开发安全的人类多能干细胞治疗策略
翻译：何君贤
原文作者：Melissa K Carpenter, Joyce Frey-Vasconcell and Mahendra S Rao
原文检索： Carpenter, M.K., J. Frey-Vasconcells, and M.S. Rao, Developing safe therapies from human pluripotent stem cells. Nat Biotech, 2009. 27(7): p. 606-613
摘要：将人类的多能干细胞(pluripotent stem cells PSC)推进到细胞治疗层面需要开发出检测产品均一性、稳定性、致瘤性、毒性和免疫原性的标准化检测方法。
前言：细胞治疗是现代医学领域最有前景的几种治疗方法之一，若干治疗方案正在产业界和科研小组中酝酿。自1968年第一例骨髓移植错误！未找到引用源。成功以来，基于成人干细胞的治疗方案已经在临床上应用了数十年。在这几十年的发展中，细胞治疗技术取得了巨大的发展。与此相应，监管机制也发生了巨大变化。(在美国)，细胞治疗受美国食品药品监督管理局的“良好组织操作规程”(Good Tissue Practices Final Rule)监管。该操作规程对与细胞治疗有关的风险进行分类监管(表1)。一批细胞产品，比如软骨细胞和人造皮肤已经获得了FDA的批准(表2)。尽管与干细胞相关的产品目前还没有获得批准，但是该类产品中已经有几种处于晚期临床试验阶段了(表2)。
表1.监督管理机制
类别 监管机制
不受FDA
一类 21CFR 1271法
案监管 适用范围 基于细胞的制品，不涉及人类细胞/组织的细胞产品；没有或很小的处理；同源使用；不与药物或
者设备搭配使用
经过较小处理的基于人类细胞/
受公共健康安
二类“361” 全法案第361部
位监管 组织的产品；同源使用；不与药物或设备混合使用；自体使用或者具有一级或二级血缘关系的
亲属间使用
受公共健康安
三类“351” 全法案第351部
分监管 经过培养或者处理的人类细胞/组织产品；不是以同源治疗为目的；结合药物或仪器使用；异体
使用 比如将右膝软骨和左膝软骨进行外科移植；用于治疗恶性血液疾病，从外周血分离纯化的CD34+簇造血细胞 利用扩大的人类神经干细胞以传输溶酶体酶类；在心肌梗死治疗中使用的人类胚胎干细胞来源的心肌细胞 器官移植、全血来源的产品、高剂量化疗或全身放疗后的骨髓移植 举例
对于成人干细胞治疗或者多能干细胞治疗来说，其一般操作流程是首先将未分化干细胞(undifferentiated stem cell)扩大培养，然后体外诱导其分化成某种特殊类型的细胞，将这些诱导生成的细胞通过一定的方法输送到病人体内，最后使这些细胞长期定居在病人体内发挥作用。围绕这一干细胞治疗流程所设立的一些监督管理办法主要是基于活细胞的一些特征而设立的。活细胞在体内或者体外都会随着时间的变化而发生改变，这些细胞所生存的环境总体上是复杂多样的。活细胞被移植到体内后会发生整合和迁移，与宿主系统，比如局部环境和免疫系统，发生相互作用。但是，干细胞来源的细胞产品除了具有上述特征外还具有以下两个额外特征使得它们与众不同：超强的自我复制能力和多能性。细胞的高度自我复制能力保证了能够进行大规模的商业化生产，但是同时也提出了新的要求，即有必要对在体外经过
一定时间培养后的细胞的稳定性进行评估。细胞的多能性是诱导生成特殊的细胞类型的前提，但同时这一特性也有可能导致肿瘤的产生和生成不需要的细胞。本文将重点讨论干细胞治疗所涉及监管控制等议题错误！未找到引用源。。由于第一个被授权的干细胞临床试验是人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells hESCs), 本文将围绕人类胚胎干细胞展开讨论。同时，我们也留出一点空间来讨论与诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells iPSCs)相关的一些特殊议题。
表2. 市场上目前正在使用的或者处于晚期临床试验阶段的细胞治疗产品
产品
软骨 Carticel
上皮 Epicel
人造皮肤 Dermagraft
人造细胞 Transcyte
人造皮肤Apligraf
间充质细胞Prochymal
肌细胞 MyoCell 描述 自体软管细胞 自体成纤维细胞 异种成纤维细胞 异种成纤维细胞 异种成纤维细胞 人类成熟间充质干细胞 自体来源的骨骼肌细胞
扩大培养物
脐带血细胞亚群 用途 软骨替代 皮肤替代 皮肤替代 皮肤替代 皮肤替代 移植物抗宿主疾病 充血性心力衰竭 遗传性代谢疾病；溶酶体ALD-101细胞 缺乏症；过氧化物蓄积疾
病；造血干细胞移植 3期临床 目前状态 已获批 已获批 已获批 已获批 已获批 3期临床 3期临床
为了证明hESC来源的治疗手段的安全性需要对原始材料进行检测、评估；证明细胞再生和细胞处理方案的可重复性；对最终产品的均一性进行分析；对细胞的体内特征如体内的分布、致瘤性、毒性和免疫原性进行分析。上述某些议题已经在讨论细胞治疗的文章中进行了阐述错误！未找到引用源。。本文将着重对具有特殊挑战性的议题包括hESCs的分离、产品的均一性、细胞的稳定性、致瘤性、毒性以及免疫原性进行讨论。
1. hESCs的分离
目前所使用的大部分hESCs都是以研究为目的，用小鼠饲养层为辅助材料分离获得的。目前FDA还没有专门针对为临床应用而进行hESCs分离的指导方案。所以，目前研究者只能参照在体细胞治疗方面的指导方案来进行hESCs的分离操作。在这样的指导方案下，用于临床的hESCs的分离需要遵循“良好的组织操作”(Good Tissue Practice GTP)和“良好的生产操作”(Good Manufacturing Practice GMP)方面的要求。这些要求包括供体的合格性，在hESCs的采集、筛选、测试、处理、储存、标记、包装和分发过程中都遵循GMP规程。详细的规程在21CFR210&211中有描述(见表3中有关FDA指导方案的链接和参考材料)。但是，目前遵循GTP/GMP规程进行hESCs的分离已不现实。比如用于人工生殖的体外生产的的胚胎虽然可以成功受孕，但是却不符合GTP/GMP操作规程。GTP规程下的“供体合格性”要求对供体进行一系列的筛查，包括对每个供体家族史和血液样本的筛查。在临床体外受精操作中一般没有做这些筛查，所以当这些体外受精所剩下的胚胎被捐献出来用于分离hESCs时也就很难实施规程中所要求的筛查了。
考虑到严格遵照GTP/CMP进行hESCs分离的现实困难，我们的焦点将集中到这些规范的要旨，即确保细胞产品不会被一些偶然的成分所污染。所以，只需要按照FDA的“细胞系特征鉴定注意事项指导方针”(Points to Consider in the Characterization of Cell Lines guideline见表3) 对起始材料和最终的细胞产品进行检验就足够了。针对hESCs进行检验可
以缓解缺少供体信息的困难。考虑到hESCs的高度自我复制的特性，即使GTP原则下的指导方针还没有完善起来，建立大的主细胞库和工作细胞库(master and working cell banks)也是有可能的。这些细胞库包括足够多的细胞用于对污染物进行检测。确实，将来按照GTP原则所生产的细胞系也不是必须进行临床注册。今年(2009年)一月，FDA就批准了Geron公司(美国，加利福尼亚，Menlo公园)的用少突胶质细胞前体细胞进行新药研究的申请，这种前体细胞所来源的hESCs系是科研实验室以小鼠饲养层为辅助材料所分离的第一个hESCs系所错误！未找到引用源。。然而，随着该领域的不断进步，将来会生产更加符合GTP/GMP规范的细胞系用于临床实践和产品开发。有几个研究小组正在针对规范中的要求开发“临床级”(clinical-grade) hESCs(即这些细胞系是在接受了GMP原则下的充分测试而产生的)，其中一个小组报道已经开发出了6个这样的细胞系错误！未找到引用源。.
表3.开发干细胞治疗的参考材料
参考资料
评审人员指南
人类体细胞治疗研究新药申请化学、生产、控制
评审人员指导说明和模板
FDA评审员和资助者指南
化学、制造和控制内容和回顾
人类体细胞治疗研究新药申请信息
产业指南：关于异种移植产品在人上使用的动物、
产品、临床前和临床期的问题
产业指南：针对开发人类细胞、组织和基于人类
细胞、组织的产品现行的良好组织操作规范
(CGTP)
对用于生产生物制品的细胞系进行特征鉴定时需
要考虑的问题(1993) 链接 http://www.fda.gov/OHRMS/DOCKETS/ 98fr/03d0349gdl.pdf http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/ Guidances/Xenotransplantation/ucm092705.pdf http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances /Xenotransplantation/ucm092707.pdf http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/ Guidances/Tissue/ucm091408.pdf http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
OtherRecommendationsforManufacturers/UCM062745.pdf
http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/
产业指南：人类体细胞治疗和基因治疗指南 GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/CellularandGeneTherapy/ucm072987.htm
产业指南：人类细胞、组织或者基于人类细胞、
组织的产品的捐献者合格性确定 http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/Tissue/ucm073964.htm
2. 产品的均一性(Product consistency)
生产基于hESCs的产品的目的就是能够在一种具有充分的安全防范措施、无菌、可追溯的洁净环境下生产出数量充足的、均一的细胞。为了实现这种目标，就需要开发一种可以获得充足细胞数量的扩增方法，一种精确的诱导分化方法和经过验证的分析方法，以此来保证所生产的产品批与批之间具有很好的均一性。只要在符合GMP规范的环境条件下使用标准操作方案和开发有效的监测整个生产环节均一性的检测方法就可以大体上达到这种均一性要求。但是，对“均一性”的明确却具有很大的困难，因为与小分子不同的是，细胞是一种有生命的有机体，并会随着时间的变化而发生改变。为了保证均一性，需要特别注意减少
起始材料的差异、分化调控方法以及生产流程，并且要对终产品进行严格的功能和成分检查。图1显示的是生产制造干细胞产品所涉及到的若干步骤。
图1. 显示干细胞产品开发的生产工艺流程。cGMP: 现行良好生产操作规范(current
Good Manufacturing Practice)。
2.1在差异性起始材料前提下保障产品均一性的措施
目前基于hESCs进行治疗策略开发的一般模式中一般是希望根据单个细胞培养建立一个群体，然后在体外进行适当扩增，以此为基础建立一种经过验证的hESCs主细胞库。如果一种细胞产品来源于单一的一个细胞系―这种现象在培养的早期可以发生－差异性就有可能存在于主细胞库中的各个细胞瓶之间。在细胞库中对细胞的构成成分进行彻底的检测可以解决差异性的问题。但是，对均一性的担忧会随着为人类白细胞配型而建立起来的，供体多样的细胞库的增加而增加。数百种hESCs细胞系已经被建立了起来，虽然没有对这些细胞系做过细致的比较，但是分化能力的明显差异却已经被发现错误！未找到引用源。。考虑到从不同个体所分离的处于同一时期的干细胞群所表现出来的明显差异(未发表数据)，上述不同hESCs系之间所展现出来的差异性也不足为奇。hESCs细胞系之间的差异有可能是由分离方法、分离时期(如桑椹期或囊胚期)或者等位基因间的差异所造成的。这些差异将导致生产速度、分化能力、核型稳定性和体内整合和体内功能的差异。
表4. hESCs具备的特征a
特征
群体倍增时间
是否需要成纤维细胞生长因子
分化能力
核型稳定
SSEA-1标记
SSEA-3标记
SSEA-4标记
TRA-1-60标记
TRA-1-81标记
Oct4标记
Nanog标记
Sox2标记
E-cadherin标记
Brachyury标记
Pax6标记
APF标记
a标准 ～36h 是 有 是 无 有 有 有 有 有 有 有 有 无 无 无 从参考文献34中整理而来
在于我们常见的生物制品中也存在类似的差异，虽然差异的程度相对来说小一些，但是还是存的，如促红细胞生成素(erythropoietin)。存在于这些生物制品中的差异性已经通过将产品限制于某一种起始材料或者开发严格的、可以提供预测能力的分析评判标准得以解决。在hESCs中采取上述同样的策略却比较困难。虽然目前对多能干细胞的特征的研究已经取得了很大的进展，但是这些特征间的关系和特征的安全性依然不清楚。目前已经采用标准化的方法，如检测多能性标记(pluripotency markers)的免疫细胞化学方法和PCR方法、核型分析(evaluation of karyotype)、类胚体和畸胎瘤形成能力检测等方法，对hESCs的特征进行了鉴定。并且，已经采用了芯片技术、基因表达序列分析(serial analysis of gene expression SAGE)以及转录谱(transcriptional profiling)等方法对不同hESC细胞系进行了比较分析错误！未找到引用源。。我们研究小组的成员还根据芯片分析的结果提出了一组多能性基因(M.R.及其同事错误！未找到引用源。)。最近，更是通过对多个细胞系的荟萃分析(metanalysis)提出了一组无偏基因用于对hESC细胞系进行分析错误！未找到引用源。。这些方法虽然都有一定的可取之处，但是在临床应用方面它们要么不能被广泛接受，要么达不到要求的精度或者可信度。考虑到各hESC细胞系之间存在的客观差异性，我们建议在主细胞库中进行的检测应该包括表型分析、基因型分析和功能分析。一些可用的检测特征在表4中列出。
2.2 在诱导分化和生产过程中确保批次间的均一性
虽然在开发诱导分化方法错误！未找到引用源。、纯化方法错误！未找到引用源。和选择错误！未找到引用源。方面已经取得了很大的进步，但是最终的细胞群体却不可能达到绝对的均一性。所以，我们需要一种可以生产出具有相似细胞组成的、可重复的诱导分化流程。在分化和生产过程中的关键控制点处需要对包括细胞表型(phenotype)、倍增时间(doubling time)、存活力(viability)、群体差异性以及包括无菌特性、内毒素水平(endotoxin level)、支原体污染(mycoplasma contamination)在内的安全性等指标进行检测。
2.3 通过确定产品的组分来确保功能的均一性
总体上来说，细胞产品可以被认为是一群由功能成分(有活性的细胞)和污染物成分组成的杂合细胞群体。污染物有可能是辅助细胞、未分化细胞或者其它与治疗作用无关的细胞。生产工艺需要确保各批次之间包括稳定数量的活性成分和污染成分。
以下将详细探讨细胞产品中存在的不需要的细胞组分以及确定这些组分的可接受水平的重要性。对细胞产品进行功能评估需要开发检测产品功效的模拟系统，以此来预测细胞产品的体内活性。这种分析测试系统有可能十分复杂，因为活细胞的类型或者其发挥活性的机制无法知晓(如在脊髓损伤治疗中，治疗性细胞有可能是促进髓鞘再生，或者是提供了某些生长因子或者两者都具备)。开发体外预测分析系统可以大大减少测试和优化生产条件所需的成本和时间，从而可以大大的促进生产。
对某个终产品的特征进行鉴定需要考虑细胞群体和其发挥功能的机制。比如，在对治疗帕金森氏病(Parkinson’s disease)中用作替代细胞的多巴胺能神经元(dopamainergic neurons)进行鉴定时，需要考虑的问题是，该细胞群需要表达合适的标记分子如神经丝和酪氨酸羟化酶(neurofilament and tyrosine hydroxylase)，不表达未分化细胞、内胚层和中胚层的标记分子。功能测试项目中应该包括细胞去极化后多巴胺的释放活性和移植后不分裂特性的维持。再比如，如果移植的细胞主要是为了提供某些因子以保护内源性细胞或者弥补内源性缺失的因子，那么功能分测试项目中就需要分析这些因子的分泌情况。
在细胞产品的评估中，表观遗传学特征分析(epigenetic profiles)也有可能起到一定的作用。目前，FDA还没有对一些细胞产品中重要基因的表达检测或者表观遗传组学(epigenome)的检测做出要求。即便如此，如果对这些指标进行检测将会有利于细胞特征的评估。刚开始的时候可以检测组蛋白修饰(histone modification)和DNA甲基化(DNA methyaltion) 错误！未找到引用源。，以此来评估表观遗传的稳定性。
确定细胞产品的均一性的困难是客观存在的，因为多能干细胞正是由于其多潜能性才在临床治疗方面受到人们青睐的。多能干细胞是一种活跃的细胞，能够对环境作出积极的反应。在培养条件下可以进行无限生长，从而导致了以体外系统很好地预测以多能干细胞为基础开发出的某种细胞产品批次间的稳定性、体内活性面临巨大的挑战性。由iPSCs所展开的个性化治疗研究，每个批次的细胞产品都是个体特异性的，每个批次产品的起始材料都不同，这又一次加剧了产品均一性评估的难度。尽管如此，还是开发出了一些方法来检验并监测这些参数。
3. 细胞的稳定性
细胞治疗领域的细胞稳定性议题起源于对细胞群体的分割。人们尤其关心的是细胞在经历若干群体倍增(population doublings)后是否变得不稳定或者发生转变。确实，造血细胞移植(目前唯一大规模使用的干细胞治疗方法)治疗中偶尔会发生的一种并发症就是供体细胞白血病(donor-cell leukemia ) 错误！未找到引用源。。 细胞在体外进行长时间培养后就会开始发生漂变或者说是发生遗传性或者表观遗传性变化。
自我更新能力增强的hESCs有可能在体外长期培养条件下获得选择优势。在某些情况下，长期培养条件下的hESCs明显具备一种稳定的表型、核型和印记特征错误！未找到引用源。，但是在另一些情况下，它们也可能获得与人类胚胎瘤类似的核型特征，比如12号染色体三体和17号染色体三体错误！未找到引用源。, 或者其他变异错误！未找到引用源。。有两个研究小组最近在长期培养的hESCs中鉴定出了一些次生的染色体异常，包括与癌基因转变有关的20q11.21扩增错误！未找到引用源。。总体上，这些细胞还是保持了多能性特征并表达一些标准的hESC标记错误！未找到引用源。。 尽管还不知道存在于hESC培养中的少数核型异常细胞是否会影响包括生长速度、细胞周期调控和分化能力在内的大体特征，但是，这些异常的发现强调了细致监测的必要性。开发出异常核型检测方法将会对安全性评
估起到很好的辅助作用。
由于采用了人类胚胎这种特殊的起始材料，对hESCs表观遗传的稳定性在一开始就引起了人们的注意。已经发现人工辅助生殖用的培养胚胎存在着一些表观遗传异常错误！未找到引用源。。 有几个研究小组已经着手对hESCs的表观遗传学特征进行研究，包括X染色体失活(X-inactivation)、印记(impringting)和甲基化(methylation)。X染色体失活似乎在不同的hESCs细胞系中存在着差异错误！未找到引用源。。印记研究表明在培养环境下可以维持基因组一定程度上的稳定性错误！未找到引用源。。一些新的工具已经被开发出来评估多能干细胞的甲基化特征错误！未找到引用源。。接下来的工作就是研究这些甲基化特征能否在长期培养下保持稳定。
考虑培养的hESCs的遗传学和表观遗传学问题对安全性测试具有多方面的启示。其中最重要的一点就是对hESCs和分化出来的细胞产品的测试需要在一个足够长的时间范围内进行，这样才可以获得关于稳定性的可靠结论。所以，上文提到的对产品稳定性进行测试的的指标(表型、核型、遗传特征和表观遗传特征)都需要在一个长的时间期限内进行。对囊括数代或者数个倍增群体进行的稳定性测试可以包括重要基因的表达(如端粒酶基因、细胞周期相关基因、关键的hESC标记分子基因)、基因组和表观遗传的稳定性(甲基化、miRNA、组蛋白乙酰化和X染色体失活)。将这些测试与对其它体外分析测试相结合，有可能使遗传学和表观遗传学特征测试成为细胞产品体内稳定性评估的一种测试方法。
虽然我们相信细胞治疗所采用的hESC群体应当是二倍体并且稳定，但是值得指出的是，在FDA批准的临床试验中，有用人类胚胎瘤细胞系NT2进行试验的项目错误！未找到引用源。。在由Layton Bioscience公司(美国加州光谷)所实施的临床试验中，所移植的神经元细胞来源于NT2/D1细胞系。NT2/D1细胞先在视黄酸条件下培养6周，然后在抗有丝分裂物质下培养6天，然后将按照这种培养方法所生产出来的神经元细胞冷冻保存直到移植。移植时，细胞被解冻，然后经过一定的处理后注射到中风病人的体内。病人在接受大约两百万到一千万细胞移植后，还需要进行持续52周的移植后评估。NT2细胞被报道有56-61条染色体，并携带很多异常错误！未找到引用源。。但是，当将NT2N细胞(对这种细胞的处理方法与上述应用于临床应用的细胞的处理方法相似)移植到裸鼠中枢神经系统时，在14个月的检测期内没有发现致瘤性和有丝分裂活性错误！未找到引用源。。另外，在这些临床试验中，没有一例致瘤的报道。这些数据表明，异常核型或者较轻微的异常倍型不是致瘤性的预测指标。
4. 致瘤性
用多能干细胞开发细胞产品最重要的一个议题是确保细胞在输入到人体后不会导致肿瘤的发生。关于这一点主要有两方面的考虑。第一，治疗性细胞可能被具有增殖能力并能够致瘤的未分化细胞所污染。第二，治疗性细胞可能去分化(de-differentiate)或发生转变，从而导致良性或者恶性肿瘤。我们建议围绕致瘤性的考虑应当针对病人个体考虑风险/受益率。比如，得了像肌萎缩性侧索硬化症或者亨廷顿氏病等致命性、恶性疾病的患者在接受细胞治疗方面所能够容忍的风险显然要比那些还能够生活数年的病人，如糖尿病患者，所能够承受的风险要大很多。
4.1 致瘤性评估所要考虑的问题
hESCs的多能性评估是通过将这种细胞注射到免疫缺陷的小鼠体内看畸胎瘤形成的情况来实现的。这些畸胎瘤一般被认为是一种包含三个胚层分化成分的良性肿瘤。尽管hESCs是从内细胞团(inner cell mass ICM)分离而来，但是由它们所形成的畸胎瘤与自发形成的生殖细胞瘤在形态上十分相似。我们有可能利用临床上所积累的关于生殖细胞肿瘤的研究治疗结果来更好地理解并预测由多能干细胞分化来的畸胎瘤的一些行为特征。自然发生的畸胎瘤被认为是一种生殖细胞来源的良性肿瘤，其明显的特征就是包含一个或多个胚层来源的细胞。
这些肿瘤的行为根据其发生的位置、患病病人是处于青少年期还是青少年后期而有所不同。大多数卵巢畸胎瘤是具有正常二倍体核型(46, XX)的良性肿瘤。这些肿瘤大多数会变成囊状化并包含一些规律性的分化细胞。成熟睾丸瘤经常是一种具有异常细胞遗传特征的固体化肿瘤，特点复杂多样并被归类为畸胎癌(teratocarcinomas)一类错误！未找到引用源。。睾丸畸胎癌经常包含复杂的细胞遗传学异常，包括12号染色体短臂扩增形成异常染色体[i(12p)]。畸胎瘤未成熟的标志通常都是包含未成熟的神经上皮细胞。患畸胎瘤或者畸胎癌的患者如果在其肿瘤中包含较少的神经上皮细胞通常预示其存活率较高错误！未找到引用源。。
生殖细胞瘤的这些特征表明了性别、核型稳定性、在免疫缺陷小鼠上的肿瘤形成类型等都可以告诉我们一些关于风险程度和需要采用的测试方法等信息。特别地，多能干细胞群体所形成的肿瘤的类型在细胞治疗的安全性评估体系中将会是一个十分重要的环节。一个可具有稳定二倍体核型和产生成熟的，分化充分的畸胎瘤的hESC细胞系比一个核型异常，产生包含神经上皮的不成熟畸胎瘤的hESC细胞系要好得多。
4.2 对起始材料的检测
在已经知道hESC能够产生畸胎瘤的前提下，接下来需要回答的问题就是需要多少个hESCs才可以产生畸胎瘤？畸胎瘤的产生受环境的影响吗？
评估产生畸胎瘤所需要的细胞数量将有助于建立一套安全参数，比如细胞产品在无致瘤风险的情况下允许存在其中的hESC数目。畸胎瘤的形成往往需要注射一百万到一千万的hESCs。然而，畸胎瘤的形成效率却依赖于细胞接种的位置和动物的品系。另外，细胞在注射时会发生大量死亡，这会在很大程度上降低细胞的“有效剂量”(effective does)。最后，hESCs只有以克隆或集落的形式进行培养时表现得更加稳定错误！未找到引用源。，分开成单个细胞进行培养将导致细胞死亡和核型异常。该结论得到了最近一项研究的证实，即当用可以影响细胞相互作用的ROCK抑制剂处理时可以提高分离成单个细胞的hESCs的存活能力错误！未找到引用源。。由此可见，测试畸胎瘤形成需要的绝对细胞数目将有赖于对细胞构成和细胞所处环境的了解。
接种位置的重要性也可以在现有的研究中找到明显得证据。在一项研究中，经皮下和肝脏注射的NCL1细胞所形成的畸胎瘤在生长和分化特性上都不同错误！未找到引用源。。肝脏着生的畸胎瘤呈囊装，掺杂着未成熟和分化的细胞，出现更迅速，生长体积更大；而皮下着生的畸胎瘤生长缓慢，体积较下，所包含的大多数是分化后的细胞。目前还不清楚这些差异的出现是否是由注射时细胞的存活能力差异或者注射后的增殖能力差异或者是环境差异或者是上述差异因素的综合所引致。
Shih等人的研究进一步强调了微环境所造成的影响错误！未找到引用源。。在该研究中，他们将人类胚胎胸腺组织、胰腺组织或者肺脏组织分别与hESCs进行协同移植。与胚胎胸腺一起移植的hESCs产生的畸胎瘤包含原始的和未分化的细胞，而不是在成熟畸胎瘤中存在的那种典型的未分化细胞结构。而与此不同的是，小鼠后肢注射同样的细胞系却产生分化后的畸胎瘤。这些作者同时也研究了与胎儿胸腺或者肺脏组织一同注射产生畸胎瘤所需要的细胞数目，发现注射5000个细胞可以稳定地产生畸胎瘤，而注射50个细胞的动物没有一例产生畸胎瘤。当然，将hESCs与胚胎组织协同注射的策略还不大有可能成为一种治疗上的策略。也许，一种更加贴近实际的测试是将hESCs分化而来的细胞与成熟的人类组织一起注射。不管怎样，这些数据都说明了hESCs来源的细胞产品必须要在相关的环境下进行测试。在临床环境下，微环境经常与疾病背景和免疫抑制有关。我们建议每个hESC细胞系形成畸胎瘤所需的细胞数目需要在多个位点，包括该细胞产品预定的注射位点进行分析评估。
一些研究已经表明将hESCs注射到动物模型中不会导致畸胎瘤的产生。这种现象似乎与细胞的纯度、移植位点及细胞的成熟度有关。如果hESCs没有完全地分化，那么畸胎瘤形成的可能性更大错误！未找到引用源。。至今没有观察到各种hESC来源的细胞群体在被
注射到心脏错误！未找到引用源。、脊索错误！未找到引用源。和大脑错误！未找到引用源。后产生畸胎瘤的现象。然而，Kroon等报道15%的动物在被移植胰腺内胚层细胞群后有畸胎瘤发生。这些作者注意到移植的这群细胞没有经过富集，有可能在移植的时候包含了中胚层和外胚层的细胞成分。所以，很难确定该文中所提及的畸胎瘤是污染的hESCs所致还是由移植了三个胚层来源的成分所致错误！未找到引用源。。在另一个试验中，给帕金森氏病的小鼠模型移植hESC来源的多巴胺能神经元后导致移植物产生一种具瘤性的扩大核心，该核心包含未分化的、具有有丝分裂活性的神经上皮细胞错误！未找到引用源。。与此相反的是，Ravindran等人错误！未找到引用源。报道，移植的hESC来源的神经前体细胞不发生畸胎瘤，即使在移植1年后也是如此。这两个研究小组所使用的是不同的hESC细胞系，在不同的培养体系下培养，用不同的方法诱导分化，然后移植到大脑的不同部位。
早期的这些研究表明hESC来源的产品的致瘤性将会受到hESC细胞系、细胞群体的纯度、细胞群体的成熟度、细胞移植的数量、细胞移植的位置等因素的影响。所以，安全性评估必须包含这些因素。另外，也需要将打算处理的临床情形也包含进来。比如，某些治疗需要暂时性或长期性地采取免疫抑制，这有可能影响移植细胞的存活能力和宿主对这些移植细胞的反应。
上述这些检测的目的就是要探究细胞在移植后最终会不会产生肿瘤。所以，所有这些检测研究都是长期性的(>1年)，究竟多长才足够取决于治疗的病人群体和风险/受益率。所测试的细胞剂量将取决于临床人用剂量。大体上推测人用剂量应该按照十倍剂量测试。即，如果给病人移植的细胞剂量是一千万的话，那么测试的细胞数量就应该达到一亿。将这样数目的细胞输注到小动物体内是很直接简单的。如果测试的细胞数量超过一亿，比如说十亿，那么将这么大数量的细胞输注到小动物体内可能就不适合了。这样的话，替代分析就很有必要。
为这样的测验确定合适的动物模型将会面临很大的困难。利用小鼠和大鼠模型进行研究的优势是这些模型可以提供免疫缺陷品系。但是它们的一大弊端就是生命期太短了(12-18个月)，随着年龄的老化，开始自发产生肿瘤。具有正常免疫功能的大动物需要进行免疫抑制才可以用于试验，但是免疫抑制经常会不充分并且不能长久进行。在这样的动物身上进行肿瘤形成试验，无肿瘤形成可能是由于免疫排斥或者毒性反应所导致的，而不是细胞产品的特性反映。选择动物模型最终取决于细胞群体和临床目标。
最后，还需要做分布试验(biodistribution studies)用于确定hESC来源的细胞是否会迁移到体内其它位置。如果细胞发生了迁移，那么我们有必要研究迁移后的新环境是否会影响细胞的分化和稳定性。Laflamme等人将hESC来源的心肌细胞移植到大鼠心脏来探究细胞的分布错误！未找到引用源。。细胞移植后，用PCR检测人类Alu序列，发现除了心脏外，其他组织都检测不到人类细胞的存在，暗示了除了心脏外，细胞没有或者很少有迁移到或存活于其他组织的。对每个细胞产品进行细胞的迁移检测都是非常重要的。
5. 毒性
虽然人们主要关心hESC来源产品的致瘤性问题，但是对这些产品的毒性和稳定性问题同样不可轻视。在细胞被移植到特定部位后，需要做主要器官的急、慢性毒理学实验，需要做血液化学和血细胞计数实验等。这些检测可能会包含周边组织和器官。比如说，如果细胞群体分泌生长因子或者神经递质，移植点周边的组织也会受到影响。尽管总体来说这样的测试是在正常动物体内进行的，但是毒性反映经常在疾病状态下发生，我们应该考虑在疾病模型动物上进行这些检测。另外，一些辅助伴随治疗措施，如免疫移植，也需要纳入评估检测范畴。
分化细胞功能的稳定性也非常重要。如果治疗效果依赖于某种受调控而产生的细胞因子，这种调控就必需要具有长期的稳定性。比如，如果某种治疗糖尿病的细胞在葡萄糖刺激
下分泌胰岛素，那么需要确保在细胞的整个生活周期中葡萄糖刺激维持稳定，因为胰岛素分泌调控紊乱对病人是有害的。
6. 免疫原性
尽管早期的研究表明hESCs和它们的衍生物具有免疫豁免特性(immune-privileged)错误！未找到引用源。, 因为它们不表达HLA II型分子，只表达有限的HLA I型分子，最近的研究却表明hESCs会引致免疫功能正常的小鼠的免疫排斥反应错误！未找到引用源。。很明显，对每种hESC衍生而来的细胞产品都需要研究其免疫特征，在大多数时候需要一定程度的免疫抑制。这样一来，问题也随之产生。其中一个问题是我们有没有必要做HLA配型(与器官移植中所做的HLA配型类似)，以此来减小免疫抑制的有害程度。这种策略需要同时具备很多个hESC细胞系，从近百到数千不等错误！未找到引用源。。 即使生产制备这样大数目的hESC细胞系是可行的，监督方面的困难却会大得惊人。因为每个细胞系都需要被当成一种独立的细胞产品，需要符合相应的规章制度。另外一种策略是通过生物工程的手段删除免疫原性，这种策略虽然给人带来无限遐想，但是迄今未见报道。
是否需要进行免疫抑制还将受到移植位点的影响。将细胞移植到一种有免疫豁免特性的地方，如中枢神经系统，只需要一些轻微的免疫移植。如果将细胞移植到外周，就需要采取完全的免疫抑制策略。每种细胞制品的免疫特性都需要在合适的位点进行测试。利用病人特异性的iPSCs有望解决免疫原性的问题。在这种策略下，iPSCs来源于病人的体细胞，在体外扩增、分化后又输回病人体内。这种很有前景的研究目前还处于早期，将来也会面临一些监管方面的问题。
7. iPSC来源的细胞制品
体细胞能够被诱导生成多能干细胞的发现从根本上改变了我们对未来干细胞治疗的观点。制备病人特异性的干细胞群给我们带来了很多机遇，同时也不乏很多的挑战。与hESCs类似，iPSCs也具有多能性和无限的扩增能力。开发基于iPSCs的安全治疗策略除了要考虑上述除免疫原性外hESCs涉及到的所有问题，还要考虑诱导策略、要求的诱导程度、组织来源、批次差异和供体差异等问题。
尽管iPSCs领域的研究日新月异，但是这项技术还处于婴幼儿期。起先，iPSCs的生产是通过携带Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因组合错误！未找到引用源。或者OCT4、SOX2、NANOG和LIN28基因组合错误！未找到引用源。的逆转录病毒(retroviruses)或者慢病毒(lentiviruses)诱导产生的。由于采用了癌基因并且担心所采用的病毒载体会整合到基因组中，人们对此产生了安全性担忧。尽管转入iPSCs中的基因大多数被沉默掉，但是人们也检测到了经过生殖脊传播后c-Myc基因效应和肿瘤发生的现象错误！未找到引用源。。为了减少发生基因组整合的风险，人们后来陆续开发了基于腺病毒(adenovirus)错误！未找到引用源。、质粒转染(plasmid transfection)错误！未找到引用源。、附加质粒转染(episomal vector transfection)错误！未找到引用源。、pippyBac转座子错误！未找到引用源。和Cre-重组酶剔除病毒错误！未找到引用源。等诱导策略。最近，研究者通过将具有穿越细胞膜特性的四种基因工程重编程蛋白Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc直接转入细胞中制备出了iPSCs错误！未找到引用源。。虽然目前已经有很多种生产制备iPSCs的技术，但是这些方法的效率和稳定性都很低。各个重编程因子的剂量和相互间的比例似乎很重要。已经有几个小组报道说由于重编程因子水平不足或者处理时间不够而导致重编程不充分。在动物克隆领域，重编程不充分将导致克隆动物的死亡或严重异常错误！未找到引用源。。重编程不充分的iPSCs很可能不稳定并很有可能产生不成熟肿瘤。
分析iPSCs衍生出来的细胞产品的安全性需要考虑编程的充分性。更进一步，生产临床可用的iPSCs要求iPSCs可以稳定地生产，这将要求能够实现充分编程的重编程蛋白具备一种稳定的剂量。
尽管iPSCs和hESCs相似，但是还没有iPSCs被培养若干年的报道。确定iPSCs在长期的培养条件下是否维持稳定意义重大。确定表型与核型的稳定与否对于确定这种细胞能否被用于临床也是非常重要的。考虑到上述提到的重编程不充分的问题，对iPSCs做在“细胞的稳定性”章节中讨论的表观遗传方面的检测也非常重要。
另外一个悬而未决的问题是选择哪种组织用于生产iPSCs。目前，已经利用人类的成纤维细胞(fibroblast)错误！未找到引用源。、角质细胞错误！未找到引用源。和造血前体细胞错误！未找到引用源。生产制备出了人类的iPSCs。组织的选择需要考虑安全性、重复取材的方便性以及该分化位点的细胞被重编程的难易程度等因素。已经有报道显示，小鼠的肝细胞错误！未找到引用源。、人类的角质细胞错误！未找到引用源。所需要的逆转录病毒整合位点较少，所需要的重编程因子剂量较少。尽管确定哪种组织最为理想还为时过早，但是从现有的数据来看不同的组织间确实存在差异。
除了细胞材料间存在着差异外，不同的供体也会带来差异。病人特异性的治疗方案需要从不同年龄、不同健康状态的病人体内取材。这些本质差异可能会影响重编程的成功率、产率、以及重编程细胞被诱导成目标细胞的能力。
尽管iPSCs给干细胞治疗所带来的基于令人兴奋，在这一技术被应用到临床之前还有很多问题需要解决。从hESCs得来的基础知识无疑会加速iPSCs衍生治疗的发展步伐。
8. 结论
在我们探讨多能干细胞这个议题时，我们看其进步非常迅速，但同时也看到随着FDA和其他管理机构在努力建立一种适合hESCs和iPSCs特性的监管机制时给这一领域带来的严峻挑战。考虑到现有技术的局限性，我们推荐将适当的精力放在维持产品的均一性上面。只有尽力减少生产过程中的差异才能确保这种均一性。这将要求在整个生产过程中进行稳定的测试。仅仅测试终端产品是不够的，hESC主细胞库的质量和稳定性也需要加强监测。这些手段不是为了给该领域引入不必要的麻烦或者推迟治疗，而是为了保证分配给其它地方进行测试和动物试验的材料是已经评估过的细胞系。合格的主细胞库中的细胞(并额外的数据)可以作为起始材料用于细胞产品的开发。我们强调产品的稳定性和测试的标准化，是考虑到hESC衍生产品的致瘤性会由于细胞组分及宿主环境的不同而明显不同，所以在动物模型上进行致瘤性试验前就需要建立明确的处理方法和细胞产品。如果可行的话，细胞移植应当在适当的疾病和免疫抑制条件下进行。尽管我们在这里的讨论着眼于内细胞来源的hESCs，我们在这里提到的很多问题同样可以使用于其他多能干细胞群，如iPSCs错误！未找到引用源。。
对任何干细胞产品的安全性进行评估离不开针对具体临床病例的风险/受益率的分析。更其他任何一种治疗策略一样，我们必须承认干细胞治疗的风险不可能完全被清除。我们的目标是让监管机构、病人、医生能够获知相关的风险/受益率，以此来决定在现有治疗方案和技术中如何取舍。
参考文献:
错误！未找到引用源。
11
开发安全的人类多能干细胞治疗策略
翻译：何君贤
原文作者：Melissa K Carpenter, Joyce Frey-Vasconcell and Mahendra S Rao
原文检索： Carpenter, M.K., J. Frey-Vasconcells, and M.S. Rao, Developing safe therapies from human pluripotent stem cells. Nat Biotech, 2009. 27(7): p. 606-613
摘要：将人类的多能干细胞(pluripotent stem cells PSC)推进到细胞治疗层面需要开发出检测产品均一性、稳定性、致瘤性、毒性和免疫原性的标准化检测方法。
前言：细胞治疗是现代医学领域最有前景的几种治疗方法之一，若干治疗方案正在产业界和科研小组中酝酿。自1968年第一例骨髓移植错误！未找到引用源。成功以来，基于成人干细胞的治疗方案已经在临床上应用了数十年。在这几十年的发展中，细胞治疗技术取得了巨大的发展。与此相应，监管机制也发生了巨大变化。(在美国)，细胞治疗受美国食品药品监督管理局的“良好组织操作规程”(Good Tissue Practices Final Rule)监管。该操作规程对与细胞治疗有关的风险进行分类监管(表1)。一批细胞产品，比如软骨细胞和人造皮肤已经获得了FDA的批准(表2)。尽管与干细胞相关的产品目前还没有获得批准，但是该类产品中已经有几种处于晚期临床试验阶段了(表2)。
表1.监督管理机制
类别 监管机制
不受FDA
一类 21CFR 1271法
案监管 适用范围 基于细胞的制品，不涉及人类细胞/组织的细胞产品；没有或很小的处理；同源使用；不与药物或
者设备搭配使用
经过较小处理的基于人类细胞/
受公共健康安
二类“361” 全法案第361部
位监管 组织的产品；同源使用；不与药物或设备混合使用；自体使用或者具有一级或二级血缘关系的
亲属间使用
受公共健康安
三类“351” 全法案第351部
分监管 经过培养或者处理的人类细胞/组织产品；不是以同源治疗为目的；结合药物或仪器使用；异体
使用 比如将右膝软骨和左膝软骨进行外科移植；用于治疗恶性血液疾病，从外周血分离纯化的CD34+簇造血细胞 利用扩大的人类神经干细胞以传输溶酶体酶类；在心肌梗死治疗中使用的人类胚胎干细胞来源的心肌细胞 器官移植、全血来源的产品、高剂量化疗或全身放疗后的骨髓移植 举例
对于成人干细胞治疗或者多能干细胞治疗来说，其一般操作流程是首先将未分化干细胞(undifferentiated stem cell)扩大培养，然后体外诱导其分化成某种特殊类型的细胞，将这些诱导生成的细胞通过一定的方法输送到病人体内，最后使这些细胞长期定居在病人体内发挥作用。围绕这一干细胞治疗流程所设立的一些监督管理办法主要是基于活细胞的一些特征而设立的。活细胞在体内或者体外都会随着时间的变化而发生改变，这些细胞所生存的环境总体上是复杂多样的。活细胞被移植到体内后会发生整合和迁移，与宿主系统，比如局部环境和免疫系统，发生相互作用。但是，干细胞来源的细胞产品除了具有上述特征外还具有以下两个额外特征使得它们与众不同：超强的自我复制能力和多能性。细胞的高度自我复制能力保证了能够进行大规模的商业化生产，但是同时也提出了新的要求，即有必要对在体外经过
一定时间培养后的细胞的稳定性进行评估。细胞的多能性是诱导生成特殊的细胞类型的前提，但同时这一特性也有可能导致肿瘤的产生和生成不需要的细胞。本文将重点讨论干细胞治疗所涉及监管控制等议题错误！未找到引用源。。由于第一个被授权的干细胞临床试验是人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells hESCs), 本文将围绕人类胚胎干细胞展开讨论。同时，我们也留出一点空间来讨论与诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells iPSCs)相关的一些特殊议题。
表2. 市场上目前正在使用的或者处于晚期临床试验阶段的细胞治疗产品
产品
软骨 Carticel
上皮 Epicel
人造皮肤 Dermagraft
人造细胞 Transcyte
人造皮肤Apligraf
间充质细胞Prochymal
肌细胞 MyoCell 描述 自体软管细胞 自体成纤维细胞 异种成纤维细胞 异种成纤维细胞 异种成纤维细胞 人类成熟间充质干细胞 自体来源的骨骼肌细胞
扩大培养物
脐带血细胞亚群 用途 软骨替代 皮肤替代 皮肤替代 皮肤替代 皮肤替代 移植物抗宿主疾病 充血性心力衰竭 遗传性代谢疾病；溶酶体ALD-101细胞 缺乏症；过氧化物蓄积疾
病；造血干细胞移植 3期临床 目前状态 已获批 已获批 已获批 已获批 已获批 3期临床 3期临床
为了证明hESC来源的治疗手段的安全性需要对原始材料进行检测、评估；证明细胞再生和细胞处理方案的可重复性；对最终产品的均一性进行分析；对细胞的体内特征如体内的分布、致瘤性、毒性和免疫原性进行分析。上述某些议题已经在讨论细胞治疗的文章中进行了阐述错误！未找到引用源。。本文将着重对具有特殊挑战性的议题包括hESCs的分离、产品的均一性、细胞的稳定性、致瘤性、毒性以及免疫原性进行讨论。
1. hESCs的分离
目前所使用的大部分hESCs都是以研究为目的，用小鼠饲养层为辅助材料分离获得的。目前FDA还没有专门针对为临床应用而进行hESCs分离的指导方案。所以，目前研究者只能参照在体细胞治疗方面的指导方案来进行hESCs的分离操作。在这样的指导方案下，用于临床的hESCs的分离需要遵循“良好的组织操作”(Good Tissue Practice GTP)和“良好的生产操作”(Good Manufacturing Practice GMP)方面的要求。这些要求包括供体的合格性，在hESCs的采集、筛选、测试、处理、储存、标记、包装和分发过程中都遵循GMP规程。详细的规程在21CFR210&211中有描述(见表3中有关FDA指导方案的链接和参考材料)。但是，目前遵循GTP/GMP规程进行hESCs的分离已不现实。比如用于人工生殖的体外生产的的胚胎虽然可以成功受孕，但是却不符合GTP/GMP操作规程。GTP规程下的“供体合格性”要求对供体进行一系列的筛查，包括对每个供体家族史和血液样本的筛查。在临床体外受精操作中一般没有做这些筛查，所以当这些体外受精所剩下的胚胎被捐献出来用于分离hESCs时也就很难实施规程中所要求的筛查了。
考虑到严格遵照GTP/CMP进行hESCs分离的现实困难，我们的焦点将集中到这些规范的要旨，即确保细胞产品不会被一些偶然的成分所污染。所以，只需要按照FDA的“细胞系特征鉴定注意事项指导方针”(Points to Consider in the Characterization of Cell Lines guideline见表3) 对起始材料和最终的细胞产品进行检验就足够了。针对hESCs进行检验可
以缓解缺少供体信息的困难。考虑到hESCs的高度自我复制的特性，即使GTP原则下的指导方针还没有完善起来，建立大的主细胞库和工作细胞库(master and working cell banks)也是有可能的。这些细胞库包括足够多的细胞用于对污染物进行检测。确实，将来按照GTP原则所生产的细胞系也不是必须进行临床注册。今年(2009年)一月，FDA就批准了Geron公司(美国，加利福尼亚，Menlo公园)的用少突胶质细胞前体细胞进行新药研究的申请，这种前体细胞所来源的hESCs系是科研实验室以小鼠饲养层为辅助材料所分离的第一个hESCs系所错误！未找到引用源。。然而，随着该领域的不断进步，将来会生产更加符合GTP/GMP规范的细胞系用于临床实践和产品开发。有几个研究小组正在针对规范中的要求开发“临床级”(clinical-grade) hESCs(即这些细胞系是在接受了GMP原则下的充分测试而产生的)，其中一个小组报道已经开发出了6个这样的细胞系错误！未找到引用源。.
表3.开发干细胞治疗的参考材料
参考资料
评审人员指南
人类体细胞治疗研究新药申请化学、生产、控制
评审人员指导说明和模板
FDA评审员和资助者指南
化学、制造和控制内容和回顾
人类体细胞治疗研究新药申请信息
产业指南：关于异种移植产品在人上使用的动物、
产品、临床前和临床期的问题
产业指南：针对开发人类细胞、组织和基于人类
细胞、组织的产品现行的良好组织操作规范
(CGTP)
对用于生产生物制品的细胞系进行特征鉴定时需
要考虑的问题(1993) 链接 http://www.fda.gov/OHRMS/DOCKETS/ 98fr/03d0349gdl.pdf http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/ Guidances/Xenotransplantation/ucm092705.pdf http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances /Xenotransplantation/ucm092707.pdf http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/ Guidances/Tissue/ucm091408.pdf http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
OtherRecommendationsforManufacturers/UCM062745.pdf
http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/
产业指南：人类体细胞治疗和基因治疗指南 GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/CellularandGeneTherapy/ucm072987.htm
产业指南：人类细胞、组织或者基于人类细胞、
组织的产品的捐献者合格性确定 http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/Tissue/ucm073964.htm
2. 产品的均一性(Product consistency)
生产基于hESCs的产品的目的就是能够在一种具有充分的安全防范措施、无菌、可追溯的洁净环境下生产出数量充足的、均一的细胞。为了实现这种目标，就需要开发一种可以获得充足细胞数量的扩增方法，一种精确的诱导分化方法和经过验证的分析方法，以此来保证所生产的产品批与批之间具有很好的均一性。只要在符合GMP规范的环境条件下使用标准操作方案和开发有效的监测整个生产环节均一性的检测方法就可以大体上达到这种均一性要求。但是，对“均一性”的明确却具有很大的困难，因为与小分子不同的是，细胞是一种有生命的有机体，并会随着时间的变化而发生改变。为了保证均一性，需要特别注意减少
起始材料的差异、分化调控方法以及生产流程，并且要对终产品进行严格的功能和成分检查。图1显示的是生产制造干细胞产品所涉及到的若干步骤。
图1. 显示干细胞产品开发的生产工艺流程。cGMP: 现行良好生产操作规范(current
Good Manufacturing Practice)。
2.1在差异性起始材料前提下保障产品均一性的措施
目前基于hESCs进行治疗策略开发的一般模式中一般是希望根据单个细胞培养建立一个群体，然后在体外进行适当扩增，以此为基础建立一种经过验证的hESCs主细胞库。如果一种细胞产品来源于单一的一个细胞系―这种现象在培养的早期可以发生－差异性就有可能存在于主细胞库中的各个细胞瓶之间。在细胞库中对细胞的构成成分进行彻底的检测可以解决差异性的问题。但是，对均一性的担忧会随着为人类白细胞配型而建立起来的，供体多样的细胞库的增加而增加。数百种hESCs细胞系已经被建立了起来，虽然没有对这些细胞系做过细致的比较，但是分化能力的明显差异却已经被发现错误！未找到引用源。。考虑到从不同个体所分离的处于同一时期的干细胞群所表现出来的明显差异(未发表数据)，上述不同hESCs系之间所展现出来的差异性也不足为奇。hESCs细胞系之间的差异有可能是由分离方法、分离时期(如桑椹期或囊胚期)或者等位基因间的差异所造成的。这些差异将导致生产速度、分化能力、核型稳定性和体内整合和体内功能的差异。
表4. hESCs具备的特征a
特征
群体倍增时间
是否需要成纤维细胞生长因子
分化能力
核型稳定
SSEA-1标记
SSEA-3标记
SSEA-4标记
TRA-1-60标记
TRA-1-81标记
Oct4标记
Nanog标记
Sox2标记
E-cadherin标记
Brachyury标记
Pax6标记
APF标记
a标准 ～36h 是 有 是 无 有 有 有 有 有 有 有 有 无 无 无 从参考文献34中整理而来
在于我们常见的生物制品中也存在类似的差异，虽然差异的程度相对来说小一些，但是还是存的，如促红细胞生成素(erythropoietin)。存在于这些生物制品中的差异性已经通过将产品限制于某一种起始材料或者开发严格的、可以提供预测能力的分析评判标准得以解决。在hESCs中采取上述同样的策略却比较困难。虽然目前对多能干细胞的特征的研究已经取得了很大的进展，但是这些特征间的关系和特征的安全性依然不清楚。目前已经采用标准化的方法，如检测多能性标记(pluripotency markers)的免疫细胞化学方法和PCR方法、核型分析(evaluation of karyotype)、类胚体和畸胎瘤形成能力检测等方法，对hESCs的特征进行了鉴定。并且，已经采用了芯片技术、基因表达序列分析(serial analysis of gene expression SAGE)以及转录谱(transcriptional profiling)等方法对不同hESC细胞系进行了比较分析错误！未找到引用源。。我们研究小组的成员还根据芯片分析的结果提出了一组多能性基因(M.R.及其同事错误！未找到引用源。)。最近，更是通过对多个细胞系的荟萃分析(metanalysis)提出了一组无偏基因用于对hESC细胞系进行分析错误！未找到引用源。。这些方法虽然都有一定的可取之处，但是在临床应用方面它们要么不能被广泛接受，要么达不到要求的精度或者可信度。考虑到各hESC细胞系之间存在的客观差异性，我们建议在主细胞库中进行的检测应该包括表型分析、基因型分析和功能分析。一些可用的检测特征在表4中列出。
2.2 在诱导分化和生产过程中确保批次间的均一性
虽然在开发诱导分化方法错误！未找到引用源。、纯化方法错误！未找到引用源。和选择错误！未找到引用源。方面已经取得了很大的进步，但是最终的细胞群体却不可能达到绝对的均一性。所以，我们需要一种可以生产出具有相似细胞组成的、可重复的诱导分化流程。在分化和生产过程中的关键控制点处需要对包括细胞表型(phenotype)、倍增时间(doubling time)、存活力(viability)、群体差异性以及包括无菌特性、内毒素水平(endotoxin level)、支原体污染(mycoplasma contamination)在内的安全性等指标进行检测。
2.3 通过确定产品的组分来确保功能的均一性
总体上来说，细胞产品可以被认为是一群由功能成分(有活性的细胞)和污染物成分组成的杂合细胞群体。污染物有可能是辅助细胞、未分化细胞或者其它与治疗作用无关的细胞。生产工艺需要确保各批次之间包括稳定数量的活性成分和污染成分。
以下将详细探讨细胞产品中存在的不需要的细胞组分以及确定这些组分的可接受水平的重要性。对细胞产品进行功能评估需要开发检测产品功效的模拟系统，以此来预测细胞产品的体内活性。这种分析测试系统有可能十分复杂，因为活细胞的类型或者其发挥活性的机制无法知晓(如在脊髓损伤治疗中，治疗性细胞有可能是促进髓鞘再生，或者是提供了某些生长因子或者两者都具备)。开发体外预测分析系统可以大大减少测试和优化生产条件所需的成本和时间，从而可以大大的促进生产。
对某个终产品的特征进行鉴定需要考虑细胞群体和其发挥功能的机制。比如，在对治疗帕金森氏病(Parkinson’s disease)中用作替代细胞的多巴胺能神经元(dopamainergic neurons)进行鉴定时，需要考虑的问题是，该细胞群需要表达合适的标记分子如神经丝和酪氨酸羟化酶(neurofilament and tyrosine hydroxylase)，不表达未分化细胞、内胚层和中胚层的标记分子。功能测试项目中应该包括细胞去极化后多巴胺的释放活性和移植后不分裂特性的维持。再比如，如果移植的细胞主要是为了提供某些因子以保护内源性细胞或者弥补内源性缺失的因子，那么功能分测试项目中就需要分析这些因子的分泌情况。
在细胞产品的评估中，表观遗传学特征分析(epigenetic profiles)也有可能起到一定的作用。目前，FDA还没有对一些细胞产品中重要基因的表达检测或者表观遗传组学(epigenome)的检测做出要求。即便如此，如果对这些指标进行检测将会有利于细胞特征的评估。刚开始的时候可以检测组蛋白修饰(histone modification)和DNA甲基化(DNA methyaltion) 错误！未找到引用源。，以此来评估表观遗传的稳定性。
确定细胞产品的均一性的困难是客观存在的，因为多能干细胞正是由于其多潜能性才在临床治疗方面受到人们青睐的。多能干细胞是一种活跃的细胞，能够对环境作出积极的反应。在培养条件下可以进行无限生长，从而导致了以体外系统很好地预测以多能干细胞为基础开发出的某种细胞产品批次间的稳定性、体内活性面临巨大的挑战性。由iPSCs所展开的个性化治疗研究，每个批次的细胞产品都是个体特异性的，每个批次产品的起始材料都不同，这又一次加剧了产品均一性评估的难度。尽管如此，还是开发出了一些方法来检验并监测这些参数。
3. 细胞的稳定性
细胞治疗领域的细胞稳定性议题起源于对细胞群体的分割。人们尤其关心的是细胞在经历若干群体倍增(population doublings)后是否变得不稳定或者发生转变。确实，造血细胞移植(目前唯一大规模使用的干细胞治疗方法)治疗中偶尔会发生的一种并发症就是供体细胞白血病(donor-cell leukemia ) 错误！未找到引用源。。 细胞在体外进行长时间培养后就会开始发生漂变或者说是发生遗传性或者表观遗传性变化。
自我更新能力增强的hESCs有可能在体外长期培养条件下获得选择优势。在某些情况下，长期培养条件下的hESCs明显具备一种稳定的表型、核型和印记特征错误！未找到引用源。，但是在另一些情况下，它们也可能获得与人类胚胎瘤类似的核型特征，比如12号染色体三体和17号染色体三体错误！未找到引用源。, 或者其他变异错误！未找到引用源。。有两个研究小组最近在长期培养的hESCs中鉴定出了一些次生的染色体异常，包括与癌基因转变有关的20q11.21扩增错误！未找到引用源。。总体上，这些细胞还是保持了多能性特征并表达一些标准的hESC标记错误！未找到引用源。。 尽管还不知道存在于hESC培养中的少数核型异常细胞是否会影响包括生长速度、细胞周期调控和分化能力在内的大体特征，但是，这些异常的发现强调了细致监测的必要性。开发出异常核型检测方法将会对安全性评
估起到很好的辅助作用。
由于采用了人类胚胎这种特殊的起始材料，对hESCs表观遗传的稳定性在一开始就引起了人们的注意。已经发现人工辅助生殖用的培养胚胎存在着一些表观遗传异常错误！未找到引用源。。 有几个研究小组已经着手对hESCs的表观遗传学特征进行研究，包括X染色体失活(X-inactivation)、印记(impringting)和甲基化(methylation)。X染色体失活似乎在不同的hESCs细胞系中存在着差异错误！未找到引用源。。印记研究表明在培养环境下可以维持基因组一定程度上的稳定性错误！未找到引用源。。一些新的工具已经被开发出来评估多能干细胞的甲基化特征错误！未找到引用源。。接下来的工作就是研究这些甲基化特征能否在长期培养下保持稳定。
考虑培养的hESCs的遗传学和表观遗传学问题对安全性测试具有多方面的启示。其中最重要的一点就是对hESCs和分化出来的细胞产品的测试需要在一个足够长的时间范围内进行，这样才可以获得关于稳定性的可靠结论。所以，上文提到的对产品稳定性进行测试的的指标(表型、核型、遗传特征和表观遗传特征)都需要在一个长的时间期限内进行。对囊括数代或者数个倍增群体进行的稳定性测试可以包括重要基因的表达(如端粒酶基因、细胞周期相关基因、关键的hESC标记分子基因)、基因组和表观遗传的稳定性(甲基化、miRNA、组蛋白乙酰化和X染色体失活)。将这些测试与对其它体外分析测试相结合，有可能使遗传学和表观遗传学特征测试成为细胞产品体内稳定性评估的一种测试方法。
虽然我们相信细胞治疗所采用的hESC群体应当是二倍体并且稳定，但是值得指出的是，在FDA批准的临床试验中，有用人类胚胎瘤细胞系NT2进行试验的项目错误！未找到引用源。。在由Layton Bioscience公司(美国加州光谷)所实施的临床试验中，所移植的神经元细胞来源于NT2/D1细胞系。NT2/D1细胞先在视黄酸条件下培养6周，然后在抗有丝分裂物质下培养6天，然后将按照这种培养方法所生产出来的神经元细胞冷冻保存直到移植。移植时，细胞被解冻，然后经过一定的处理后注射到中风病人的体内。病人在接受大约两百万到一千万细胞移植后，还需要进行持续52周的移植后评估。NT2细胞被报道有56-61条染色体，并携带很多异常错误！未找到引用源。。但是，当将NT2N细胞(对这种细胞的处理方法与上述应用于临床应用的细胞的处理方法相似)移植到裸鼠中枢神经系统时，在14个月的检测期内没有发现致瘤性和有丝分裂活性错误！未找到引用源。。另外，在这些临床试验中，没有一例致瘤的报道。这些数据表明，异常核型或者较轻微的异常倍型不是致瘤性的预测指标。
4. 致瘤性
用多能干细胞开发细胞产品最重要的一个议题是确保细胞在输入到人体后不会导致肿瘤的发生。关于这一点主要有两方面的考虑。第一，治疗性细胞可能被具有增殖能力并能够致瘤的未分化细胞所污染。第二，治疗性细胞可能去分化(de-differentiate)或发生转变，从而导致良性或者恶性肿瘤。我们建议围绕致瘤性的考虑应当针对病人个体考虑风险/受益率。比如，得了像肌萎缩性侧索硬化症或者亨廷顿氏病等致命性、恶性疾病的患者在接受细胞治疗方面所能够容忍的风险显然要比那些还能够生活数年的病人，如糖尿病患者，所能够承受的风险要大很多。
4.1 致瘤性评估所要考虑的问题
hESCs的多能性评估是通过将这种细胞注射到免疫缺陷的小鼠体内看畸胎瘤形成的情况来实现的。这些畸胎瘤一般被认为是一种包含三个胚层分化成分的良性肿瘤。尽管hESCs是从内细胞团(inner cell mass ICM)分离而来，但是由它们所形成的畸胎瘤与自发形成的生殖细胞瘤在形态上十分相似。我们有可能利用临床上所积累的关于生殖细胞肿瘤的研究治疗结果来更好地理解并预测由多能干细胞分化来的畸胎瘤的一些行为特征。自然发生的畸胎瘤被认为是一种生殖细胞来源的良性肿瘤，其明显的特征就是包含一个或多个胚层来源的细胞。
这些肿瘤的行为根据其发生的位置、患病病人是处于青少年期还是青少年后期而有所不同。大多数卵巢畸胎瘤是具有正常二倍体核型(46, XX)的良性肿瘤。这些肿瘤大多数会变成囊状化并包含一些规律性的分化细胞。成熟睾丸瘤经常是一种具有异常细胞遗传特征的固体化肿瘤，特点复杂多样并被归类为畸胎癌(teratocarcinomas)一类错误！未找到引用源。。睾丸畸胎癌经常包含复杂的细胞遗传学异常，包括12号染色体短臂扩增形成异常染色体[i(12p)]。畸胎瘤未成熟的标志通常都是包含未成熟的神经上皮细胞。患畸胎瘤或者畸胎癌的患者如果在其肿瘤中包含较少的神经上皮细胞通常预示其存活率较高错误！未找到引用源。。
生殖细胞瘤的这些特征表明了性别、核型稳定性、在免疫缺陷小鼠上的肿瘤形成类型等都可以告诉我们一些关于风险程度和需要采用的测试方法等信息。特别地，多能干细胞群体所形成的肿瘤的类型在细胞治疗的安全性评估体系中将会是一个十分重要的环节。一个可具有稳定二倍体核型和产生成熟的，分化充分的畸胎瘤的hESC细胞系比一个核型异常，产生包含神经上皮的不成熟畸胎瘤的hESC细胞系要好得多。
4.2 对起始材料的检测
在已经知道hESC能够产生畸胎瘤的前提下，接下来需要回答的问题就是需要多少个hESCs才可以产生畸胎瘤？畸胎瘤的产生受环境的影响吗？
评估产生畸胎瘤所需要的细胞数量将有助于建立一套安全参数，比如细胞产品在无致瘤风险的情况下允许存在其中的hESC数目。畸胎瘤的形成往往需要注射一百万到一千万的hESCs。然而，畸胎瘤的形成效率却依赖于细胞接种的位置和动物的品系。另外，细胞在注射时会发生大量死亡，这会在很大程度上降低细胞的“有效剂量”(effective does)。最后，hESCs只有以克隆或集落的形式进行培养时表现得更加稳定错误！未找到引用源。，分开成单个细胞进行培养将导致细胞死亡和核型异常。该结论得到了最近一项研究的证实，即当用可以影响细胞相互作用的ROCK抑制剂处理时可以提高分离成单个细胞的hESCs的存活能力错误！未找到引用源。。由此可见，测试畸胎瘤形成需要的绝对细胞数目将有赖于对细胞构成和细胞所处环境的了解。
接种位置的重要性也可以在现有的研究中找到明显得证据。在一项研究中，经皮下和肝脏注射的NCL1细胞所形成的畸胎瘤在生长和分化特性上都不同错误！未找到引用源。。肝脏着生的畸胎瘤呈囊装，掺杂着未成熟和分化的细胞，出现更迅速，生长体积更大；而皮下着生的畸胎瘤生长缓慢，体积较下，所包含的大多数是分化后的细胞。目前还不清楚这些差异的出现是否是由注射时细胞的存活能力差异或者注射后的增殖能力差异或者是环境差异或者是上述差异因素的综合所引致。
Shih等人的研究进一步强调了微环境所造成的影响错误！未找到引用源。。在该研究中，他们将人类胚胎胸腺组织、胰腺组织或者肺脏组织分别与hESCs进行协同移植。与胚胎胸腺一起移植的hESCs产生的畸胎瘤包含原始的和未分化的细胞，而不是在成熟畸胎瘤中存在的那种典型的未分化细胞结构。而与此不同的是，小鼠后肢注射同样的细胞系却产生分化后的畸胎瘤。这些作者同时也研究了与胎儿胸腺或者肺脏组织一同注射产生畸胎瘤所需要的细胞数目，发现注射5000个细胞可以稳定地产生畸胎瘤，而注射50个细胞的动物没有一例产生畸胎瘤。当然，将hESCs与胚胎组织协同注射的策略还不大有可能成为一种治疗上的策略。也许，一种更加贴近实际的测试是将hESCs分化而来的细胞与成熟的人类组织一起注射。不管怎样，这些数据都说明了hESCs来源的细胞产品必须要在相关的环境下进行测试。在临床环境下，微环境经常与疾病背景和免疫抑制有关。我们建议每个hESC细胞系形成畸胎瘤所需的细胞数目需要在多个位点，包括该细胞产品预定的注射位点进行分析评估。
一些研究已经表明将hESCs注射到动物模型中不会导致畸胎瘤的产生。这种现象似乎与细胞的纯度、移植位点及细胞的成熟度有关。如果hESCs没有完全地分化，那么畸胎瘤形成的可能性更大错误！未找到引用源。。至今没有观察到各种hESC来源的细胞群体在被
注射到心脏错误！未找到引用源。、脊索错误！未找到引用源。和大脑错误！未找到引用源。后产生畸胎瘤的现象。然而，Kroon等报道15%的动物在被移植胰腺内胚层细胞群后有畸胎瘤发生。这些作者注意到移植的这群细胞没有经过富集，有可能在移植的时候包含了中胚层和外胚层的细胞成分。所以，很难确定该文中所提及的畸胎瘤是污染的hESCs所致还是由移植了三个胚层来源的成分所致错误！未找到引用源。。在另一个试验中，给帕金森氏病的小鼠模型移植hESC来源的多巴胺能神经元后导致移植物产生一种具瘤性的扩大核心，该核心包含未分化的、具有有丝分裂活性的神经上皮细胞错误！未找到引用源。。与此相反的是，Ravindran等人错误！未找到引用源。报道，移植的hESC来源的神经前体细胞不发生畸胎瘤，即使在移植1年后也是如此。这两个研究小组所使用的是不同的hESC细胞系，在不同的培养体系下培养，用不同的方法诱导分化，然后移植到大脑的不同部位。
早期的这些研究表明hESC来源的产品的致瘤性将会受到hESC细胞系、细胞群体的纯度、细胞群体的成熟度、细胞移植的数量、细胞移植的位置等因素的影响。所以，安全性评估必须包含这些因素。另外，也需要将打算处理的临床情形也包含进来。比如，某些治疗需要暂时性或长期性地采取免疫抑制，这有可能影响移植细胞的存活能力和宿主对这些移植细胞的反应。
上述这些检测的目的就是要探究细胞在移植后最终会不会产生肿瘤。所以，所有这些检测研究都是长期性的(>1年)，究竟多长才足够取决于治疗的病人群体和风险/受益率。所测试的细胞剂量将取决于临床人用剂量。大体上推测人用剂量应该按照十倍剂量测试。即，如果给病人移植的细胞剂量是一千万的话，那么测试的细胞数量就应该达到一亿。将这样数目的细胞输注到小动物体内是很直接简单的。如果测试的细胞数量超过一亿，比如说十亿，那么将这么大数量的细胞输注到小动物体内可能就不适合了。这样的话，替代分析就很有必要。
为这样的测验确定合适的动物模型将会面临很大的困难。利用小鼠和大鼠模型进行研究的优势是这些模型可以提供免疫缺陷品系。但是它们的一大弊端就是生命期太短了(12-18个月)，随着年龄的老化，开始自发产生肿瘤。具有正常免疫功能的大动物需要进行免疫抑制才可以用于试验，但是免疫抑制经常会不充分并且不能长久进行。在这样的动物身上进行肿瘤形成试验，无肿瘤形成可能是由于免疫排斥或者毒性反应所导致的，而不是细胞产品的特性反映。选择动物模型最终取决于细胞群体和临床目标。
最后，还需要做分布试验(biodistribution studies)用于确定hESC来源的细胞是否会迁移到体内其它位置。如果细胞发生了迁移，那么我们有必要研究迁移后的新环境是否会影响细胞的分化和稳定性。Laflamme等人将hESC来源的心肌细胞移植到大鼠心脏来探究细胞的分布错误！未找到引用源。。细胞移植后，用PCR检测人类Alu序列，发现除了心脏外，其他组织都检测不到人类细胞的存在，暗示了除了心脏外，细胞没有或者很少有迁移到或存活于其他组织的。对每个细胞产品进行细胞的迁移检测都是非常重要的。
5. 毒性
虽然人们主要关心hESC来源产品的致瘤性问题，但是对这些产品的毒性和稳定性问题同样不可轻视。在细胞被移植到特定部位后，需要做主要器官的急、慢性毒理学实验，需要做血液化学和血细胞计数实验等。这些检测可能会包含周边组织和器官。比如说，如果细胞群体分泌生长因子或者神经递质，移植点周边的组织也会受到影响。尽管总体来说这样的测试是在正常动物体内进行的，但是毒性反映经常在疾病状态下发生，我们应该考虑在疾病模型动物上进行这些检测。另外，一些辅助伴随治疗措施，如免疫移植，也需要纳入评估检测范畴。
分化细胞功能的稳定性也非常重要。如果治疗效果依赖于某种受调控而产生的细胞因子，这种调控就必需要具有长期的稳定性。比如，如果某种治疗糖尿病的细胞在葡萄糖刺激
下分泌胰岛素，那么需要确保在细胞的整个生活周期中葡萄糖刺激维持稳定，因为胰岛素分泌调控紊乱对病人是有害的。
6. 免疫原性
尽管早期的研究表明hESCs和它们的衍生物具有免疫豁免特性(immune-privileged)错误！未找到引用源。, 因为它们不表达HLA II型分子，只表达有限的HLA I型分子，最近的研究却表明hESCs会引致免疫功能正常的小鼠的免疫排斥反应错误！未找到引用源。。很明显，对每种hESC衍生而来的细胞产品都需要研究其免疫特征，在大多数时候需要一定程度的免疫抑制。这样一来，问题也随之产生。其中一个问题是我们有没有必要做HLA配型(与器官移植中所做的HLA配型类似)，以此来减小免疫抑制的有害程度。这种策略需要同时具备很多个hESC细胞系，从近百到数千不等错误！未找到引用源。。 即使生产制备这样大数目的hESC细胞系是可行的，监督方面的困难却会大得惊人。因为每个细胞系都需要被当成一种独立的细胞产品，需要符合相应的规章制度。另外一种策略是通过生物工程的手段删除免疫原性，这种策略虽然给人带来无限遐想，但是迄今未见报道。
是否需要进行免疫抑制还将受到移植位点的影响。将细胞移植到一种有免疫豁免特性的地方，如中枢神经系统，只需要一些轻微的免疫移植。如果将细胞移植到外周，就需要采取完全的免疫抑制策略。每种细胞制品的免疫特性都需要在合适的位点进行测试。利用病人特异性的iPSCs有望解决免疫原性的问题。在这种策略下，iPSCs来源于病人的体细胞，在体外扩增、分化后又输回病人体内。这种很有前景的研究目前还处于早期，将来也会面临一些监管方面的问题。
7. iPSC来源的细胞制品
体细胞能够被诱导生成多能干细胞的发现从根本上改变了我们对未来干细胞治疗的观点。制备病人特异性的干细胞群给我们带来了很多机遇，同时也不乏很多的挑战。与hESCs类似，iPSCs也具有多能性和无限的扩增能力。开发基于iPSCs的安全治疗策略除了要考虑上述除免疫原性外hESCs涉及到的所有问题，还要考虑诱导策略、要求的诱导程度、组织来源、批次差异和供体差异等问题。
尽管iPSCs领域的研究日新月异，但是这项技术还处于婴幼儿期。起先，iPSCs的生产是通过携带Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因组合错误！未找到引用源。或者OCT4、SOX2、NANOG和LIN28基因组合错误！未找到引用源。的逆转录病毒(retroviruses)或者慢病毒(lentiviruses)诱导产生的。由于采用了癌基因并且担心所采用的病毒载体会整合到基因组中，人们对此产生了安全性担忧。尽管转入iPSCs中的基因大多数被沉默掉，但是人们也检测到了经过生殖脊传播后c-Myc基因效应和肿瘤发生的现象错误！未找到引用源。。为了减少发生基因组整合的风险，人们后来陆续开发了基于腺病毒(adenovirus)错误！未找到引用源。、质粒转染(plasmid transfection)错误！未找到引用源。、附加质粒转染(episomal vector transfection)错误！未找到引用源。、pippyBac转座子错误！未找到引用源。和Cre-重组酶剔除病毒错误！未找到引用源。等诱导策略。最近，研究者通过将具有穿越细胞膜特性的四种基因工程重编程蛋白Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc直接转入细胞中制备出了iPSCs错误！未找到引用源。。虽然目前已经有很多种生产制备iPSCs的技术，但是这些方法的效率和稳定性都很低。各个重编程因子的剂量和相互间的比例似乎很重要。已经有几个小组报道说由于重编程因子水平不足或者处理时间不够而导致重编程不充分。在动物克隆领域，重编程不充分将导致克隆动物的死亡或严重异常错误！未找到引用源。。重编程不充分的iPSCs很可能不稳定并很有可能产生不成熟肿瘤。
分析iPSCs衍生出来的细胞产品的安全性需要考虑编程的充分性。更进一步，生产临床可用的iPSCs要求iPSCs可以稳定地生产，这将要求能够实现充分编程的重编程蛋白具备一种稳定的剂量。
尽管iPSCs和hESCs相似，但是还没有iPSCs被培养若干年的报道。确定iPSCs在长期的培养条件下是否维持稳定意义重大。确定表型与核型的稳定与否对于确定这种细胞能否被用于临床也是非常重要的。考虑到上述提到的重编程不充分的问题，对iPSCs做在“细胞的稳定性”章节中讨论的表观遗传方面的检测也非常重要。
另外一个悬而未决的问题是选择哪种组织用于生产iPSCs。目前，已经利用人类的成纤维细胞(fibroblast)错误！未找到引用源。、角质细胞错误！未找到引用源。和造血前体细胞错误！未找到引用源。生产制备出了人类的iPSCs。组织的选择需要考虑安全性、重复取材的方便性以及该分化位点的细胞被重编程的难易程度等因素。已经有报道显示，小鼠的肝细胞错误！未找到引用源。、人类的角质细胞错误！未找到引用源。所需要的逆转录病毒整合位点较少，所需要的重编程因子剂量较少。尽管确定哪种组织最为理想还为时过早，但是从现有的数据来看不同的组织间确实存在差异。
除了细胞材料间存在着差异外，不同的供体也会带来差异。病人特异性的治疗方案需要从不同年龄、不同健康状态的病人体内取材。这些本质差异可能会影响重编程的成功率、产率、以及重编程细胞被诱导成目标细胞的能力。
尽管iPSCs给干细胞治疗所带来的基于令人兴奋，在这一技术被应用到临床之前还有很多问题需要解决。从hESCs得来的基础知识无疑会加速iPSCs衍生治疗的发展步伐。
8. 结论
在我们探讨多能干细胞这个议题时，我们看其进步非常迅速，但同时也看到随着FDA和其他管理机构在努力建立一种适合hESCs和iPSCs特性的监管机制时给这一领域带来的严峻挑战。考虑到现有技术的局限性，我们推荐将适当的精力放在维持产品的均一性上面。只有尽力减少生产过程中的差异才能确保这种均一性。这将要求在整个生产过程中进行稳定的测试。仅仅测试终端产品是不够的，hESC主细胞库的质量和稳定性也需要加强监测。这些手段不是为了给该领域引入不必要的麻烦或者推迟治疗，而是为了保证分配给其它地方进行测试和动物试验的材料是已经评估过的细胞系。合格的主细胞库中的细胞(并额外的数据)可以作为起始材料用于细胞产品的开发。我们强调产品的稳定性和测试的标准化，是考虑到hESC衍生产品的致瘤性会由于细胞组分及宿主环境的不同而明显不同，所以在动物模型上进行致瘤性试验前就需要建立明确的处理方法和细胞产品。如果可行的话，细胞移植应当在适当的疾病和免疫抑制条件下进行。尽管我们在这里的讨论着眼于内细胞来源的hESCs，我们在这里提到的很多问题同样可以使用于其他多能干细胞群，如iPSCs错误！未找到引用源。。
对任何干细胞产品的安全性进行评估离不开针对具体临床病例的风险/受益率的分析。更其他任何一种治疗策略一样，我们必须承认干细胞治疗的风险不可能完全被清除。我们的目标是让监管机构、病人、医生能够获知相关的风险/受益率，以此来决定在现有治疗方案和技术中如何取舍。
参考文献:
错误！未找到引用源。
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