·药品鉴定·
2011年5月第8卷第14期
利用酸水解氨基酸法测定脑蛋白水解物片中
肽的含量
陈宇堃，邓锋，薛巧如
广东省药品检验所，广东广州
510180
[摘要]目的：探讨脑蛋白水解物片中肽含量的测定方法。方法：采用盐酸水解多肽方法，利用WatersAccQ-Tag氨基酸衍生技术，使用Kromasil100-5C18色谱柱（250.0mm×4.6mm，5μm）进行液相色谱分析，以乙酸钠（pH=5.00）缓冲液为流动相A，60%乙腈为流动相B进行梯度洗脱，检测波长为248nm，柱温为37℃，进样量为5μl。水解后游离氨基酸总量扣除水解前氨基酸总量即为肽含量。结果：各氨基酸测定结果具有良好线性（r＝0.9991~0.9999，n=5），未水解氨基酸平均回收率为100.6%（RSD为0.7%，n=9），肽含量平均回收率为100.4%（RSD为1.1%，n=9）。结论：本方法
准确可行，可作为药品中肽含量测定的方法补充和完善。
[关键词]脑蛋白水解物片；酸水解；氨基酸[中图分类号]R927.2[文献标识码]A
[文章编号]1673-7210（2011）05（b）-066-03
DeterminationofpeptidecontentsfromCerebroproteinHydrolysateTabletsbyacidhydrolyticmethod
CHENYukun,DENGFeng,XUEQiaoru
InstitudeforDrugControlofGuangdongProvince,Guangzhou510180,China
[Abstract]Objective:ToinvestigatetheanalyticmethodofpeptidecontentsfromCerebroproteinHydrolysateTablets.Methods:UsedWatersAccQ-TagmethodbyKromasil100-5C18column(250mm×4.6mm,5μm)toanalyzeaminoacids.Gradienteluentsconsistedofsodiumacetatesolution(pH=5.00)and60%acetonitrile.Thedetectionwavelengthwas248nm,columntemperaturewas37℃,thesamplesizewas5μl.Theequationbetweenthetotalaminoacidscontentsofthehydrolyticandnun-hydrolyticsamplewasthecontentsofpeptide.Results:Thecalibrationcurvesforaminoacidshadgoodlinearities(r=0.9991-0.9999,n=5).Themeanrecoveriesofnun-hydrolyticwas100.6%withRSDof0.7%(n=9);themeanrecoveriesofpeptidewas100.4%withRSDof1.1%(n=9).Conclusion:Themethodissuitableforthefurtherdeterminationofpeptidecontentsindrug.
[Keywords]CerebroproteinHydrolysateTablets;Acidhydrolysis;Aminoacid
脑蛋白水解物是一种大脑所特有的肽类神经营养药物，作用于中枢神经，为神经元修复提供氨基酸，营养神经细胞，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损
见表5。
表5样品自制20060418批自制20060427批自制20060518批
西力欣
头孢呋辛酯片含量测定结果（n=3）
平均含量（%）
孢呋辛酯片的质量控制提供了依据。
[参考文献]
RSD（%）1.581.130.891.54
[1]孟雅杰,李应瑞,候栩.呼吸道细菌性感染成本-效果分析[J].武警医学,
2008,19(8):698-699.
[2]韩润凤,袁恒杰,张洪香,等.4厂家头孢呋辛酯片的质量评价[J].中国药
房,2010,(9):845-847.
[3]倪瑾莹.头孢菌素类药物比较及应用[J].检验医学与临床,2007,4(1):
78-79.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:化学工业出版
社,2005:250.
[5]闫志刚,曾环想,王磊,等.头孢呋辛酯片的试制[J].中国药学杂志,
2002,37(8):28.
[6]闫志刚,曾环想,王磊,等.头孢呋辛酯片的制备工艺及稳定性研究[J].
中国医药导刊,2001,3(5):20.
（收稿日期：2011-01-20）
99.2997.7597.5997.89
3讨论
头孢呋辛酯质量控制方法的研究在国内较少见于报道。该法简便、准确、专属，有一定的新颖性，可用于该制剂的含量及稳定性分析，同时辅料及有关物质对测定无干扰，为头
中国医药导报CHINAMEDICALHERALD
2011年5月第8卷第14期
·药品鉴定·
后溶液5μl。按表1进行梯度洗脱。以内标法计算各氨基酸
的含量。肽含量为水解样品的氨基酸总量扣除未水解样品的氨基酸总量。
表1梯度洗脱表
时间（min）
害[1]。它可透过血脑屏障而促进脑蛋白质合成，影响呼吸链，具有抗缺氧的能力，改善脑内能量代谢，激活腺苷酸环化酶和催化其他激素系统，改善神经突触间的递质传递功能，促进神经元的增生。这些左右可能与其含有的低分子肽的生物活性有关[2]。临床研究表明，脑蛋白水解物能够迅速改善大脑的血液供应，促进有氧代谢，对阿尔茨海默病具有较好的治疗作用[3]。对于急性脑梗死、脑萎缩等其他脑血管疾病，脑蛋白水解物均有治疗作用，且不良反应少，对治疗的依从性高[4]。脑蛋白水解物片主要有效成分为经水解后的小肽分子，含有多种氨基酸及脑磷脂、卵磷脂和肽类神经生长因子等。但国家药品标准中没有对其肽含量进行有效的控制，只是规定其总氮含量和氨基氮含量，不够严谨和规范。通过盐酸水解肽后测定氨基酸是分析肽含量以及氨基酸组成的一个常规方法[6]，而采用WatersAccQ-Tag氨基酸衍生方法测定氨基酸含量是目前常用的一项分析技术[7-8]。本研究依照上述方法，对脑蛋白水解物片中肽含量进行研究和分析。
[5]
[1**********]
Tab.1Gradientelutiontime
流动相A（%）
89
8959598989
流动相B（%）
[1**********]1
2结果
2.1线性关系考察
精密取氨基酸对照品贮备液0.50ml、0.75ml、1.00ml、1.25ml、1.50ml，分别置100ml量瓶中，加D-正亮氨酸内标溶液（2mg/ml）1ml，加水稀释至刻度。依法测定，结果见表2。
1材料与方法1.1仪器与试药
Waters2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器，EM-POWER2色谱工作站，SARTORIUSCP225D电子天平，Mil-liporeQ超纯水机，BINDERED50烘箱。色谱柱：Kromasil100-5C18色谱柱（250.0mm×4.6mm，5μm）；乙腈为色谱纯（美国Merck公司），其余试剂均为分析纯。对照品为十八种氨基酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：624-200104），样品的5批脑蛋白水解物片（批号：20091001、20091002、20091004、20100604、20100601）为上海实业联合
集团长城药业有限公司提供。
表2回归方程及线性范围
Tab.2Regressionequationandlinearranger
氨基酸线性范围（μg/ml）线性方程相关系数门冬氨酸（Asp）15.2450~45.7350Y=-0.015374+0.0354X0.9995谷氨酸（Glu）丝氨酸（Ser）组氨酸（His）甘氨酸（Gly）精氨酸（Arg）苏氨酸（Thr）丙氨酸（Ala）脯氨酸（Pro）缬氨酸（Val）甲硫氨酸（Met）赖氨酸（Lys）异亮氨酸（Ile）亮氨酸（Leu）色氨酸（Trp）
20.8695~62.6085Y=-0.017515+0.0315X1.5525~4.6575
Y=0.002419+0.0470X
6.7385~20.2155Y=-0.011154+0.0324X7.0925~21.2775Y=-0.059951+0.0682X3.6605~10.9815Y=-0.016681+0.0285X1.4745~4.4235
Y=-0.026929+0.0447X
14.8105~44.4315Y=-0.031121+0.0561X10.0785~30.2355Y=-0.006909+0.0432X10.7445~32.2335Y=-0.000852+0.0506X2.7100~8.1300
Y=-0.001765+0.0404X
29.7785~89.3355Y=-0.048216+0.0709X10.4640~31.3920Y=-0.006737+0.0481X30.3155~90.9465Y=-0.006188+0.0479X2.4655~7.3965
Y=0.000104+0.0306X
0.99940.99930.99980.99600.99990.99920.99960.99960.99930.99910.99960.99950.99970.99950.9997
1.2溶液配制
1.2.1对照品溶液配制精密称取各种氨基酸对照品适量，加水配制成适当浓度，作为对照品贮备溶液，精密吸取1ml至100ml量瓶中，精密加入D-正亮氨酸内标溶液（2mg/ml）1ml，加水至刻度，摇匀。
1.2.2未水解样品溶液取样品20粒，精密称定，研细。精密称取样品适量，置100ml量瓶中，加盐酸溶液（1mol/L）1ml和D-正亮氨酸内标溶液（2mg/ml）1ml，加水稀释至刻度，摇
匀，滤过。
1.2.3水解样品溶液精密称取样品适量，置硬质安瓿中，加D-正亮氨酸内标溶液（2mg/ml）1ml和盐酸2ml，封口，110℃水解20h，放冷，启封，置蒸发皿中，水浴蒸干，加水溶解，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过。
苯丙氨酸（Phe）10.2250~30.6750Y=-0.005556+0.0387X
2.2精密度试验
取同一份未水解氨基酸样品、水解氨基酸样品溶液衍生液连续进样6次，未水解氨基酸含量在34.801~35.101mg/片范围，RSD为0.4%；水解氨基酸含量在82.244~82.884mg/片范围，RSD为0.3%；肽含量在47.443~47.783mg/片范围。2.3重复性试验
取样品6份，照肽含量测定方法项下实验，未水解氨基酸含量在35.052~35.708mg/片范围，RSD为0.9%；水解氨基酸含量在81.289~82.863mg/片范围，RSD为0.8%；肽含量在46.237~47.155mg/片范围。
1.2.4衍生分别精密吸取上述溶液10μl，置0.4cm×5.0cm的小管中，加硼酸盐缓冲液（pH=8.8）70μl，加入衍生试剂AQC溶液（AQC试剂1瓶加AQC稀释液1ml，置55℃烘箱中使溶解，即得）20μl，混匀，置55℃烘箱中10min，即可。1.3色谱条件
色谱柱：Kromasil100-5C18色谱柱（250.0mm×4.6mm）；流动相A：取醋酸钠19.05g，加1000ml超纯水溶解，用磷酸调节溶液pH至5.00，滤过；流动相B：60％乙腈；柱温：37.0°C；流速：1.4ml/min；检测波长：248nm；进样量：取衍生
CHINAMEDICAL中国医药导报67
·药品鉴定·
2.4中间精密度试验
取同一份未水解氨基酸样品溶液、水解氨基酸样品溶液，分别测定氨基酸含量。5℃放置14d后重新测定。见表3。
表3
中间精密度试验结果
图1
2011年5月第8卷第14期
Tab.3Resultsofintermediateprecision
分类当天14d后水解氨基酸含量（mg/片）82.75382.662未水解氨基酸含量（mg/片）肽含量（mg/片）
氨基酸对照品色谱图
RSD（%）
0.050.360.17
Fig.1Aminoacidschromatogramofcontrol
35.05247.701
34.80147.861
2.5加样回收率试验
取已知未水解氨基酸含量和水解氨基酸含量的样品1批，精密称定，分别加入相当于80％、100％、120％量的氨基酸对照品贮备液，各做3份，依法测定，计算回收率，结果见表4、5。
表4
未水解各氨基酸回收率结果（%）
图2
未水解氨基酸样品色谱图
Fig.2Aminoacidschromatogramofnun-hydrolyticsample
Tab.4Recoveryrateofnun-hydrolyticcontents（%）
对照品加入量回收率平均（n=9）RSD（n=9）
80%100.5499.19100.97
100%120%
100.73101.25
99.85100.6
100.49101.47
100.60
0.70
图3水解氨基酸样品色谱图
Fig.3Aminoacidschromatogramofhydrolyticsample
表5肽含量回收率结果（%）
Tab.5Recoveryrateofpeptidecontents（%）对照品加入量回收率平均（n=9）RSD（n=9）
80%100.37101.94100.46
100%120%
100.4699.92
98.63100.39
102.1399.14
100.40
1.10
图（图2、3）可见，脑蛋白水解物片的未水解和水解样品中含有的氨基酸均为较常见的一级氨基酸，没有出现其他明显的杂峰，表明WatersAccQ-Tag方法能作为测定肽含量方法。此外，盐酸水解后色氨酸几乎完全损失（图3），但由于色氨酸的含量极少，对本实验影响较少。国家药品标准中只对总氮和氨基氮的含量进行控制，专属性不高，增加肽含量的测定可以加强其质量控制。
2.6样品测定
取5批样品进行氨基酸含量测定，结果见表6。氨基酸对照品测定图谱见图1，未水解氨基酸样品测定图谱见图2，水解氨基酸样品测定图谱见图3。
表6
样品测定结果
肽含量（mg/片）
[参考文献]
[1]欧阳鸿,牛勇,张欧,等.脑活素对大鼠及小鼠缺氧的保护作用[J].解放
军药学学报,1999,15(1):37.
[1]潘均喜.胞二磷胆碱联合脑蛋白水解物治疗老年性痴呆56例[J].广西
医学,2008,30(9):1404-1405.
Tab.6Resultsofsamples
批号
未水解氨基酸含水解氨基酸含量量（mg/片）
（mg/片）
[3]张道东,王秀英.脑蛋白水解物注射液治疗阿尔茨海默病的临床研究[J].
中国药业,2006,15(15):27-28
[4]田箐.脑蛋白水解物临床应用研究进展[J].中国医学创新,2010,7(2):
121-122.
[5]国家药典委员会.国家药品标准[S].16册.北京:人民卫生出版社,2003:
325.
[6]邓锋,梁蔚阳.氨基酸分析法测定脑蛋白水解物注射液中肽的含量[J].
药物分析杂志,2010,30(10):2001-2003.
[***********][***********]0601
35.2728.0023.9919.7818.80
82.3376.5874.6474.5165.41
47.148.650.754.746.6
3讨论
由于盐酸水解样品过程较繁琐，所以采用内标可以有效的减少系统误差。又因为脑蛋白水解物中可能含有γ-氨基丁酸，故本实验采用D-正亮氨酸作为内标。由样品图谱色谱
[7]陈宇堃,梁蔚阳,薛巧如,等.AccQ-Tag法测定复方氨基酸注射液(18AA-V)中17种氨基酸的含量[J].广东药学院学报,2008,24(2):243-246.[8]于泓,牟世芬.氨基酸分析方法的研究进展[J].分析化学,2005,33(3):
398-404.
（收稿日期：2011-02-16）
中国医药导报CHINAMEDICALHERALD
·药品鉴定·
2011年5月第8卷第14期
利用酸水解氨基酸法测定脑蛋白水解物片中
肽的含量
陈宇堃，邓锋，薛巧如
广东省药品检验所，广东广州
510180
[摘要]目的：探讨脑蛋白水解物片中肽含量的测定方法。方法：采用盐酸水解多肽方法，利用WatersAccQ-Tag氨基酸衍生技术，使用Kromasil100-5C18色谱柱（250.0mm×4.6mm，5μm）进行液相色谱分析，以乙酸钠（pH=5.00）缓冲液为流动相A，60%乙腈为流动相B进行梯度洗脱，检测波长为248nm，柱温为37℃，进样量为5μl。水解后游离氨基酸总量扣除水解前氨基酸总量即为肽含量。结果：各氨基酸测定结果具有良好线性（r＝0.9991~0.9999，n=5），未水解氨基酸平均回收率为100.6%（RSD为0.7%，n=9），肽含量平均回收率为100.4%（RSD为1.1%，n=9）。结论：本方法
准确可行，可作为药品中肽含量测定的方法补充和完善。
[关键词]脑蛋白水解物片；酸水解；氨基酸[中图分类号]R927.2[文献标识码]A
[文章编号]1673-7210（2011）05（b）-066-03
DeterminationofpeptidecontentsfromCerebroproteinHydrolysateTabletsbyacidhydrolyticmethod
CHENYukun,DENGFeng,XUEQiaoru
InstitudeforDrugControlofGuangdongProvince,Guangzhou510180,China
[Abstract]Objective:ToinvestigatetheanalyticmethodofpeptidecontentsfromCerebroproteinHydrolysateTablets.Methods:UsedWatersAccQ-TagmethodbyKromasil100-5C18column(250mm×4.6mm,5μm)toanalyzeaminoacids.Gradienteluentsconsistedofsodiumacetatesolution(pH=5.00)and60%acetonitrile.Thedetectionwavelengthwas248nm,columntemperaturewas37℃,thesamplesizewas5μl.Theequationbetweenthetotalaminoacidscontentsofthehydrolyticandnun-hydrolyticsamplewasthecontentsofpeptide.Results:Thecalibrationcurvesforaminoacidshadgoodlinearities(r=0.9991-0.9999,n=5).Themeanrecoveriesofnun-hydrolyticwas100.6%withRSDof0.7%(n=9);themeanrecoveriesofpeptidewas100.4%withRSDof1.1%(n=9).Conclusion:Themethodissuitableforthefurtherdeterminationofpeptidecontentsindrug.
[Keywords]CerebroproteinHydrolysateTablets;Acidhydrolysis;Aminoacid
脑蛋白水解物是一种大脑所特有的肽类神经营养药物，作用于中枢神经，为神经元修复提供氨基酸，营养神经细胞，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损
见表5。
表5样品自制20060418批自制20060427批自制20060518批
西力欣
头孢呋辛酯片含量测定结果（n=3）
平均含量（%）
孢呋辛酯片的质量控制提供了依据。
[参考文献]
RSD（%）1.581.130.891.54
[1]孟雅杰,李应瑞,候栩.呼吸道细菌性感染成本-效果分析[J].武警医学,
2008,19(8):698-699.
[2]韩润凤,袁恒杰,张洪香,等.4厂家头孢呋辛酯片的质量评价[J].中国药
房,2010,(9):845-847.
[3]倪瑾莹.头孢菌素类药物比较及应用[J].检验医学与临床,2007,4(1):
78-79.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:化学工业出版
社,2005:250.
[5]闫志刚,曾环想,王磊,等.头孢呋辛酯片的试制[J].中国药学杂志,
2002,37(8):28.
[6]闫志刚,曾环想,王磊,等.头孢呋辛酯片的制备工艺及稳定性研究[J].
中国医药导刊,2001,3(5):20.
（收稿日期：2011-01-20）
99.2997.7597.5997.89
3讨论
头孢呋辛酯质量控制方法的研究在国内较少见于报道。该法简便、准确、专属，有一定的新颖性，可用于该制剂的含量及稳定性分析，同时辅料及有关物质对测定无干扰，为头
中国医药导报CHINAMEDICALHERALD
2011年5月第8卷第14期
·药品鉴定·
后溶液5μl。按表1进行梯度洗脱。以内标法计算各氨基酸
的含量。肽含量为水解样品的氨基酸总量扣除未水解样品的氨基酸总量。
表1梯度洗脱表
时间（min）
害[1]。它可透过血脑屏障而促进脑蛋白质合成，影响呼吸链，具有抗缺氧的能力，改善脑内能量代谢，激活腺苷酸环化酶和催化其他激素系统，改善神经突触间的递质传递功能，促进神经元的增生。这些左右可能与其含有的低分子肽的生物活性有关[2]。临床研究表明，脑蛋白水解物能够迅速改善大脑的血液供应，促进有氧代谢，对阿尔茨海默病具有较好的治疗作用[3]。对于急性脑梗死、脑萎缩等其他脑血管疾病，脑蛋白水解物均有治疗作用，且不良反应少，对治疗的依从性高[4]。脑蛋白水解物片主要有效成分为经水解后的小肽分子，含有多种氨基酸及脑磷脂、卵磷脂和肽类神经生长因子等。但国家药品标准中没有对其肽含量进行有效的控制，只是规定其总氮含量和氨基氮含量，不够严谨和规范。通过盐酸水解肽后测定氨基酸是分析肽含量以及氨基酸组成的一个常规方法[6]，而采用WatersAccQ-Tag氨基酸衍生方法测定氨基酸含量是目前常用的一项分析技术[7-8]。本研究依照上述方法，对脑蛋白水解物片中肽含量进行研究和分析。
[5]
[1**********]
Tab.1Gradientelutiontime
流动相A（%）
89
8959598989
流动相B（%）
[1**********]1
2结果
2.1线性关系考察
精密取氨基酸对照品贮备液0.50ml、0.75ml、1.00ml、1.25ml、1.50ml，分别置100ml量瓶中，加D-正亮氨酸内标溶液（2mg/ml）1ml，加水稀释至刻度。依法测定，结果见表2。
1材料与方法1.1仪器与试药
Waters2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器，EM-POWER2色谱工作站，SARTORIUSCP225D电子天平，Mil-liporeQ超纯水机，BINDERED50烘箱。色谱柱：Kromasil100-5C18色谱柱（250.0mm×4.6mm，5μm）；乙腈为色谱纯（美国Merck公司），其余试剂均为分析纯。对照品为十八种氨基酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：624-200104），样品的5批脑蛋白水解物片（批号：20091001、20091002、20091004、20100604、20100601）为上海实业联合
集团长城药业有限公司提供。
表2回归方程及线性范围
Tab.2Regressionequationandlinearranger
氨基酸线性范围（μg/ml）线性方程相关系数门冬氨酸（Asp）15.2450~45.7350Y=-0.015374+0.0354X0.9995谷氨酸（Glu）丝氨酸（Ser）组氨酸（His）甘氨酸（Gly）精氨酸（Arg）苏氨酸（Thr）丙氨酸（Ala）脯氨酸（Pro）缬氨酸（Val）甲硫氨酸（Met）赖氨酸（Lys）异亮氨酸（Ile）亮氨酸（Leu）色氨酸（Trp）
20.8695~62.6085Y=-0.017515+0.0315X1.5525~4.6575
Y=0.002419+0.0470X
6.7385~20.2155Y=-0.011154+0.0324X7.0925~21.2775Y=-0.059951+0.0682X3.6605~10.9815Y=-0.016681+0.0285X1.4745~4.4235
Y=-0.026929+0.0447X
14.8105~44.4315Y=-0.031121+0.0561X10.0785~30.2355Y=-0.006909+0.0432X10.7445~32.2335Y=-0.000852+0.0506X2.7100~8.1300
Y=-0.001765+0.0404X
29.7785~89.3355Y=-0.048216+0.0709X10.4640~31.3920Y=-0.006737+0.0481X30.3155~90.9465Y=-0.006188+0.0479X2.4655~7.3965
Y=0.000104+0.0306X
0.99940.99930.99980.99600.99990.99920.99960.99960.99930.99910.99960.99950.99970.99950.9997
1.2溶液配制
1.2.1对照品溶液配制精密称取各种氨基酸对照品适量，加水配制成适当浓度，作为对照品贮备溶液，精密吸取1ml至100ml量瓶中，精密加入D-正亮氨酸内标溶液（2mg/ml）1ml，加水至刻度，摇匀。
1.2.2未水解样品溶液取样品20粒，精密称定，研细。精密称取样品适量，置100ml量瓶中，加盐酸溶液（1mol/L）1ml和D-正亮氨酸内标溶液（2mg/ml）1ml，加水稀释至刻度，摇
匀，滤过。
1.2.3水解样品溶液精密称取样品适量，置硬质安瓿中，加D-正亮氨酸内标溶液（2mg/ml）1ml和盐酸2ml，封口，110℃水解20h，放冷，启封，置蒸发皿中，水浴蒸干，加水溶解，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过。
苯丙氨酸（Phe）10.2250~30.6750Y=-0.005556+0.0387X
2.2精密度试验
取同一份未水解氨基酸样品、水解氨基酸样品溶液衍生液连续进样6次，未水解氨基酸含量在34.801~35.101mg/片范围，RSD为0.4%；水解氨基酸含量在82.244~82.884mg/片范围，RSD为0.3%；肽含量在47.443~47.783mg/片范围。2.3重复性试验
取样品6份，照肽含量测定方法项下实验，未水解氨基酸含量在35.052~35.708mg/片范围，RSD为0.9%；水解氨基酸含量在81.289~82.863mg/片范围，RSD为0.8%；肽含量在46.237~47.155mg/片范围。
1.2.4衍生分别精密吸取上述溶液10μl，置0.4cm×5.0cm的小管中，加硼酸盐缓冲液（pH=8.8）70μl，加入衍生试剂AQC溶液（AQC试剂1瓶加AQC稀释液1ml，置55℃烘箱中使溶解，即得）20μl，混匀，置55℃烘箱中10min，即可。1.3色谱条件
色谱柱：Kromasil100-5C18色谱柱（250.0mm×4.6mm）；流动相A：取醋酸钠19.05g，加1000ml超纯水溶解，用磷酸调节溶液pH至5.00，滤过；流动相B：60％乙腈；柱温：37.0°C；流速：1.4ml/min；检测波长：248nm；进样量：取衍生
CHINAMEDICAL中国医药导报67
·药品鉴定·
2.4中间精密度试验
取同一份未水解氨基酸样品溶液、水解氨基酸样品溶液，分别测定氨基酸含量。5℃放置14d后重新测定。见表3。
表3
中间精密度试验结果
图1
2011年5月第8卷第14期
Tab.3Resultsofintermediateprecision
分类当天14d后水解氨基酸含量（mg/片）82.75382.662未水解氨基酸含量（mg/片）肽含量（mg/片）
氨基酸对照品色谱图
RSD（%）
0.050.360.17
Fig.1Aminoacidschromatogramofcontrol
35.05247.701
34.80147.861
2.5加样回收率试验
取已知未水解氨基酸含量和水解氨基酸含量的样品1批，精密称定，分别加入相当于80％、100％、120％量的氨基酸对照品贮备液，各做3份，依法测定，计算回收率，结果见表4、5。
表4
未水解各氨基酸回收率结果（%）
图2
未水解氨基酸样品色谱图
Fig.2Aminoacidschromatogramofnun-hydrolyticsample
Tab.4Recoveryrateofnun-hydrolyticcontents（%）
对照品加入量回收率平均（n=9）RSD（n=9）
80%100.5499.19100.97
100%120%
100.73101.25
99.85100.6
100.49101.47
100.60
0.70
图3水解氨基酸样品色谱图
Fig.3Aminoacidschromatogramofhydrolyticsample
表5肽含量回收率结果（%）
Tab.5Recoveryrateofpeptidecontents（%）对照品加入量回收率平均（n=9）RSD（n=9）
80%100.37101.94100.46
100%120%
100.4699.92
98.63100.39
102.1399.14
100.40
1.10
图（图2、3）可见，脑蛋白水解物片的未水解和水解样品中含有的氨基酸均为较常见的一级氨基酸，没有出现其他明显的杂峰，表明WatersAccQ-Tag方法能作为测定肽含量方法。此外，盐酸水解后色氨酸几乎完全损失（图3），但由于色氨酸的含量极少，对本实验影响较少。国家药品标准中只对总氮和氨基氮的含量进行控制，专属性不高，增加肽含量的测定可以加强其质量控制。
2.6样品测定
取5批样品进行氨基酸含量测定，结果见表6。氨基酸对照品测定图谱见图1，未水解氨基酸样品测定图谱见图2，水解氨基酸样品测定图谱见图3。
表6
样品测定结果
肽含量（mg/片）
[参考文献]
[1]欧阳鸿,牛勇,张欧,等.脑活素对大鼠及小鼠缺氧的保护作用[J].解放
军药学学报,1999,15(1):37.
[1]潘均喜.胞二磷胆碱联合脑蛋白水解物治疗老年性痴呆56例[J].广西
医学,2008,30(9):1404-1405.
Tab.6Resultsofsamples
批号
未水解氨基酸含水解氨基酸含量量（mg/片）
（mg/片）
[3]张道东,王秀英.脑蛋白水解物注射液治疗阿尔茨海默病的临床研究[J].
中国药业,2006,15(15):27-28
[4]田箐.脑蛋白水解物临床应用研究进展[J].中国医学创新,2010,7(2):
121-122.
[5]国家药典委员会.国家药品标准[S].16册.北京:人民卫生出版社,2003:
325.
[6]邓锋,梁蔚阳.氨基酸分析法测定脑蛋白水解物注射液中肽的含量[J].
药物分析杂志,2010,30(10):2001-2003.
[***********][***********]0601
35.2728.0023.9919.7818.80
82.3376.5874.6474.5165.41
47.148.650.754.746.6
3讨论
由于盐酸水解样品过程较繁琐，所以采用内标可以有效的减少系统误差。又因为脑蛋白水解物中可能含有γ-氨基丁酸，故本实验采用D-正亮氨酸作为内标。由样品图谱色谱
[7]陈宇堃,梁蔚阳,薛巧如,等.AccQ-Tag法测定复方氨基酸注射液(18AA-V)中17种氨基酸的含量[J].广东药学院学报,2008,24(2):243-246.[8]于泓,牟世芬.氨基酸分析方法的研究进展[J].分析化学,2005,33(3):
398-404.
（收稿日期：2011-02-16）
中国医药导报CHINAMEDICALHERALD