DOI：10.13200/j.cjb.2011.09.125.baiy.014
·1116·
中国生物制品学杂志2011年9月第24卷第9期ChinJBiologicalsSeptember2011，Vol.24No.9
【述评】
病毒灭活疫苗生产工艺要点
白玉
李敏
高恩明
【关键词】病毒疫苗；疫苗，灭活；生产工艺；工艺验证
【中国图书分类号】R373R392-33【文献标识码】A【文章编号】1004-5503（2011）09-1116-02
灭活疫苗是指将病原微生物及其代谢产物，利
用理化方法处理，使其丧失感染性或毒性而保有免疫原性的一类生物制剂。灭活疫苗可分为灭活的细菌疫苗和灭活的病毒疫苗，本文所涉及的病毒灭活疫裂解疫苗和亚单位疫苗等。苗包括全病毒灭活疫苗、
病毒灭活疫苗的生产工艺一般分为病毒的扩增、灭活、纯化和/或裂解。工艺的确定应有充分的理论和实验依据，在仔细调研相关理论文献的基础上，应对工艺步骤进行优化，为工艺参数的确定提供依据。工艺确定后，还要进行相应的工艺验证。若研发过程中涉及工艺变更的，还要进行变更前后的可比性研究和验证。
1.病毒的接种、培养和收获
需要优化的生产工艺主要技术参数包括病毒的接种量、感染时间、病毒的繁殖动态，细胞基质的培养条件、发酵条件，生产过程中污染的控制，不同收获
限定收次数的比较等。根据优化结果确定收获终点，获次数范围。需对收获液进行全面检测，包括病毒滴
度、抗原含量、蛋白含量、无菌试验和支原体检测等。如果生产用细胞基质可能引入新的外源因子污染（如非SPF级鸡胚），应增加相应外源因子的检测。2.病毒灭活
病毒能否被彻底灭活是灭活疫苗生产工艺研究的重点，因此需对灭活条件进行充分的研究和验证。2.1灭活剂的选择：常用的灭活剂有甲醛和β-丙内酯等。不同灭活剂的灭活原理不同，在研制新的病毒灭活疫苗时，应考虑所采用的灭活方法的合理性。2.2灭活工艺：选择适合的灭活剂后，应对灭活条件进行优化，如病毒滴度或蛋白浓度/抗原含量、灭活剂的浓度、pH值、作用时间以及作用温度、离子强度等，应对可能影响灭活效果的参数分别进行研究，根据病毒灭活的动力学变化，综合各研究的病毒灭活速率和灭活曲线，确定最佳的灭活工艺参数。2.3病毒灭活方法验证：应同时考虑灭活效果和灭
作者单位：国家食品药品监督管理局药品审评中心（北京100038）.
通讯作者：高恩明，E-mail：gaoem＠cde．org．cn
活方法及参数对产品质量的影响两方面的验证。需提供病毒灭活验证的详细资料。可采用敏感细胞盲传3代，对每代细胞进行检测，而且取样量和接种量应具有广泛的代表性。应采用最敏感的检测方法来验证无活病毒。这些方法应该有足够的灵敏度和可重复性，每一个取样点应取双份样品，并设对照以保证结果的准确性；也可直接采用动物法，观察接种动物的存活情况。同时，还要验证灭活条件对疫苗抗原含量、效价等的影响。3.纯化工艺
病毒通常在细胞中培养，收获的培养液除含有病毒外，还含有细胞蛋白（杂蛋白）、培养中引入的杂质则会引起过敏反应或等。如果疫苗中含杂质量过多，
其他不良反应。因此，疫苗必须进行纯化，去除杂质。
目前，灭活疫苗通常采用的纯化工艺包括超滤、柱层析和/或密度梯度离心等。超滤可去除部分分子量较小的杂蛋白和工艺相关杂质，如灭活剂等，并使收获液体积大大减小，利于后续工艺操作。应通过对杂蛋白及DNA去除率、抗原回收率等的研究选择不同截留分子量的超滤膜、确定浓缩倍数。柱层析和/或密度梯度离心为去除宿主细胞蛋白、DNA等杂质的有效步骤，应优化层析条件，如层析柱类型、上样洗脱液条件等工艺参数。梯度离心是根据病毒颗量、
粒的沉降系数来分离病毒，通过对不同梯度液中的病毒滴度的检测来确定收集病毒的条件。
纯化工艺确定后，还要对其进行验证。通过对各纯化步骤对细胞基质相关杂质、工艺相关杂质（如有机溶剂、核酸内切酶、灭活剂、裂解剂、残留牛血清等）的去除效果以及对有效成分的分离纯化效果的验证，来评估纯化工艺的合理性。同时，还要关注纯化过程中污染的控制，进行中间产物（如超滤液、层析洗脱液等）细菌内毒素含量及微生物限度的检测，并根据多批次的生产检定结果建立限度标准。4.裂解工艺
某些疫苗（如流感病毒裂解疫苗）需进行裂解工
中国生物制品学杂志2011年9月第24卷第9期ChinJBiologicalsSeptember2011，Vol.24No.9
·1117·
艺处理。研发中需要进行裂解剂的选择、裂解工艺的优化研究，并进行工艺验证。裂解剂的选择一般应遵循以下原则：①已应用于生物制品或药品生产的试剂；②毒性不宜过高；③应具有较高的溶解病毒膜抗应对裂解原的能力和较高的收率。选择了裂解剂后，工艺参数进行优化，如裂解剂的浓度、底物（如流感作用时间等。确定参数时，除考虑裂解病毒）的浓度、效果外，还应考虑裂解剂可能对疫苗免疫原性的影响。有文献报道，TritonX-100的浓度若高于1.0%，裂解时间超过90min后，在病毒裂解的同时，部分血凝素发生了断裂，从而影响了疫苗的免疫原性［1］。还应注意的是，同一裂解剂对不同型别的流感病毒毒株的裂解效果不同，因季节性流感每年都要更换毒株，应重新进行裂解工艺参数的优化。裂解完成后，要进行二次纯化，以去除杂蛋白和裂解剂等杂质。5.
工艺验证
工艺验证的目的是确认工艺是否有效以及是否具有可重复性，从而为建立常规的规模化生产工艺提
产品属性、组分属性、工艺参供关键数据，如质量属性、数、操作参数和仪器参数等，企业应保证疫苗上市前其生产工艺的性能，即能始终如一地生产出满足有关
特性、含量、纯度和效价等参数要求的疫苗。这些保证应从小试、中试和/或规模化生产研究的客观信息和数据中得到，是达到疫苗质量保证目标的关键要素。
考虑到疫苗研发的阶段性，临床研究期间难以完成全面的工艺验证（工艺设计阶段验证、工艺确认阶段验证），但仍应进行实验室规模和／或中试规模的生产过程连续性和重复性的验证，应遵循合理的科学方法和原则，对某些特定条件进行评估，并对规模化生产工艺的性能进行预测。
在申报生产阶段，建议进行完整的工艺验证，并应符合cGMP条件。应考虑规模化生产设备的功能性和限制性，以及由一些因素所产生的变异情况，如不同批次、不同来源的原材料，不同生产操作者，不同生产环境条件，不同计量系统等，以清楚这些典型的规模化生产变量的变化范围。应建立每个单元操作与总工艺的工艺控制方法，通过工艺控制，确保疫苗的质量在可控的范围内。工艺控制既包括物料（原料、各工艺产品）的检测，也包括设备的监测，特别是由于取样或检测的限制，疫苗的属性不易被检测（如病毒的清除或微生物污染）及中间产品和成品不能很好地鉴别，其影响质量的特性参数不能很好地确定时，操作参数限度和在线实时的工艺监测对工艺的控制是尤其必不可少的。
应对整个生产过程中的工艺关键参数以及过程控制点进行全面分析，特别是数据偏离分析。通过分析，企业应了解是否有变异及变异的来源，监测变异的存在与程度，理解变异对工艺以及最终对疫苗属性的影响，使用与工艺和疫苗中出现的风险相适应的方法控制变异。
各阶段工艺验证的批次，一般要求按照工艺研究的结果至少连续生产3批符合质量要求的样品。6.工艺研究中的其他问题6.1有机溶剂的使用：生产过程中，如采用有机溶剂或其他物质进行提取、纯化或灭活处理等，产品的后续纯化工艺应保证可有效去除制品中的有机溶剂或其他物质，去除工艺应经过验证。生产过程中有机溶剂的使用及残留限值的规定应严格按照现行版《中国药典》三部中的相应要求。如药典中没有的，要建立相应的方法，设定相应的标准。6.2抗生素和防腐剂的使用：应遵守现行版《中国药典》三部“凡例”中的具体要求。6.3佐剂的使用：目前能用于疫苗的佐剂多为氢氧化铝和磷酸铝，而铝佐剂通常使疫苗产生的抗体滞后，且增加注射局部的不良反应机率。因此，如疫苗的抗原量和免疫原性能满足免疫保护的需要，则以不加佐剂为宜。若必须添加，首先应考虑常用的、安
作用全性较易接受的佐剂，并对添加佐剂的必要性、
机制（包括抗原的吸附效果）及是否对疫苗的安全性造成影响进行研究。应注意添加佐剂后可能改变机体免疫应答的方式，如改变产生抗体的类型或时间可能对疫苗的预防目的产生影响。应对上述研究提供详细数据并经综合分析后确定是否使用佐剂。新佐剂的使用目前国内无相关的指导原则，可参考欧洲药品评价局（EMEA）发布的有关指导原则。7.
结语
本文所涉及的病毒灭活疫苗的工艺研究只是一般共性问题，不可能包括和适用于所有的病毒灭活疫苗，因此，在病毒灭活疫苗研制和工艺验证中，应结合产品的具体性质和特点，充分考虑特定品种的个性问题，且应突出和强调科学性。
（志谢：衷心感谢北京科兴生物制品有限公司公雪杰注册总监在本文工艺验证部分撰写中提供的帮助。）
参考文献
［1］杨喆，刘红岩，马波，等．流感裂解疫苗纯化及裂解工艺优化［J］．
中国生物制品学杂志，2008，12（1）：36-39．
（收稿日期：2011-07-06）
DOI：10.13200/j.cjb.2011.09.125.baiy.014
·1116·
中国生物制品学杂志2011年9月第24卷第9期ChinJBiologicalsSeptember2011，Vol.24No.9
【述评】
病毒灭活疫苗生产工艺要点
白玉
李敏
高恩明
【关键词】病毒疫苗；疫苗，灭活；生产工艺；工艺验证
【中国图书分类号】R373R392-33【文献标识码】A【文章编号】1004-5503（2011）09-1116-02
灭活疫苗是指将病原微生物及其代谢产物，利
用理化方法处理，使其丧失感染性或毒性而保有免疫原性的一类生物制剂。灭活疫苗可分为灭活的细菌疫苗和灭活的病毒疫苗，本文所涉及的病毒灭活疫裂解疫苗和亚单位疫苗等。苗包括全病毒灭活疫苗、
病毒灭活疫苗的生产工艺一般分为病毒的扩增、灭活、纯化和/或裂解。工艺的确定应有充分的理论和实验依据，在仔细调研相关理论文献的基础上，应对工艺步骤进行优化，为工艺参数的确定提供依据。工艺确定后，还要进行相应的工艺验证。若研发过程中涉及工艺变更的，还要进行变更前后的可比性研究和验证。
1.病毒的接种、培养和收获
需要优化的生产工艺主要技术参数包括病毒的接种量、感染时间、病毒的繁殖动态，细胞基质的培养条件、发酵条件，生产过程中污染的控制，不同收获
限定收次数的比较等。根据优化结果确定收获终点，获次数范围。需对收获液进行全面检测，包括病毒滴
度、抗原含量、蛋白含量、无菌试验和支原体检测等。如果生产用细胞基质可能引入新的外源因子污染（如非SPF级鸡胚），应增加相应外源因子的检测。2.病毒灭活
病毒能否被彻底灭活是灭活疫苗生产工艺研究的重点，因此需对灭活条件进行充分的研究和验证。2.1灭活剂的选择：常用的灭活剂有甲醛和β-丙内酯等。不同灭活剂的灭活原理不同，在研制新的病毒灭活疫苗时，应考虑所采用的灭活方法的合理性。2.2灭活工艺：选择适合的灭活剂后，应对灭活条件进行优化，如病毒滴度或蛋白浓度/抗原含量、灭活剂的浓度、pH值、作用时间以及作用温度、离子强度等，应对可能影响灭活效果的参数分别进行研究，根据病毒灭活的动力学变化，综合各研究的病毒灭活速率和灭活曲线，确定最佳的灭活工艺参数。2.3病毒灭活方法验证：应同时考虑灭活效果和灭
作者单位：国家食品药品监督管理局药品审评中心（北京100038）.
通讯作者：高恩明，E-mail：gaoem＠cde．org．cn
活方法及参数对产品质量的影响两方面的验证。需提供病毒灭活验证的详细资料。可采用敏感细胞盲传3代，对每代细胞进行检测，而且取样量和接种量应具有广泛的代表性。应采用最敏感的检测方法来验证无活病毒。这些方法应该有足够的灵敏度和可重复性，每一个取样点应取双份样品，并设对照以保证结果的准确性；也可直接采用动物法，观察接种动物的存活情况。同时，还要验证灭活条件对疫苗抗原含量、效价等的影响。3.纯化工艺
病毒通常在细胞中培养，收获的培养液除含有病毒外，还含有细胞蛋白（杂蛋白）、培养中引入的杂质则会引起过敏反应或等。如果疫苗中含杂质量过多，
其他不良反应。因此，疫苗必须进行纯化，去除杂质。
目前，灭活疫苗通常采用的纯化工艺包括超滤、柱层析和/或密度梯度离心等。超滤可去除部分分子量较小的杂蛋白和工艺相关杂质，如灭活剂等，并使收获液体积大大减小，利于后续工艺操作。应通过对杂蛋白及DNA去除率、抗原回收率等的研究选择不同截留分子量的超滤膜、确定浓缩倍数。柱层析和/或密度梯度离心为去除宿主细胞蛋白、DNA等杂质的有效步骤，应优化层析条件，如层析柱类型、上样洗脱液条件等工艺参数。梯度离心是根据病毒颗量、
粒的沉降系数来分离病毒，通过对不同梯度液中的病毒滴度的检测来确定收集病毒的条件。
纯化工艺确定后，还要对其进行验证。通过对各纯化步骤对细胞基质相关杂质、工艺相关杂质（如有机溶剂、核酸内切酶、灭活剂、裂解剂、残留牛血清等）的去除效果以及对有效成分的分离纯化效果的验证，来评估纯化工艺的合理性。同时，还要关注纯化过程中污染的控制，进行中间产物（如超滤液、层析洗脱液等）细菌内毒素含量及微生物限度的检测，并根据多批次的生产检定结果建立限度标准。4.裂解工艺
某些疫苗（如流感病毒裂解疫苗）需进行裂解工
中国生物制品学杂志2011年9月第24卷第9期ChinJBiologicalsSeptember2011，Vol.24No.9
·1117·
艺处理。研发中需要进行裂解剂的选择、裂解工艺的优化研究，并进行工艺验证。裂解剂的选择一般应遵循以下原则：①已应用于生物制品或药品生产的试剂；②毒性不宜过高；③应具有较高的溶解病毒膜抗应对裂解原的能力和较高的收率。选择了裂解剂后，工艺参数进行优化，如裂解剂的浓度、底物（如流感作用时间等。确定参数时，除考虑裂解病毒）的浓度、效果外，还应考虑裂解剂可能对疫苗免疫原性的影响。有文献报道，TritonX-100的浓度若高于1.0%，裂解时间超过90min后，在病毒裂解的同时，部分血凝素发生了断裂，从而影响了疫苗的免疫原性［1］。还应注意的是，同一裂解剂对不同型别的流感病毒毒株的裂解效果不同，因季节性流感每年都要更换毒株，应重新进行裂解工艺参数的优化。裂解完成后，要进行二次纯化，以去除杂蛋白和裂解剂等杂质。5.
工艺验证
工艺验证的目的是确认工艺是否有效以及是否具有可重复性，从而为建立常规的规模化生产工艺提
产品属性、组分属性、工艺参供关键数据，如质量属性、数、操作参数和仪器参数等，企业应保证疫苗上市前其生产工艺的性能，即能始终如一地生产出满足有关
特性、含量、纯度和效价等参数要求的疫苗。这些保证应从小试、中试和/或规模化生产研究的客观信息和数据中得到，是达到疫苗质量保证目标的关键要素。
考虑到疫苗研发的阶段性，临床研究期间难以完成全面的工艺验证（工艺设计阶段验证、工艺确认阶段验证），但仍应进行实验室规模和／或中试规模的生产过程连续性和重复性的验证，应遵循合理的科学方法和原则，对某些特定条件进行评估，并对规模化生产工艺的性能进行预测。
在申报生产阶段，建议进行完整的工艺验证，并应符合cGMP条件。应考虑规模化生产设备的功能性和限制性，以及由一些因素所产生的变异情况，如不同批次、不同来源的原材料，不同生产操作者，不同生产环境条件，不同计量系统等，以清楚这些典型的规模化生产变量的变化范围。应建立每个单元操作与总工艺的工艺控制方法，通过工艺控制，确保疫苗的质量在可控的范围内。工艺控制既包括物料（原料、各工艺产品）的检测，也包括设备的监测，特别是由于取样或检测的限制，疫苗的属性不易被检测（如病毒的清除或微生物污染）及中间产品和成品不能很好地鉴别，其影响质量的特性参数不能很好地确定时，操作参数限度和在线实时的工艺监测对工艺的控制是尤其必不可少的。
应对整个生产过程中的工艺关键参数以及过程控制点进行全面分析，特别是数据偏离分析。通过分析，企业应了解是否有变异及变异的来源，监测变异的存在与程度，理解变异对工艺以及最终对疫苗属性的影响，使用与工艺和疫苗中出现的风险相适应的方法控制变异。
各阶段工艺验证的批次，一般要求按照工艺研究的结果至少连续生产3批符合质量要求的样品。6.工艺研究中的其他问题6.1有机溶剂的使用：生产过程中，如采用有机溶剂或其他物质进行提取、纯化或灭活处理等，产品的后续纯化工艺应保证可有效去除制品中的有机溶剂或其他物质，去除工艺应经过验证。生产过程中有机溶剂的使用及残留限值的规定应严格按照现行版《中国药典》三部中的相应要求。如药典中没有的，要建立相应的方法，设定相应的标准。6.2抗生素和防腐剂的使用：应遵守现行版《中国药典》三部“凡例”中的具体要求。6.3佐剂的使用：目前能用于疫苗的佐剂多为氢氧化铝和磷酸铝，而铝佐剂通常使疫苗产生的抗体滞后，且增加注射局部的不良反应机率。因此，如疫苗的抗原量和免疫原性能满足免疫保护的需要，则以不加佐剂为宜。若必须添加，首先应考虑常用的、安
作用全性较易接受的佐剂，并对添加佐剂的必要性、
机制（包括抗原的吸附效果）及是否对疫苗的安全性造成影响进行研究。应注意添加佐剂后可能改变机体免疫应答的方式，如改变产生抗体的类型或时间可能对疫苗的预防目的产生影响。应对上述研究提供详细数据并经综合分析后确定是否使用佐剂。新佐剂的使用目前国内无相关的指导原则，可参考欧洲药品评价局（EMEA）发布的有关指导原则。7.
结语
本文所涉及的病毒灭活疫苗的工艺研究只是一般共性问题，不可能包括和适用于所有的病毒灭活疫苗，因此，在病毒灭活疫苗研制和工艺验证中，应结合产品的具体性质和特点，充分考虑特定品种的个性问题，且应突出和强调科学性。
（志谢：衷心感谢北京科兴生物制品有限公司公雪杰注册总监在本文工艺验证部分撰写中提供的帮助。）
参考文献
［1］杨喆，刘红岩，马波，等．流感裂解疫苗纯化及裂解工艺优化［J］．
中国生物制品学杂志，2008，12（1）：36-39．
（收稿日期：2011-07-06）