现代农业科技２０１０年第８期农业基础科学
植物４一香豆酸：辅酶Ａ连接酶（４ＣＬ｝研究进展
冯春燕
（北京林业大学生物科学与技术学院，北京１０００８３）
摘要综述了扣香豆酸：辅酶Ａ连接酶（４ＣＬ）的功能、功能与结构的关系及晶体学方面的研究进展，以期为４ＣＬ蛋白质的结构和功能
的进一步研究提供依据。
关键词４一香豆酸：辅酶Ａ连接酶；功能；研究进展
文献标识码Ａ文章编号１００７－５７３９（２０１０）０８－－００３９－－０２中图分类号Ｑ７１
Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
０１１
４－Ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏｅｎｚｙｍｅＡＬｉｇａｓｅ（４ＣＬ）ｏｆＰｌａｎｔｓ
ＦＥＮＧＣｈｕｎ－ｙａｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈ
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３）
ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆ４－ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ｃｏｅｎｚｙｍｅＡｌｉｇａｓｅ（４ＣＬ）ｗａｓｏｖｅｒｖｉｅｗｅｄ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
ｂｅｔｗｅｅｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ｉｔｗｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ４ＣＬｐｒｏｔｅｉｎｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ４－－ｃｏｕｍａｒａ，ｔｅ；ｃｏｅｎｚｙｍｅａｌｉｇａｓｅ（４ＣＬ）；ｆｕｎｃｔｉｏｎ；ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓ
４一香豆酸：辅酶Ａ连接酶（４ＣＬ）是木质素生物合成的关键酶之一，它位于苯丙酸途径与木质素特异合成途径的转折点上。４ＣＬ催化肉桂酸及其羟基或甲氧基衍生物生成相应的辅酶Ａ酯．这些中间产物随后进入苯丙烷类衍生物支路合成途径ｆｌ－２１。以前的研究大都集中在各物种的４ＣＬ基因及其同工酶基因的发现和表达调控，近年来其催化反应和底物偏好选择的分子机理成为研究热点。目前的研究进展
表达水平在一个生长季节中呈现“双峰”模式。印“弱一强一弱一强一弱”，分别在６月底至７月初、７月底至８月初达到峰值．与早材和晚材的形成阶段相符合四。４ＣＬ基因的表达还能被许多环境因子激活，如各种伤害、病原菌侵染、紫外线辐射等。４ｃＬ基因家族的不同成员对于各种环境因子的反应差异说明其在苯丙烷类衍生物代谢中具有不同的功能。
２
４ＣＬ蛋白的结构和功能的关系
通过对几种植物的４ＣＬ蛋白的氨基酸序列进行同源比
主要是通过研究功能域氨基酸位点的突变体酶蛋白的体外
功能和蛋白质晶体结构模型，提出可能的分子机理。
１
对分析结果发现：４ＣＬ蛋白质归类为２组，组Ｉ和组Ⅱ。拟南芥Ａ“ＣＬｌ、Ａｔ４ＣＬ２，杂种杨Ｐｔｄ４ＣＬｌ、Ｐｔｄ４ＣＬ２和Ｐｔ４ＣＬｌ归类为组Ｉ，拟南芥Ａｔ４ＣＬ３及杨树Ｐｔ４ＣＬ２归类为组ＩＩ。组Ｉ内蛋白质相互之间的关系比其与组ＩＩ来自同一种植物的蛋白质之间的关系更为接近，反之亦然（反之亦然）。组ＩＩ内拟南芥、杨树和大豆的４ＣＬｓ主要伴随着类黄酮的生物合成，而组Ｉ内的４ＣＬｓ更为主要地伴随木质素以及其他苯丙烷类衍生物的生物合成。
对４ＣＬ蛋白质序列的比对分析还表明，在所有已知的４ＣＬ氨基酸序列中存在几个保守的肽基序（ｍｏｔｉｆ）。肽基序ＢｏｘＩ、ＳＳＧＴｒＧＬＰＫＧＶ在４ＣＬ蛋白质序列中几乎绝对保守，而且与荧光素酶、长链脂肪酰基一ＣｏＡ合成酶、肽合成酶中发现的保守基序相似。肽基序ＢｏｘＩＩ、ＧＥＩＣＩＲＧ在所有４ＣＬ中绝对保守，其中心的Ｃ残基被认为直接参与催化进程阐。
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等【刀基于短杆菌肽Ｓ一合成酶ＰｈｅＡ（Ｐｈｅｎｙｌａ—ｌａｎｉｎｅ—ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）的晶体数据．分子模建了拟南芥Ａｔ４ＣＬ２的蛋白质模型。鉴定了参与Ａｔ４ＣＬ２ＳＢＰ的１２个氨基酸残基。
４ＣＬ蛋白的功能研究
４ＣＬ蛋白的研究在２０世纪７０年代初就已经开始，最
初的研究工作主要集中在分离纯化植物中的４ＣＬ蛋白酶，并对提取的天然４ＣＬ蛋白酶进行生化特性研究方面。到目前为止，已从大豆、欧芹、云杉、杨树、水稻、丝瓜、刺槐等多种植物中纯化或部分纯化出了４ＣＬ蛋白。
随着越来越多植物的４ＣＬ基因被发现，人们发现这些植物基因组中４ＣＬ基因一般以小的基因家族的形式存在，家族内不同成员可能在苯丙烷类代谢不同分支代谢途径中起作用。同时人们发现４ＣＬ基因是组织特异性表达基因，同一物种中４ＣＬ基因家族中不同成员的表达表现出器官、组织和细胞的特异性，这可能与不同成员参与不同的分支途径有关。如美洲山杨含有结构上和功能上均不同的２个４ＣＬ基因Ｐｔ４ＣＬｌ和Ｐｔ４ＣＬ２，二者差异表达以调控不同的苯丙烷类衍生物的生物合成，它们参与不同的生理功能【３】，Ｐｔ４ＣＬｌ在正在发育的木质部组织参与木质素生物合成，而Ｐｔ４ＣＬ２在表皮细胞中参与其他酚类化合物如类黄酮的生物合成。
人们也对４ＣＬ基因的表达调控作了大量的研究。与植物次生代谢途径中的大多数酶类一样，４ＣＬ基因也属于调控基因。其表达主要受发育的调控，４ＣＬ基因在植物生命世代中很早即开始表达。拟南芥４ＣＬ基因在苗期阶段即被活化，拟南芥发芽后２—３ｄ。４ＣＬ基因即开始表达，其活性与子叶和根部木质素沉积的起始密切相关Ｉ．Ｉ。毛白杨４ＣＬ基因的
作者简介冯春燕（１９８３－），女，河北保定人，硕士研宽生。研究方向：生
物化学与分子生物学。
收稿日期２０１０—０３—１８
创造了“功能的获得”（Ｇａｉｎ刊一ｎｃｔｉｏｎ）突变体，通过增加
强的肉桂酸转化的Ａ“ＣＬ２突变体。
上述研究结果对于更好地理解苯丙烷类衍生物途径中
ＳＢＰ的空间大小产生了具有转化阿魏酸和芥子酸能力的Ａｔ４ＣＬ２突变体，而通过增加ＳＢＰ的疏水性导致具有强烈增
关键酶的催化过程，对于设计具有新的底物特异性的４ＣＬ突变体有很好的帮助。但这些都没有从根本上揭示４ｃＬ同工酶的底物特异性和偏好性的分手机制。要阐明４ｃＬ蛋白的催化机制，最佳方法就是获得４ＣＬ蛋白的晶体，并通过
３９
农业基础科学
Ｘ一衍射收集４ＣＬ晶体的结构数据，解析４ＣＬ蛋白的原子结构．从而更好地解释４ＣＬ蛋白的结构与功能的关系。
３
现代农业科技２０１０年第８期
少了优化结晶条件的时间，加速了蛋白质结构研究的速度［１１Ｉ。
近几年来。国际上有几个实验室同时对４ＣＬ的结构及其功能关系进行深入地研究，获得了一系列有关４ＣＬ蛋白晶体结构与功能之间关系的信息。但到目前为止，没有获得任何一个物种的４ＣＬ蛋白晶体的三维结构。４存在问题与展望
早在２０世纪７０年代初。４ＣＬ蛋白的研究就已经开始进行，已发现近４０个４ＣＬ蛋白家族成员，但至今为止，整个家族没有任何一个物种的４ＣＬ蛋白的三维结构被解析，所有的分子机理都是从侧面提出，其三维结构的获得成为当前４ＣＬ研究中的一个难点，国内外多个研究组都在努力去解析其三维结构。
毛白杨Ｉ型４ＣＬｌ母体蛋白的晶体获得及优化的研究，为最终获得高质量的衍射单晶提供了可能，为整个４ＣＬ家族的第一个代表性结构．并能从分子水平上阐明其催化反应和底物偏好选择的分子机理，将为４ＣＬ蛋白参与的生物代谢途径的改造提供理论依据。特别是为现有的植物中木质素生物合成和黄酮的生物合成提供直接的理论依据，因而在苯丙烷类化合物的生物合成中具有极大的应用价值。５参考文献
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４ＣＬ蛋白晶体学研究现状
３．１晶体生长的基本原理和方法
蛋白质晶体生长的基本原理是指蛋白质溶液在过饱和状态下，蛋白质在固相沉积的速率大于离开固相进入液相的速率时。溶液中蛋白质分子就会自我聚集成核，在合适的条件下．形成的晶核发育成蛋白质晶体。蛋白质晶体通常在过饱和状态下出现。蛋白质能达到过饱和状态而不是在达到饱和态就立即沉淀或者结晶出来，主要是因为蛋白质结晶也有类似于化学反应的能垒，成核是一个高能态。使得蛋白质成核过程较慢。能垒越高，蛋白质形成临界核的速度就越慢，过饱和状态就越容易维持。同时蛋白质溶液过饱和状态越高．蛋白质形成临界核的可能性就越大。结晶的方法分为４种：批量结晶、蒸发结晶、液液扩散结晶和透析结晶｛８１。３．２蛋白质晶体解析方法
蛋白质空间结构与其生物活性的关系是结构生物学的核心。空间结构对酶的功能至关重要，即使极其细微的扰乱也会导致酶活力的丧失。结构与功能关系的研究，一直是蛋白质研究的核心问题之一。１９６０年ＭａｘＰｅｍｔｚ解析出了第１
个蛋白质结构——血红蛋白质的三维结构。这之后蛋白质
结构解析工作逐渐开展起来［９１。蛋白质晶体结构测定可以提供原子（或接近）分辨率的三维精细结构。经过修正的高于１五分辨率的蛋白质结构，可以确定其结构中的原子的空间坐标及原子之间的关系（如氢键）、结构表面及内部的溶剂分布，以及分子柔性或运动的变化㈣。目前，可用于完整、准确、实时测定生物大分子三维结构的主要方法包括：Ｘ射线晶体结构分析、多维核磁共振（ＮＭＲ）波谱解析和电子显徽镜二维晶体三维重构（电子晶体学，ＥＣ）。３．３蛋白质结晶影响因素
Ｘ射线衍射是确定所有分子三维空间结构最可靠的方法之一，而获得合适的晶体是进行Ｘ射线衍射的基本前题。结构测定往往由于得不到高质量的晶体而受到阻碍。蛋白质结晶的影响因素有：结晶蛋白质的纯度、过饱和度、温度、ｐＨ值、结晶剂、压力、外加物理场，其他因素包括：蛋白质结晶液的浓度、蛋白质的来源、细菌及真菌引起的污染程度、样品体积及氧化一还原环境等。对于蛋白质的结晶，结晶剂的作用主要在于对溶剂产生影响而对蛋白质分子不产生影响。＿般来说，结晶剂主要有盐类，如磷酸盐、硫酸盐等，以及高分子直链聚合物，女１３ＰＥＧ
。新近发展的高通量蛋白质结
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ｍｌｅｓｏｆ
ｉｎｄｕｃｅｄｂｙＢａｘｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
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［２４１ＷＡＴＡＮＡＢＥＮ．ＬＡＭＥ．ＴｗｏＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｍｅｔａｅａｓｐａｓｅｓＡｔＭＣＰｌｂａｎｄ【２７】ＳＩＬＶＡＲＤ．ＳＯＴＯＣＡＲ，ＪＯＨＡＮＳＳＯＮＢ，ｅｔａ１．Ｍ．Ｃｏｒｔｅ—Ｒｅａｌ，
ＡｔＭＣＰ２ｂａｒｅａｒｇｉｎｉｎｄｌｙｓｉｎｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｓａｎｄａｃｔｉｖａｔｅＨｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｅｓｍｅｔａｅａｓｐａｓｅ—ａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ【Ｊ】．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５（５８）：ａｐｏｐｔａｓｉｓ—ｌｉｋｅｃｅｌｌｄｅａｔｈｉｎｙｅａｓｔ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００５（２８０）：１４６９１一
１４６９９．
８２４＿８３４．
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［２５】ＧＯＮＺＡＬＥＺ
ｍｅｔａｅａ－ｓｐａｓｅ
Ｊ，ＤＥＳＰＯＮＤＳＣ，ＳＣＨＡＦＦＣ。ｅｔａ１．Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｍａｊｏｒ【２８】ＦＡＮＮＪＩＡＮＧＹ，ＣＨＥＮＧＷＣ，ＬＥＥＳＪ，ｅｔａ１．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｉｓｓｉｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ
Ｃａｎｒｅｐｌａｃｅ
ｙｅａｓｔ
ｍｅｔａｃａｓｐａｓｅ
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ｙｅａｓｔ叨．ＧｅｎｅｓＤｅｖ，２００４
ａｎｄｈａｓａｒｇｉｎｉｎｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ４０
ｃｙｓｔｅｉｎｅ
ｐｅｐｔｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ们．ＩｎｔＪＰａｒａｓｉｔｏｌ。
（１８）：２７８５—２７９７．
植物4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)研究进展
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
冯春燕， FENG Chun-yan
北京林业大学生物科学与技术学院,北京,100083现代农业科技
XIANDAI NONGYE KEJI2010(8)
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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_ahny201008017.aspx
现代农业科技２０１０年第８期农业基础科学
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关键词４一香豆酸：辅酶Ａ连接酶；功能；研究进展
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Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
０１１
４－Ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏｅｎｚｙｍｅＡＬｉｇａｓｅ（４ＣＬ）ｏｆＰｌａｎｔｓ
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ｂｅｔｗｅｅｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ｉｔｗｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ４ＣＬｐｒｏｔｅｉｎｓ．
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表达水平在一个生长季节中呈现“双峰”模式。印“弱一强一弱一强一弱”，分别在６月底至７月初、７月底至８月初达到峰值．与早材和晚材的形成阶段相符合四。４ＣＬ基因的表达还能被许多环境因子激活，如各种伤害、病原菌侵染、紫外线辐射等。４ｃＬ基因家族的不同成员对于各种环境因子的反应差异说明其在苯丙烷类衍生物代谢中具有不同的功能。
２
４ＣＬ蛋白的结构和功能的关系
通过对几种植物的４ＣＬ蛋白的氨基酸序列进行同源比
主要是通过研究功能域氨基酸位点的突变体酶蛋白的体外
功能和蛋白质晶体结构模型，提出可能的分子机理。
１
对分析结果发现：４ＣＬ蛋白质归类为２组，组Ｉ和组Ⅱ。拟南芥Ａ“ＣＬｌ、Ａｔ４ＣＬ２，杂种杨Ｐｔｄ４ＣＬｌ、Ｐｔｄ４ＣＬ２和Ｐｔ４ＣＬｌ归类为组Ｉ，拟南芥Ａｔ４ＣＬ３及杨树Ｐｔ４ＣＬ２归类为组ＩＩ。组Ｉ内蛋白质相互之间的关系比其与组ＩＩ来自同一种植物的蛋白质之间的关系更为接近，反之亦然（反之亦然）。组ＩＩ内拟南芥、杨树和大豆的４ＣＬｓ主要伴随着类黄酮的生物合成，而组Ｉ内的４ＣＬｓ更为主要地伴随木质素以及其他苯丙烷类衍生物的生物合成。
对４ＣＬ蛋白质序列的比对分析还表明，在所有已知的４ＣＬ氨基酸序列中存在几个保守的肽基序（ｍｏｔｉｆ）。肽基序ＢｏｘＩ、ＳＳＧＴｒＧＬＰＫＧＶ在４ＣＬ蛋白质序列中几乎绝对保守，而且与荧光素酶、长链脂肪酰基一ＣｏＡ合成酶、肽合成酶中发现的保守基序相似。肽基序ＢｏｘＩＩ、ＧＥＩＣＩＲＧ在所有４ＣＬ中绝对保守，其中心的Ｃ残基被认为直接参与催化进程阐。
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等【刀基于短杆菌肽Ｓ一合成酶ＰｈｅＡ（Ｐｈｅｎｙｌａ—ｌａｎｉｎｅ—ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）的晶体数据．分子模建了拟南芥Ａｔ４ＣＬ２的蛋白质模型。鉴定了参与Ａｔ４ＣＬ２ＳＢＰ的１２个氨基酸残基。
４ＣＬ蛋白的功能研究
４ＣＬ蛋白的研究在２０世纪７０年代初就已经开始，最
初的研究工作主要集中在分离纯化植物中的４ＣＬ蛋白酶，并对提取的天然４ＣＬ蛋白酶进行生化特性研究方面。到目前为止，已从大豆、欧芹、云杉、杨树、水稻、丝瓜、刺槐等多种植物中纯化或部分纯化出了４ＣＬ蛋白。
随着越来越多植物的４ＣＬ基因被发现，人们发现这些植物基因组中４ＣＬ基因一般以小的基因家族的形式存在，家族内不同成员可能在苯丙烷类代谢不同分支代谢途径中起作用。同时人们发现４ＣＬ基因是组织特异性表达基因，同一物种中４ＣＬ基因家族中不同成员的表达表现出器官、组织和细胞的特异性，这可能与不同成员参与不同的分支途径有关。如美洲山杨含有结构上和功能上均不同的２个４ＣＬ基因Ｐｔ４ＣＬｌ和Ｐｔ４ＣＬ２，二者差异表达以调控不同的苯丙烷类衍生物的生物合成，它们参与不同的生理功能【３】，Ｐｔ４ＣＬｌ在正在发育的木质部组织参与木质素生物合成，而Ｐｔ４ＣＬ２在表皮细胞中参与其他酚类化合物如类黄酮的生物合成。
人们也对４ＣＬ基因的表达调控作了大量的研究。与植物次生代谢途径中的大多数酶类一样，４ＣＬ基因也属于调控基因。其表达主要受发育的调控，４ＣＬ基因在植物生命世代中很早即开始表达。拟南芥４ＣＬ基因在苗期阶段即被活化，拟南芥发芽后２—３ｄ。４ＣＬ基因即开始表达，其活性与子叶和根部木质素沉积的起始密切相关Ｉ．Ｉ。毛白杨４ＣＬ基因的
作者简介冯春燕（１９８３－），女，河北保定人，硕士研宽生。研究方向：生
物化学与分子生物学。
收稿日期２０１０—０３—１８
创造了“功能的获得”（Ｇａｉｎ刊一ｎｃｔｉｏｎ）突变体，通过增加
强的肉桂酸转化的Ａ“ＣＬ２突变体。
上述研究结果对于更好地理解苯丙烷类衍生物途径中
ＳＢＰ的空间大小产生了具有转化阿魏酸和芥子酸能力的Ａｔ４ＣＬ２突变体，而通过增加ＳＢＰ的疏水性导致具有强烈增
关键酶的催化过程，对于设计具有新的底物特异性的４ＣＬ突变体有很好的帮助。但这些都没有从根本上揭示４ｃＬ同工酶的底物特异性和偏好性的分手机制。要阐明４ｃＬ蛋白的催化机制，最佳方法就是获得４ＣＬ蛋白的晶体，并通过
３９
农业基础科学
Ｘ一衍射收集４ＣＬ晶体的结构数据，解析４ＣＬ蛋白的原子结构．从而更好地解释４ＣＬ蛋白的结构与功能的关系。
３
现代农业科技２０１０年第８期
少了优化结晶条件的时间，加速了蛋白质结构研究的速度［１１Ｉ。
近几年来。国际上有几个实验室同时对４ＣＬ的结构及其功能关系进行深入地研究，获得了一系列有关４ＣＬ蛋白晶体结构与功能之间关系的信息。但到目前为止，没有获得任何一个物种的４ＣＬ蛋白晶体的三维结构。４存在问题与展望
早在２０世纪７０年代初。４ＣＬ蛋白的研究就已经开始进行，已发现近４０个４ＣＬ蛋白家族成员，但至今为止，整个家族没有任何一个物种的４ＣＬ蛋白的三维结构被解析，所有的分子机理都是从侧面提出，其三维结构的获得成为当前４ＣＬ研究中的一个难点，国内外多个研究组都在努力去解析其三维结构。
毛白杨Ｉ型４ＣＬｌ母体蛋白的晶体获得及优化的研究，为最终获得高质量的衍射单晶提供了可能，为整个４ＣＬ家族的第一个代表性结构．并能从分子水平上阐明其催化反应和底物偏好选择的分子机理，将为４ＣＬ蛋白参与的生物代谢途径的改造提供理论依据。特别是为现有的植物中木质素生物合成和黄酮的生物合成提供直接的理论依据，因而在苯丙烷类化合物的生物合成中具有极大的应用价值。５参考文献
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４ＣＬ蛋白晶体学研究现状
３．１晶体生长的基本原理和方法
蛋白质晶体生长的基本原理是指蛋白质溶液在过饱和状态下，蛋白质在固相沉积的速率大于离开固相进入液相的速率时。溶液中蛋白质分子就会自我聚集成核，在合适的条件下．形成的晶核发育成蛋白质晶体。蛋白质晶体通常在过饱和状态下出现。蛋白质能达到过饱和状态而不是在达到饱和态就立即沉淀或者结晶出来，主要是因为蛋白质结晶也有类似于化学反应的能垒，成核是一个高能态。使得蛋白质成核过程较慢。能垒越高，蛋白质形成临界核的速度就越慢，过饱和状态就越容易维持。同时蛋白质溶液过饱和状态越高．蛋白质形成临界核的可能性就越大。结晶的方法分为４种：批量结晶、蒸发结晶、液液扩散结晶和透析结晶｛８１。３．２蛋白质晶体解析方法
蛋白质空间结构与其生物活性的关系是结构生物学的核心。空间结构对酶的功能至关重要，即使极其细微的扰乱也会导致酶活力的丧失。结构与功能关系的研究，一直是蛋白质研究的核心问题之一。１９６０年ＭａｘＰｅｍｔｚ解析出了第１
个蛋白质结构——血红蛋白质的三维结构。这之后蛋白质
结构解析工作逐渐开展起来［９１。蛋白质晶体结构测定可以提供原子（或接近）分辨率的三维精细结构。经过修正的高于１五分辨率的蛋白质结构，可以确定其结构中的原子的空间坐标及原子之间的关系（如氢键）、结构表面及内部的溶剂分布，以及分子柔性或运动的变化㈣。目前，可用于完整、准确、实时测定生物大分子三维结构的主要方法包括：Ｘ射线晶体结构分析、多维核磁共振（ＮＭＲ）波谱解析和电子显徽镜二维晶体三维重构（电子晶体学，ＥＣ）。３．３蛋白质结晶影响因素
Ｘ射线衍射是确定所有分子三维空间结构最可靠的方法之一，而获得合适的晶体是进行Ｘ射线衍射的基本前题。结构测定往往由于得不到高质量的晶体而受到阻碍。蛋白质结晶的影响因素有：结晶蛋白质的纯度、过饱和度、温度、ｐＨ值、结晶剂、压力、外加物理场，其他因素包括：蛋白质结晶液的浓度、蛋白质的来源、细菌及真菌引起的污染程度、样品体积及氧化一还原环境等。对于蛋白质的结晶，结晶剂的作用主要在于对溶剂产生影响而对蛋白质分子不产生影响。＿般来说，结晶剂主要有盐类，如磷酸盐、硫酸盐等，以及高分子直链聚合物，女１３ＰＥＧ
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ＡｔＭＣＰ２ｂａｒｅａｒｇｉｎｉｎｄｌｙｓｉｎｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｓａｎｄａｃｔｉｖａｔｅＨｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｅｓｍｅｔａｅａｓｐａｓｅ—ａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ【Ｊ】．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５（５８）：ａｐｏｐｔａｓｉｓ—ｌｉｋｅｃｅｌｌｄｅａｔｈｉｎｙｅａｓｔ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００５（２８０）：１４６９１一
１４６９９．
８２４＿８３４．
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ｍｅｔａｅａ－ｓｐａｓｅ
Ｊ，ＤＥＳＰＯＮＤＳＣ，ＳＣＨＡＦＦＣ。ｅｔａ１．Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｍａｊｏｒ【２８】ＦＡＮＮＪＩＡＮＧＹ，ＣＨＥＮＧＷＣ，ＬＥＥＳＪ，ｅｔａ１．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｉｓｓｉｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ
Ｃａｎｒｅｐｌａｃｅ
ｙｅａｓｔ
ｍｅｔａｃａｓｐａｓｅ
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ｃｅｌｌｄｅａｔｈｉｎ
ｙｅａｓｔ叨．ＧｅｎｅｓＤｅｖ，２００４
ａｎｄｈａｓａｒｇｉｎｉｎｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ４０
ｃｙｓｔｅｉｎｅ
ｐｅｐｔｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ们．ＩｎｔＪＰａｒａｓｉｔｏｌ。
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植物4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)研究进展
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
冯春燕， FENG Chun-yan
北京林业大学生物科学与技术学院,北京,100083现代农业科技
XIANDAI NONGYE KEJI2010(8)
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