动物胚胎移植技术
摘 要
胚胎移植又称受精卵移植，是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内冲洗出来，移植到另一头雌性动物的输卵管或是子宫内，使之继续发育成新个体的技术。
动物胚胎移植主要是通过对优良供体母畜作同期排卵处理和体内胚胎生产 或体外人工授精（IVF ）的方法，以大量获得优良的动物胚胎后再将其移植给普通代孕受体母牛进行快速繁殖优良动物的生物技术。胚胎移植技术主要用于快速扩大优秀种公牛和核心母牛的数量。尽管单个胚胎的生产成本较高，但由于种公牛和种母牛较高的经济价值和社会价值，以及利用胚胎移植在育种方面可以获得同胞或同卵双生牛进行后裔测定等优势，因此，该技术在种公牛的选育和优质核心母牛群的培育以及加快育种步伐方面均具有极大的优越性。
本论文将对动物胚胎技术作比较全面的阐述，使大家对动物胚胎技术有一个比较全面的认识。
关键词： 供受体 超数排卵 同期发情 胚胎回收 胚胎检查 胚胎移植
1.1 发情后生殖器官的孕向发育
家畜在发情后生殖器官会发生一系列变化，如：卵巢中功能性黄体的形成，孕酮的分泌和维持，子宫内膜组织的增生和分泌机能的增强，以及其他生理生化的特异现象。这些变化都为胚胎的生存和发育创造了适宜的条件，为妊娠作准备。 配种受孕后的动物其生殖系统朝着妊娠的方向继续发生变化以适应胚胎发育的需要，如黄体的持续存在以及孕酮的分泌和维持，子宫内膜的继续发育。而未受孕的动物其生殖系统会退回到发情前状态。
发情供体和受体发情周期的同期化程度前后不超过一天，否则移植成功率就会降低，甚至移植失败
因此发情后或交配刺激后雌性动物生殖器官的孕向变化是进行胚胎移植的主要生理学基础。
1.2 早期胚胎的游离状态
胚胎在发育的早期有相当一段时间是游离存在于子宫内的，和子宫黏膜没有建立紧密联系，其发育主要靠自身贮存的养分。这样，早期的胚胎容易从生殖道中取出，而且在离体情况下，可短期培养，易存活。
早期胚胎处于游离状态是能够进行胚胎移植技术的基础
1.3 子宫对早期胚胎的免疫耐受性
1.4 胚胎遗传物质的稳定性
在同一物种之内进行胚胎移植不会产生排斥现象; 同时，受体对胚胎不产生遗传上的影响，不会改变新个体的遗传特性，也不会减弱起优良性状在出生后的表现程度。
2.1 供受体的选择与管理
2.1.1 供体的选择
• 遗传学价值
在畜牧生产中，应选择生产性能优秀的母兽作为供体
• 健康状况
应选择身体健康，营养水平中等以上未受孕动物作为供体
• 繁殖性能
供体应是达到配种年龄以上繁殖机能正常的母畜
2.1.2 受体的选择
• 身体健康
• 繁殖状况正常
• 母性良好
包括泌乳性能和护仔能力等
2.1.3 供受体的管理
在供受体选择时，可根据情况进行传染病的检疫，预防注射和驱虫等工作，确保在胚胎移植过程中供受体的健康; 观察供受体发情周期，以便超排和同期发情程序的选择和安排；每日供给中等以上营养水平，注意青绿饲料，维生素和微量元素的补充；
2.2 超数排卵处理
在雌性动物发情周期中的适当时间注射促性腺激素，使卵巢上有比自然生理状态下更多的卵泡发育并排卵，这种方法称为超数排卵。
其目的是增加有活力卵子的数量，并获得较多的可移植胚胎。
目前，用于超排的促性腺激素主要是促卵泡素（FSH ）和孕马血清促性腺激素（PMSG ）。
FSH半衰期短，用于超排时需要多次注射，而PMSG 半衰期长，会产生后效应，导致 发情期延长，影响超排效果和胚胎质量，结合注射PMSG 抗血清，可消除半衰期过长的副作用。
2.3
2.3.1 同期发情的定义
利用某些激素制剂处理, 人为地控制并调整一群雌性动物发情周期之间同期化的方法, 称同期发情.
胚胎移植时, 受体必须和供体处于相同的发情阶段, 才能获得较高的成功率. 在发情周期的不同阶段, 生殖器官的内分泌环境, 生化和组织学特性, 对不同发育阶段的胚胎有不同的影响, 胚胎要移植到和供体处于相同发情周期阶段的受体生殖道的适当部位, 才能继续发育.
2.3.2 同期发情的原理
同期发情主要借助外源激素刺激卵巢. 使之按预定的要求发生变化, 使处理母畜的卵巢生理机能处于相同阶段. 通常采用两种途径:一种时延长黄体期, 给一群母畜同时使用孕激素药物, 抑制卵泡的生长发育和动物的发情表现. 经过一定时期后同时停药, 由于卵巢同时失去外源性孕激素的控制, 且卵巢上的周期黄体已退化, 于是同时出项卵泡发育, 引起母畜发情采用孕激素移植母畜发情, 实际上是认为地延长黄体期, 起到延长发情周期, 推迟发情地作用.
另一种途径是缩短黄体期, 应用前列腺素促使黄体退化, 使卵巢提前摆脱内源性激素地控制, 于是卵泡得以同同时开始发育从而达到母畜同期发情. 这种情况实际上是缩短母畜地发情周期, 促使母畜在短时间内发情。
2.3.3 同期发情的药物及其使用方法
同期发情
2.3.3.1 抑制卵泡发育的制剂
这一类药物主要是孕激素类, 包括孕酮, 甲孕酮, 氟孕酮, 甲地孕酮和18-甲基炔诺酮等. 他们能够抑制垂体促卵泡素的分泌, 延长黄体期, 因而间接地抑制卵泡发育和成熟, 是母畜不发情.
其用药方法有:
◆ 阴道栓塞法:将孕酮阴道栓或自制浸吸一定量药剂的阴道海绵塞放置于阴
道前端, 药液不断被阴道黏膜吸收, 经过一定时间后取出, 此法常用于牛和羊
◆ 埋植法:将成形的药剂或装有药物的带孔容器埋植于母畜皮下组织, 药物
被缓慢吸收, 经过一丝那个时间后取出, 此法可用作群体处理.
◆ 注射法:每日将定量药物作皮下或肌肉注射, 经过一定时间后停药. 此法剂
量准确, 但操作麻烦.
◆ 口服法:每日将一定量的药物均匀拌在饲料中, 以单个饲喂较为准确, 经过
一定时间后停药. 这种方法可用于舍饲母畜. 但较费时费工, 群体饲喂还会造成个体剂量不准确.
2.3.3.2 溶解黄体的制剂
主要是前列腺素及其类似物, 如15-甲基PGF2ά, 氯前列烯醇, 氯胎素等. 它们具有明显的溶解黄体作用, 因此用于正处于黄体期的母畜的同期发情, 对卵巢上没有黄体的动物无效. 牛和羊的发情周期的7~16d以内的黄体对前列腺素都易产生反应, 采用子宫内灌注效果优于肌肉注射. 经前列腺素处理后2~4d,母畜发现发情, 未发情的间隔10~20d进行第二次注射, 在此期间, 可能自然发情形成黄体, 对第二次注射作出应答反应. 此法方便可靠, 但费用高。
2.3.3.3 促进卵泡发育, 排卵的药剂
主要有FSH,LG,PMSG,hCG 和GnRH 等及其类似物的那个, 一般在应用上述; 两类激素的基础上配合使用, 以增强发情同期化, 并使卵泡更好地成熟和排卵.
2.4
胚胎回收
2.4.1 胚胎回收的定义
胚胎回收也称采卵或采胚, 就是利用冲胚液把胚胎从供体生殖道中冲洗出来, 提供移植或其他胚胎工程应用.
2.4.2 胚胎回收地时间
胚胎回收地时间, 可根据所需胚胎地发育阶段来确定. 动物种类不同, 其胚胎早期地发育速度有所差异. 以配种后计算, 几种动物的早期胚胎发育进程近似值见表
2.4.3 冲胚液的配制
冲胚液和胚胎的短期培养液通常是用改良的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS) 根据配方要求分别制备I,II,III 液, 三蒸水加至最终量的80%,在冰箱中冷却至4 ℃, 依次混合后用容量瓶定容至1000mL, 注意防止沉淀,PH 应为7.1~7.2,如不符, 可用NaHCO3或HCL 调节, 渗透压为310mOsm. 配好后, 用孔径0.45um 滤器过滤除菌, 分装密封(注意无菌操作), 标记,4℃冰箱保存3~4月. 临用前加入灭活小牛血清, 一般冲胚液加10%~20%,也可在定容时加入血清, 然后再过滤分装.
2.4.4 采胚方法
根据动物种类和胚胎的发育阶段, 胚胎回收可采用手术法和非手术法
2.4.4.1 手术法
就是对供体进行常规腹部手术将生殖道部分移出腹腔, 用冲胚液对输卵管或子宫角进行冲洗, 回收胚胎. 本法适用于羊, 猪和兔等中小动物; 在牛中, 如需回收进入子宫前的早期胚胎, 仍需用此法.
按外科手术常规方法打开腹腔, 先把一侧子宫角, 输卵管和卵巢牵引至腹壁切口之外, 检查卵巢反应情况(黄体数, 残留卵泡的大小, 数目及排卵情况) 并进行记录.
冲胚的方法包括输卵管冲胚法和子宫角冲胚法
2.4.4.1.1 输卵管冲胚法
用冲胚液冲洗输卵管腔, 回收进入子宫前的胚胎, 分上行法和下行法. 上行法时从子宫角的前端刺入注射针, 向上冲洗输卵管, 注意用手指固定针头并提捏住子宫角, 防止冲洗液从进针周围流出后流向子宫体方向. 冲洗液通过从输卵管伞插入到壶腹部的玻璃细管或硅胶管等回收到平皿或试管内; 下行法时通过从伞部插入到壶腹的玻璃细管或硅胶管等注入冲胚液, 向子宫方向冲洗, 冲洗液通过插入到子宫角上部的带有充气囊的二路式导管或回收针回收. 一侧冲洗完毕后, 还纳腹腔, 在冲另一侧.
2.4.4.1.2 子宫角冲胚法
冲洗子宫角, 回收进入子宫角的胚胎. 依据动物子宫角的大小, 选用长4~5cm,外径1.2~1.4mm的针头, 改制一个回收针. 将回收针插入子宫腔, 用套有乳胶管的肠钳夹住子宫角和针体. 将宫管结合部之前的输卵管用血管夹夹住, 以免冲胚液流入输卵管. 然后从宫管结合部后端的胶管收集冲出液于平皿或试管内. 一侧冲洗完毕后, 除去器械, 确认针孔无出血后, 还纳腹腔, 然后冲另一侧.
冲胚完毕后, 把生殖器官还纳腹腔, 向腹腔注入防粘连剂和抗生素. 按常规腹
部手术方法闭合手术通路, 进行常规术后护理.
手术法采胚, 冲胚液用量少, 胚胎回收率高, 但由于手术对动物有一定的损伤, 手术不当或多次手术, 易引起生殖器官粘连, 导致供体不孕.
2.4.4.2 非手术法
是在胚胎进入子宫角后, 用冲胚器具通过子宫角冲洗采集胚胎的方法. 可以不做手术而采胚, 不仅减小了手术对供体的危害, 节约时间, 降低成本, 而且可以重复采胚. 本法主要用于牛, 马等大家畜.
回收方法: 先要去除子宫颈黏液, 术者一手在直肠内握住子宫颈, 一手持子宫颈黏液去除器插入子宫颈, 由助手抽吸除去子宫颈黏液. 如插入困难,
可用子宫
颈扩张棒扩张子宫颈, 除去子宫颈黏液后, 送入两路或三路冲胚管. 冲胚管前端插入子宫角前1/3后，给气囊充气。通过冲胚管的进液管向子宫内注入冲胚液. 当液体注入使子宫角膨大到相当于妊娠40～60d 时，一般20～40ml ，如使用三路冲胚管，可打开除夜管，并按摩子宫，时胚胎从子宫皱壁中游离出来，随液体流出，收集在量筒活集卵胚等容器内。反复冲洗，每侧用液300～500ml 。
冲洗完毕，向子宫内注入青霉素100万IU ，链霉素1.0g 。回收的冲胚液，在室温下静置30min ，用吸管除去上部液体，将下部回收液放入大检卵杯活平皿中检出胚胎，也可用集卵杯过滤冲胚液，剩下适量用于检胚。
2.5 胚胎检查
2.5.1 胚胎检查的定义
胚检是从回收液中，将受精卵活胚胎检出，并进行必要的净化处理，同时对检得的胚胎进行形态学鉴定，确定其品质，把符合移植的胚胎暂时保存于新鲜培养基中，准备移植或保存。
2.5.2 胚胎的发育
受精后，卵细胞是按2，4，8……. 细胞顺序相继分裂，到16细胞为止，可通过显微镜观察来计算分裂球的数目。16细胞以后，分裂球难以计算，形成的细胞团呈桑椹状，故称为桑椹胚。桑椹胚进一步发育，在细胞团中出现小腔，形成囊胚状，这时的胚胎叫囊胚。囊胚逐渐扩张其腔，不久从透明带中脱出（即孵化）。
正常的胚胎透明带应是圆形，有弹性，厚度随着胚胎的发育而变化，胚胎细胞发育均匀一致，轮廓清晰规则。凡出现边缘不整齐，细胞突出，色暗及有空泡和游离分裂球的为异常胚胎。
2.5.3 胚胎质量的形态学评级与分级
超排处理后，卵巢内的卵泡并非同时排卵，加之超排处理使生殖道的内分泌环境发生改变，回收到的胚胎发育程度有很大的变化。这就需要对胚胎进行形态学鉴定，选出形态比较正常的胚胎进行移植或保存。有些形态特征较差或发育迟缓的胚胎移植后也有可能发育，但发育延迟2天以上者，往往难以存活。
胚胎质量的形态评价可在40～200倍的显微镜下观察，评价的主要内容有：1透明带的形态和完整性。2胚胎的发育阶段与胚龄是否一致。3胚胎的形态与匀称性，胚内细胞大小的变化。4细胞质的结构及颜色，胚内是否出现空泡，细胞碎片，有无游离细胞
根据胚胎的形态特征，可将胚胎分为三个等级：
• A 级：为优良胚胎，齐形态典型，卵裂球轮廓清晰，紧密充实，细胞质致
密，色调和分布均一。
• B 级：为普通胚胎，与A 级胚胎相比，稍有变形，但卵裂球的轮廓清晰，
细胞质较致密，分布均匀，变形细胞和空泡不超过30％。
• C 级：为不良胚胎，其形态有明显变异，卵裂球轮廓稍有不清晰或部分不
清晰，大小不一，细胞质不致密，分布不均匀，色调发暗，突出的细胞，空泡和变形的细胞占30％～50％。
2.6 胚胎的移植
2.6.1 胚胎移植的定义
胚胎的移植就是把胚胎在放入受体的生殖道的适当部位，使其继续发育为胎儿，是整个胚胎移植技术的关键一环。
2.6.2 胚胎移植的方法
2.6.2.1 常规手术移植
对受体进行腹部手术，取出子宫和输卵管，风巨胚胎发育情况，将胚胎移入输卵管或子宫角，适用于羊、猪、兔等中小动物。
移胚管有玻璃细管、塑料管带塑料套管的针管等，接1ml 注射液，吸入新鲜DPBS 三段与管中，中段含胚胎。输卵管移植时，将移胚管经伞部腹腔孔插入输卵管2～3cm ；注入胚胎；子宫角移植时，在黄体侧子宫角前1/3先用钝针将子宫角开洞，在插入移胚管，确认在子宫角腔内注入胚胎。移植时要避免注入空气，抽出移胚管时要慢，防止将胚胎带出。对移植情况进行记录。
2.6.2.2 简易手术移植
郭志勤（1998）把我国船头猪的小挑去势技术用于绵羊、山羊的胚胎移植上，手术时间由常规的20～30min 降为1～3min ，粘连率降至5％左右，且减少感染，不易出血。用猪的小挑手术刀，在麻醉后受体羊大腿内侧鼠蹊部（无毛处），经消毒后，将皮肤向腹部拉紧，用手术刀在靠近盆腔处下刀，开约1.2～1.5cm 可通入腹腔的道刀口，插入食指，指到子宫后在插入刀柄，用食指和刀柄夹出子宫角，进行移植。术后还纳子宫角，松开皮肤，使腹腔的切口由复原皮肤错开覆盖，刀口皮肤消毒即可。
2.6.2.3 腹腔镜监控移植
利用腹腔镜和配套的器械在不对受体进行常规手术的情况下将胚胎移植到子 宫角，适用于羊、猪等动物。以羊为例说明操作方法。在乳房前6cm 处的中线两侧各2cm 处分别做两个小切口，插入腹腔镜头和固定钳。在腹腔镜监视下，进行黄体数和质量评价，用固定钳固定宫管结合部。再从乳房前6cm 处的中线上插入一套长7cm 、内径7mm 的套管针，伸入18号长针刺入子宫角。推动注射器，注入胚胎。每次移植仅需5～8min ，比常规手术移植快1倍，受胎率40.1％～86％。
2.6.2.4 非手术法
用易胚器械通过子宫颈将胚胎移植于子宫角，本法常用于牛、马等大动物，猪、羊也有类似方法，但不常用。
移植器械：目前多采用专用不锈钢活塑套移植器，一般由外套、移植管及内芯组成，用前消毒。也可用凯苏输精枪。
移植操作：似牛的人工受精。用直肠把握法将移胚器通过子宫颈，送至黄体侧子宫角前1/3处（大弯或大弯深处）推入胚胎，缓慢抽回移胚器。操作过程应轻巧，不可损伤生殖道。如果操作过程中生殖道出血，将会降低受胎率。 移植后，要对具体移植情况进行记录。
2.7 供、受体的术后管理
• 对术后的供、受体要注意护理和饲养管理，保证其健康。同时要注意观察，
确定其状态，并做好记录。
• 对于供体，要观察其健康状况，再预定时间是否发情，如果正常发情，可
以配种。
• 对于受体，要观察其健康状况，是否返情，并在一定时间后要进行妊娠诊
断，便于妊娠受体加强饲料管理。诊断方法有直肠检查法和B 超诊断法等。
3 胚胎移植技术的应用
3.1 胚胎的国际交流
以胚胎代替活体动物进行种质资源交流，不仅可大大降低运输成本，而且可减少疾病的传播。实验证明，牛胚胎只要保持透明带完好，移植前在做适当清洗，其传播疾病的可能性比精液或动物活体都小的多（Sreenan 1989），而且，在国内外已进行的数以万计的胚胎移植，均未爆发传染病。
3.2 优良种畜的扩群
通过胚胎移植技术使优良母畜能较早地获得较多地后代，扩大其在群体遗传改良中的作用，这对于低繁殖力地畜种和一些本身遗传素质十分优秀，却因某些繁殖障碍而不能妊娠地母畜具有重要意义。
3.3 建立胚胎库，保护动物种质资源
将胚胎移植技术和胚胎超低温冷冻贮存技术结合起来，建立胚胎库，不仅为胚胎交流提供方便，而且在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽救濒临灭绝地野生动物方面也越来越发挥重要作用。这对于保持动物地多样性具有重要意义。
3.4 其他和科学研究和技术应用地手段
在家畜繁殖学研究中，胚胎移植技术可用于繁殖生理学、生殖内分泌学和遗传学地研究。如利用胚胎移植试验已证实，是奶牛排卵数而不是子宫容纳量限制双胎或多胎率。
胚胎移植技术是其他胚胎工程技术如体外受精、克隆、转基因、胚胎嵌合、胚胎性别鉴定与性别控制等地基础，为其研究合应用提供手段。
参考文献
[1] 曹斌云，窦忠英，张一玲，曹光荣，刘金燕，张万民，魏志杰. 布尔山羊MOET 品系繁育方案设计及遗传进展预估[J]. 畜牧兽医杂志，6：23～26
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[3] 何涛. 世界首例万枚优质种羊胚胎移植工程在内蒙古草原启动[J]，四川畜牧兽医，2001，1：58
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[5] 王光亚，段恩奎. 山羊胚胎工程[M].天则出版社，1993，42
[6] 王建辰，章孝荣. 动物生殖调控[M].安徽科学技术出版社.1998，250
[8] 张嘉保.21世纪我国家畜繁育技术的发展趋势与展望[J].黑龙江动物繁殖，1999，4：35～43
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[10]张阮 中国荷斯坦奶牛MOET 育种体系的建立与实施[J].中国奶牛，1999，4：34～36
动物胚胎移植技术
摘 要
胚胎移植又称受精卵移植，是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内冲洗出来，移植到另一头雌性动物的输卵管或是子宫内，使之继续发育成新个体的技术。
动物胚胎移植主要是通过对优良供体母畜作同期排卵处理和体内胚胎生产 或体外人工授精（IVF ）的方法，以大量获得优良的动物胚胎后再将其移植给普通代孕受体母牛进行快速繁殖优良动物的生物技术。胚胎移植技术主要用于快速扩大优秀种公牛和核心母牛的数量。尽管单个胚胎的生产成本较高，但由于种公牛和种母牛较高的经济价值和社会价值，以及利用胚胎移植在育种方面可以获得同胞或同卵双生牛进行后裔测定等优势，因此，该技术在种公牛的选育和优质核心母牛群的培育以及加快育种步伐方面均具有极大的优越性。
本论文将对动物胚胎技术作比较全面的阐述，使大家对动物胚胎技术有一个比较全面的认识。
关键词： 供受体 超数排卵 同期发情 胚胎回收 胚胎检查 胚胎移植
1.1 发情后生殖器官的孕向发育
家畜在发情后生殖器官会发生一系列变化，如：卵巢中功能性黄体的形成，孕酮的分泌和维持，子宫内膜组织的增生和分泌机能的增强，以及其他生理生化的特异现象。这些变化都为胚胎的生存和发育创造了适宜的条件，为妊娠作准备。 配种受孕后的动物其生殖系统朝着妊娠的方向继续发生变化以适应胚胎发育的需要，如黄体的持续存在以及孕酮的分泌和维持，子宫内膜的继续发育。而未受孕的动物其生殖系统会退回到发情前状态。
发情供体和受体发情周期的同期化程度前后不超过一天，否则移植成功率就会降低，甚至移植失败
因此发情后或交配刺激后雌性动物生殖器官的孕向变化是进行胚胎移植的主要生理学基础。
1.2 早期胚胎的游离状态
胚胎在发育的早期有相当一段时间是游离存在于子宫内的，和子宫黏膜没有建立紧密联系，其发育主要靠自身贮存的养分。这样，早期的胚胎容易从生殖道中取出，而且在离体情况下，可短期培养，易存活。
早期胚胎处于游离状态是能够进行胚胎移植技术的基础
1.3 子宫对早期胚胎的免疫耐受性
1.4 胚胎遗传物质的稳定性
在同一物种之内进行胚胎移植不会产生排斥现象; 同时，受体对胚胎不产生遗传上的影响，不会改变新个体的遗传特性，也不会减弱起优良性状在出生后的表现程度。
2.1 供受体的选择与管理
2.1.1 供体的选择
• 遗传学价值
在畜牧生产中，应选择生产性能优秀的母兽作为供体
• 健康状况
应选择身体健康，营养水平中等以上未受孕动物作为供体
• 繁殖性能
供体应是达到配种年龄以上繁殖机能正常的母畜
2.1.2 受体的选择
• 身体健康
• 繁殖状况正常
• 母性良好
包括泌乳性能和护仔能力等
2.1.3 供受体的管理
在供受体选择时，可根据情况进行传染病的检疫，预防注射和驱虫等工作，确保在胚胎移植过程中供受体的健康; 观察供受体发情周期，以便超排和同期发情程序的选择和安排；每日供给中等以上营养水平，注意青绿饲料，维生素和微量元素的补充；
2.2 超数排卵处理
在雌性动物发情周期中的适当时间注射促性腺激素，使卵巢上有比自然生理状态下更多的卵泡发育并排卵，这种方法称为超数排卵。
其目的是增加有活力卵子的数量，并获得较多的可移植胚胎。
目前，用于超排的促性腺激素主要是促卵泡素（FSH ）和孕马血清促性腺激素（PMSG ）。
FSH半衰期短，用于超排时需要多次注射，而PMSG 半衰期长，会产生后效应，导致 发情期延长，影响超排效果和胚胎质量，结合注射PMSG 抗血清，可消除半衰期过长的副作用。
2.3
2.3.1 同期发情的定义
利用某些激素制剂处理, 人为地控制并调整一群雌性动物发情周期之间同期化的方法, 称同期发情.
胚胎移植时, 受体必须和供体处于相同的发情阶段, 才能获得较高的成功率. 在发情周期的不同阶段, 生殖器官的内分泌环境, 生化和组织学特性, 对不同发育阶段的胚胎有不同的影响, 胚胎要移植到和供体处于相同发情周期阶段的受体生殖道的适当部位, 才能继续发育.
2.3.2 同期发情的原理
同期发情主要借助外源激素刺激卵巢. 使之按预定的要求发生变化, 使处理母畜的卵巢生理机能处于相同阶段. 通常采用两种途径:一种时延长黄体期, 给一群母畜同时使用孕激素药物, 抑制卵泡的生长发育和动物的发情表现. 经过一定时期后同时停药, 由于卵巢同时失去外源性孕激素的控制, 且卵巢上的周期黄体已退化, 于是同时出项卵泡发育, 引起母畜发情采用孕激素移植母畜发情, 实际上是认为地延长黄体期, 起到延长发情周期, 推迟发情地作用.
另一种途径是缩短黄体期, 应用前列腺素促使黄体退化, 使卵巢提前摆脱内源性激素地控制, 于是卵泡得以同同时开始发育从而达到母畜同期发情. 这种情况实际上是缩短母畜地发情周期, 促使母畜在短时间内发情。
2.3.3 同期发情的药物及其使用方法
同期发情
2.3.3.1 抑制卵泡发育的制剂
这一类药物主要是孕激素类, 包括孕酮, 甲孕酮, 氟孕酮, 甲地孕酮和18-甲基炔诺酮等. 他们能够抑制垂体促卵泡素的分泌, 延长黄体期, 因而间接地抑制卵泡发育和成熟, 是母畜不发情.
其用药方法有:
◆ 阴道栓塞法:将孕酮阴道栓或自制浸吸一定量药剂的阴道海绵塞放置于阴
道前端, 药液不断被阴道黏膜吸收, 经过一定时间后取出, 此法常用于牛和羊
◆ 埋植法:将成形的药剂或装有药物的带孔容器埋植于母畜皮下组织, 药物
被缓慢吸收, 经过一丝那个时间后取出, 此法可用作群体处理.
◆ 注射法:每日将定量药物作皮下或肌肉注射, 经过一定时间后停药. 此法剂
量准确, 但操作麻烦.
◆ 口服法:每日将一定量的药物均匀拌在饲料中, 以单个饲喂较为准确, 经过
一定时间后停药. 这种方法可用于舍饲母畜. 但较费时费工, 群体饲喂还会造成个体剂量不准确.
2.3.3.2 溶解黄体的制剂
主要是前列腺素及其类似物, 如15-甲基PGF2ά, 氯前列烯醇, 氯胎素等. 它们具有明显的溶解黄体作用, 因此用于正处于黄体期的母畜的同期发情, 对卵巢上没有黄体的动物无效. 牛和羊的发情周期的7~16d以内的黄体对前列腺素都易产生反应, 采用子宫内灌注效果优于肌肉注射. 经前列腺素处理后2~4d,母畜发现发情, 未发情的间隔10~20d进行第二次注射, 在此期间, 可能自然发情形成黄体, 对第二次注射作出应答反应. 此法方便可靠, 但费用高。
2.3.3.3 促进卵泡发育, 排卵的药剂
主要有FSH,LG,PMSG,hCG 和GnRH 等及其类似物的那个, 一般在应用上述; 两类激素的基础上配合使用, 以增强发情同期化, 并使卵泡更好地成熟和排卵.
2.4
胚胎回收
2.4.1 胚胎回收的定义
胚胎回收也称采卵或采胚, 就是利用冲胚液把胚胎从供体生殖道中冲洗出来, 提供移植或其他胚胎工程应用.
2.4.2 胚胎回收地时间
胚胎回收地时间, 可根据所需胚胎地发育阶段来确定. 动物种类不同, 其胚胎早期地发育速度有所差异. 以配种后计算, 几种动物的早期胚胎发育进程近似值见表
2.4.3 冲胚液的配制
冲胚液和胚胎的短期培养液通常是用改良的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS) 根据配方要求分别制备I,II,III 液, 三蒸水加至最终量的80%,在冰箱中冷却至4 ℃, 依次混合后用容量瓶定容至1000mL, 注意防止沉淀,PH 应为7.1~7.2,如不符, 可用NaHCO3或HCL 调节, 渗透压为310mOsm. 配好后, 用孔径0.45um 滤器过滤除菌, 分装密封(注意无菌操作), 标记,4℃冰箱保存3~4月. 临用前加入灭活小牛血清, 一般冲胚液加10%~20%,也可在定容时加入血清, 然后再过滤分装.
2.4.4 采胚方法
根据动物种类和胚胎的发育阶段, 胚胎回收可采用手术法和非手术法
2.4.4.1 手术法
就是对供体进行常规腹部手术将生殖道部分移出腹腔, 用冲胚液对输卵管或子宫角进行冲洗, 回收胚胎. 本法适用于羊, 猪和兔等中小动物; 在牛中, 如需回收进入子宫前的早期胚胎, 仍需用此法.
按外科手术常规方法打开腹腔, 先把一侧子宫角, 输卵管和卵巢牵引至腹壁切口之外, 检查卵巢反应情况(黄体数, 残留卵泡的大小, 数目及排卵情况) 并进行记录.
冲胚的方法包括输卵管冲胚法和子宫角冲胚法
2.4.4.1.1 输卵管冲胚法
用冲胚液冲洗输卵管腔, 回收进入子宫前的胚胎, 分上行法和下行法. 上行法时从子宫角的前端刺入注射针, 向上冲洗输卵管, 注意用手指固定针头并提捏住子宫角, 防止冲洗液从进针周围流出后流向子宫体方向. 冲洗液通过从输卵管伞插入到壶腹部的玻璃细管或硅胶管等回收到平皿或试管内; 下行法时通过从伞部插入到壶腹的玻璃细管或硅胶管等注入冲胚液, 向子宫方向冲洗, 冲洗液通过插入到子宫角上部的带有充气囊的二路式导管或回收针回收. 一侧冲洗完毕后, 还纳腹腔, 在冲另一侧.
2.4.4.1.2 子宫角冲胚法
冲洗子宫角, 回收进入子宫角的胚胎. 依据动物子宫角的大小, 选用长4~5cm,外径1.2~1.4mm的针头, 改制一个回收针. 将回收针插入子宫腔, 用套有乳胶管的肠钳夹住子宫角和针体. 将宫管结合部之前的输卵管用血管夹夹住, 以免冲胚液流入输卵管. 然后从宫管结合部后端的胶管收集冲出液于平皿或试管内. 一侧冲洗完毕后, 除去器械, 确认针孔无出血后, 还纳腹腔, 然后冲另一侧.
冲胚完毕后, 把生殖器官还纳腹腔, 向腹腔注入防粘连剂和抗生素. 按常规腹
部手术方法闭合手术通路, 进行常规术后护理.
手术法采胚, 冲胚液用量少, 胚胎回收率高, 但由于手术对动物有一定的损伤, 手术不当或多次手术, 易引起生殖器官粘连, 导致供体不孕.
2.4.4.2 非手术法
是在胚胎进入子宫角后, 用冲胚器具通过子宫角冲洗采集胚胎的方法. 可以不做手术而采胚, 不仅减小了手术对供体的危害, 节约时间, 降低成本, 而且可以重复采胚. 本法主要用于牛, 马等大家畜.
回收方法: 先要去除子宫颈黏液, 术者一手在直肠内握住子宫颈, 一手持子宫颈黏液去除器插入子宫颈, 由助手抽吸除去子宫颈黏液. 如插入困难,
可用子宫
颈扩张棒扩张子宫颈, 除去子宫颈黏液后, 送入两路或三路冲胚管. 冲胚管前端插入子宫角前1/3后，给气囊充气。通过冲胚管的进液管向子宫内注入冲胚液. 当液体注入使子宫角膨大到相当于妊娠40～60d 时，一般20～40ml ，如使用三路冲胚管，可打开除夜管，并按摩子宫，时胚胎从子宫皱壁中游离出来，随液体流出，收集在量筒活集卵胚等容器内。反复冲洗，每侧用液300～500ml 。
冲洗完毕，向子宫内注入青霉素100万IU ，链霉素1.0g 。回收的冲胚液，在室温下静置30min ，用吸管除去上部液体，将下部回收液放入大检卵杯活平皿中检出胚胎，也可用集卵杯过滤冲胚液，剩下适量用于检胚。
2.5 胚胎检查
2.5.1 胚胎检查的定义
胚检是从回收液中，将受精卵活胚胎检出，并进行必要的净化处理，同时对检得的胚胎进行形态学鉴定，确定其品质，把符合移植的胚胎暂时保存于新鲜培养基中，准备移植或保存。
2.5.2 胚胎的发育
受精后，卵细胞是按2，4，8……. 细胞顺序相继分裂，到16细胞为止，可通过显微镜观察来计算分裂球的数目。16细胞以后，分裂球难以计算，形成的细胞团呈桑椹状，故称为桑椹胚。桑椹胚进一步发育，在细胞团中出现小腔，形成囊胚状，这时的胚胎叫囊胚。囊胚逐渐扩张其腔，不久从透明带中脱出（即孵化）。
正常的胚胎透明带应是圆形，有弹性，厚度随着胚胎的发育而变化，胚胎细胞发育均匀一致，轮廓清晰规则。凡出现边缘不整齐，细胞突出，色暗及有空泡和游离分裂球的为异常胚胎。
2.5.3 胚胎质量的形态学评级与分级
超排处理后，卵巢内的卵泡并非同时排卵，加之超排处理使生殖道的内分泌环境发生改变，回收到的胚胎发育程度有很大的变化。这就需要对胚胎进行形态学鉴定，选出形态比较正常的胚胎进行移植或保存。有些形态特征较差或发育迟缓的胚胎移植后也有可能发育，但发育延迟2天以上者，往往难以存活。
胚胎质量的形态评价可在40～200倍的显微镜下观察，评价的主要内容有：1透明带的形态和完整性。2胚胎的发育阶段与胚龄是否一致。3胚胎的形态与匀称性，胚内细胞大小的变化。4细胞质的结构及颜色，胚内是否出现空泡，细胞碎片，有无游离细胞
根据胚胎的形态特征，可将胚胎分为三个等级：
• A 级：为优良胚胎，齐形态典型，卵裂球轮廓清晰，紧密充实，细胞质致
密，色调和分布均一。
• B 级：为普通胚胎，与A 级胚胎相比，稍有变形，但卵裂球的轮廓清晰，
细胞质较致密，分布均匀，变形细胞和空泡不超过30％。
• C 级：为不良胚胎，其形态有明显变异，卵裂球轮廓稍有不清晰或部分不
清晰，大小不一，细胞质不致密，分布不均匀，色调发暗，突出的细胞，空泡和变形的细胞占30％～50％。
2.6 胚胎的移植
2.6.1 胚胎移植的定义
胚胎的移植就是把胚胎在放入受体的生殖道的适当部位，使其继续发育为胎儿，是整个胚胎移植技术的关键一环。
2.6.2 胚胎移植的方法
2.6.2.1 常规手术移植
对受体进行腹部手术，取出子宫和输卵管，风巨胚胎发育情况，将胚胎移入输卵管或子宫角，适用于羊、猪、兔等中小动物。
移胚管有玻璃细管、塑料管带塑料套管的针管等，接1ml 注射液，吸入新鲜DPBS 三段与管中，中段含胚胎。输卵管移植时，将移胚管经伞部腹腔孔插入输卵管2～3cm ；注入胚胎；子宫角移植时，在黄体侧子宫角前1/3先用钝针将子宫角开洞，在插入移胚管，确认在子宫角腔内注入胚胎。移植时要避免注入空气，抽出移胚管时要慢，防止将胚胎带出。对移植情况进行记录。
2.6.2.2 简易手术移植
郭志勤（1998）把我国船头猪的小挑去势技术用于绵羊、山羊的胚胎移植上，手术时间由常规的20～30min 降为1～3min ，粘连率降至5％左右，且减少感染，不易出血。用猪的小挑手术刀，在麻醉后受体羊大腿内侧鼠蹊部（无毛处），经消毒后，将皮肤向腹部拉紧，用手术刀在靠近盆腔处下刀，开约1.2～1.5cm 可通入腹腔的道刀口，插入食指，指到子宫后在插入刀柄，用食指和刀柄夹出子宫角，进行移植。术后还纳子宫角，松开皮肤，使腹腔的切口由复原皮肤错开覆盖，刀口皮肤消毒即可。
2.6.2.3 腹腔镜监控移植
利用腹腔镜和配套的器械在不对受体进行常规手术的情况下将胚胎移植到子 宫角，适用于羊、猪等动物。以羊为例说明操作方法。在乳房前6cm 处的中线两侧各2cm 处分别做两个小切口，插入腹腔镜头和固定钳。在腹腔镜监视下，进行黄体数和质量评价，用固定钳固定宫管结合部。再从乳房前6cm 处的中线上插入一套长7cm 、内径7mm 的套管针，伸入18号长针刺入子宫角。推动注射器，注入胚胎。每次移植仅需5～8min ，比常规手术移植快1倍，受胎率40.1％～86％。
2.6.2.4 非手术法
用易胚器械通过子宫颈将胚胎移植于子宫角，本法常用于牛、马等大动物，猪、羊也有类似方法，但不常用。
移植器械：目前多采用专用不锈钢活塑套移植器，一般由外套、移植管及内芯组成，用前消毒。也可用凯苏输精枪。
移植操作：似牛的人工受精。用直肠把握法将移胚器通过子宫颈，送至黄体侧子宫角前1/3处（大弯或大弯深处）推入胚胎，缓慢抽回移胚器。操作过程应轻巧，不可损伤生殖道。如果操作过程中生殖道出血，将会降低受胎率。 移植后，要对具体移植情况进行记录。
2.7 供、受体的术后管理
• 对术后的供、受体要注意护理和饲养管理，保证其健康。同时要注意观察，
确定其状态，并做好记录。
• 对于供体，要观察其健康状况，再预定时间是否发情，如果正常发情，可
以配种。
• 对于受体，要观察其健康状况，是否返情，并在一定时间后要进行妊娠诊
断，便于妊娠受体加强饲料管理。诊断方法有直肠检查法和B 超诊断法等。
3 胚胎移植技术的应用
3.1 胚胎的国际交流
以胚胎代替活体动物进行种质资源交流，不仅可大大降低运输成本，而且可减少疾病的传播。实验证明，牛胚胎只要保持透明带完好，移植前在做适当清洗，其传播疾病的可能性比精液或动物活体都小的多（Sreenan 1989），而且，在国内外已进行的数以万计的胚胎移植，均未爆发传染病。
3.2 优良种畜的扩群
通过胚胎移植技术使优良母畜能较早地获得较多地后代，扩大其在群体遗传改良中的作用，这对于低繁殖力地畜种和一些本身遗传素质十分优秀，却因某些繁殖障碍而不能妊娠地母畜具有重要意义。
3.3 建立胚胎库，保护动物种质资源
将胚胎移植技术和胚胎超低温冷冻贮存技术结合起来，建立胚胎库，不仅为胚胎交流提供方便，而且在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽救濒临灭绝地野生动物方面也越来越发挥重要作用。这对于保持动物地多样性具有重要意义。
3.4 其他和科学研究和技术应用地手段
在家畜繁殖学研究中，胚胎移植技术可用于繁殖生理学、生殖内分泌学和遗传学地研究。如利用胚胎移植试验已证实，是奶牛排卵数而不是子宫容纳量限制双胎或多胎率。
胚胎移植技术是其他胚胎工程技术如体外受精、克隆、转基因、胚胎嵌合、胚胎性别鉴定与性别控制等地基础，为其研究合应用提供手段。
参考文献
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