暨南大学本科实验报告专用纸
课程名称 酶与酶工程实验 成绩评定
实验项目名称 从植物材料中提取过氧化氢酶 指导教师 李任强 实验项目编号 实验项目类型 实验地点 学生姓名 郑子豪 学号 2010052045
学院 生命科学技术学院 系 生物工程学 专业 生物技术 实验时间2012年 9 月 20 日下 午~ 9 月27 日 下 午 温度 25 ℃湿度
一 实验目的
1.1 学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法。 1.2 了解纯化酶的一些基本步骤。 1.3 掌握酶含量与活性测定的方法。
二 实验原理
过氧化物酶是一类以铁卟啉环为辅基的氧化酶，可溶于水，溶解度约为5％（w/v)，溶液棕色透明，许多植物如辣根、柑橘叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，由于该酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸溶液，而在0.62饱和度以上则不溶，可由此对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化、得到较纯的制品。过氧化物酶能催化愈创木酚瓜产生有色物质，以此可用分光光度计测其含量及活性，对实验结果进行检测。
三 实验器材 3.1材料：新鲜柑橘叶
3.2试剂：愈创木酚、0.2mol/l磷酸缓冲液、0.004％过氧化氢、硫酸铵 3.3仪器：高速组织捣碎机、冰箱、紫外可见分光光度计、离心机
四 实验步骤 4.1粗酶提取液的制备
取新鲜柑橘叶剪碎后用捣碎机捣烂（加少许纯净水使总体积少于200ml), 转移到500ml 烧杯中（冰浴）加水至200ml ，于冰箱中浸提约1小时（中间多次搅动）。 4.2第一次盐析纯化
上述样品经多层纱布挤压过滤后以4000r/min离心15min ，10ml 上清液用来测酶活力，其余上清液测体积后按226g/l加硫酸铵盐析，冰箱中静置半小时以上。 4.3第二次盐析纯化
以上上清液以4000r/min离心15min 后去沉淀，再按258g/l加硫酸铵盐析，冰箱中静置。 4.4透析去盐
离心收集沉淀，用水溶解至约10ml ，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测活力，其余酶液用作精制样品。
暨南大学本科实验报告专用纸（附页）
4.5第一次丙酮纯化
在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷（-15℃）的丙酮于酶液中，混匀，静置10min ，低温离心（8000r/min,4℃) 去沉淀。 4.6第二次丙酮纯化
按上清液与丙酮之比为1: 0.8 ，再次加入预冷丙酮，静置10min 后离心（8000r/min,4℃), 收集沉淀，溶于少量水中。 4.7透析去丙酮
将上述样液透析去丙酮，然后测定其酶活力，最后冷冻干燥酶液得较纯的酶制品。 4.8酶活性测定方法
按下表于试管中加入试剂（ml):
在37℃保温10min ，管1作为对照在时间扫描470nm 调好零点，混合管2与3，即倒入比色杯中进行470nm 的时间扫描，读取30s 或60s 时（直线部分）的OD 值，测定OD 280和OD 260，计算出蛋白含量。 以OD 470/毫克蛋白质×分表示酶比活和以OD 470/克鲜重×分表示酶活性。
五 数据处理 5.1 数据记录
5.1.1 新鲜柑橘叶 30.11 g , 得到粗酶提取液V= 225.00 ml 5.1.2 第一次盐析中，除去10 ml用于测活后： 实际加入硫酸铵 48.59 g 5.1.3 第二次盐析中，上清液V= 242.00 ml 实际加入硫酸铵 62.43 g
5.1.4 沉淀经溶解透析后为 11.00 ml,其中 1.00 ml用于测活，其余经丙酮沉淀纯化： 第一次丙酮沉淀：样品V= 10.00 ml 丙酮V ’= 10.00 ml 第二次丙酮沉淀：样品V= 17.30 ml 丙酮V ’= 13.84 ml 最后沉淀溶于2.50 ml水中 5.1.5 酶活性和酶含量测定结果：
5.2 数据计算与分析
5.2.1 数据计算. 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A 280和A 260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度, 蛋白质浓度=1.45×A 280－0.74×A 260 (mg/ml)。而蛋白质含量(mg/ml)= 蛋白质浓度×稀释倍数。而酶的比活=OD470/(毫克蛋白质×min) ,克鲜重=新鲜柑橘叶质量/粗酶提取液V ,活性= OD470/(克鲜重×min) 。 经计算:
总纯化倍数=纯化后酶比活/粗酶酶比活=46.62/0.2706=172.28, 总活性回收率=纯化后酶活性/粗酶酶活性=11.52/84.77=0.1359。
5.2.2 结果分析.
经实验证明, 本次提取的酶具有活性. 而本实验的纯化倍数达172.28倍, 纯化效果良好. 而总活性回收率为0.1359, 酶活性下降说明在操作过程中有大部分的酶损失或失活, 而这些损失或失活有可能是在离心或盐析的过程中造成的. 另一方面, 本实验是通过使用紫外分光光度计来测定酶和蛋白质的浓度的, 随着纯化和浓缩的进行, 样品中的杂蛋白也在不断被除去, 这也是导致溶液OD 值大幅降低的重要原因, 同时它也在酶活性下降的结果中体现出来。
通过实验的结果来比较盐析和丙酮沉淀的纯化效果, 不难看出, 丙酮沉淀法的纯化效果更好, 但其活性回收率则比盐析法要低, 说明两种方法的优点各异, 若要得到纯度高的酶制剂, 则应选用丙酮沉淀法提纯; 而若要得到活性高的酶制剂, 则应选用硫酸铵等盐进行分段盐析。
六 思考题
6.1纯化前后酶比活的变化说明了什么?
答:纯化后酶比活的提高说明单位质量的酶蛋白在一分钟内使OD470增大的能力提高了, 也就说明了纯化后的酶制剂的纯度更高。单位质量酶制剂的酶浓度提高了, 酶制剂的效价就提高了。
6.2 纯化前后酶活性(OD470/克鲜重×min) 的变化又说明什么? 这些数据有何意义?
答:纯化后酶活性在不断下降, 说明纯化的过程中大部分杂蛋白都被除去了, 而酶也有部分被除去或在纯化过程中失活, 从而使0D260和0D280下降. 这些数据的意义在于, 显示一次纯化过程的效果, 即杂蛋白去除效果和活性酶的保留效果。
暨南大学本科实验报告专用纸
课程名称 酶与酶工程实验 成绩评定
实验项目名称 从植物材料中提取过氧化氢酶 指导教师 李任强 实验项目编号 实验项目类型 实验地点 学生姓名 郑子豪 学号 2010052045
学院 生命科学技术学院 系 生物工程学 专业 生物技术 实验时间2012年 9 月 20 日下 午~ 9 月27 日 下 午 温度 25 ℃湿度
一 实验目的
1.1 学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法。 1.2 了解纯化酶的一些基本步骤。 1.3 掌握酶含量与活性测定的方法。
二 实验原理
过氧化物酶是一类以铁卟啉环为辅基的氧化酶，可溶于水，溶解度约为5％（w/v)，溶液棕色透明，许多植物如辣根、柑橘叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，由于该酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸溶液，而在0.62饱和度以上则不溶，可由此对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化、得到较纯的制品。过氧化物酶能催化愈创木酚瓜产生有色物质，以此可用分光光度计测其含量及活性，对实验结果进行检测。
三 实验器材 3.1材料：新鲜柑橘叶
3.2试剂：愈创木酚、0.2mol/l磷酸缓冲液、0.004％过氧化氢、硫酸铵 3.3仪器：高速组织捣碎机、冰箱、紫外可见分光光度计、离心机
四 实验步骤 4.1粗酶提取液的制备
取新鲜柑橘叶剪碎后用捣碎机捣烂（加少许纯净水使总体积少于200ml), 转移到500ml 烧杯中（冰浴）加水至200ml ，于冰箱中浸提约1小时（中间多次搅动）。 4.2第一次盐析纯化
上述样品经多层纱布挤压过滤后以4000r/min离心15min ，10ml 上清液用来测酶活力，其余上清液测体积后按226g/l加硫酸铵盐析，冰箱中静置半小时以上。 4.3第二次盐析纯化
以上上清液以4000r/min离心15min 后去沉淀，再按258g/l加硫酸铵盐析，冰箱中静置。 4.4透析去盐
离心收集沉淀，用水溶解至约10ml ，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测活力，其余酶液用作精制样品。
暨南大学本科实验报告专用纸（附页）
4.5第一次丙酮纯化
在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷（-15℃）的丙酮于酶液中，混匀，静置10min ，低温离心（8000r/min,4℃) 去沉淀。 4.6第二次丙酮纯化
按上清液与丙酮之比为1: 0.8 ，再次加入预冷丙酮，静置10min 后离心（8000r/min,4℃), 收集沉淀，溶于少量水中。 4.7透析去丙酮
将上述样液透析去丙酮，然后测定其酶活力，最后冷冻干燥酶液得较纯的酶制品。 4.8酶活性测定方法
按下表于试管中加入试剂（ml):
在37℃保温10min ，管1作为对照在时间扫描470nm 调好零点，混合管2与3，即倒入比色杯中进行470nm 的时间扫描，读取30s 或60s 时（直线部分）的OD 值，测定OD 280和OD 260，计算出蛋白含量。 以OD 470/毫克蛋白质×分表示酶比活和以OD 470/克鲜重×分表示酶活性。
五 数据处理 5.1 数据记录
5.1.1 新鲜柑橘叶 30.11 g , 得到粗酶提取液V= 225.00 ml 5.1.2 第一次盐析中，除去10 ml用于测活后： 实际加入硫酸铵 48.59 g 5.1.3 第二次盐析中，上清液V= 242.00 ml 实际加入硫酸铵 62.43 g
5.1.4 沉淀经溶解透析后为 11.00 ml,其中 1.00 ml用于测活，其余经丙酮沉淀纯化： 第一次丙酮沉淀：样品V= 10.00 ml 丙酮V ’= 10.00 ml 第二次丙酮沉淀：样品V= 17.30 ml 丙酮V ’= 13.84 ml 最后沉淀溶于2.50 ml水中 5.1.5 酶活性和酶含量测定结果：
5.2 数据计算与分析
5.2.1 数据计算. 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A 280和A 260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度, 蛋白质浓度=1.45×A 280－0.74×A 260 (mg/ml)。而蛋白质含量(mg/ml)= 蛋白质浓度×稀释倍数。而酶的比活=OD470/(毫克蛋白质×min) ,克鲜重=新鲜柑橘叶质量/粗酶提取液V ,活性= OD470/(克鲜重×min) 。 经计算:
总纯化倍数=纯化后酶比活/粗酶酶比活=46.62/0.2706=172.28, 总活性回收率=纯化后酶活性/粗酶酶活性=11.52/84.77=0.1359。
5.2.2 结果分析.
经实验证明, 本次提取的酶具有活性. 而本实验的纯化倍数达172.28倍, 纯化效果良好. 而总活性回收率为0.1359, 酶活性下降说明在操作过程中有大部分的酶损失或失活, 而这些损失或失活有可能是在离心或盐析的过程中造成的. 另一方面, 本实验是通过使用紫外分光光度计来测定酶和蛋白质的浓度的, 随着纯化和浓缩的进行, 样品中的杂蛋白也在不断被除去, 这也是导致溶液OD 值大幅降低的重要原因, 同时它也在酶活性下降的结果中体现出来。
通过实验的结果来比较盐析和丙酮沉淀的纯化效果, 不难看出, 丙酮沉淀法的纯化效果更好, 但其活性回收率则比盐析法要低, 说明两种方法的优点各异, 若要得到纯度高的酶制剂, 则应选用丙酮沉淀法提纯; 而若要得到活性高的酶制剂, 则应选用硫酸铵等盐进行分段盐析。
六 思考题
6.1纯化前后酶比活的变化说明了什么?
答:纯化后酶比活的提高说明单位质量的酶蛋白在一分钟内使OD470增大的能力提高了, 也就说明了纯化后的酶制剂的纯度更高。单位质量酶制剂的酶浓度提高了, 酶制剂的效价就提高了。
6.2 纯化前后酶活性(OD470/克鲜重×min) 的变化又说明什么? 这些数据有何意义?
答:纯化后酶活性在不断下降, 说明纯化的过程中大部分杂蛋白都被除去了, 而酶也有部分被除去或在纯化过程中失活, 从而使0D260和0D280下降. 这些数据的意义在于, 显示一次纯化过程的效果, 即杂蛋白去除效果和活性酶的保留效果。