细菌质粒复制的控制机制

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．３Ｍａｙ，２００７

文章编号：１００９－０００２（２００７）０３－０４９７－０４

生物技术通讯

４９７

综述

细菌质粒复制的控制机制

赵月峨，朱舜亚综述；马永平审校

军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京１０００７１［摘要］

通过分析细菌中质粒的存在状态和调控机制的相关研究进展，为研究细菌致病机理、机体免疫防护机制，分析确

定菌株的标识基因和标识分子，以及研究质粒表达调控分子机理提供思路，进而为应用基因工程手段构建筛选新的表达载体、研究新型疫苗候选株提供理论基础。［关键词］

质粒；复制；调控机制

［中图分类号］

Ｑ７８［文献标识码］Ａ

ＣｏｎｔｒｏｌＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＢａｃｔｅｒｉａｌＰｌａｓｍｉｄＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ

ＺＨＡＯＹｕｅ－ｅ，ＺＨＵＳｈｕｎ－ｙａ，ＭＡＹｏｎｇ－ｐｉｎｇ

ＩｎｓｉｔｉｔｕｅｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰａｔｈｏｇｅｎａｎｄＢｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００７１，Ｃｈｉｎａ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］

Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅａｕｔｈｏｒａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｒｅｌａｔｉｎｇｔｏｔｈｅｅｘｉｓｔｅｎｃｅｓｔａｔｅａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ

ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｄａｖｉａｂｌｅｗａｙｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｎｏｓｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａ，

Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，

ｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ

ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐｌａｓｉｍｄｉｎｂａｃｔｅｒｉａ，

ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅｏｒｇａｎｉｓｍ，ａｎｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｔａｇｇｅｎｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌｅｏｆｐａｒｔｉｃｕｌａｒｂａｃｔｅｒｉａｓｔｒａｉｎ，ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｐｌａｓｉｍｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］

ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｃａｎｂｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｎｅｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｃａｒｒｉｅｒａｎｄｆｉｎｄｎｅｗｖａｃｃｉｎｅｃａｎｄｉｄａｔｅｓｔｒａｉｎｂｙｍｅａｎｓｏｆｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．

ｐｌａｓｍｉｄR ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎR ｃｏｎｔｒｏｌｍｅｃｈａｎｉｓｍ

表达，以评估其胞内浓度的改变会对ｏｒｉ浓度和细胞生理产生何种影响。在许多（但不是全部）情况下，Ｒｅｐ蛋白和重复子一样，对复制具有双向调控作用，且视它们的胞内浓度而定，当胞内浓度低时起复制激活剂作用，胞内浓度高时则起抑制剂作用。

基于上述实验结果，先后提出了２个含重复子质粒的复制控制模型，即滴定模型（ｔｉｔｒａｔｉｏｎｍｏｄｅｌ）和空间位阻模型（ｓｔｅｒｉｃ

质粒是细菌中能自主复制的染色体外遗传成分。它们能为宿主提供一些额外的功能，如抗药性和毒力等。为与宿主稳定地共存并把代谢负担减至最低，质粒必须控制自身的复制。在一定的生长条件下、在一定的宿主菌中，某一质粒的拷贝数（Ｎ）通常是一定的。对质粒是如何控制自身的复制已进行了大量研究［１－４］。

Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ等提出的负调控模型认为，一个质粒刚移入新宿主时，

负调节因子的浓度可忽略不计，质粒能在短时间内达到正常拷贝数，然后通过增加或减少每细胞周期每质粒拷贝的复制率来调节细胞中的质粒拷贝数，使该菌群体中各细胞的质粒拷贝数维持在平均值Ｎａｖ附近的一个很小的波动范围内。进一步的研究表明，上述控制机制是通过质粒自编码的负控制系统调控复制起始而实现的，其负调控作用的控制元件就编码在质粒上。

依所用负控制元件的类型不同，质粒复制的控制系统主要有重复子控制和反义ＲＮＡ控制２大类，后者又包括反义ＲＮＡ单独控制和反义ＲＮＡ与转录阻遏蛋白共同控制２类。我们拟对这３类控制元件及其控制机理做一简要介绍。

ｈｉｎｄｒａｎｃｅｍｏｄｅｌ）。滴定模型认为，Ｒｅｐ蛋白是复制起始的限速因

子，重复子能滴定Ｒｅｐ蛋白，从而限制复制起始的频率。后来发现大多数含重复子质粒的Ｒｅｐ蛋白均具有自阻遏作用，且在

Ｒ６Ｋ和ＲＫ２等系统中，胞内Ｒｅｐ蛋白的量大大超过了与重复子

饱和结合的需要。对于这些现象，滴定模型不能给出合理的解释。而空间位阻模型认为，决定质粒复制率的主要因素是重复子的浓度而不是Ｒｅｐ蛋白的表达水平。当质粒拷贝数较低时，Ｒｅｐ蛋白与重复子结合并饱和，促发复制起始；随着质粒拷贝数的增加，结合于某一起点重复子的Ｒｅｐ分子，开始与结合于另一起点重复子的Ｒｅｐ分子相互作用，并通过Ｒｅｐ－Ｒｅｐ相互作用把２个环状质粒分子偶联起来，形成“手铐”状的复合物［此模型亦因此而被称为“手铐”模型（“ｈａｎｄｃｕｆｆｉｎｇ”ｍｏｄｅｌ）］，导致这２个重复子区之间出现空间位阻而阻断复制的起始。在随后的细胞生长期间，这种质粒对也渐次分离，使各质粒分子的复制起始潜力得以恢复。不过，按此模型仍无法解释Ｒｅｐ蛋白的自调控问题。

［收稿日期］２００６－１０－２５

［作者简介］赵月峨（１９７４－），女，博士研究生，

（Ｅ－ｍａｉｌ）ｚｈａｏｙｕｅｅ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ

１重复子控制

在含重复子质粒的复制起点（ｏｒｉ），有一富ＡＴ区和多个重复

序列（重复子），质粒编码的复制起始蛋白Ｒｅｐ能以有序的方式与重复子结合，在控制质粒拷贝数方面起重要作用。Ｒｅｐ蛋白能以二体形式结合于操纵子／启动子（Ｏｐ／Ｐｒ）区，反式作用，对其合成进行自我调节；它亦受转录控制，在可调控启动子控制下进行

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对这个问题的解释看来有一定的难度。有些质粒如ＲＫ２，

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．３Ｍａｙ，２００７

调控。ＲＮＡⅠ长１０８ｎｔ，其序列与ＲＮＡⅡ的前１０８碱基序列完全互补，有３个茎－环和无结构的５＇尾部。ＲＮＡⅠ与ＲＮＡⅡ互补区结合可改变后者的二级结构，使ＲＮＡⅡ的３＇端不能与模板ＤＮＡ杂交形成ＲＮＡⅡ－ＤＮＡ杂交物，ＲＮａｓｅＨ就不能对ＲＮＡⅡ进行加工，从而阻断引物的生成，抑制复制的起始。遗传学和生物化学分析表明，ＲＮＡⅠ与ＲＮＡⅡ互补序列的相互作用最初发生在在从ＲＮＡⅠ５＇端开这２种折叠分子中呈单链环而暴露的区域。

吻接”复合物（“始的过程中，这一初始接触形成所谓的“ｋｉｓｓｉｎｇ”

生物技术通讯

Ｒｅｐ蛋白水平的下降对质粒的复制率没有明显影响；但对另一些

质粒如Ｐ１，Ｒｅｐ蛋白水平下降至１／２可使复制停止，增加４倍则可抑制复制。这些现象说明，至少在某些情况下，Ｒｅｐ蛋白的自调控机制对保持合适浓度的起始蛋白来说是重要的。故有人认为，在某些起始蛋白有限的质粒系统中，起始蛋白的滴定和配对是联合起作用的。

含重复子质粒的Ｒｅｐ蛋白在复制控制和自调控中的作用提示，能影响蛋白质－蛋白质或蛋白质－ＤＮＡ相互作用的ｒｅｐ突变能增加质粒拷贝数。在质粒Ｒ６Ｋ中，增拷贝突变（ｃｏｐｙ－ｕｐｍｕ－

ｃｏｍｐｌｅｘ），是该相互作用的限速步骤。ＲＮＡⅠ的启动子是组成型

的，故其数量与质粒拷贝数成正比，但不稳定。

在ＣｏｌＥ１中还有一个质粒编码的控制元件Ｒｏｍ蛋白（又称

ｔａｔｉｏｎ）能影响位于ＬＺ模体和推定的π蛋白－ＤＮＡ结合域之间的

一个３２ａａ区，该区与起始蛋白的高序寡聚化（ｈｉｇｈ－ｏｒｄｅｒ

Ｒｏｐ蛋白），长６３ａａ。Ｒｏｍ蛋白是ＲＮＡ结合蛋白，它能增强ＲＮＡⅠ与ＲＮＡⅡ的相互作用，稳定ＲＮＡⅠ－ＲＮＡⅡ复合物，因而能加

强对复制的抑制作用，但在上述控制回路中只起辅助作用。

ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）有关。在质粒ｐＳＣ１０１和ＲＫ２中也观察到了类似

的现象。

除重复子和起始蛋白这２个基本因素外，探讨含重复子质粒的复制控制机制还需要考虑如下一些辅助因素。①有些含重复子的质粒在ｏｒｉ内外都有重复子存在。原则上，这会大大增加

２．２抑制前导肽翻译

这种作用方式的例子是质粒Ｒ１，它的基本复制子含有可读

前导肽ＴＡＰ框ｃｏｐＢ、ｔａｐ和ｒｅｐＡ，分别编码转录阻遏蛋白ＣｏｐＢ、和起始必需蛋白ＲｅｐＡ。ｔａｐ和ｒｅｐＡ是翻译偶联的。ＲｅｐＡ是复制的限速因子，以顺式作用，但不能重复使用，其复制控制在转录和转录后２个水平上进行。主控制元件是反义ＲＮＡ，名为ＣｏｐＡ，从ｒｅｐＡｍＲＮＡ前导区的一段互补链转录而来，长约９０ｎｔ，有２个茎－环（一大一小），不稳定（半衰期为１～２ｍｉｎ）。ｒｅｐＡｍＲＮＡ前导区中与之互补的这一段序列称为ＣｏｐＴ。ＣｏｐＡ也可通过吻接形式与ＣｏｐＴ形成复合物。因ｒｅｐＡ的翻译需要ｔａｐ的翻译（翻译偶联），故当ＣｏｐＡ与ＣｏｐＴ结合后，由于位阻效应阻碍了前导肽基因（ｔａｐ）的翻译，进而抑制了ＲｅｐＡ的合成，其抑制效率取决于吻接复合物形成的亲和力。能降低吻接复合物形成效率的ｃｏｐＡ突变可增加质粒的拷贝数，此时复制仍是可控的，但ＣｏｐＡ完全失活则会使复制不可控。ＲＮａｓｅⅢ可特异地切割ＣｏｐＡ－ＣｏｐＴ复合物，这种切割对ＲｅｐＡ的合成也有控制作用。有实验显示，

Ｒｅｐ介导的重复子配对的概率而降低复制率，且还会产生质粒分

子内的、与拷贝数无关的配对，故这种配对并不能矫正拷贝数对平均拷贝数的偏离。再则，ｏｒｉ内外重复子的作用也不尽相同。

ＲＫ２和Ｐ１的数据显示，作为负调控子，ｏｒｉ外的重复子要比ｏｒｉ

内的更有效，这可能与它们在数量和结构上的差异有关：在ＲＫ２中，辅助重复子能刺激复制起点间的初次配对；在Ｐ１中，复制调控的决定因素是辅助重复子的浓度而不是它们的相对排列。②

Ｒｅｐ蛋白不只能与重复子（ＤｎａＡ盒）结合，它还有一些非重复子

的结合位点，如在ＲｅｐＩＢ／Ｒ１１６２（ＲＳＦ１０１０）系统的富ＡＴ区内就有这样一个结合位点，Ｒｅｐ蛋白与之结合后，可通过直接抑制引物合成而对引发作用进行负调控。③一些宿主蛋白也会参与含重复子质粒的复制，它们或能直接与复制起点结合，或通过蛋白质－蛋白质相互作用进行补充。这不仅是因为复制机器（ｒｅｐｌｉ－

ｃａｔｉｏｎｍａｃｈｉｎｅｒｙ）是由细胞提供的，而且还因为有些宿主蛋白能

通过辅助Ｒｅｐ／重复子的装配来间接地调控质粒拷贝数。

ＣｏｐＡ的大茎－环Ｌ１的结构对Ｒ１的复制控制有重要作用，对

而且，ＣｏｐＡＣｏｐＡ和ＣｏｐＴ的相互作用来说其最适大小为５～７ｎｔ。茎区凸起（ｂｕｌｇｅ）的存在也是ＣｏｐＡ在体外迅速与ＣｏｐＴ形成复合物和在体内有效地起抑制作用所需要的。此外，这还能导致结构不稳定。ＣｏｐＡ的结构－功能研究表明，质粒拷贝数（基因剂量）与ＣｏｐＡ水平呈正相关，其复制率不依赖于质粒的拷贝数和宿主细胞的生长速率。由此可得：①当每个细胞的质粒拷贝数低于平均值时，每拷贝质粒的复制频率大于１；当细胞中质粒拷贝高于平均值时，则每拷贝质粒的复制频率小于１。②Ｒ１质粒拷贝数随宿主细胞生长速率的下降而增加。每个细胞的复制率不随质粒拷贝数而变，这将会缓慢地矫正其与平均质粒复制频率的偏离程度，因而能保持每个细胞的平均质粒拷贝数不变。

２反义ＲＮＡ控制

原核的反义ＲＮＡ是些小ＲＮＡ分子，长３５～１５０ｎｔ，有１～４

个茎－环（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ），其序列与靶ＲＮＡ（正义ＲＮＡ）互补，以顺式或反式起作用，寿命较短。控制质粒拷贝数的反义ＲＮＡ与靶转录物（ｔａｒｇｅｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）即ｒｅｐｍＲＮＡ５＇端的一个区域互补，又称反转录ＲＮＡ（ｃｏｕｎｔｅｒｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＲＮＡ，ｃｔＲＮＡ）。在一些质粒中，

ｃｔＲＮＡ的抑制作用是在与靶ＲＮＡ的配对区完成的；在另一些质

粒中，ｃｔＲＮＡ－靶ＲＮＡ双链体的形成导致靶转录物的构象发生改变并失活。ｃｔＲＮＡ的作用方式有以下几种。

Ｒ１的第２个控制元件是ＣｏｐＢ蛋白，缺失ｃｏｐＢ基因可使拷

贝数增加８倍，但克隆ｃｏｐＢ基因并不能对野生型Ｒ１质粒施与不相容性，表明它在正常情况下只起辅助作用。ＣｏｐＢ为碱性蛋白，相对分子质量为１１０００，可以二聚体形式阻遏ｒｅｐＡ始自Ｐ２启动子（位于ｃｏｐＢ下游）的转录。在稳态条件下，ＣｏｐＢ呈饱和浓度，可充分阻遏ｒｅｐＡ始自Ｐ２的转录，使其维持在基线水平。此时，ｒｅｐＡｍＲＮＡ主要以ｃｏｐＢ－ｔａｐ－ｒｅｐＡＲＮＡ多顺反子形式合成。但在质粒定居的早期阶段，质粒拷贝数很低，ＣｏｐＢ介导的阻遏失效。此时，Ｐ２启动子去阻遏，ｒｅｐＡ转录为ｔａｐ－ｒｅｐＡｍＲＮＡ，

２．１抑制引物ＲＮＡ加工

可以质粒ＣｏｌＥ１为例来说明。ＣｏｌＥ１质粒是大肠杆菌中多拷

贝质粒的代表，其复制起始由一长为５５０ｎｔ的转录物ＲＮＡⅡ引发。ＲＮＡⅡ由宿主ＲＮＡ聚合酶合成，经构象变化后，与模板ＤＮＡ在起点区形成有２个接触区的ＲＮＡⅡ－ＤＮＡ杂交物，ＲＮａｓｅＨ切割其中的ＲＮＡ部分，产生游离的３＇－ＯＨ，再在ＤＮＡ聚合酶Ⅰ的作用下，从这个游离的３＇－ＯＨ开始ＤＮＡ前导链的合成。这一——ＲＮＡⅠ３＇－ＯＨ的生成是复制起始的限速步骤，受反义ＲＮＡ—

赵月峨等：细菌质粒复制的控制机制

使ｒｅｐＡ的转录率和质粒的复制频率得以暂时性增加。故在质粒接合转移或拷贝数降至野生型水平以下很低时，Ｐ２启动子的去阻遏可发挥重要作用。而在正常的稳态条件下，矫正拷贝数的偏离程度，仅用不稳定的ＣｏｐＡＲＮＡ即已足够。

４９９

萄球菌质粒ｐＴ１８１。ｐＴ１８１为滚环复制型质粒，在它的ｒｅｐＣ

ｍＲＮＡ上有２个串联的起点和一长段５＇－非翻译前导区，其拷贝

数控制元件就编码在这个前导区，它有２种反义ＲＮＡ：ＲＮＡⅠ，长约８０ｎｔ；ＲＮＡⅡ，长约１５０ｎｔ，序列与ｒｅｐＣｍＲＮＡ的５＇－非翻译区互补。ＲＮＡⅡ看来是ＲＮＡⅠ的通读产物，它们有相同的序列，在５＇端有２个结构相同的茎－环，且两者的配对和抑制速率常数也都相同。反义ＲＮＡ与ｒｅｐＣｍＲＮＡ的前导区互补配对，形因子的转录终止子，结果使ｒｅｐｍＲＮＡ转录提前终成不依赖ρ

止。这种被截短的ｒｅｐｍＲＮＡ不含Ｒｅｐ蛋白翻译的信息，致使

２．３抑制ｒｅｐｍＲＮＡ翻译

在滚环复制型质粒ｐＭＶ１５８家族中，反义ＲＮＡ可通过它与

复制起始蛋白基因ｒｅｐ的核糖体结合位点（ＲＢＳ）配对来直接抑制ｒｅｐ的翻译。其中研究得较清楚的是质粒ｐＭＶ５８及其衍生质粒ｐＬＳ１，它们的反义ＲＮＡ（ＲＮＡⅡ）长约５０ｎｔ，其序列与ｃｏｐ－

ｒｅｐｍＲＮＡ中基因ｃｏｐＧ和ｒｅｐＢ之间的一个含ＲＢＳ的区域互

补，ｃｏｐ－ｒｅｐｍＲＮＡ中的靶区可减至２１ｎｔ。已证明ＲＮＡⅡ是该质粒的主ｉｎｃ决定簇。推定的ｒｅｐ翻译起始信号在ｒｅｐｍＲＮＡ的预测环上，ＲＮＡⅡ可通过阻断核糖体与ｒｅｐｍＲＮＡ翻译起始序列接近，抑制Ｒｅｐ蛋白合成起始，来直接控制质粒拷贝数。有人认为，ＲＮＡⅡ是通过与ｒｅｐＢｍＲＮＡ翻译起始信号区直接相互作用来抑制ｒｅｐＢ翻译的。在ＲＮＡⅡ中，除对应于转录终止子的二当质粒缺失终止子的ＤＮＡ级结构外，并未发现其他的二级结构。

编码区和ｃｏｐ－ｒｅｐｍＲＮＡ上的互补序列时，仍对野生型ＲＮＡⅡ敏感，提示吻接复合物的形成对ＲＮＡⅡ－ｍＲＮＡ杂交物的产生是重要的，但并不是必需的。在质粒Ｒ１１６２中，起始频率由ＤＮＡ结合蛋白ＲｅｐＣ的水平决定，ｒｅｐＣ的表达在转录水平上由ｒｅｐＣ操纵子的第１个基因调控，在翻译水平上由与ｒｅｐＣ翻译起始信号互补的ｃｔＲＮＡ调控。至今仍不了解其中哪一步是ＲｅｐＣ合成的限速步骤。

Ｒｅｐ的翻译无从进行。这种砖录弱化机制也见于质粒ｐＩＰ５０１，且

对其进行了相当深入的研究。

３转录阻遏蛋白和反义ＲＮＡ共同控制

在Ｒ１、ｐＭＶ１５８等质粒中存在转录阻遏蛋白和反义ＲＮＡ共

同控制复制的现象，如前所述，Ｒ１的主控制因子是反义ＲＮＡ

ＣｏｐＡ，ＣｏｐＢ只起辅助作用，ｃｏｐＢ的缺失只引起质粒拷贝中等程

度的升高，将ｃｏｐＢ克隆入相容质粒后并未发生与Ｒ１不相容的现象。

但在ｐＭＶ１５８家族中，参与质粒复制控制的ＲＮＡⅡ和转录阻遏蛋白ＣｏｐＧ可能是共同起作用的。ＣｏｐＧ能与ｃｏｐＧ和ｒｅｐＢ两者的单一启动子结合并阻遏其转录。ｃｏｐＧ基因的突变或缺失可导致质粒拷贝数的增加。ＣｏｐＧ在它自己的转录和翻译信号控制下，对携有克隆入高拷贝数相容载体的ｐＭＶ１５８复制子的质粒，只引起微弱的不相容性。在高基因剂量下以反式作用时，

２．４抑制假结形成

这种控制机制见于ＩｎｃＩα和ＩｎｃＢ群质粒。以质粒ＣｏｌＩｂ－Ｐ９

ＲＮＡⅡ是一个强ｉｎｃ决定簇。能废止ｃｔＲＮＡ合成的突变亦可导

致质粒拷贝数的增加，但复制仍受ＣｏｐＧ的控制，此时可观察到单个细胞内的质粒拷贝数波动很大。当ＲＮＡⅡ单独克隆于低拷贝数载体，未发现它对携有ｐＭＶ１５８复制子的质粒有显著的不相容性。调控回路元件ｃｏｐＧ和（或）ＲＮＡⅡ可以生理剂量（即近似于野生型质粒的拷贝数）进行克隆。有实验表明，若整个调控回路（即ｃｏｐＧ和ＲＮＡⅡ）一起克隆，以反式作用，可观察到对

（ＩｎｃＩα）为例，它的自主复制区中含有编码复制起始蛋白ＲｅｐＺ的基因ｒｅｐＺ及其翻译控制元件ｉｎｃ和ｒｅｐＹ，ｉｎｃ为负控制元件，

ｒｅｐＹ为前导区，是正调控元件。ｒｅｐＹ与ｒｅｐＺ翻译偶联，而ｒｅｐＺ

的有效翻译还须有一远程ＲＮＡ假结形成，这是质粒复制的限速步骤。质粒ＣｏｌＩｂ－Ｐ９（ＩｎｃＩα）的ｒｅｐＺｍＲＮＡ上有３个茎－环结构，其中结构Ⅰ在ｒｅｐＹ核糖体结合位点的上游，结构Ⅲ在ｒｅｐＹ基因的中部。恰当地终止ｒｅｐＹ的翻译可使结构Ⅲ解折叠，在靶环（ｔａｒｇｅｔｌｏｏｐ）与断茎（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄｓｔｅｍ）之间形成一个短螺旋，诱导结构Ⅰ环上（３２７～３２９位）的５＇－ｒＧＧＣＧ－３＇序列与结构Ⅲ（４３７～

ｐＭＶ１５８的强烈的不相容性，但若ｃｏｐＧ和ＲＮＡⅡ分别克隆，则

前者不显示不相容性，后者只显示微弱的不相容性。由此推断，控制ｐＭＶ１５８质粒复制的是整个控制回路而不是其中的一个元件。基于ｐＭＶ１５８家族质粒的遗传结构相似性，有人认为类似的调控回路可能也存在于该家族的其它质粒中。

４４０位）的５＇－ｒＣＧＣＣ－３＇序列配对，形成激活假结（ａｃｔｉｖａｔｏｒｐｓｅｕ－ｄｏｋｎｏｔ）。该假结的形成促使核糖体与ｒｅｐＺ核糖体结合位点结

合，启动ｒｅｐＺ的翻译。

该质粒的复制控制由反义ＲＮＡ单独实施，不需要转录阻遏蛋白。这个反义ＲＮＡ长约７０ｎｔ，有一个含六核苷酸环的大茎－环（５１ｎｔ）、一个不稳定的上茎（ｕｐｐｅｒｓｔｅｍ）和５＇尾部，由ｉｎｃ编它有２种功能，一是隔离ｒｅｐＹ核糖码，称为ＲＮＡⅠ或ＩｎｃＲＮＡ。

体结合位点，直接阻断ｒｅｐＹ转录；二是阻止ｒｅｐＺ翻译激活，因为

θ复制型质粒ｐＩＰ５０１的复制控制回路似乎兼有Ｒ１和

与Ｒ１类似，ｐＩＰ５０１的ＣｏｐＲ蛋白不能调节其自ｐＭＶ１５８的特点。

身的合成，但能阻遏从下游ｒｅｐＢ启动子起始的转录，但与Ｒ１不同，这种阻遏是不充分的，这又类似于ｐＭＶ１５８。质粒ｐＩＰ５０１中的第２个控制元件是反义ＲＮＡⅢ，它异常稳定，寿命长达约３０

ｍｉｎ，这就提出了它如何矫正质粒拷贝数向下波动的问题，因为ＲＮＡⅢ的水平不会随质粒拷贝数的减少而快速下降，这可能会

导致质粒的丢失，但在实验中没有观察到这种现象。为解释这一悖论，有人提出了一个与ｐＭＶ１５８类似的模型，认为ｐＩＰ５０１质粒拷贝数的减少可能会因ＣｏｐＲ水平的下降而导致ｒｅｐ启动子的去阻遏。

质粒ｐＵＢ１１０的ＲｅｐＵ蛋白也能调控其自身的合成，该质粒的复制亦采取双重控制（转录调控和翻译调控）机制，且可能是滚环复制型质粒复制的另一种更具一般性的双重控制机制。

ＲＮＡⅠ／ｒｅｐＺｍＲＮＡ相互作用位点含有结构Ⅰ中为形成假结所

需的核苷酸。ＩｎｃＲＮＡ与靶ＲＮＡ先经环－环接触而发生初始相互作用，然后，ＩｎｃＲＮＡ的５＇端与ｒｅｐＹ核糖体结合位点的一个近侧区碱基配对，前者的环和５＇－前导区分别直接抑制对ｒｅｐＹ和ｒｅｐＺ表达至关重要的ＲＮＡ－ＲＮＡ相互作用，即抑制激活假结形成，进而抑制ＲｅｐＺ的翻译，实现对质粒复制的控制。

２．５转录弱化

反义ＲＮＡ介导的转录弱化仅见于革兰阳性菌的质粒，如葡

５００４

结语

已对质粒复制的控制机制进行了广泛、深入的研究，取得了质粒ＤＮＡ的复制是伴随宿主菌的细胞周期，以使菌重要进展［５，６］。

群保持一定浓度质粒的方式进行的，这可通过监测和调节起始频率，使每细胞周期每质粒拷贝平均复制１次的机制来实现。复制控制元件由质粒编码，以剂量依赖方式限制Ｒｅｐ蛋白的水平、前导链引物的获得和活性ｏｒｉ的数量，抑制复制的起始。现在已知的复制控制方式主要有３类：①单一元件控制；②主、辅元件控制；③２种控制元件协同作用。也提出了多个质粒复制控制模型，但多不很完善，尚不能解释全部实验数据，有待进一步深入研究。基于质粒在细菌代谢、抗药性等生理过程及遗传工程等生物技术中的重要性，有关质粒复制及其控制机制的研究仍在继续深入［７－１２］，许多研究已在相关元件及其相互作用机制的构象、拓扑变化等更深的层次上进行，对这些新进展将另文评述。

［９］［８］［７］［４］

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．３Ｍａｙ，２００７

ｄｅｌＳｏｌａｒＧ，ＥｓｐｉｎｏｓａＭ．Ｐｌａｓｍｉｄｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｃｏｎｔｒｏｌ：ａｎｅｖｅｒ－ｇｒｏｗｉｎｇｓｔｏｒｙ［Ｊ］．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，３７（３）：４９２

［５］ＫｒｕｇｅｒＲ，ＲａｋｏｗｓｋｉＳＡ，ＦｉｌｕｔｏｗｉｃｚＭ．Ｐａｔｉｃｉｐａｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅ

ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＩｔｅｒｏｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｌａｓｍｉｄｓ［Ａ］．ＦｕｎｎｅｌｌＢＥ，ＰｈｉｌｉｌｌｉｐｓＧＪ．ＰｌａｍｉｄＢｉｏｌｏｇｙ［Ｃ］．ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ：ＡＳＭＰｒｅｓｓ，２００６．２５－４５［６］ＢｒａｎｔｌＳ．ＰｌａｓｍｉｄｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌｂｙａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡｓ［Ａ］．Ｆｕｎｎｅｌｌ

ＢＥ，ＰｈｉｌｉｌｌｉｐｓＧＪ．ＰｌａｍｉｄＢｉｏｌｏｇｙ［Ｃ］．ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ：ＡＳＭＰｒｅｓｓ，２００６．４７－６２．

Ｖｅｎｋｏｖａ－ＣａｎｏｖａＴ，Ｐ$ｔｅｋＭ，Ｎｅe ｖｅｒａＪ．Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｒｅｐｇｅｎｅｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｌａｓｍｉｄｐＧＡ１ｆｒｏｍＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ［Ｊ］．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００３，１８５（８）：２４０２

ＡｂｈｙａｎｋａｒＭＭ，ＲｅａｄｙＪＭ，ＳｈａｒｍａＲ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉ－ｇａｔｉｏｎｓｏｆｃｏｎｔｒｏｌｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｍｉｄＲ６Ｋ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００４，２７９（８）：６７１１

ＢｅｔｔｅｒｉｄｇｅＴ，ＹａｎｇＪ，ＰｉｔｔａｒｄＡＪ，ｅｔａｌ．ＲｏｌｅｏｆＲｅｐＡａｎｄＤｎａＡｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅｏｐｅｎｉｎｇｏｆｔｈｅｏｒｉｇｉｎｏｆＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎＩｎ－ｃＢｐｌａｓｍｉｄ［Ｊ］．ＪＢａｔｅｒｉｏｌ，２００４，１８６（１２）：３７８５

［１０］ＤａｓＮ，Ｖａｌｊａｖｅｃ－ＧｒａｔｉａｎＭ，ＢａｓｕｒａｇＡＮ，ｅｔａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｈｏｍｅｏ－

ｓｔａｔｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆＰ１ｐｌａｓｍｉｄｒｅｐｌｉｃａｔｉｕｏｎ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００５，１０２（８）：２８５６

［１１］ＰａｕｓｓｏｎＪ，ＣｈａｔｔｏｒａｊＤＫ．ＯｒｉｇｉｎｉｎａｃｔｖａｔｉｏｎｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌＤＮＡｒｅｐｌｉ－

ｃａｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００６，６１（１）：９

［１２］ＫｗｏｎｇＳＭ，ＳｋｕｒｒａｙＲＡ，ＦｉｒｔｈＮ．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌｏｆｓｔａｐｈｙｌｏ－

ｃｏｃｃａｌｍｕｌｔｉｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｐｌａｓｍｉｄｐＳＫ４１：ａｎａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡｍｅｄｉａｔｅｄｄｕａｌ－ｌｅｃｅｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＲｅｐｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．ＪＢａｔｅｒｉｏｌ，２００６，１８８（１２）：４４０２

Ｊ

生物技术通讯

参考文献

［１］ｄｅｌＳｏｌａｒＧ，ＧｉｒａｌｄｏＲ，Ｒｕｉｚ－ＥｃｈｅｖａｒｒｉａＭＪ，ｅｔａｌ．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄ

ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｃｉｒｃｕｌａｒｂａｃｔｅｒｉａｌｐｌａｓｍｉｄｓ［Ｊ］．１９９８，６３（２）：４３４

［２］ＫｈａｎＳＡ．Ｐｌａｓｍｉｄｒｏｌｌｉｎｇ－ｃｉｒｃｌｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ［Ｊ］．

ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，３７（３）：４７７［３］

ＣｈａｔｔｏｒａｊＤＫ．ＣｏｎｔｒｏｌｏｆｐｌａｓｍｉｄＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｂｙｉｔｅｒｏｎｓ：ｎｏｌｏｎｇｅｒｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ［Ｊ］．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，３７（３）：４６７

ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＭｏｌＢｉｏｌＲｅｖ，

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．３Ｍａｙ，２００７

文章编号：１００９－０００２（２００７）０３－０４９７－０４

生物技术通讯

４９７

综述

细菌质粒复制的控制机制

赵月峨，朱舜亚综述；马永平审校

军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京１０００７１［摘要］

通过分析细菌中质粒的存在状态和调控机制的相关研究进展，为研究细菌致病机理、机体免疫防护机制，分析确

定菌株的标识基因和标识分子，以及研究质粒表达调控分子机理提供思路，进而为应用基因工程手段构建筛选新的表达载体、研究新型疫苗候选株提供理论基础。［关键词］

质粒；复制；调控机制

［中图分类号］

Ｑ７８［文献标识码］Ａ

ＣｏｎｔｒｏｌＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＢａｃｔｅｒｉａｌＰｌａｓｍｉｄＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ

ＺＨＡＯＹｕｅ－ｅ，ＺＨＵＳｈｕｎ－ｙａ，ＭＡＹｏｎｇ－ｐｉｎｇ

ＩｎｓｉｔｉｔｕｅｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰａｔｈｏｇｅｎａｎｄＢｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００７１，Ｃｈｉｎａ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］

Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅａｕｔｈｏｒａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｒｅｌａｔｉｎｇｔｏｔｈｅｅｘｉｓｔｅｎｃｅｓｔａｔｅａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ

ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｄａｖｉａｂｌｅｗａｙｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｎｏｓｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａ，

Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，

ｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ

ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐｌａｓｉｍｄｉｎｂａｃｔｅｒｉａ，

ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅｏｒｇａｎｉｓｍ，ａｎｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｔａｇｇｅｎｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌｅｏｆｐａｒｔｉｃｕｌａｒｂａｃｔｅｒｉａｓｔｒａｉｎ，ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｐｌａｓｉｍｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］

ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｃａｎｂｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｎｅｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｃａｒｒｉｅｒａｎｄｆｉｎｄｎｅｗｖａｃｃｉｎｅｃａｎｄｉｄａｔｅｓｔｒａｉｎｂｙｍｅａｎｓｏｆｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．

ｐｌａｓｍｉｄR ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎR ｃｏｎｔｒｏｌｍｅｃｈａｎｉｓｍ

表达，以评估其胞内浓度的改变会对ｏｒｉ浓度和细胞生理产生何种影响。在许多（但不是全部）情况下，Ｒｅｐ蛋白和重复子一样，对复制具有双向调控作用，且视它们的胞内浓度而定，当胞内浓度低时起复制激活剂作用，胞内浓度高时则起抑制剂作用。

基于上述实验结果，先后提出了２个含重复子质粒的复制控制模型，即滴定模型（ｔｉｔｒａｔｉｏｎｍｏｄｅｌ）和空间位阻模型（ｓｔｅｒｉｃ

质粒是细菌中能自主复制的染色体外遗传成分。它们能为宿主提供一些额外的功能，如抗药性和毒力等。为与宿主稳定地共存并把代谢负担减至最低，质粒必须控制自身的复制。在一定的生长条件下、在一定的宿主菌中，某一质粒的拷贝数（Ｎ）通常是一定的。对质粒是如何控制自身的复制已进行了大量研究［１－４］。

Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ等提出的负调控模型认为，一个质粒刚移入新宿主时，

负调节因子的浓度可忽略不计，质粒能在短时间内达到正常拷贝数，然后通过增加或减少每细胞周期每质粒拷贝的复制率来调节细胞中的质粒拷贝数，使该菌群体中各细胞的质粒拷贝数维持在平均值Ｎａｖ附近的一个很小的波动范围内。进一步的研究表明，上述控制机制是通过质粒自编码的负控制系统调控复制起始而实现的，其负调控作用的控制元件就编码在质粒上。

依所用负控制元件的类型不同，质粒复制的控制系统主要有重复子控制和反义ＲＮＡ控制２大类，后者又包括反义ＲＮＡ单独控制和反义ＲＮＡ与转录阻遏蛋白共同控制２类。我们拟对这３类控制元件及其控制机理做一简要介绍。

ｈｉｎｄｒａｎｃｅｍｏｄｅｌ）。滴定模型认为，Ｒｅｐ蛋白是复制起始的限速因

子，重复子能滴定Ｒｅｐ蛋白，从而限制复制起始的频率。后来发现大多数含重复子质粒的Ｒｅｐ蛋白均具有自阻遏作用，且在

Ｒ６Ｋ和ＲＫ２等系统中，胞内Ｒｅｐ蛋白的量大大超过了与重复子

饱和结合的需要。对于这些现象，滴定模型不能给出合理的解释。而空间位阻模型认为，决定质粒复制率的主要因素是重复子的浓度而不是Ｒｅｐ蛋白的表达水平。当质粒拷贝数较低时，Ｒｅｐ蛋白与重复子结合并饱和，促发复制起始；随着质粒拷贝数的增加，结合于某一起点重复子的Ｒｅｐ分子，开始与结合于另一起点重复子的Ｒｅｐ分子相互作用，并通过Ｒｅｐ－Ｒｅｐ相互作用把２个环状质粒分子偶联起来，形成“手铐”状的复合物［此模型亦因此而被称为“手铐”模型（“ｈａｎｄｃｕｆｆｉｎｇ”ｍｏｄｅｌ）］，导致这２个重复子区之间出现空间位阻而阻断复制的起始。在随后的细胞生长期间，这种质粒对也渐次分离，使各质粒分子的复制起始潜力得以恢复。不过，按此模型仍无法解释Ｒｅｐ蛋白的自调控问题。

［收稿日期］２００６－１０－２５

［作者简介］赵月峨（１９７４－），女，博士研究生，

（Ｅ－ｍａｉｌ）ｚｈａｏｙｕｅｅ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ

１重复子控制

在含重复子质粒的复制起点（ｏｒｉ），有一富ＡＴ区和多个重复

序列（重复子），质粒编码的复制起始蛋白Ｒｅｐ能以有序的方式与重复子结合，在控制质粒拷贝数方面起重要作用。Ｒｅｐ蛋白能以二体形式结合于操纵子／启动子（Ｏｐ／Ｐｒ）区，反式作用，对其合成进行自我调节；它亦受转录控制，在可调控启动子控制下进行

４９８

对这个问题的解释看来有一定的难度。有些质粒如ＲＫ２，

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．３Ｍａｙ，２００７

调控。ＲＮＡⅠ长１０８ｎｔ，其序列与ＲＮＡⅡ的前１０８碱基序列完全互补，有３个茎－环和无结构的５＇尾部。ＲＮＡⅠ与ＲＮＡⅡ互补区结合可改变后者的二级结构，使ＲＮＡⅡ的３＇端不能与模板ＤＮＡ杂交形成ＲＮＡⅡ－ＤＮＡ杂交物，ＲＮａｓｅＨ就不能对ＲＮＡⅡ进行加工，从而阻断引物的生成，抑制复制的起始。遗传学和生物化学分析表明，ＲＮＡⅠ与ＲＮＡⅡ互补序列的相互作用最初发生在在从ＲＮＡⅠ５＇端开这２种折叠分子中呈单链环而暴露的区域。

吻接”复合物（“始的过程中，这一初始接触形成所谓的“ｋｉｓｓｉｎｇ”

生物技术通讯

Ｒｅｐ蛋白水平的下降对质粒的复制率没有明显影响；但对另一些

质粒如Ｐ１，Ｒｅｐ蛋白水平下降至１／２可使复制停止，增加４倍则可抑制复制。这些现象说明，至少在某些情况下，Ｒｅｐ蛋白的自调控机制对保持合适浓度的起始蛋白来说是重要的。故有人认为，在某些起始蛋白有限的质粒系统中，起始蛋白的滴定和配对是联合起作用的。

含重复子质粒的Ｒｅｐ蛋白在复制控制和自调控中的作用提示，能影响蛋白质－蛋白质或蛋白质－ＤＮＡ相互作用的ｒｅｐ突变能增加质粒拷贝数。在质粒Ｒ６Ｋ中，增拷贝突变（ｃｏｐｙ－ｕｐｍｕ－

ｃｏｍｐｌｅｘ），是该相互作用的限速步骤。ＲＮＡⅠ的启动子是组成型

的，故其数量与质粒拷贝数成正比，但不稳定。

在ＣｏｌＥ１中还有一个质粒编码的控制元件Ｒｏｍ蛋白（又称

ｔａｔｉｏｎ）能影响位于ＬＺ模体和推定的π蛋白－ＤＮＡ结合域之间的

一个３２ａａ区，该区与起始蛋白的高序寡聚化（ｈｉｇｈ－ｏｒｄｅｒ

Ｒｏｐ蛋白），长６３ａａ。Ｒｏｍ蛋白是ＲＮＡ结合蛋白，它能增强ＲＮＡⅠ与ＲＮＡⅡ的相互作用，稳定ＲＮＡⅠ－ＲＮＡⅡ复合物，因而能加

强对复制的抑制作用，但在上述控制回路中只起辅助作用。

ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）有关。在质粒ｐＳＣ１０１和ＲＫ２中也观察到了类似

的现象。

除重复子和起始蛋白这２个基本因素外，探讨含重复子质粒的复制控制机制还需要考虑如下一些辅助因素。①有些含重复子的质粒在ｏｒｉ内外都有重复子存在。原则上，这会大大增加

２．２抑制前导肽翻译

这种作用方式的例子是质粒Ｒ１，它的基本复制子含有可读

前导肽ＴＡＰ框ｃｏｐＢ、ｔａｐ和ｒｅｐＡ，分别编码转录阻遏蛋白ＣｏｐＢ、和起始必需蛋白ＲｅｐＡ。ｔａｐ和ｒｅｐＡ是翻译偶联的。ＲｅｐＡ是复制的限速因子，以顺式作用，但不能重复使用，其复制控制在转录和转录后２个水平上进行。主控制元件是反义ＲＮＡ，名为ＣｏｐＡ，从ｒｅｐＡｍＲＮＡ前导区的一段互补链转录而来，长约９０ｎｔ，有２个茎－环（一大一小），不稳定（半衰期为１～２ｍｉｎ）。ｒｅｐＡｍＲＮＡ前导区中与之互补的这一段序列称为ＣｏｐＴ。ＣｏｐＡ也可通过吻接形式与ＣｏｐＴ形成复合物。因ｒｅｐＡ的翻译需要ｔａｐ的翻译（翻译偶联），故当ＣｏｐＡ与ＣｏｐＴ结合后，由于位阻效应阻碍了前导肽基因（ｔａｐ）的翻译，进而抑制了ＲｅｐＡ的合成，其抑制效率取决于吻接复合物形成的亲和力。能降低吻接复合物形成效率的ｃｏｐＡ突变可增加质粒的拷贝数，此时复制仍是可控的，但ＣｏｐＡ完全失活则会使复制不可控。ＲＮａｓｅⅢ可特异地切割ＣｏｐＡ－ＣｏｐＴ复合物，这种切割对ＲｅｐＡ的合成也有控制作用。有实验显示，

Ｒｅｐ介导的重复子配对的概率而降低复制率，且还会产生质粒分

子内的、与拷贝数无关的配对，故这种配对并不能矫正拷贝数对平均拷贝数的偏离。再则，ｏｒｉ内外重复子的作用也不尽相同。

ＲＫ２和Ｐ１的数据显示，作为负调控子，ｏｒｉ外的重复子要比ｏｒｉ

内的更有效，这可能与它们在数量和结构上的差异有关：在ＲＫ２中，辅助重复子能刺激复制起点间的初次配对；在Ｐ１中，复制调控的决定因素是辅助重复子的浓度而不是它们的相对排列。②

Ｒｅｐ蛋白不只能与重复子（ＤｎａＡ盒）结合，它还有一些非重复子

的结合位点，如在ＲｅｐＩＢ／Ｒ１１６２（ＲＳＦ１０１０）系统的富ＡＴ区内就有这样一个结合位点，Ｒｅｐ蛋白与之结合后，可通过直接抑制引物合成而对引发作用进行负调控。③一些宿主蛋白也会参与含重复子质粒的复制，它们或能直接与复制起点结合，或通过蛋白质－蛋白质相互作用进行补充。这不仅是因为复制机器（ｒｅｐｌｉ－

ｃａｔｉｏｎｍａｃｈｉｎｅｒｙ）是由细胞提供的，而且还因为有些宿主蛋白能

通过辅助Ｒｅｐ／重复子的装配来间接地调控质粒拷贝数。

ＣｏｐＡ的大茎－环Ｌ１的结构对Ｒ１的复制控制有重要作用，对

而且，ＣｏｐＡＣｏｐＡ和ＣｏｐＴ的相互作用来说其最适大小为５～７ｎｔ。茎区凸起（ｂｕｌｇｅ）的存在也是ＣｏｐＡ在体外迅速与ＣｏｐＴ形成复合物和在体内有效地起抑制作用所需要的。此外，这还能导致结构不稳定。ＣｏｐＡ的结构－功能研究表明，质粒拷贝数（基因剂量）与ＣｏｐＡ水平呈正相关，其复制率不依赖于质粒的拷贝数和宿主细胞的生长速率。由此可得：①当每个细胞的质粒拷贝数低于平均值时，每拷贝质粒的复制频率大于１；当细胞中质粒拷贝高于平均值时，则每拷贝质粒的复制频率小于１。②Ｒ１质粒拷贝数随宿主细胞生长速率的下降而增加。每个细胞的复制率不随质粒拷贝数而变，这将会缓慢地矫正其与平均质粒复制频率的偏离程度，因而能保持每个细胞的平均质粒拷贝数不变。

２反义ＲＮＡ控制

原核的反义ＲＮＡ是些小ＲＮＡ分子，长３５～１５０ｎｔ，有１～４

个茎－环（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ），其序列与靶ＲＮＡ（正义ＲＮＡ）互补，以顺式或反式起作用，寿命较短。控制质粒拷贝数的反义ＲＮＡ与靶转录物（ｔａｒｇｅｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）即ｒｅｐｍＲＮＡ５＇端的一个区域互补，又称反转录ＲＮＡ（ｃｏｕｎｔｅｒｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＲＮＡ，ｃｔＲＮＡ）。在一些质粒中，

ｃｔＲＮＡ的抑制作用是在与靶ＲＮＡ的配对区完成的；在另一些质

粒中，ｃｔＲＮＡ－靶ＲＮＡ双链体的形成导致靶转录物的构象发生改变并失活。ｃｔＲＮＡ的作用方式有以下几种。

Ｒ１的第２个控制元件是ＣｏｐＢ蛋白，缺失ｃｏｐＢ基因可使拷

贝数增加８倍，但克隆ｃｏｐＢ基因并不能对野生型Ｒ１质粒施与不相容性，表明它在正常情况下只起辅助作用。ＣｏｐＢ为碱性蛋白，相对分子质量为１１０００，可以二聚体形式阻遏ｒｅｐＡ始自Ｐ２启动子（位于ｃｏｐＢ下游）的转录。在稳态条件下，ＣｏｐＢ呈饱和浓度，可充分阻遏ｒｅｐＡ始自Ｐ２的转录，使其维持在基线水平。此时，ｒｅｐＡｍＲＮＡ主要以ｃｏｐＢ－ｔａｐ－ｒｅｐＡＲＮＡ多顺反子形式合成。但在质粒定居的早期阶段，质粒拷贝数很低，ＣｏｐＢ介导的阻遏失效。此时，Ｐ２启动子去阻遏，ｒｅｐＡ转录为ｔａｐ－ｒｅｐＡｍＲＮＡ，

２．１抑制引物ＲＮＡ加工

可以质粒ＣｏｌＥ１为例来说明。ＣｏｌＥ１质粒是大肠杆菌中多拷

贝质粒的代表，其复制起始由一长为５５０ｎｔ的转录物ＲＮＡⅡ引发。ＲＮＡⅡ由宿主ＲＮＡ聚合酶合成，经构象变化后，与模板ＤＮＡ在起点区形成有２个接触区的ＲＮＡⅡ－ＤＮＡ杂交物，ＲＮａｓｅＨ切割其中的ＲＮＡ部分，产生游离的３＇－ＯＨ，再在ＤＮＡ聚合酶Ⅰ的作用下，从这个游离的３＇－ＯＨ开始ＤＮＡ前导链的合成。这一——ＲＮＡⅠ３＇－ＯＨ的生成是复制起始的限速步骤，受反义ＲＮＡ—

赵月峨等：细菌质粒复制的控制机制

使ｒｅｐＡ的转录率和质粒的复制频率得以暂时性增加。故在质粒接合转移或拷贝数降至野生型水平以下很低时，Ｐ２启动子的去阻遏可发挥重要作用。而在正常的稳态条件下，矫正拷贝数的偏离程度，仅用不稳定的ＣｏｐＡＲＮＡ即已足够。

４９９

萄球菌质粒ｐＴ１８１。ｐＴ１８１为滚环复制型质粒，在它的ｒｅｐＣ

ｍＲＮＡ上有２个串联的起点和一长段５＇－非翻译前导区，其拷贝

数控制元件就编码在这个前导区，它有２种反义ＲＮＡ：ＲＮＡⅠ，长约８０ｎｔ；ＲＮＡⅡ，长约１５０ｎｔ，序列与ｒｅｐＣｍＲＮＡ的５＇－非翻译区互补。ＲＮＡⅡ看来是ＲＮＡⅠ的通读产物，它们有相同的序列，在５＇端有２个结构相同的茎－环，且两者的配对和抑制速率常数也都相同。反义ＲＮＡ与ｒｅｐＣｍＲＮＡ的前导区互补配对，形因子的转录终止子，结果使ｒｅｐｍＲＮＡ转录提前终成不依赖ρ

止。这种被截短的ｒｅｐｍＲＮＡ不含Ｒｅｐ蛋白翻译的信息，致使

２．３抑制ｒｅｐｍＲＮＡ翻译

在滚环复制型质粒ｐＭＶ１５８家族中，反义ＲＮＡ可通过它与

复制起始蛋白基因ｒｅｐ的核糖体结合位点（ＲＢＳ）配对来直接抑制ｒｅｐ的翻译。其中研究得较清楚的是质粒ｐＭＶ５８及其衍生质粒ｐＬＳ１，它们的反义ＲＮＡ（ＲＮＡⅡ）长约５０ｎｔ，其序列与ｃｏｐ－

ｒｅｐｍＲＮＡ中基因ｃｏｐＧ和ｒｅｐＢ之间的一个含ＲＢＳ的区域互

补，ｃｏｐ－ｒｅｐｍＲＮＡ中的靶区可减至２１ｎｔ。已证明ＲＮＡⅡ是该质粒的主ｉｎｃ决定簇。推定的ｒｅｐ翻译起始信号在ｒｅｐｍＲＮＡ的预测环上，ＲＮＡⅡ可通过阻断核糖体与ｒｅｐｍＲＮＡ翻译起始序列接近，抑制Ｒｅｐ蛋白合成起始，来直接控制质粒拷贝数。有人认为，ＲＮＡⅡ是通过与ｒｅｐＢｍＲＮＡ翻译起始信号区直接相互作用来抑制ｒｅｐＢ翻译的。在ＲＮＡⅡ中，除对应于转录终止子的二当质粒缺失终止子的ＤＮＡ级结构外，并未发现其他的二级结构。

编码区和ｃｏｐ－ｒｅｐｍＲＮＡ上的互补序列时，仍对野生型ＲＮＡⅡ敏感，提示吻接复合物的形成对ＲＮＡⅡ－ｍＲＮＡ杂交物的产生是重要的，但并不是必需的。在质粒Ｒ１１６２中，起始频率由ＤＮＡ结合蛋白ＲｅｐＣ的水平决定，ｒｅｐＣ的表达在转录水平上由ｒｅｐＣ操纵子的第１个基因调控，在翻译水平上由与ｒｅｐＣ翻译起始信号互补的ｃｔＲＮＡ调控。至今仍不了解其中哪一步是ＲｅｐＣ合成的限速步骤。

Ｒｅｐ的翻译无从进行。这种砖录弱化机制也见于质粒ｐＩＰ５０１，且

对其进行了相当深入的研究。

３转录阻遏蛋白和反义ＲＮＡ共同控制

在Ｒ１、ｐＭＶ１５８等质粒中存在转录阻遏蛋白和反义ＲＮＡ共

同控制复制的现象，如前所述，Ｒ１的主控制因子是反义ＲＮＡ

ＣｏｐＡ，ＣｏｐＢ只起辅助作用，ｃｏｐＢ的缺失只引起质粒拷贝中等程

度的升高，将ｃｏｐＢ克隆入相容质粒后并未发生与Ｒ１不相容的现象。

但在ｐＭＶ１５８家族中，参与质粒复制控制的ＲＮＡⅡ和转录阻遏蛋白ＣｏｐＧ可能是共同起作用的。ＣｏｐＧ能与ｃｏｐＧ和ｒｅｐＢ两者的单一启动子结合并阻遏其转录。ｃｏｐＧ基因的突变或缺失可导致质粒拷贝数的增加。ＣｏｐＧ在它自己的转录和翻译信号控制下，对携有克隆入高拷贝数相容载体的ｐＭＶ１５８复制子的质粒，只引起微弱的不相容性。在高基因剂量下以反式作用时，

２．４抑制假结形成

这种控制机制见于ＩｎｃＩα和ＩｎｃＢ群质粒。以质粒ＣｏｌＩｂ－Ｐ９

ＲＮＡⅡ是一个强ｉｎｃ决定簇。能废止ｃｔＲＮＡ合成的突变亦可导

致质粒拷贝数的增加，但复制仍受ＣｏｐＧ的控制，此时可观察到单个细胞内的质粒拷贝数波动很大。当ＲＮＡⅡ单独克隆于低拷贝数载体，未发现它对携有ｐＭＶ１５８复制子的质粒有显著的不相容性。调控回路元件ｃｏｐＧ和（或）ＲＮＡⅡ可以生理剂量（即近似于野生型质粒的拷贝数）进行克隆。有实验表明，若整个调控回路（即ｃｏｐＧ和ＲＮＡⅡ）一起克隆，以反式作用，可观察到对

（ＩｎｃＩα）为例，它的自主复制区中含有编码复制起始蛋白ＲｅｐＺ的基因ｒｅｐＺ及其翻译控制元件ｉｎｃ和ｒｅｐＹ，ｉｎｃ为负控制元件，

ｒｅｐＹ为前导区，是正调控元件。ｒｅｐＹ与ｒｅｐＺ翻译偶联，而ｒｅｐＺ

的有效翻译还须有一远程ＲＮＡ假结形成，这是质粒复制的限速步骤。质粒ＣｏｌＩｂ－Ｐ９（ＩｎｃＩα）的ｒｅｐＺｍＲＮＡ上有３个茎－环结构，其中结构Ⅰ在ｒｅｐＹ核糖体结合位点的上游，结构Ⅲ在ｒｅｐＹ基因的中部。恰当地终止ｒｅｐＹ的翻译可使结构Ⅲ解折叠，在靶环（ｔａｒｇｅｔｌｏｏｐ）与断茎（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄｓｔｅｍ）之间形成一个短螺旋，诱导结构Ⅰ环上（３２７～３２９位）的５＇－ｒＧＧＣＧ－３＇序列与结构Ⅲ（４３７～

ｐＭＶ１５８的强烈的不相容性，但若ｃｏｐＧ和ＲＮＡⅡ分别克隆，则

前者不显示不相容性，后者只显示微弱的不相容性。由此推断，控制ｐＭＶ１５８质粒复制的是整个控制回路而不是其中的一个元件。基于ｐＭＶ１５８家族质粒的遗传结构相似性，有人认为类似的调控回路可能也存在于该家族的其它质粒中。

４４０位）的５＇－ｒＣＧＣＣ－３＇序列配对，形成激活假结（ａｃｔｉｖａｔｏｒｐｓｅｕ－ｄｏｋｎｏｔ）。该假结的形成促使核糖体与ｒｅｐＺ核糖体结合位点结

合，启动ｒｅｐＺ的翻译。

该质粒的复制控制由反义ＲＮＡ单独实施，不需要转录阻遏蛋白。这个反义ＲＮＡ长约７０ｎｔ，有一个含六核苷酸环的大茎－环（５１ｎｔ）、一个不稳定的上茎（ｕｐｐｅｒｓｔｅｍ）和５＇尾部，由ｉｎｃ编它有２种功能，一是隔离ｒｅｐＹ核糖码，称为ＲＮＡⅠ或ＩｎｃＲＮＡ。

体结合位点，直接阻断ｒｅｐＹ转录；二是阻止ｒｅｐＺ翻译激活，因为

θ复制型质粒ｐＩＰ５０１的复制控制回路似乎兼有Ｒ１和

与Ｒ１类似，ｐＩＰ５０１的ＣｏｐＲ蛋白不能调节其自ｐＭＶ１５８的特点。

身的合成，但能阻遏从下游ｒｅｐＢ启动子起始的转录，但与Ｒ１不同，这种阻遏是不充分的，这又类似于ｐＭＶ１５８。质粒ｐＩＰ５０１中的第２个控制元件是反义ＲＮＡⅢ，它异常稳定，寿命长达约３０

ｍｉｎ，这就提出了它如何矫正质粒拷贝数向下波动的问题，因为ＲＮＡⅢ的水平不会随质粒拷贝数的减少而快速下降，这可能会

导致质粒的丢失，但在实验中没有观察到这种现象。为解释这一悖论，有人提出了一个与ｐＭＶ１５８类似的模型，认为ｐＩＰ５０１质粒拷贝数的减少可能会因ＣｏｐＲ水平的下降而导致ｒｅｐ启动子的去阻遏。

质粒ｐＵＢ１１０的ＲｅｐＵ蛋白也能调控其自身的合成，该质粒的复制亦采取双重控制（转录调控和翻译调控）机制，且可能是滚环复制型质粒复制的另一种更具一般性的双重控制机制。

ＲＮＡⅠ／ｒｅｐＺｍＲＮＡ相互作用位点含有结构Ⅰ中为形成假结所

需的核苷酸。ＩｎｃＲＮＡ与靶ＲＮＡ先经环－环接触而发生初始相互作用，然后，ＩｎｃＲＮＡ的５＇端与ｒｅｐＹ核糖体结合位点的一个近侧区碱基配对，前者的环和５＇－前导区分别直接抑制对ｒｅｐＹ和ｒｅｐＺ表达至关重要的ＲＮＡ－ＲＮＡ相互作用，即抑制激活假结形成，进而抑制ＲｅｐＺ的翻译，实现对质粒复制的控制。

２．５转录弱化

反义ＲＮＡ介导的转录弱化仅见于革兰阳性菌的质粒，如葡

５００４

结语

已对质粒复制的控制机制进行了广泛、深入的研究，取得了质粒ＤＮＡ的复制是伴随宿主菌的细胞周期，以使菌重要进展［５，６］。

群保持一定浓度质粒的方式进行的，这可通过监测和调节起始频率，使每细胞周期每质粒拷贝平均复制１次的机制来实现。复制控制元件由质粒编码，以剂量依赖方式限制Ｒｅｐ蛋白的水平、前导链引物的获得和活性ｏｒｉ的数量，抑制复制的起始。现在已知的复制控制方式主要有３类：①单一元件控制；②主、辅元件控制；③２种控制元件协同作用。也提出了多个质粒复制控制模型，但多不很完善，尚不能解释全部实验数据，有待进一步深入研究。基于质粒在细菌代谢、抗药性等生理过程及遗传工程等生物技术中的重要性，有关质粒复制及其控制机制的研究仍在继续深入［７－１２］，许多研究已在相关元件及其相互作用机制的构象、拓扑变化等更深的层次上进行，对这些新进展将另文评述。

［９］［８］［７］［４］

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．３Ｍａｙ，２００７

ｄｅｌＳｏｌａｒＧ，ＥｓｐｉｎｏｓａＭ．Ｐｌａｓｍｉｄｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｃｏｎｔｒｏｌ：ａｎｅｖｅｒ－ｇｒｏｗｉｎｇｓｔｏｒｙ［Ｊ］．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，３７（３）：４９２

［５］ＫｒｕｇｅｒＲ，ＲａｋｏｗｓｋｉＳＡ，ＦｉｌｕｔｏｗｉｃｚＭ．Ｐａｔｉｃｉｐａｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅ

ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＩｔｅｒｏｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｌａｓｍｉｄｓ［Ａ］．ＦｕｎｎｅｌｌＢＥ，ＰｈｉｌｉｌｌｉｐｓＧＪ．ＰｌａｍｉｄＢｉｏｌｏｇｙ［Ｃ］．ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ：ＡＳＭＰｒｅｓｓ，２００６．２５－４５［６］ＢｒａｎｔｌＳ．ＰｌａｓｍｉｄｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌｂｙａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡｓ［Ａ］．Ｆｕｎｎｅｌｌ

ＢＥ，ＰｈｉｌｉｌｌｉｐｓＧＪ．ＰｌａｍｉｄＢｉｏｌｏｇｙ［Ｃ］．ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ：ＡＳＭＰｒｅｓｓ，２００６．４７－６２．

Ｖｅｎｋｏｖａ－ＣａｎｏｖａＴ，Ｐ$ｔｅｋＭ，Ｎｅe ｖｅｒａＪ．Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｒｅｐｇｅｎｅｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｌａｓｍｉｄｐＧＡ１ｆｒｏｍＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ［Ｊ］．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００３，１８５（８）：２４０２

ＡｂｈｙａｎｋａｒＭＭ，ＲｅａｄｙＪＭ，ＳｈａｒｍａＲ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉ－ｇａｔｉｏｎｓｏｆｃｏｎｔｒｏｌｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｍｉｄＲ６Ｋ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００４，２７９（８）：６７１１

ＢｅｔｔｅｒｉｄｇｅＴ，ＹａｎｇＪ，ＰｉｔｔａｒｄＡＪ，ｅｔａｌ．ＲｏｌｅｏｆＲｅｐＡａｎｄＤｎａＡｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅｏｐｅｎｉｎｇｏｆｔｈｅｏｒｉｇｉｎｏｆＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎＩｎ－ｃＢｐｌａｓｍｉｄ［Ｊ］．ＪＢａｔｅｒｉｏｌ，２００４，１８６（１２）：３７８５

［１０］ＤａｓＮ，Ｖａｌｊａｖｅｃ－ＧｒａｔｉａｎＭ，ＢａｓｕｒａｇＡＮ，ｅｔａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｈｏｍｅｏ－

ｓｔａｔｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆＰ１ｐｌａｓｍｉｄｒｅｐｌｉｃａｔｉｕｏｎ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００５，１０２（８）：２８５６

［１１］ＰａｕｓｓｏｎＪ，ＣｈａｔｔｏｒａｊＤＫ．ＯｒｉｇｉｎｉｎａｃｔｖａｔｉｏｎｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌＤＮＡｒｅｐｌｉ－

ｃａｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００６，６１（１）：９

［１２］ＫｗｏｎｇＳＭ，ＳｋｕｒｒａｙＲＡ，ＦｉｒｔｈＮ．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌｏｆｓｔａｐｈｙｌｏ－

ｃｏｃｃａｌｍｕｌｔｉｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｐｌａｓｍｉｄｐＳＫ４１：ａｎａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡｍｅｄｉａｔｅｄｄｕａｌ－ｌｅｃｅｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＲｅｐｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．ＪＢａｔｅｒｉｏｌ，２００６，１８８（１２）：４４０２

Ｊ

生物技术通讯

参考文献

［１］ｄｅｌＳｏｌａｒＧ，ＧｉｒａｌｄｏＲ，Ｒｕｉｚ－ＥｃｈｅｖａｒｒｉａＭＪ，ｅｔａｌ．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄ

ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｃｉｒｃｕｌａｒｂａｃｔｅｒｉａｌｐｌａｓｍｉｄｓ［Ｊ］．１９９８，６３（２）：４３４

［２］ＫｈａｎＳＡ．Ｐｌａｓｍｉｄｒｏｌｌｉｎｇ－ｃｉｒｃｌｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ［Ｊ］．

ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，３７（３）：４７７［３］

ＣｈａｔｔｏｒａｊＤＫ．ＣｏｎｔｒｏｌｏｆｐｌａｓｍｉｄＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｂｙｉｔｅｒｏｎｓ：ｎｏｌｏｎｇｅｒｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ［Ｊ］．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，３７（３）：４６７

ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＭｏｌＢｉｏｌＲｅｖ，