside-forward，outside-reverse；
第二轮 inside-forward，inside-reverse
注意事项：
1、第一轮的模板为beads，吸出的时候要小心，防止滑落或者弄碎。在其他都加好之后再加beads。
2、第二轮的模板是第一轮反应的产物，为胶状，加入之前应在55度化开。
（三）纯化PCR产物 (参见相关Kit说明书)
（四）连接至T-vector
体系：基本按照T-vector说明书，Solution I的体积应占总体积的一半，T-vector每个反应0.5ul。
比如，PCR产物浓度高时可用以下体系（PCR产物浓度较低时适当增加体积）：
（纯化好的PCR产物） 3 ul
T-vector 0.5 ul
3.5 ul
16℃连接过夜，第二天转化。最后挑克隆，抽质粒并且送测序即可。
6.4干细胞内源基因的表达分析
实时定量PCR检测内外源基因的表达
6.4.1抽提RNA
1. 将培养板每孔上清吸掉，用移液管加500μl TRIZOL反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后，收集到1.5ml离心管中（也可将细胞收集在离心管中后再用TRIZOL裂解）。
2. 每500μl TRIZOL 加0.1 ml 氯仿。盖紧样品管盖，用力摇晃试管15 秒并将其在室温孵育2-3 分钟。在2-8℃ 下12,000×g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL 容量的50%。
3. 将水样层转移到一干净的试管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每500lμlTRIZOL 对应0.25ml 异丙醇。将混合的样品在 15-30℃ 条件下孵育10 分钟并在2-8℃ 下12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
4. 移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA 沉淀一次，每500μl 的TRIZOL加0.5 ml 的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2-8℃ 下以7,500×g的离心力高速冷冻离心5 分钟。
5. 在操作的最后，简单干燥RNA沉淀。取DEPC水来溶解RNA，并在55-60℃下孵育10 分钟。紫外分光光度计测RNA浓度。
6.4.2反转录RNA（用反转录Kit）
1. 取5μgRNA加适量DEPC水至11μl，再加1μl Oligo dT Primer 共12μl体系混匀，70℃ 5分钟。
2. 置冰上，加4μl反转录缓冲液，1μlRNA 抑制剂，2μldNTP混匀，37℃ 5分钟。
3. 置冰上，加1μl反转录酶混匀，42℃ 1小时。
4. 70℃ 10分钟失活反转录酶，得到的cDNA可以用于后续real-time PCR实验。
6.4.3实时荧光定量PCR(real-time PCR)
1. real-time PCR程序：
95℃ 5min；
94℃ 15s，66℃ 10s，72℃ 15s；
2-4步重复40循环；
72℃ 5 min。
2. 反应体系：
2X realtime PCR master mix(含染料SYBRGreen 1 ) 7.5μl
Primer Mix（25μM each） 0.1μl
Template（反转录好的cDNA稀释10倍后使用） 0.3μl
H2O 7.1μl
共15μl体系。
6.5端粒酶活性检测
推荐用端粒酶活性检测试剂盒（Millipore，货号S7710），方法详见kit内，不再赘述。
6.6核型检测
6.7拟胚体形成
拟胚体的制备：将得到的iPS细胞系扩增培养后，按正常传代步骤消化下来，洗涤去除MEF细胞，将细胞吹打至小团块（比正常传代大小再小一些），然后悬浮培养在MEF培养液中。3天后换第一次液，之后每2-3天换液一次，直至收集。收集EB后用TRIZOL裂解，抽提RNA, 反转录，通过real-time PCR的方法（见real-time PCR检测的具体protocol）检测各胚层marker的表达情况。
6.8畸胎瘤形成实验
将得到的iPS细胞系传代培养至10代以上后，按正常传代方式消化下来洗涤，去除滋养层细胞污染后，悬浮在小于400ul的培养液中，无菌注射入NOD-SCID小鼠的后腿根部肌肉中，每个注射点的细胞量约为2-3×106。每个细胞系均注射3-5只小鼠，8周后取出畸胎瘤进行HE染色，观察是否分化为三个胚层。
7．干细胞技术培训及服务一览表
技术培训
技术服务
8． 附录
HESC medium配方(500ML)
DMEM/F12 400ml SR 100ml 1% non-essential amino acid 5ml L-glutamine 2.5ml 0.1mM beta-mercaptoethanol 17ul bFGF 10ug
mES 培养液配方（500ml）
knockout DMEM 425ml
FBS（干细胞） 75ml
NEAA 5ml
L-G 5ml
0.1mM β-mercaptoethanol 3.6µl
LIF 1000U/ml
MEF medium 配方 500ml
DMEM 440ml
FBS 50ml
NEAA 5ml
L-G 5ml
常用材料
PRODUCT NAME
DMEM/F12
SR
1% non-essential amino acid
L-glutamine COMPANY GIBCO GIBCO CAT NO. 11330 10828 GIBCO 11140 GIBCO 25030
0.1mM beta-mercaptoethanol SIGMA M7522
bFGF INVITROGEN 13256-029 Collagenase IV 即用型 Sidansai M-001
Matrigel matrix 即用型 Sidansai M-002
DMEM GIBCO 11995
FBS GIBCO sh30396.03 Knockout D-MEM GIBCO GB10829-018 ES qualified FBS GIBCO GB30044-333 LIF millipore ESG1107 碱性磷酸酶染色试剂盒Alkaline Phosphatase Substrate Kit (Sidansai)
端粒酶检测试剂盒 TRAPEZE Telomerase Detection Kit（CHEMICON）
人类诱导性多能干细胞（iPS细胞）
技术指导手册
目录：
1. 前言 ............................................................................................................................ 1 2. 人类胚胎成纤维细胞培养............................................................................................. 2 3. 重编程载体构建........................................................................................................... 3 4. 病毒包装 .................................................................................................................... 4 5. 人类iPS细胞的诱导 .................................................................................................... 6 6. iPS细胞鉴定 .............................................................................................................. 8
6.1碱性磷酸酶活性检测 ........................................................................................... 8 6.2干细胞表面marker的免疫染色检测 .................................................................... 9 6.3干性因子的去甲基化程度分析 ........................................................................... 10 6.4干细胞内源基因的表达分析 .............................................................................. 13 6.5端粒酶活性检测 ................................................................................................. 14 6.6核型检测 ........................................................................................................... 15 6.7拟胚体形成 ........................................................................................................ 15 6.8畸胎瘤形成实验 ................................................................................................. 15 7．干细胞技术培训及服务一览表 ................................................................................... 15 8．附录 ......................................................................................................................... 16
1. 前言
iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。其他细胞类型，包括来自外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminili et al 2008）。2006年Yamanaka 和 Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc, 和 Klf4，Yamanaka 因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类iPS细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashi et al ;Yu et al, 2007）。 由于iPS细胞具有和ES类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，《自然》和《科学》杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。随后，
iPS细胞的研究日新月异。
. 近几年来，iPS研究方面取得的一系列的重大成果让我们欣喜不已，然而，这才刚刚开始，iPS细胞能真正用于临床惠及大众还面临着很多技术上的问题。一方面iPS产生的方法有待改进；另一方面iPS细胞的定向分化手段需继续探索。
斯丹赛干细胞生物技术公司拥有成熟稳定的胚胎干细胞/iPS细胞技术平
台，将竭力为全国各类进行干细胞/iPS研究的科研机构、高校、相关医疗机构和制药企业等提供高品质产品和优质的服务。
目前，公司提供两种人类iPS细胞系，分别由4因子和6因子所诱导，方
便科研工作者做后续的研究。
另外，对于新手提供初学者试剂盒：
这些产品都是经过严格的质控，为您科研的成功提供了基本的保证。
2. 人类胚胎成纤维细胞培养
材料：
人胚肺成纤维细胞： 货号SDSC-07，SDSC-08规格1*106/支； 人类胎儿包皮成纤维细胞： 货号SDSC-17，规格1*106/支； 0.25%trypsin：胰酶，Sidansai，货号M-005-1，M-005-2；
含10%FBS的DMEM：成纤维细胞完全培养液，Sidansai，货号：EFM-01。
实验步骤：
人类成纤维细胞培养及传代方法基本与293T细胞相同。
先吸弃废液，用0.25%Trypsin消化（一般T25瓶加1ml即可），放培养箱3－5分钟，待细胞大部分脱落时就可加含FBS 的DMEM培养液终止消化，反复吹打至细胞至单细胞悬浮液即可。传代比例为1：3－1：5。 Point
此细胞系消化时间比293T细胞稍长，请不要在加入Trypsin后马上拍打使
其脱落，否则会导致细胞结块，吹打不散。
细胞传代比例大概为1：3-1：5，不能传得太稀，否则不易生长甚至停止
生长。
传代间隔时间为3－4天。
3. 重编程载体构建
用于重编程的病毒载体，其构建方法与普通载体构建的方法基本相同，一般用慢病毒、腺病毒或逆转录病毒质粒作为质粒构建的载体：
4. 病毒包装
材料：
293T细胞：Sidansai，货号Plv-C-01 转染试剂Fugene：Roche，货号4709713001
实验步骤
1．包装细胞铺板：
①. 传代293T细胞前将T75培养瓶用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，于37°C培养箱放置10min以上。 ②. 传代293T细胞
将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL 0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37°C培养箱中3min，取出，轻轻摇晃可发现细胞开始脱离瓶底，待其全部脱落，加入3mL 37°C水浴中预热的培养液，用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准瓶口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mL eppendorf管中，加入450ul DMEM培养液，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。
③. 铺细胞前，用明胶包被的培养瓶取出，轻晃使明胶将瓶底完全覆盖，之后吸净剩余的明胶，即可将细胞铺上。细胞数量为1000万/T75，最后加新鲜培养液至总体积为10ml。）
2. 转染：第二天做转染前先观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。
做脂转complex：Opti MEM需在37°C水浴中预热，Fugene转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。 转染每瓶T75的complex成分如下： 含cDNA的lv质粒：10ug
pVSVG：5ug delta 8.91：7.5ug
opti MEM补足至1mL后，用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，加入56ul Fugene转染试剂，加至opti MEM液面之下，吹打3-4次。再用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，室温放置15min，即可加入T75瓶中。晃匀后，最好隔2-4h后再取出培养瓶晃匀一次。
3．收集病毒： 转染后12-24h，将T75瓶中的培养基弃去，加入10％ DMEM 培养液10mL，即开始收集病毒。
分别收集转染后48-96h的病毒上清，收集后可置于4°C冰箱短期保存。 4．病毒滴度测定：收集病毒后即可测病毒滴度（悬浮感染）：
①. 在24孔板中测定病毒滴度，先用明胶包被24孔板10min以上（同步骤1，
每孔加入200ul明胶）。
②. 消化293T细胞（步骤1.2），24孔板每孔铺被15万细胞。可将细胞做mix，
体积扩大到15万细胞/500ul，加入1/1000 polybrene（终浓度为10ug/mL），混匀，每孔加入500ul/ 15万细胞即可。
③. 将病毒上清4000rpm离心5min，将细胞碎片离至管底。分别取2ul或者5ul
病毒上清至上述步骤中的24孔板一孔中，摇匀后放入培养箱中。48h后即可在荧光显微镜下观察其滴度。 5．病毒滴度确定：
①. 15万293T细胞48h即可刚好长至90-100％满，此时即可固定细胞，计数确定病毒滴度。
②. 将培养基用真空泵吸去部分，务必不要将其吸净，由于293T细胞易飘，固定及DAPI染色整个过程请务必保持293T细胞处于液面之下。用PBS涮3次。加入4％ PFA室温固定30min, 24孔板每孔200ul。 ③．用PBT洗2次，每次3分钟。
④．PBS将DAPI 1000倍稀释，每孔加入200ul，避光室温静置5min。 ⑤．PBS洗2次，每次5分钟，即可在荧光显微镜下计数，取2-3处取平均值。 ⑥．病毒滴度（IU/mL）=荧光细胞占总细胞数的百分比÷加入的病毒上清体积×1.5×105×103
6．停止收集病毒上清，用75％酒精或者巴斯消毒液处理培养瓶方可弃去。 7．病毒在感染目的细胞前用0.45um滤膜过滤后，预热方可使用。
我们提供的主要包装病毒：
此外，我们还提供相关的病毒包装培训，为期1周。学成后方便迅速搭建平台。
5. 人类iPS细胞的诱导
材料：
已经测定好滴度的慢病毒(以6种为例)
体细胞（以人类胎儿包皮成纤维细胞为例）货号：Sidansai，SDSC-17 助转剂polybrene：Sidansai，货号M-020 胰酶：Sidansai，货号M-005-2
0.1% gelatin：明胶，Sidansai，货号M-004
DMEM(含10%FBS)培养液：成纤维细胞完全培养液，Sidansai，货号：
EFM-01
滋养层细胞（CF-1 MEF cells）：Sidansai，货号MEF-CF1-01 人类胚胎干细胞培养液：Sidansai，货号HESM-01-500 人类胚胎干细胞条件培养基：Sidansai，货号HESCM-01-100 基质胶：Sidansai，货号M-002
Point：
6种病毒所含基因分别为：OCT4, NANOG, SOX2, LIN28, C-MYC, KLF4; 由预实验可知，慢病毒感染MRC-5 细胞的比例为10：1（即10个病毒
颗粒对应一个细胞时所有的细胞均能被感染上）。
病毒感染可分悬浮感染和贴壁感染两种，两种方法均可行，不影响感染
效率，细胞生长不受影响，故均可用。
开始病毒感染实验以前，请先准备好滋养层细胞（MEF）。
病毒感染步骤：（悬浮感染方案）
a. 先用0.1% gelatin预包被一个T25 瓶，包被时间约为10min。
b. 待细胞生长良好时，用0.25%trypsin消化，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数（具体过程见成纤维细胞培养protocol）。之后取出用于感染实验所需的细胞量（比如1×105）。
c. 若感染1×105的细胞，以感染比例10：1计算出所需的病毒量，将所需的各个病毒量加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45um过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质，避免对后续实验的影响。
d. 然后将1×105的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5ul助转剂polybrene（使用浓度为10ug/ml），将整个体系混匀后，转移到已经预包被好的T25 瓶中, 摇匀后放入37°C培养箱中，过夜。 e. 病毒感染24小时后（第1天），将昨日感染的细胞消化下来，铺到事先准备好的MEF上。按T75瓶每瓶铺5×104的细胞，铺2个T75瓶即可。 f. 第2天，将DMEM培养液换成hESC培养液，继续培养。以后每2天换液
一次。
g. 逐日观察，待细胞长至第5－7天时，可见小的细胞聚集，细胞形态已经明显发生了改变，由梭形变圆形，生长聚集在一起。
h. 直至第12天，由于MEF使用时间过长，故培养液换成CM(conditioned medium)+HES(hESC正常培养液)的1:1混合液, 以提供给细胞充足的营养。 i. 待细胞长至第20天左右，可以挑克隆，将ES-like clone挑至新的MEF上，按hESC培养方法继续培养，扩增。IPS 克隆与正常的人类胚胎干细胞在形态上基本无异。
6.iPS细胞鉴定
iPS细胞的鉴定主要包括以下几种： 碱性磷酸酶活性检测
干细胞表面marker的免疫染色检测 干性因子的去甲基化分析 干细胞内源基因的表达分析 端粒酶活性检测 核型检测 拟胚体形成 畸胎瘤形成实验
下面分述各种鉴定的方法以及详细的操作步骤：
6.1．碱性磷酸酶活性检测
材料
PBS buffer
4% Paraformaldehyde
Alkaline Phosphatase Detection Kit：Sidansai，货号AP-1kit
1 x Rinse Buffer (e.g. TBST: 20mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.05%
Tween-20)
碱性磷酸酶染色步骤：
a. Aspirate media and fix ES or iPS cells with a fixative (e.g. 4% Paraformaldehyde
in PBS) for 1-2 minutes. Note: Do not overfix. Fixing cells longer than 2 minutes will result in the inactivation of alkaline phosphatase. b. Aspirate fixative and rinse with PBS buffer.
c. Aspirate and rinse with 1 X Rinse Buffer. DO NOT allow wells to dry.
d. Prepare reagents for Alkaline Phosphatase staining (BufferA: BufferB: BufferC=100:38:28)
e. Add enough stain solution to cover each well (e.g. 0.5mL for a well of a 24-well
plate). Incubate in dark at room temperature for 15 minutes.
f. Aspirate staining solution and rinse wells with 1 X Rinse Buffer. Cover cells with
1 X PBS to prevent drying and then count the number of colonies expressing AP
(red stem cell colonies), versus the number of differentiated colonies (colorless).
6.2. 干细胞表面marker的免疫染色检测
可用的试剂盒包括：
表达于人类ES/iPS细胞中的标志物包括：
Stage-specific embryonic antigen-3(SSEA3) Stage-specific embryonic antigen-4(SSEA4) Tumor-related antigen-1-60(TRA-1-60) Tumor-related antigen-1-81(TRA-1-81) OCT4 SOX2 Nanog
表达于小鼠ES/iPS细胞中的标志物包括： Stage specific embryonic antigen-1(SSEA-1) OCT4 SOX2 Nanog
免疫染色步骤：
1. 首先把细胞固定在4％多聚甲醛（4％PFA）中，室温放置30min; 2. 在无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或3次，10min/次）
注意：此步骤仅限于核蛋白，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白如SSEA 和Tra等
3. 将上述溶液吸干，先用1X PBS洗涤一次，再用抗体稀释液（0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于PBS）洗涤两次；
4. （此步骤可不操作，进行此步骤是为了更好的封闭非特异反应）用封闭液（含1%BSA+4% normal serum+0.4%TritonX100的PBS溶液）封闭细胞；
5. 将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或4度放置过夜； 6. 用PBT（0.1%TritonX100）洗涤细胞3－5次；
7. 将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到细胞样品上，室温放置1h; 注意：从步骤7开始，样品要注意避光！ 8. 用PBT洗涤3次；
9. 将DAPI (1mg/ml in PBS)母液以1:1000 用PBS稀释, 室温放置5min;
OR: 将JASMIN（hochest）母液以1:1000用PBS稀释，室温放置5min; 10. 用PBS洗涤5min,两次；
11. 再用4％多聚甲醛室温固定30min； 12. 最后再用PBS洗涤两次，每次5min.
6.3干性因子的去甲基化程度分析
Bisulphite Squencing 法分析甲基化状态
（一）Bisulphite 处理基因组DNA
1、 将基因组DNA置于冰上，液体石蜡冰上预冷。
2、 给每个样品准备6个Ep管，每管加300ul液体石蜡。
3、 准备样品：
1）每个样品取210ng的DNA，稀释到21ul。
2）新配2M的NaOH（用超纯水配，1.6g NaOH/20ml水），每管样品中加4ul（使之终浓度为0.3M）NaOH。
3）50℃，15min。
4、准备2％ 低熔点argrose：0.02g/ml，用双蒸水配。100℃ 5min，之后置于50℃待用。
5、向3中的DNA液中加入50ul 2％ 低熔点argrose，混匀（保持50℃）。
6、吸取上述argose和DNA混合液，加10ul/管 于第二步预冷的矿物油中。冰上至少30min，使beads坚硬。
7、向beads中加入500ul （新配），摇匀，使beads位于分层上。离心甩一下。
8、50℃避光反应4h～12h，不超过16h～18h（一般12h）。
附： 总体积：20ml
I. Hydroquinone 220mg
H2O 2ml
50℃避光溶解（黄红色）
II. Sodium bisulphate 7.6g
H2O 8ml
2M NaOH 5ml
50℃避光溶解，每隔10min晃一次，溶30min
I，II分别配好后，在暗处混合，混合后颜色变浅，降为室温即可使用。
终止反应，洗脱：
1、1ml TE ph8.0洗3次，10min/次。
2、0.5ml 0.2M NaOH 洗2次，每次15min（时间不可缩短）。
3、1ml TE ph8.0洗3次，10min/次。
4、每管beads加100ul TE，4℃保存。
（二）Bisulphite PCR
方式：巢式PCR
引物：2对
第一轮 outside-forward，outside-reverse；
第二轮 inside-forward，inside-reverse
注意事项：
1、第一轮的模板为beads，吸出的时候要小心，防止滑落或者弄碎。在其他都加好之后再加beads。
2、第二轮的模板是第一轮反应的产物，为胶状，加入之前应在55度化开。
（三）纯化PCR产物 (参见相关Kit说明书)
（四）连接至T-vector
体系：基本按照T-vector说明书，Solution I的体积应占总体积的一半，T-vector每个反应0.5ul。
比如，PCR产物浓度高时可用以下体系（PCR产物浓度较低时适当增加体积）：
（纯化好的PCR产物） 3 ul
T-vector 0.5 ul
3.5 ul
16℃连接过夜，第二天转化。最后挑克隆，抽质粒并且送测序即可。
6.4干细胞内源基因的表达分析
实时定量PCR检测内外源基因的表达
6.4.1抽提RNA
1. 将培养板每孔上清吸掉，用移液管加500μl TRIZOL反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后，收集到1.5ml离心管中（也可将细胞收集在离心管中后再用TRIZOL裂解）。
2. 每500μl TRIZOL 加0.1 ml 氯仿。盖紧样品管盖，用力摇晃试管15 秒并将其在室温孵育2-3 分钟。在2-8℃ 下12,000×g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL 容量的50%。
3. 将水样层转移到一干净的试管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每500lμlTRIZOL 对应0.25ml 异丙醇。将混合的样品在 15-30℃ 条件下孵育10 分钟并在2-8℃ 下12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
4. 移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA 沉淀一次，每500μl 的TRIZOL加0.5 ml 的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2-8℃ 下以7,500×g的离心力高速冷冻离心5 分钟。
5. 在操作的最后，简单干燥RNA沉淀。取DEPC水来溶解RNA，并在55-60℃下孵育10 分钟。紫外分光光度计测RNA浓度。
6.4.2反转录RNA（用反转录Kit）
1. 取5μgRNA加适量DEPC水至11μl，再加1μl Oligo dT Primer 共12μl体系混匀，70℃ 5分钟。
2. 置冰上，加4μl反转录缓冲液，1μlRNA 抑制剂，2μldNTP混匀，37℃ 5分钟。
3. 置冰上，加1μl反转录酶混匀，42℃ 1小时。
4. 70℃ 10分钟失活反转录酶，得到的cDNA可以用于后续real-time PCR实验。
6.4.3实时荧光定量PCR(real-time PCR)
1. real-time PCR程序：
95℃ 5min；
94℃ 15s，66℃ 10s，72℃ 15s；
2-4步重复40循环；
72℃ 5 min。
2. 反应体系：
2X realtime PCR master mix(含染料SYBRGreen 1 ) 7.5μl
Primer Mix（25μM each） 0.1μl
Template（反转录好的cDNA稀释10倍后使用） 0.3μl
H2O 7.1μl
共15μl体系。
6.5端粒酶活性检测
推荐用端粒酶活性检测试剂盒（Millipore，货号S7710），方法详见kit内，不再赘述。
6.6核型检测
6.7拟胚体形成
拟胚体的制备：将得到的iPS细胞系扩增培养后，按正常传代步骤消化下来，洗涤去除MEF细胞，将细胞吹打至小团块（比正常传代大小再小一些），然后悬浮培养在MEF培养液中。3天后换第一次液，之后每2-3天换液一次，直至收集。收集EB后用TRIZOL裂解，抽提RNA, 反转录，通过real-time PCR的方法（见real-time PCR检测的具体protocol）检测各胚层marker的表达情况。
6.8畸胎瘤形成实验
将得到的iPS细胞系传代培养至10代以上后，按正常传代方式消化下来洗涤，去除滋养层细胞污染后，悬浮在小于400ul的培养液中，无菌注射入NOD-SCID小鼠的后腿根部肌肉中，每个注射点的细胞量约为2-3×106。每个细胞系均注射3-5只小鼠，8周后取出畸胎瘤进行HE染色，观察是否分化为三个胚层。
7．干细胞技术培训及服务一览表
技术培训
技术服务
8． 附录
HESC medium配方(500ML)
DMEM/F12 400ml SR 100ml 1% non-essential amino acid 5ml L-glutamine 2.5ml 0.1mM beta-mercaptoethanol 17ul bFGF 10ug
mES 培养液配方（500ml）
knockout DMEM 425ml
FBS（干细胞） 75ml
NEAA 5ml
L-G 5ml
0.1mM β-mercaptoethanol 3.6µl
LIF 1000U/ml
MEF medium 配方 500ml
DMEM 440ml
FBS 50ml
NEAA 5ml
L-G 5ml
常用材料
PRODUCT NAME
DMEM/F12
SR
1% non-essential amino acid
L-glutamine COMPANY GIBCO GIBCO CAT NO. 11330 10828 GIBCO 11140 GIBCO 25030
0.1mM beta-mercaptoethanol SIGMA M7522
bFGF INVITROGEN 13256-029 Collagenase IV 即用型 Sidansai M-001
Matrigel matrix 即用型 Sidansai M-002
DMEM GIBCO 11995
FBS GIBCO sh30396.03 Knockout D-MEM GIBCO GB10829-018 ES qualified FBS GIBCO GB30044-333 LIF millipore ESG1107 碱性磷酸酶染色试剂盒Alkaline Phosphatase Substrate Kit (Sidansai)
端粒酶检测试剂盒 TRAPEZE Telomerase Detection Kit（CHEMICON）