可溶性糖含量测定
1， 试剂配制
1) 葡萄糖标液100μg/ml ：10mg /100ml;
2) 蒽酮试剂：200mg 蒽酮溶于100ml98%硫酸溶液中，用时现配
2 ， 标准曲线
a) 加盖振荡 5min （涡旋 5min ）
b) 之后立即将其放入沸水浴中保温 7min
c) 取出自然冷却至室温，测 620nm 处吸光度
3 ， 样品测定
a) 称取样品 0.1g ，剪成 1cm 小段，加 10ml 水沸水浴 1h，自然冷却后，定至 10ml ；
b）加 提取液0.2ml ①
蒸馏水 0.8ml②
蒽酮试剂 4ml③
C ）后续操作和标曲操作一样，测OD 值
4 计算
可溶性糖含量=X*VT *(WF *VS ) -1
X ——测定的值（ug/ml）
V T ——提取液体积（ml ）
V S ——测定时吸取的体积（ml ）
W F ——称取样品鲜重（g ）
一、试剂配制
1) 50mM Na-phosphate 缓冲液 PH7.0 （PBS7.0）
母液 A（0.2M NaH2PO 4·2H2O ） 31.2g/L （蒸馏水定容） 母液 B（0.2M Na2HPO 4·12H2O ） 71.628g/L （蒸馏水定容）
97.5ml A + 152.5ml B 蒸馏水定容至 1000ml
195ml A + 305ml B 蒸馏水定容至 2000ml
2) 50mM Na-phosphate PH7.8 （PBS7.8）
21.25ml A + 228.75ml B 蒸馏水定容至 1000ml
42.5ml A + 457.5ml B 蒸馏水定容至 2000ml
3) 10mM EDTANa2：0.372g/100ml PBS7.8 定容
4) 酶提取液：
100ml PBS7.0 + 1g PVP + 0.00744g EDTANa
1000ml PBS7.0 + 10g PVP + 0.0744g EDTANa
5) 硼酸-硼砂缓冲液：
母液A(0.05mol/L硼砂溶液) ：称19.07gNa 2B 4O 7.10H 2O(M=381.43)溶解稀释至1000ml ，硼砂易失水，必须在带塞得瓶中保存。9.535g 定容于500ml 。
母液B(0.2mol/L硼酸溶液) ：称取12.37gH 2BO 3(M=61.84)溶解，稀释至1000ml ，6.185g 定容于500ml 。
二、酶液的提取
（2ml 的离心管）
1，称样 0.15g ，剪碎与研钵中；
2，加适量液氮，研磨成粉末状
3，加 1ml 酶提取液，研磨成匀浆，转移到 2ml 的离心管中； 4，加 1ml 酶提取液冲洗，转移至之前的离心管中，标号，存于冰盒中；
5，4℃，15000*g 离心，20min ；
6，上清转移至新的 2ml 的离心管中4℃保存备用，转移到新管的目的是为了将上清混匀，进行样品测定。
如需长期保存，需放入-80℃冰箱保存
三、可溶性蛋白测定（10ml 离心管）
2，测样
a 取酶液 50ul，加蒸馏水950ul 。
b 加5ml 考马斯亮蓝后，混匀，静置5min ，595nm 比色。
3，计算 样品中蛋白质的质量分数（mg/g）=(C*VT )*(1000*VS *WF ) -1 C ——查标准曲线值（ug ）
VT ——提取液总体积（ml ）
W F ——样品鲜重（g ）
V S ——测定时加样量（ml ）
4，试剂配制
牛血清蛋白标液（100μg/ml ）：牛血清蛋白 10mg用质量分数为0.9%的氯化钠溶解，并定容于100ml
考马斯亮蓝溶液（G250）：100mg 考马斯亮蓝250，溶于 50ml 90%的乙醇，加 100ml 85% 磷酸，蒸馏水定容至 1000ml， 两层滤纸过滤，室温下可放置 1-2 个月
四、过氧化物酶POD 活性（茶褐色产物）
（4ml 离心管）
1，加样 ①50Mm PBS7.0 1ml
②0.3% H2O 2 1ml
③0.2% 愈创木酚 0.95ml
④酶液（对照PBS ） 50ul 2, 加盖混匀，加样96孔板
3, 室温反应，470nm 处测OD 值，动力学测，10min ，每2min 测一次
4, 以每分钟内OD 值变化0.01为一个酶活力单位U.
5，计算
POD 酶活性= （ΔOD470*VT ）*(0.01*WF *VS *t)-1
ΔOD470——反应时间内吸光值的变化
W F ——样品鲜重（g ）
t ——反应时间（min ）
V T ——提取粗酶液总体积（ml ）
V S ——测定时取用的酶液体积（ml ）
6, 试剂配制
0.3% H2O 2：1ml 30% H2O 2，蒸馏水至 100ml ，避光保存
0.2%愈创木酚：0.2g ，少量乙醇（5ml ）溶解，蒸馏水定容至100ml
200μl ，20ml 95%乙醇，蒸馏水定容100ml
五、超氧化物歧化酶SOD 活性测定
（4ml 体系）
两只对照管，暗处理的离心管提前用锡箔纸包好
1，加样 ①PBS7.8 2.82ml
②13mM Met甲硫氨酸 30ul
③10Mm EDTA 30ul
④6.3Mm NBT 30ul
⑤酶液（对照PBS ） 60ul
⑥核黄素（最后加） 30ul
2，加盖混匀，暗处理的离心管用锡箔纸包好头。一起放在组培室，
25℃，光照。处理20min 。
3，反应结束，暗条件下，快速加样96孔板。
4，放于酶标仪，于560nm 波长，测OD 值
5，计算 以遮光的对照管作为空白，调零。以能抑制反应50%的酶量为1个SOD 酶单位，用U 表示。
SOD活性=(A0-A S )*VT *(0.5*A0*WF *Vs ) -1
A 0——照光对照管的OD 值
A S ——样品管的 OD值
V T ——样品的总体积（ml ）
V s ——测定时样品用量（ml ） W F ——样品的鲜重（g ）
7，试剂配制
0.05mmol/L PBS7.8
13mM 甲硫氨酸：0.194g/100ml；0.485g/250ml；0.97g/500ml；PBS7.8 定容
6.3mM NBT ：0.05256g/10ml；0.5256g/100ml；PBS7.8 定容；避光保存
10mM EDTANa2：0.372g/100ml PBS7.8 定容
130μM 核黄素：0.00499g/100ml，少量稀碱溶解，蒸馏水定容，避光，现用现配
六、抗坏血酸过氧化氢酶APX 活性测定
（4ml 离心管）
1，加样 ①50Mm PBS7.0 2.82ml
②50mM 抗坏血酸 30ul
③10mM EDTA 30ul
④酶液 100ul
2，加盖混匀
3，加 10mM H2O 2 30ul 反应开始 4，加样96孔板
5，放入酶标仪，于290nm 室温下，动力学测，10min ，每2min 测一次
6，以每分钟内OD 值变化0.1为一个酶活力单位U.
7，计算
APX 酶活性= （ΔOD290*VT ）*(0.1*WF *VS *t)-1
ΔOD290——反应时间内吸光值的变化
W F ——样品鲜重（g ）
t ——反应时间（min ）
V T ——提取粗酶液总体积（ml ）
V S ——测定时取用的酶液体积（ml ）
8，试剂配制
50mM 抗坏血酸：0.8805g/100ml，0.2201g/25ml；0.08805g/10ml，现用现配
10mM H2O 2：0.1ml 30% H2O 2，蒸馏水定容至 98ml ，避光保存
七、过氧化氢酶（CAT ）活性测定
（4ml 离心管）
1，加样
①50Mm PBS7.0 2.84ml
②1.5mM H2O 2 30ul
③酶液（对照PBS ） 100ul 2，加盖混匀，加样96孔板
3，放入酶标仪，于240nm 室温下，动力学测，10min ，每2min 测一次
4，以每分钟内OD 值变化0.01为一个酶活力单位U.
5，计算
APX 酶活性= （ΔOD240*VT ）*(0.01*WF *VS *t)-1
ΔOD240——反应时间内吸光值的变化
W F ——样品鲜重（g ）
t ——反应时间（min ）
V T ——提取粗酶液总体积（ml ）
V S ——测定时取用的酶液体积（ml ）
6，试剂配制
1.5M H2O 2：30%的 H2O 2=9.8M ，（注意 H2O 2 在使用过程中不要碰壁） 10ml 30% H2O 2，蒸馏水定容至 65.3m l ，避光保存
八、脂氧合酶LOX 活性测定
(3ml反应体系)
1，加样 ①亚油酸钠溶液 50ul
②Ph=7.0磷酸缓冲液 2.9ml
③酶液（对照PBS ） 50ul 2，加盖混匀，加样96孔板
3，室温25℃反应，234nm 处测OD 值，动力学测，15min ，每3min 测一次
4，以每分钟内OD 值变化1为一个酶活力单位U.
5，计算
LOX 酶活性= （ΔOD234*VT ）*(1*WF *VS *t)-1
ΔOD234——反应时间内吸光值的变化
W F ——样品鲜重（g ）
t ——反应时间（min ）
V T ——提取粗酶液总体积（ml ）
V S ——测定时取用的酶液体积（ml ）
6，试剂配制
亚油酸钠溶液：取50ul 亚油酸加入到溶有0.1mlTween-20的8ml 重蒸馏水中，然后加入190ul 1mol/L氢氧化钠至澄清，定容20ml ，于冰箱中冷藏备用
九、苯丙氨酸解氨酶PAL 活性测定
(6ml体系)
1，加样 ①0.02mol/L苯丙氨酸 1ml
②0.1mol/L PH=8.8硼酸缓冲液 4ml
③酶液（缓冲液对照） 50ul
2，加盖混匀 3，加样96孔板
4，放于酶标仪，于290nm 波长，调温度为30℃，动力学60min ，每个15min 测一次OD 值
5，以每分钟内OD 值变化0.01为一个酶活力单位U.
6，计算
PAL 酶活性= （ΔOD290*VT ）*(0.01*WF *VS *t)-1
ΔOD525——反应时间内吸光值的变化
W F ——样品鲜重（g ）
t ——反应时间（min ）
V T ——提取粗酶液总体积（ml ）
V S ——测定时取用的酶液体积（ml ）
7，试剂配制
0.1mol/L PH=8.8硼酸缓冲液: 取66.67ml 母液A 0.05mol/L硼砂溶液和33.33ml 母液B 0.2mol/L硼酸溶液，混匀，调节PH 至8.8，稀释至200ml
20mmol/L L-苯丙氨酸溶液：称取330mg L-苯丙氨酸，用0.1mol/L硼酸缓冲液溶解定容至100ml
十、多酚氧化酶PPO 活性
(6ml体系)
1，加样 ①0.05mol/L PH=6.06磷酸缓冲液 3.9ml
②0.1mol/L儿茶酚 1.0ml
③酶液（以磷酸缓冲液为对照） 100ul
2，加盖混匀 3，加样96孔板
4，放于酶标仪，于525nm 波长，调温度为37℃，动力学30min ，每个5min 测一次OD 值
5，以每分钟内OD 值变化0.01为一个酶活力单位U.
6，计算 PPO酶活性= （ΔOD525*VT ）*(0.01*WF *VS *t)-1
ΔOD525——反应时间内吸光值的变化
W F ——样品鲜重（g ）
t ——反应时间（min ）
V T ——提取粗酶液总体积（ml ）
V S ——测定时取用的酶液体积（ml ）
7，试剂配制
0.05mol/LPH=6.06磷酸缓冲液:1ml母液 B（0.2M Na 2HPO 4·12H 2O ）+8ml母液 A （0.2M NaH2PO 4·2H 2O ）定容于100ml 容量瓶
0.1mol/L儿茶酚：取2.75275g 儿茶酚，用蒸馏水定容于250ml 容量瓶
个人见解，有所改良。
祝实验顺利！
可溶性糖含量测定
1， 试剂配制
1) 葡萄糖标液100μg/ml ：10mg /100ml;
2) 蒽酮试剂：200mg 蒽酮溶于100ml98%硫酸溶液中，用时现配
2 ， 标准曲线
a) 加盖振荡 5min （涡旋 5min ）
b) 之后立即将其放入沸水浴中保温 7min
c) 取出自然冷却至室温，测 620nm 处吸光度
3 ， 样品测定
a) 称取样品 0.1g ，剪成 1cm 小段，加 10ml 水沸水浴 1h，自然冷却后，定至 10ml ；
b）加 提取液0.2ml ①
蒸馏水 0.8ml②
蒽酮试剂 4ml③
C ）后续操作和标曲操作一样，测OD 值
4 计算
可溶性糖含量=X*VT *(WF *VS ) -1
X ——测定的值（ug/ml）
V T ——提取液体积（ml ）
V S ——测定时吸取的体积（ml ）
W F ——称取样品鲜重（g ）
一、试剂配制
1) 50mM Na-phosphate 缓冲液 PH7.0 （PBS7.0）
母液 A（0.2M NaH2PO 4·2H2O ） 31.2g/L （蒸馏水定容） 母液 B（0.2M Na2HPO 4·12H2O ） 71.628g/L （蒸馏水定容）
97.5ml A + 152.5ml B 蒸馏水定容至 1000ml
195ml A + 305ml B 蒸馏水定容至 2000ml
2) 50mM Na-phosphate PH7.8 （PBS7.8）
21.25ml A + 228.75ml B 蒸馏水定容至 1000ml
42.5ml A + 457.5ml B 蒸馏水定容至 2000ml
3) 10mM EDTANa2：0.372g/100ml PBS7.8 定容
4) 酶提取液：
100ml PBS7.0 + 1g PVP + 0.00744g EDTANa
1000ml PBS7.0 + 10g PVP + 0.0744g EDTANa
5) 硼酸-硼砂缓冲液：
母液A(0.05mol/L硼砂溶液) ：称19.07gNa 2B 4O 7.10H 2O(M=381.43)溶解稀释至1000ml ，硼砂易失水，必须在带塞得瓶中保存。9.535g 定容于500ml 。
母液B(0.2mol/L硼酸溶液) ：称取12.37gH 2BO 3(M=61.84)溶解，稀释至1000ml ，6.185g 定容于500ml 。
二、酶液的提取
（2ml 的离心管）
1，称样 0.15g ，剪碎与研钵中；
2，加适量液氮，研磨成粉末状
3，加 1ml 酶提取液，研磨成匀浆，转移到 2ml 的离心管中； 4，加 1ml 酶提取液冲洗，转移至之前的离心管中，标号，存于冰盒中；
5，4℃，15000*g 离心，20min ；
6，上清转移至新的 2ml 的离心管中4℃保存备用，转移到新管的目的是为了将上清混匀，进行样品测定。
如需长期保存，需放入-80℃冰箱保存
三、可溶性蛋白测定（10ml 离心管）
2，测样
a 取酶液 50ul，加蒸馏水950ul 。
b 加5ml 考马斯亮蓝后，混匀，静置5min ，595nm 比色。
3，计算 样品中蛋白质的质量分数（mg/g）=(C*VT )*(1000*VS *WF ) -1 C ——查标准曲线值（ug ）
VT ——提取液总体积（ml ）
W F ——样品鲜重（g ）
V S ——测定时加样量（ml ）
4，试剂配制
牛血清蛋白标液（100μg/ml ）：牛血清蛋白 10mg用质量分数为0.9%的氯化钠溶解，并定容于100ml
考马斯亮蓝溶液（G250）：100mg 考马斯亮蓝250，溶于 50ml 90%的乙醇，加 100ml 85% 磷酸，蒸馏水定容至 1000ml， 两层滤纸过滤，室温下可放置 1-2 个月
四、过氧化物酶POD 活性（茶褐色产物）
（4ml 离心管）
1，加样 ①50Mm PBS7.0 1ml
②0.3% H2O 2 1ml
③0.2% 愈创木酚 0.95ml
④酶液（对照PBS ） 50ul 2, 加盖混匀，加样96孔板
3, 室温反应，470nm 处测OD 值，动力学测，10min ，每2min 测一次
4, 以每分钟内OD 值变化0.01为一个酶活力单位U.
5，计算
POD 酶活性= （ΔOD470*VT ）*(0.01*WF *VS *t)-1
ΔOD470——反应时间内吸光值的变化
W F ——样品鲜重（g ）
t ——反应时间（min ）
V T ——提取粗酶液总体积（ml ）
V S ——测定时取用的酶液体积（ml ）
6, 试剂配制
0.3% H2O 2：1ml 30% H2O 2，蒸馏水至 100ml ，避光保存
0.2%愈创木酚：0.2g ，少量乙醇（5ml ）溶解，蒸馏水定容至100ml
200μl ，20ml 95%乙醇，蒸馏水定容100ml
五、超氧化物歧化酶SOD 活性测定
（4ml 体系）
两只对照管，暗处理的离心管提前用锡箔纸包好
1，加样 ①PBS7.8 2.82ml
②13mM Met甲硫氨酸 30ul
③10Mm EDTA 30ul
④6.3Mm NBT 30ul
⑤酶液（对照PBS ） 60ul
⑥核黄素（最后加） 30ul
2，加盖混匀，暗处理的离心管用锡箔纸包好头。一起放在组培室，
25℃，光照。处理20min 。
3，反应结束，暗条件下，快速加样96孔板。
4，放于酶标仪，于560nm 波长，测OD 值
5，计算 以遮光的对照管作为空白，调零。以能抑制反应50%的酶量为1个SOD 酶单位，用U 表示。
SOD活性=(A0-A S )*VT *(0.5*A0*WF *Vs ) -1
A 0——照光对照管的OD 值
A S ——样品管的 OD值
V T ——样品的总体积（ml ）
V s ——测定时样品用量（ml ） W F ——样品的鲜重（g ）
7，试剂配制
0.05mmol/L PBS7.8
13mM 甲硫氨酸：0.194g/100ml；0.485g/250ml；0.97g/500ml；PBS7.8 定容
6.3mM NBT ：0.05256g/10ml；0.5256g/100ml；PBS7.8 定容；避光保存
10mM EDTANa2：0.372g/100ml PBS7.8 定容
130μM 核黄素：0.00499g/100ml，少量稀碱溶解，蒸馏水定容，避光，现用现配
六、抗坏血酸过氧化氢酶APX 活性测定
（4ml 离心管）
1，加样 ①50Mm PBS7.0 2.82ml
②50mM 抗坏血酸 30ul
③10mM EDTA 30ul
④酶液 100ul
2，加盖混匀
3，加 10mM H2O 2 30ul 反应开始 4，加样96孔板
5，放入酶标仪，于290nm 室温下，动力学测，10min ，每2min 测一次
6，以每分钟内OD 值变化0.1为一个酶活力单位U.
7，计算
APX 酶活性= （ΔOD290*VT ）*(0.1*WF *VS *t)-1
ΔOD290——反应时间内吸光值的变化
W F ——样品鲜重（g ）
t ——反应时间（min ）
V T ——提取粗酶液总体积（ml ）
V S ——测定时取用的酶液体积（ml ）
8，试剂配制
50mM 抗坏血酸：0.8805g/100ml，0.2201g/25ml；0.08805g/10ml，现用现配
10mM H2O 2：0.1ml 30% H2O 2，蒸馏水定容至 98ml ，避光保存
七、过氧化氢酶（CAT ）活性测定
（4ml 离心管）
1，加样
①50Mm PBS7.0 2.84ml
②1.5mM H2O 2 30ul
③酶液（对照PBS ） 100ul 2，加盖混匀，加样96孔板
3，放入酶标仪，于240nm 室温下，动力学测，10min ，每2min 测一次
4，以每分钟内OD 值变化0.01为一个酶活力单位U.
5，计算
APX 酶活性= （ΔOD240*VT ）*(0.01*WF *VS *t)-1
ΔOD240——反应时间内吸光值的变化
W F ——样品鲜重（g ）
t ——反应时间（min ）
V T ——提取粗酶液总体积（ml ）
V S ——测定时取用的酶液体积（ml ）
6，试剂配制
1.5M H2O 2：30%的 H2O 2=9.8M ，（注意 H2O 2 在使用过程中不要碰壁） 10ml 30% H2O 2，蒸馏水定容至 65.3m l ，避光保存
八、脂氧合酶LOX 活性测定
(3ml反应体系)
1，加样 ①亚油酸钠溶液 50ul
②Ph=7.0磷酸缓冲液 2.9ml
③酶液（对照PBS ） 50ul 2，加盖混匀，加样96孔板
3，室温25℃反应，234nm 处测OD 值，动力学测，15min ，每3min 测一次
4，以每分钟内OD 值变化1为一个酶活力单位U.
5，计算
LOX 酶活性= （ΔOD234*VT ）*(1*WF *VS *t)-1
ΔOD234——反应时间内吸光值的变化
W F ——样品鲜重（g ）
t ——反应时间（min ）
V T ——提取粗酶液总体积（ml ）
V S ——测定时取用的酶液体积（ml ）
6，试剂配制
亚油酸钠溶液：取50ul 亚油酸加入到溶有0.1mlTween-20的8ml 重蒸馏水中，然后加入190ul 1mol/L氢氧化钠至澄清，定容20ml ，于冰箱中冷藏备用
九、苯丙氨酸解氨酶PAL 活性测定
(6ml体系)
1，加样 ①0.02mol/L苯丙氨酸 1ml
②0.1mol/L PH=8.8硼酸缓冲液 4ml
③酶液（缓冲液对照） 50ul
2，加盖混匀 3，加样96孔板
4，放于酶标仪，于290nm 波长，调温度为30℃，动力学60min ，每个15min 测一次OD 值
5，以每分钟内OD 值变化0.01为一个酶活力单位U.
6，计算
PAL 酶活性= （ΔOD290*VT ）*(0.01*WF *VS *t)-1
ΔOD525——反应时间内吸光值的变化
W F ——样品鲜重（g ）
t ——反应时间（min ）
V T ——提取粗酶液总体积（ml ）
V S ——测定时取用的酶液体积（ml ）
7，试剂配制
0.1mol/L PH=8.8硼酸缓冲液: 取66.67ml 母液A 0.05mol/L硼砂溶液和33.33ml 母液B 0.2mol/L硼酸溶液，混匀，调节PH 至8.8，稀释至200ml
20mmol/L L-苯丙氨酸溶液：称取330mg L-苯丙氨酸，用0.1mol/L硼酸缓冲液溶解定容至100ml
十、多酚氧化酶PPO 活性
(6ml体系)
1，加样 ①0.05mol/L PH=6.06磷酸缓冲液 3.9ml
②0.1mol/L儿茶酚 1.0ml
③酶液（以磷酸缓冲液为对照） 100ul
2，加盖混匀 3，加样96孔板
4，放于酶标仪，于525nm 波长，调温度为37℃，动力学30min ，每个5min 测一次OD 值
5，以每分钟内OD 值变化0.01为一个酶活力单位U.
6，计算 PPO酶活性= （ΔOD525*VT ）*(0.01*WF *VS *t)-1
ΔOD525——反应时间内吸光值的变化
W F ——样品鲜重（g ）
t ——反应时间（min ）
V T ——提取粗酶液总体积（ml ）
V S ——测定时取用的酶液体积（ml ）
7，试剂配制
0.05mol/LPH=6.06磷酸缓冲液:1ml母液 B（0.2M Na 2HPO 4·12H 2O ）+8ml母液 A （0.2M NaH2PO 4·2H 2O ）定容于100ml 容量瓶
0.1mol/L儿茶酚：取2.75275g 儿茶酚，用蒸馏水定容于250ml 容量瓶
个人见解，有所改良。
祝实验顺利！