氮蓝四唑（NBT ）法测定超氧化物歧化酶（SOD ）活力
一、原理
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD ）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。而SOD 可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：植物叶片。
（二）仪器设备：高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx ），试管或指形管数支，黑色硬纸套。
（三）试剂
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。[0.2M的Na 2HPO 491.5mL 和NaH 2PO 48.5mL 混合后稀释4倍]or[0.05mol/L PBS 缓冲液（pH7.8）：7.1g/L ，6.8g/LKH2PO 4，按体积9:1混合，如pH 高或低于7.8，则用KH 2PO 4或Na 2HPO 4调节。每1000mL 缓冲液含8gNaCl ，0.2gKCl] 提取介质：内含1%聚乙烯吡咯烷酮的上述缓冲液。
（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml 。
（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液（NBT ）：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，避光保存。
（4）100µmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml 。
（5）20 µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至1000ml ，避光保存，现用现配。
三、实验步骤
1. 酶液提取
取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于研钵中液氮研磨成粉末，加2ml 预冷的提取介质在冰浴上研磨成浆，加入提取介质冲洗研钵，提取介质终体积为5ml 。取1.5-2ml 于4℃下10000r/min下离心20min ，上清液即为SOD 粗提液。
2. 显色反应
取5ml 指形管或试管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液：[当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶和核黄素除外）按比例混合后每支试管一次加入2.65mL ，然后依次加入核黄素和酶液，但终浓度不变。]
试剂名称 用量（mL ） 终浓度（比色时）
0.05mol/L磷酸缓冲液 1.5
130mmol/L Met 溶液 0.3 13mmol/L
750µmol/L NBT 溶液 0.3 75µmol/L
100µmol/L EDTA-Na2溶液 0.3 10µmol/L
20 µmol/L核黄素溶液 0.3 2.0µmol/L
酶液 0.05 2支对照管以缓冲液代替酶
液
蒸馏水 0.25
总体积 3.0
混匀后将1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光或置暗处，其他各管于4000lx
日光下反应10min （要求各管受光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，温度高时间缩短，低时延长；视酶活性高低可适当调整反应时间）。
3.SOD 活性测定
至反应结束后，用黑布罩盖上试管，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管在560nm 下的吸光度。
四、结果计算
已知SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD 活性。
式中：
SOD ——活性以每克鲜重酶单位表示，比活力以每毫克蛋白酶单位表示；
A 0——照光对照管的吸光值；
As ——样品管的吸光值；
Vt ——样液总体积（mL ）；
V S ——测定时样品用量（mL ）；
W ——样品鲜重（g ）；
蛋白质浓度——每克鲜重含蛋白毫克数（mg·g -1）。
五、注意事项
1. 核黄素产生 O 2- ，NBT 还原为蓝色的化合物都与光密切相关，因此，测定时要严格控制光照的强度和时间。
2. 植物中的酚类对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP ），尽可能除去植物组织中的酚类等次生代谢物质。
3. 测定SOD 活性时加入的酶量，以能抑制反应的50％为佳。
氮蓝四唑（NBT ）法测定超氧化物歧化酶（SOD ）活力
一、原理
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD ）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。而SOD 可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：植物叶片。
（二）仪器设备：高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx ），试管或指形管数支，黑色硬纸套。
（三）试剂
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。[0.2M的Na 2HPO 491.5mL 和NaH 2PO 48.5mL 混合后稀释4倍]or[0.05mol/L PBS 缓冲液（pH7.8）：7.1g/L ，6.8g/LKH2PO 4，按体积9:1混合，如pH 高或低于7.8，则用KH 2PO 4或Na 2HPO 4调节。每1000mL 缓冲液含8gNaCl ，0.2gKCl] 提取介质：内含1%聚乙烯吡咯烷酮的上述缓冲液。
（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml 。
（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液（NBT ）：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，避光保存。
（4）100µmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml 。
（5）20 µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至1000ml ，避光保存，现用现配。
三、实验步骤
1. 酶液提取
取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于研钵中液氮研磨成粉末，加2ml 预冷的提取介质在冰浴上研磨成浆，加入提取介质冲洗研钵，提取介质终体积为5ml 。取1.5-2ml 于4℃下10000r/min下离心20min ，上清液即为SOD 粗提液。
2. 显色反应
取5ml 指形管或试管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液：[当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶和核黄素除外）按比例混合后每支试管一次加入2.65mL ，然后依次加入核黄素和酶液，但终浓度不变。]
试剂名称 用量（mL ） 终浓度（比色时）
0.05mol/L磷酸缓冲液 1.5
130mmol/L Met 溶液 0.3 13mmol/L
750µmol/L NBT 溶液 0.3 75µmol/L
100µmol/L EDTA-Na2溶液 0.3 10µmol/L
20 µmol/L核黄素溶液 0.3 2.0µmol/L
酶液 0.05 2支对照管以缓冲液代替酶
液
蒸馏水 0.25
总体积 3.0
混匀后将1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光或置暗处，其他各管于4000lx
日光下反应10min （要求各管受光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，温度高时间缩短，低时延长；视酶活性高低可适当调整反应时间）。
3.SOD 活性测定
至反应结束后，用黑布罩盖上试管，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管在560nm 下的吸光度。
四、结果计算
已知SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD 活性。
式中：
SOD ——活性以每克鲜重酶单位表示，比活力以每毫克蛋白酶单位表示；
A 0——照光对照管的吸光值；
As ——样品管的吸光值；
Vt ——样液总体积（mL ）；
V S ——测定时样品用量（mL ）；
W ——样品鲜重（g ）；
蛋白质浓度——每克鲜重含蛋白毫克数（mg·g -1）。
五、注意事项
1. 核黄素产生 O 2- ，NBT 还原为蓝色的化合物都与光密切相关，因此，测定时要严格控制光照的强度和时间。
2. 植物中的酚类对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP ），尽可能除去植物组织中的酚类等次生代谢物质。
3. 测定SOD 活性时加入的酶量，以能抑制反应的50％为佳。