玉米科学2009，17(3)：142～145文章编号：1005-0906(2009)03-0142-04
JournalofMaizeSciences
单核苷酸多态性检测方法研究概述及其应用
李
摘
琳1，杨德光1，胡正2，王永力1
(1.东北农业大学农学院，哈尔滨150030；2.中国农业科学院作物科学研究所，北京100081)
要：单核苷酸多态性(SNP)作为第3代分子标记有着广阔的应用前景。本文从单核苷酸多态性(SNP)的概
念、分类、特点、检测技术等方面进行了概述，论述了单核苷酸多态性在高密度遗传图谱构建、性状作图、病害关联性标记辅助育种等方面的应用，为单核苷酸多态性的研究提供理论依据。分析、
关键词：单核苷酸多态性；作物；检测技术中图分类号：Q503
文献标识码：A
TheOutlineofDetectionforSingleNucleotidePolymorphism
LILin1,YANGDe-guang1,HUZheng2,WANGYong-li1
(1.AgronomicCollegeofNortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030;
2.InstituteofCropScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciencesBeijing100081,China)
Abstract：Asthethirdmolecularmarkertechnology,singlenucleotidepolymorphism(SNP)hasbeenusedinmanyareasandowningthebrightfuture.Thisthesisintroducedthedefinition,classification,character,themethodofdetectionandtheusingincropof,SNP,discussedtheapplicationofSNPonconstructionofhigh-densitygeneticmap,traitmapping,analysisofdiseaseassociationandmarker-assistedbreeding,gavethetheorybasisforthestudiesinfieldofSNP.
Keyword：SNP;Crop;Detectiontechnology单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，其最少一种等位基因在群体中的频率不少于1%，美国界定此频率为2%。它是继限制性片断长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)、简单重复序列(SimpleSequenceRepeat,SSR)之后的第3代分子遗传标记。
体表现型是无意义的，但对群体而言，这些SNP作为遗传标记在群体遗传和生物进化中却有很大作
用。cSNP对生物遗传性状影响可分为两类：一是同义cSNP(SynonymouscSNP)，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质；二是非同义cSNP(Non-synonymouscSNP)，即SNP所致的编码序列的改变可使以其为模版翻译的蛋白质序列改变，从而影响蛋白质功能。
1单核苷酸多态性分类
SNP在基因组内按其分布可分为两类：一类是
2
2.1
单核苷酸多态性特点
SNP分布广泛，多态性丰富
SNP位点在人类基因组中约有320万个，平均
分布在基因编码区(codingregion)的功能性突变，又
称为cSNP；一类是处于非编码区的大量单碱基突变。大多数SNP位于基因组的非编码区，它们对个
每千个核苷酸就有一个以上的SNP；其他哺乳类动物中SNP的频率为500～1000个碱基出现1次；植
物中玉米1号染色体中每104个碱基就出现1个
收稿日期：2008-04-10
基金项目：东北农业大学博士基金、黑龙江省博士后落户基金作者简介：李
琳(1983-)，女，在读硕士，从事作物生理和生物技术研究。Tel：010-62186654Email：[email protected]杨德光为本文通讯作者。E-mail：[email protected]
SNP；水稻第4号染色体每隔250bp左右就有一个
SNP，小麦编码序列中SNP的频率为540个碱基出现1次。NCBIdbSNP最新数据，已有超过486万的SNP位点被发现。这些SNP在整个基因组上的分布十分广泛，其中非编码区的SNP要大大多过编码区
3期李琳等：单核苷酸多态性检测方法研究概述及其应用143
的SNP，其功能的探索具有重大意义。2.2
易于实现自动化分析
SNP通常被称为二等位基因，因此在检测时只需纪录全或无(+或-)，无需像检测微卫星标记那样对片段长度做出测量。2.3
具有稳定的遗传特性
大多数SNP来源于物种形成之后、种群出现之前，每一代中每一核苷酸的变异频率极低(10-8)以及剪辑变化的随机性使单碱基等位基因十分稳定，尤其是编码区的SNP。
SNP也存在缺点，由于通常是二等位基因，一个SNP的信息量是有限的，特别是其中一个位点出现的频率较低时更是如此。但其高密度和稳定遗传的特性弥补了信息量的不足。
3单核苷酸多态性检测技术
SNP检测技术按研究对象主要分为两大类：①
对未知SNP进行分析，即找寻未知的SNP或确定某一未知SNP与某性状的关系；
②对已知SNP进行分析，即对不同物种SNP遗传多样性检测。在实际应用中许多检测未知SNP的方法也可用来对已知SNP进行检测，而对已知SNP检测的方法也可用于对未知SNP的粗筛。按其检测技术原理则分为基于构象的方法、酶切及PCR技术、基于杂交技术、直接测序等。3.1
未知单核苷酸突变位点的检测技术
3.1.1基于构象的方法
单链构象多态性(Single-StrandConformationalPolymorphism,SSCP)、
变性梯度凝胶电泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis,DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TempretureGradientGel-Electrophoresis,TGGE)、变性的高效液相色谱法(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography,DHPLC)都是基于构象分析的方法。Martins-lopes等使用MDETM凝胶通过SSCP检测小麦单碱基突变，分辨率很高。Schwaab等发现SSCP检测效率低于变形梯度凝胶电泳(DGGE)和化学错配切割法(CMC)。陆小军等用DGGE方法检测白血病患者白细胞线粒体DNAD-loop区的碱基突变，以DNA序列分析作为对照，其碱基突变特异度达100%，灵敏度为97.1%。3.1.2毛细管电泳
毛细管电泳技术(CapillaryElectroresis,CE)是近年来发展起来的一种高效快速分离、分析技术，泛指在散热效率高的20～100μm的细管内，在筛分机制(有或无凝胶)和高强度电场的双重作用下，DNA片段因离子表面积和分子外形的变异导致的迁移时间不同而检测SNP。该方法主要是和其他检测技术如DGGE、SSCP等相结合，用毛细管电泳代替传统的琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳。此法可同时处理多个样品，相对减少操作时间及工作量，而且适合于自动化的要求。3.1.3基因芯片技术
基因芯片(Genechip)是指在面积不大的基片表面有序地固定大量的基因探针(Geneprobe)形成的DNA微阵列。芯片上每一特定位置的核苷酸序列都是已知的，杂交后根据各点产生的荧光信号强弱，利用激光共聚焦扫描和电荷耦合器(CCD)成像等方法对杂交结果进行检测。该方法具有简单、迅速、自动化程度高的优点，其应用成本高和技术上的高要求使之不能迅速普及，但前景可观。
直接测序法是最直接的SNP检测方法，其检出率可达100%且可以得到SNP的类型及其准确位置等。
PE公司已推出DNA自动测序仪，但是对一些较大的、外显子较多的基因不宜使用。SNPshotGeneS-can(minisequencing)也是利用测序仪GeneScan的功能检测SNP，但比测序更方便、省时。质谱法(MassSpectrums)是根据反应产物的分子量直接进行检测的方法，不需任何标记。单碱基延伸技术或其修饰形式与MALDI-TOF质谱分析(Matrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry)结合已广泛用于SNP研究中，GOOD分析方法及其改进后的简便GOOD分析方法也都取得了很好的结果。近年来，根据SNP在表达序列标签中的分布比其他基因组多，应用相关软件对DNA进行序列变异监测的方法也应用较广。3.2对已知单核苷酸突变位点的检测技术3.2.1
限制性片段长度多态性分析(RestrictionFrag-mentLengthPolymorphism,RFLP)
RFLP是较经典、
常用的技术，具有共显性、设备要求不高等特点，其先决条件是该SNP位点的两侧需含有限制性内切酶识别序列，而相隔很近并同时发生的点突变使此方法难以完成，引入酶切位点可使此方法得到广泛应用。
3.2.2等位基因特异性PCR(AS-PCR)
AS-PCR技术主要是依赖引物的设计及优化PCR反应条件，根据基因SNP位点设计引物，使引物最后一个碱基与突变位点互补，使得只有完全互补的序列才能扩增，因此只需根据PCR产物的有无来判定结果。
陈慧发现错配的3’末端仍可以低于正
144玉米常配对末端的速度延伸，干扰判定结果。改进的方法是在引物人为引入错配碱基、降低3’末端特异性碱基不匹配的扩增产物，不影响或较小影响完全匹配的特异性产物的生成。引入长度差异性引物和双向等位特异PCR是近年来常用的方法。
TaqMam技术与分子信标(MolecularBeacons)都是在荧光能量转移(FluorescenceResornanceEnergyTransfer,FRET)基础上建立起来的，利用荧光标记及仪器达到检测目的。焦磷酸测序(Pyrosequencing)则是利用测序过程中可释放的焦磷酸和酶类产生荧光，是不依赖平板胶或毛细管电泳、不依赖DNA的荧光标记技术，很可能成为未来的主流技术。Po-lakova等就利用Pyrosequencing检测79个大麦品种的β-淀粉酶的cSNP,发现了第5个β-淀粉酶等位基因。
4
单核苷酸多态性的应用
4.1
构建高密度图谱
SNP在同一位点上的双等位基因特异性及其在
基因组中分布的丰富性，使之能提供大量的信息用于建立遗传图谱。在玉米中，保守估计可获得2千万个以上的SNP供分析；在水稻中，
SNP最高数量可达80127个，平均每154个碱基就存在1个SNP；在小麦中发现、
收集与鉴定的SNP已经构成了较大的序列变异数据库；拟南芥全基因组的SNP定位图谱已建立；玉米B73×Mo17随机交配4次的群体，也通过SNP进行EST作图。随着SNP标记的不断发现和定位，将提供丰富的遗传信息和品种资源鉴定信息。4.2
用于辅助选择
瑞士利用SNP开发了基于PCR的标记，用于大麦家系叶锈病抗病性状的标记辅助选择，在供试的12个家系中，11个选择出来的抗叶锈病家系含有抗病基因Rph7。BurenMvon用SNP对小麦r醇溶蛋白基因进行了研究。Schwarz等在Glu-D1基因座的HMW麦谷蛋白X-型等位基因启动子序列间标记了一个SNP；在水稻中SNP使mRNA加工前的多位点剪辑发生变化，降低颗粒结合淀粉合成酶的高效性，进而影响直链淀粉的合成。4.3
SNP与生物性状的相关性研究
生物体大多数表型差异是在遗传因素和非遗传因素作用下形成的自身变异的结果，其遗传因素主要在于单个碱基差异的存在。SNP标记的发现与丰富使遗传学家能够更准确而快速地进行生物体基因
科学17卷
型和表现型的相关性和遗传特点的研究，最终确定某一性状差异的特征位点，为作物改良与筛选提供便利。2006年，Sattarzadeh等以SNP为基础发展了一种诊断抗根结线虫土豆品种的方法，通过对大量抗性品种与敏感品种的比较分析，他们认为SNP是研究生物性状差异的可靠手段。郝岗平等通过研究拟南芥CBF4基因的单核苷酸多态性变化，揭示了不同生态型间抗旱表型的差异与SNP的相关性。
5结论与讨论
SNP有多种检测方法，但各种方法适用类型及
实验条件各有利弊，应根据各方条件选择合适的方法，也可几种方法综合使用，以期达到最佳效果。目前的SNP检测方法总体还是速度较慢、成本较高，急需发展一种快速、高通量、简单易行的检测方法。SNP的发现、检测只是良好的开端，确定其功能并将其应用到实际生产和生活中才是最终目的，所以特定DNA区域的特定SNP在特定群体中的序列验证和频率分析以及SNP与特定生理、
病理状态的关系将是研究的重点。SNP检测与分析也存在着诸如专利问题、多学科之间难以融合、各方面科研人员疏于合作等问题有待于发展和完善，但其对于基因组的理论价值和应用价值已经引起人们的普遍关注。作物单核苷酸多态性的研究仍属于起步阶段，仅在水稻、小麦、大豆、西红柿、黑麦等重要的农作物和模式植物拟南芥中有少量报道，且仅针对单个基因进行了研究，今后作物单核苷酸多态性研究将成为SNP发展与应用的主要方面。
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(责任编辑：尹航)
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李
摘
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关键词：单核苷酸多态性；作物；检测技术中图分类号：Q503
文献标识码：A
TheOutlineofDetectionforSingleNucleotidePolymorphism
LILin1,YANGDe-guang1,HUZheng2,WANGYong-li1
(1.AgronomicCollegeofNortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030;
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Keyword：SNP;Crop;Detectiontechnology单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，其最少一种等位基因在群体中的频率不少于1%，美国界定此频率为2%。它是继限制性片断长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)、简单重复序列(SimpleSequenceRepeat,SSR)之后的第3代分子遗传标记。
体表现型是无意义的，但对群体而言，这些SNP作为遗传标记在群体遗传和生物进化中却有很大作
用。cSNP对生物遗传性状影响可分为两类：一是同义cSNP(SynonymouscSNP)，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质；二是非同义cSNP(Non-synonymouscSNP)，即SNP所致的编码序列的改变可使以其为模版翻译的蛋白质序列改变，从而影响蛋白质功能。
1单核苷酸多态性分类
SNP在基因组内按其分布可分为两类：一类是
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2.1
单核苷酸多态性特点
SNP分布广泛，多态性丰富
SNP位点在人类基因组中约有320万个，平均
分布在基因编码区(codingregion)的功能性突变，又
称为cSNP；一类是处于非编码区的大量单碱基突变。大多数SNP位于基因组的非编码区，它们对个
每千个核苷酸就有一个以上的SNP；其他哺乳类动物中SNP的频率为500～1000个碱基出现1次；植
物中玉米1号染色体中每104个碱基就出现1个
收稿日期：2008-04-10
基金项目：东北农业大学博士基金、黑龙江省博士后落户基金作者简介：李
琳(1983-)，女，在读硕士，从事作物生理和生物技术研究。Tel：010-62186654Email：[email protected]杨德光为本文通讯作者。E-mail：[email protected]
SNP；水稻第4号染色体每隔250bp左右就有一个
SNP，小麦编码序列中SNP的频率为540个碱基出现1次。NCBIdbSNP最新数据，已有超过486万的SNP位点被发现。这些SNP在整个基因组上的分布十分广泛，其中非编码区的SNP要大大多过编码区
3期李琳等：单核苷酸多态性检测方法研究概述及其应用143
的SNP，其功能的探索具有重大意义。2.2
易于实现自动化分析
SNP通常被称为二等位基因，因此在检测时只需纪录全或无(+或-)，无需像检测微卫星标记那样对片段长度做出测量。2.3
具有稳定的遗传特性
大多数SNP来源于物种形成之后、种群出现之前，每一代中每一核苷酸的变异频率极低(10-8)以及剪辑变化的随机性使单碱基等位基因十分稳定，尤其是编码区的SNP。
SNP也存在缺点，由于通常是二等位基因，一个SNP的信息量是有限的，特别是其中一个位点出现的频率较低时更是如此。但其高密度和稳定遗传的特性弥补了信息量的不足。
3单核苷酸多态性检测技术
SNP检测技术按研究对象主要分为两大类：①
对未知SNP进行分析，即找寻未知的SNP或确定某一未知SNP与某性状的关系；
②对已知SNP进行分析，即对不同物种SNP遗传多样性检测。在实际应用中许多检测未知SNP的方法也可用来对已知SNP进行检测，而对已知SNP检测的方法也可用于对未知SNP的粗筛。按其检测技术原理则分为基于构象的方法、酶切及PCR技术、基于杂交技术、直接测序等。3.1
未知单核苷酸突变位点的检测技术
3.1.1基于构象的方法
单链构象多态性(Single-StrandConformationalPolymorphism,SSCP)、
变性梯度凝胶电泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis,DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TempretureGradientGel-Electrophoresis,TGGE)、变性的高效液相色谱法(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography,DHPLC)都是基于构象分析的方法。Martins-lopes等使用MDETM凝胶通过SSCP检测小麦单碱基突变，分辨率很高。Schwaab等发现SSCP检测效率低于变形梯度凝胶电泳(DGGE)和化学错配切割法(CMC)。陆小军等用DGGE方法检测白血病患者白细胞线粒体DNAD-loop区的碱基突变，以DNA序列分析作为对照，其碱基突变特异度达100%，灵敏度为97.1%。3.1.2毛细管电泳
毛细管电泳技术(CapillaryElectroresis,CE)是近年来发展起来的一种高效快速分离、分析技术，泛指在散热效率高的20～100μm的细管内，在筛分机制(有或无凝胶)和高强度电场的双重作用下，DNA片段因离子表面积和分子外形的变异导致的迁移时间不同而检测SNP。该方法主要是和其他检测技术如DGGE、SSCP等相结合，用毛细管电泳代替传统的琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳。此法可同时处理多个样品，相对减少操作时间及工作量，而且适合于自动化的要求。3.1.3基因芯片技术
基因芯片(Genechip)是指在面积不大的基片表面有序地固定大量的基因探针(Geneprobe)形成的DNA微阵列。芯片上每一特定位置的核苷酸序列都是已知的，杂交后根据各点产生的荧光信号强弱，利用激光共聚焦扫描和电荷耦合器(CCD)成像等方法对杂交结果进行检测。该方法具有简单、迅速、自动化程度高的优点，其应用成本高和技术上的高要求使之不能迅速普及，但前景可观。
直接测序法是最直接的SNP检测方法，其检出率可达100%且可以得到SNP的类型及其准确位置等。
PE公司已推出DNA自动测序仪，但是对一些较大的、外显子较多的基因不宜使用。SNPshotGeneS-can(minisequencing)也是利用测序仪GeneScan的功能检测SNP，但比测序更方便、省时。质谱法(MassSpectrums)是根据反应产物的分子量直接进行检测的方法，不需任何标记。单碱基延伸技术或其修饰形式与MALDI-TOF质谱分析(Matrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry)结合已广泛用于SNP研究中，GOOD分析方法及其改进后的简便GOOD分析方法也都取得了很好的结果。近年来，根据SNP在表达序列标签中的分布比其他基因组多，应用相关软件对DNA进行序列变异监测的方法也应用较广。3.2对已知单核苷酸突变位点的检测技术3.2.1
限制性片段长度多态性分析(RestrictionFrag-mentLengthPolymorphism,RFLP)
RFLP是较经典、
常用的技术，具有共显性、设备要求不高等特点，其先决条件是该SNP位点的两侧需含有限制性内切酶识别序列，而相隔很近并同时发生的点突变使此方法难以完成，引入酶切位点可使此方法得到广泛应用。
3.2.2等位基因特异性PCR(AS-PCR)
AS-PCR技术主要是依赖引物的设计及优化PCR反应条件，根据基因SNP位点设计引物，使引物最后一个碱基与突变位点互补，使得只有完全互补的序列才能扩增，因此只需根据PCR产物的有无来判定结果。
陈慧发现错配的3’末端仍可以低于正
144玉米常配对末端的速度延伸，干扰判定结果。改进的方法是在引物人为引入错配碱基、降低3’末端特异性碱基不匹配的扩增产物，不影响或较小影响完全匹配的特异性产物的生成。引入长度差异性引物和双向等位特异PCR是近年来常用的方法。
TaqMam技术与分子信标(MolecularBeacons)都是在荧光能量转移(FluorescenceResornanceEnergyTransfer,FRET)基础上建立起来的，利用荧光标记及仪器达到检测目的。焦磷酸测序(Pyrosequencing)则是利用测序过程中可释放的焦磷酸和酶类产生荧光，是不依赖平板胶或毛细管电泳、不依赖DNA的荧光标记技术，很可能成为未来的主流技术。Po-lakova等就利用Pyrosequencing检测79个大麦品种的β-淀粉酶的cSNP,发现了第5个β-淀粉酶等位基因。
4
单核苷酸多态性的应用
4.1
构建高密度图谱
SNP在同一位点上的双等位基因特异性及其在
基因组中分布的丰富性，使之能提供大量的信息用于建立遗传图谱。在玉米中，保守估计可获得2千万个以上的SNP供分析；在水稻中，
SNP最高数量可达80127个，平均每154个碱基就存在1个SNP；在小麦中发现、
收集与鉴定的SNP已经构成了较大的序列变异数据库；拟南芥全基因组的SNP定位图谱已建立；玉米B73×Mo17随机交配4次的群体，也通过SNP进行EST作图。随着SNP标记的不断发现和定位，将提供丰富的遗传信息和品种资源鉴定信息。4.2
用于辅助选择
瑞士利用SNP开发了基于PCR的标记，用于大麦家系叶锈病抗病性状的标记辅助选择，在供试的12个家系中，11个选择出来的抗叶锈病家系含有抗病基因Rph7。BurenMvon用SNP对小麦r醇溶蛋白基因进行了研究。Schwarz等在Glu-D1基因座的HMW麦谷蛋白X-型等位基因启动子序列间标记了一个SNP；在水稻中SNP使mRNA加工前的多位点剪辑发生变化，降低颗粒结合淀粉合成酶的高效性，进而影响直链淀粉的合成。4.3
SNP与生物性状的相关性研究
生物体大多数表型差异是在遗传因素和非遗传因素作用下形成的自身变异的结果，其遗传因素主要在于单个碱基差异的存在。SNP标记的发现与丰富使遗传学家能够更准确而快速地进行生物体基因
科学17卷
型和表现型的相关性和遗传特点的研究，最终确定某一性状差异的特征位点，为作物改良与筛选提供便利。2006年，Sattarzadeh等以SNP为基础发展了一种诊断抗根结线虫土豆品种的方法，通过对大量抗性品种与敏感品种的比较分析，他们认为SNP是研究生物性状差异的可靠手段。郝岗平等通过研究拟南芥CBF4基因的单核苷酸多态性变化，揭示了不同生态型间抗旱表型的差异与SNP的相关性。
5结论与讨论
SNP有多种检测方法，但各种方法适用类型及
实验条件各有利弊，应根据各方条件选择合适的方法，也可几种方法综合使用，以期达到最佳效果。目前的SNP检测方法总体还是速度较慢、成本较高，急需发展一种快速、高通量、简单易行的检测方法。SNP的发现、检测只是良好的开端，确定其功能并将其应用到实际生产和生活中才是最终目的，所以特定DNA区域的特定SNP在特定群体中的序列验证和频率分析以及SNP与特定生理、
病理状态的关系将是研究的重点。SNP检测与分析也存在着诸如专利问题、多学科之间难以融合、各方面科研人员疏于合作等问题有待于发展和完善，但其对于基因组的理论价值和应用价值已经引起人们的普遍关注。作物单核苷酸多态性的研究仍属于起步阶段，仅在水稻、小麦、大豆、西红柿、黑麦等重要的农作物和模式植物拟南芥中有少量报道，且仅针对单个基因进行了研究，今后作物单核苷酸多态性研究将成为SNP发展与应用的主要方面。
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