※生物工程食品科学
2009, Vol. 30, No. 05171
冬虫夏草液体发酵生产多糖和菌丝体的研究
吴彩琴，陈 野＊，郝 迎
（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 ３００４５７）
摘 要：本实验采用液体发酵冬虫夏草生产菌丝体和多糖。通过单因素试验，确定利用蔗糖酵母膏液体培养基发酵生产多糖和菌丝体的最佳条件为：接种量５％、温度２６℃、培养时间４ｄ，通气流量１Ｌ／ｍｉｎ。关键词：冬虫夏草；菌丝体；液体发酵；多糖
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｅｌｉａ ａｎｄ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ Ｌｉｑｕｉｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ
ＷＵ Ｃａｉ－ｑｉｎ，ＣＨＥＮ Ｙｅ＊，ＨＡＯ Ｙｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７， Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｍｙｃｅｌｉａ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ． Ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｙｉｅｌｄｓ， ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ，ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ， ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ａｓ ５％， １ Ｌ／ｍｉｎ， ２６ ℃ ａｎｄ ４ ｄａｙｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ；ｍｙｃｅｌｉｕｍ；ｌｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
中图分类号：ＴＳ２７２．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００９）０５－０１７１－０４
冬虫夏草又名“虫草”，是我国医药宝库中的一种名贵中药。它隶属于真菌界、真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、肉座菌目、麦角菌科［１］，其化学成分复杂，含有虫草菌素、核苷类、氨基酸、多肽、多糖类、糖醇、甾醇类、脂肪酸、酯、烷烃、多胺类物质等活性成分［２］，具有多种药理及活性功能。如：抑菌、抗肿瘤［３］、增强免疫力［４］、显著降低颅压、促进新陈代谢，抗疲劳［５］等，其中甾醇类有抗疟疾作用［６］，虫草菌素有抑菌、抗病毒和抗癌作用［７］。
由于冬虫夏草严格的寄生条件和特殊的地理环境，使其天然资源非常紧缺。随着人们保健意识的加强，保健系列产品的大量开发，加剧了人们对野生虫草的采挖和虫草繁殖环境的破坏，自然产量急剧减少，资源日趋枯竭。液体发酵生产冬虫夏草，可在一定程度上弥补野生虫草资源的不足。大量药理、药化及临床应用表明：人工虫草菌丝体和天然冬虫夏草具有相似的化学成分、药理作用和临床疗效［８］。本实验对冬虫夏草液体发酵产胞外多糖和菌丝体的发酵条件进行研究，以期为冬虫夏草多糖的工业化生产提供必要的理论基础。１
材料与方法
１．１材料与试剂
冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）取自日本筑波大学生命
科学研究科生物资源工学研究室。
高温α－淀粉酶（２００００Ｕ／ｍｌ）和糖化酶（１０×１０４Ｕ／ｍｌ）宜兴市生物工程公司；木瓜蛋白酶（０．５～２Ｕ／ｍｇ，固体）Ｓｉｇｍａ公司。１．２
仪器与设备
双层小容量恒温培养摇床（ＺＨＷＹ－２１２１Ｃ） 上海智城分析仪器制造有限公司；ＤＧＧ－１０１－ＯＢＳ电热鼓风干燥箱天津市天宇实验仪器有限公司；７２２Ｅ型可见光分光光度计 上海光谱仪器有限公司；定量泵 日本柴田科学仪器株式会社。１．３
培养基
斜面培养基（％）：含马铃薯汁２０、葡萄糖２．０、琼脂２．０；种子培养基（％）：含蔗糖２０、酵母膏２．０、ＫＨ２ＰＯ４ １．０、ＭｇＳＯ４ ０．６，ｐＨ值自然。１．４
培养方法
斜面培养：将保藏冬虫夏草菌种接种于ＰＤＡ斜面，２８℃恒温培养４～５ｄ，备用。
种子液培养：将活化的菌种接种于种子培养基中，
收稿日期：２００８－０３－１５
基金项目：天津市农业科技成果转化与推广项目（０５０２１６０）
作者简介：吴彩琴（１９８２－），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｃｑ＿１５９＠１６３．ｃｏｍ＊
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食品科学※生物工程
在转速１３０ ｒ／ｍｉｎ、温度２６℃的摇床中培养３～４ｄ。
发酵培养：在１Ｌ的锥形瓶中加入蔗糖酵母膏培养基，分别按０．５％、１％、３％、５％和７％（Ｖ／Ｖ）接种量接入液体种子，选取２４、２６、２８和３０℃四个温度，发酵时间为２、３、４和５ｄ，通气量分别为０、２５０、５００、７５０和１０００ｍｌ／ｍｉｎ的条件下培养４ｄ。１．５１．５．１
检测方法
菌丝体产量的测定
用１００目的筛子过滤发酵液，得到的菌球用蒸馏水反复冲洗，然后放入干燥箱，在３５℃下烘干至恒重，称重量。１．５．２
胞内多糖含量测定［９］
取１ｇ干燥菌丝体于烧杯中，加入５０ｍｌ蒸馏水，添加０．１ｇ淀粉酶调节ｐＨ值至５．０，在６０℃下加热３０ｍｉｎ，再加入０．１ｇ木瓜蛋白酶，调节ｐＨ值至７．０，在６０℃下加热３０ｍｉｎ，然后加入０．２ｍｌ淀粉葡萄糖酶调节ｐＨ值至４．５，在６０℃下加热６０ｍｉｎ，最后加入４倍乙醇沉淀５ｈ，结晶过滤，得到的沉淀即为粗胞内多糖。１．５．３１．５．３．１
胞外多糖含量测定葡萄糖标准曲线的制作
释１０００倍的多糖水解液。取１ｍｌ多糖水解液，再加入ＤＮＳ试剂１ｍｌ，沸水浴加热５ｍｉｎ，取出冷却后加入蒸馏水８ｍｌ，摇匀，以表２第６管作为空白，用分光光度计于５４０ｎｍ
处测定吸光度（Ａ５４０ｎｍ）。按下式计算胞外多糖的含量。
１０００
胞外多糖含量（ｇ／Ｌ）＝Ａ５４０ｎｍ×——×稀释倍数×０．００１
Ｖ
式中：Ｖ为样品取样量。２２．１影响
接种是为发酵过程中提供生长旺盛、生命力强的种子，接种量的大小对于发酵周期、产量具有明显的影响，为确定最佳的接种量，研究以０．５％～７％的接种量接种于蔗糖和酵母膏组合培养基，温度２６℃的条件下培养４ｄ，其菌丝体的产量见图１，多糖产量见图２。
２．５菌丝体产量（ｇ／Ｌ）
２．０１．５１．００．５０
０．５
１
３接种量（％）
图１ 接种量对菌丝体产量的影响
Fig.1 Effects of different inoculation quantities on yield of
Cordyceps sinensis mycelium
５
７
结果与分析
接种量对菌丝体产量及胞内多糖和胞外多糖产量的
标准葡萄糖梯度溶液的配制：取５支大试管，分别按表１加入试剂。
表１ 葡萄糖溶液的配制
Table 1 Preparation of glucose solution of different cocentrations
from 1000μm/ml standard solution试剂
葡萄糖标准溶液（１０００μｇ／ｍｌ）
蒸馏水加入量（ｍｌ）葡萄糖最终浓度（μｇ／ｍｌ）
１１９１００
２２８２００
３４６４００
４６４６００
５８２８００
由图１可以看出，随着接种量的增加，菌丝体产量呈上升趋势，但是当接种量增长到５％时，菌丝体产
量基本接近７％时的产量，且呈现平缓的趋势，这是由
绘制标准曲线：另取６只试管，前５支分别加入上述不同梯度葡萄糖溶液１ｍｌ，第６管加入蒸馏水１ｍｌ。然后各管再加入３，５－二硝基水杨酸（ＤＮＳ）显色试剂１ｍｌ，沸水浴加热５ｍｉｎ，取出冷却后再加入蒸馏水８ｍｌ，摇匀，以第６管作为空白，分光光度计５４０ｎｍ处测定吸光度。
于开始菌丝体生长旺盛，代谢主要流向菌丝体生长，当生长到一定程度，培养基被完全利用，开始产生抑制菌丝体生长现象。
３．５３多糖含量（ｇ／Ｌ）
２．５２１．５１０．５０
０．５
１
３接种量（％）
图２ 不同接种量对胞内多糖和胞外多糖产量的影响Fig.2 Effects of different inoculation quantities on yields of
intracellular polysaccharides and exopolysaccharides
５
７
胞内多糖胞外多糖
以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。１．５．３．２
多糖的测定
取４０ｍｌ滤过菌丝的发酵液放入小烧杯中，先加入１６０ｍｌ的 ８０％乙醇溶液，静置１２ｈ，弃去上清液，取沉淀加少许水，沸水浴加热水解１ｈ，冷却后加６ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ ８ｍｌ水解１０ｍｉｎ，再用６ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ调ｐＨ值到中性（１滴酚酞试剂检测呈微红），然后转移至１００ｍｌ容量瓶中定容，过滤后取１０ｍｌ上清液稀释至１００ｍｌ，即为稀
※生物工程食品科学
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由图２可知，随着接种量的增加，胞内多糖和胞外多糖的产量均呈上升趋势，与菌丝体生长趋势一致，接种量５％时的胞内多糖产量为０．９２ｇ／Ｌ，胞外多糖为３．１３ｇ／Ｌ，这与接种量７％时胞内多糖产量０．９３４ｇ／Ｌ，胞外多糖３．２３ｇ／Ｌ大体相当，因此从菌丝体、胞内多糖、胞外多糖的产量和接种成本方面考虑，选择５％为发酵培养基的接种量较为适宜。２．２
温度对菌丝体产量及胞内多糖和胞外多糖的产量影响微生物的生命活动都是由一系列生物化学反应组成的，这些反应都要在各种酶的催化下进行，而温度是保证酶活性的重要因素，因此，在发酵过程中，保证稳定合适的温度，具有重要意义。将菌种接种于蔗糖和酵母膏组合培养基，温度２４～３０℃的条件下培养４ｄ后菌丝体产量见图３，多糖产量见图４。
６菌丝体产量（ｇ／Ｌ）
５４３２１０
２４
２６２８温度（℃）
３０
糖产量增加，但２６～３０℃时，多糖产量下降，因此２６℃为适宜的培养温度。２．３
培养时间对菌丝体产量及胞内多糖和胞外多糖产量发酵周期是确定发酵终止时间的最终依据。以５％的接种量接种于蔗糖和酵母膏组合培养基，测定了１～６ｄ中菌丝体的生长和多糖产生情况，其结果分别如图５、６所示。
３．５菌丝体的产量（ｇ／Ｌ）
３．０２．５２．０１．５１．００．５０
１
２
３４天数（ｄ）
５
６
的影响
图５ 培养时间对菌丝体产量的影响
Fig.5 Effects of different fermentation time on yield of Cordyceps
sinensis
mycelium
由图５可以看出，菌丝体生长与发酵时间的关系呈典型的微生物生长曲线特性。其延滞期达到１ｄ，１ｄ后进入对数期，４ｄ后到达稳定期，此时，菌丝体的产量最大。到第６ｄ的时候，菌丝体出现明显的自溶现象，原因可能是其蛋白水解酶活力的增强而导致的。从观察的结果可得知代谢产物的不断增多，将会抑制菌丝体的增长，导致发酵液浓度增大，菌丝体自溶。
７６多糖含量（ｇ／Ｌ）
５４３２１０
１
２
３４天数（ｄ）
５
６
胞内多糖胞外多糖
图３ 温度对菌丝体产量的影响
Fig.3 Effects of different temperatures on yield of Cordyceps
sinensis
mycelium
由图３可以看出，冬虫夏草生长适宜的温度范围比较广，在２４～３０℃均能生长，但在２６℃下菌丝体的产量最大，随着温度的升高，产量下降，原因是温度升高，生长过快，菌球出现一定的自溶现象，菌丝体产量也开始下降。
１２１０多糖含量（ｇ／Ｌ）
８６４２０
２４
胞内多糖胞外多糖
图６ 不同培养时间对胞内多糖和胞外多糖产量的影响
Fig.6 Effects of different fermentation time on yields of intracellu-lar polysaccharides and exopolysaccharides
２６２８温度（℃）
３０
图４ 不同温度对胞内多糖和胞外多糖产量的影响
Fig.4 Effects of different temperatures on yields of intracellular
polysaccharides and exopolysaccharides
由图６可以看出，冬虫夏草菌在２ｄ进入对数期后至４ｄ菌丝体达到最大，此时胞内多糖和胞外多糖的量也最大，因此胞内多糖和胞外多糖的产生与菌丝体的量有一定的偶联性。在发酵进行５ｄ以后，菌丝体产量和胞内多糖、胞外多糖的产量均开始下降，这可能与菌丝体自溶过程中分泌的各种酶使胞内多糖和胞外多糖分解有关。因此为了取得菌丝体、胞内多糖、胞外多糖
由图４可以看出，温度的波动对胞内多糖和胞外多糖的产量影响很大，随着温度的升高，２４～２６℃时，多
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产量的最大值，选择最佳培养时间为４ｄ。
食品科学※生物工程
比较图７和图８可知，菌丝体产量的增长趋势与胞内多糖、胞外多糖的增长趋势一致，因此通气量选择１Ｌ／ｍｉｎ较合适。３
结 论
通过对冬虫夏草液体发酵生产多糖和菌丝体的发酵条件优化，初步得出冬虫夏草在蔗糖酵母膏液体培养基下发酵的最适条件：接种量５％、温度２６℃、培养时间４ｄ、通气流量为１Ｌ／ｍｉｎ。在此条件下，最高产量菌丝体能够达到１２．３ｇ／Ｌ；胞内多糖产量为５．８９ｇ／Ｌ，占到菌丝体重量的４７．９％；胞外多糖产量为２４．５ｇ／Ｌ。
固体栽培冬虫夏草周期长，劳动强度大，易受外界因素的影响，而液体发酵周期短，易于人工控制。
通气量的确定
通气量的大小直接影响到发酵培养液中的溶氧水平，过高和过低都不利于菌丝体的生长。溶氧过低，不足以满足虫草这种好氧菌的需要，溶氧过高，容易是菌丝体受到损伤。因此选择适宜的通气量对菌丝体的生长至关重要。在上述确定的条件下，研究通气量对菌丝生长和多糖产量的影响，结果见图７、８。
１４１２菌丝产量（ｇ／Ｌ）
１０８６４２０
０
２５０５００１０００通气量（ｍｌ／ｍｉｎ）
１２５０
２．４
选用合适的冬虫夏草发酵工艺，从发酵液中提取胞外多糖，从菌丝体中提取胞内多糖，可以缩短生产周期，降低成本。
参考文献：
［１］［２］［３］［４］
汪玲玲， 钟士清， 方祥． 等． 虫草多糖研究综述［Ｊ］． 微生物学杂志，２００３， ２３（１）： ４３－４５．
连云岚， 杨中林． 北虫草化学成分及药理作用研究进展［Ｊ］． 山西医药杂志， ２００６， ３５（１）： ４４－４６．
ＷＯＯ Ｊ Ｂ， ＬＥＲＭＥＲ Ｌ， ＣＨＩＬＴＯＮ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｓｔｅｒｏｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅｍｙｃｅｌｉａ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９９， ５１： ８９１－８９８．ＡＮＤＥＲＳＯＮ Ｊ． Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔ ｗｅａｐｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｔｈｌｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｎｅｗ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｗｏｒｌｄ， １９９４（１２）： １４．
［５］［６］
都兴范， 李亚杰， 王林华， 等． 北冬虫夏草的研究发展现状［Ｊ］． 辽宁农业科学， ２００３（４）： ２６－２８．
ＰＡＮ Ｔ Ｌ， ＧＯＴＯ Ｓ， ＣＨＥＮ Ｃ Ｌ． Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｇｅｎｔ ｈａｖｉｎｇ ｓｔｅｒｏｉｄ－ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｗａｓｐ （ｔｏｃｈｕｋａｓｏ）：Ｊａｐａｎ， ＷＯ９９４３６９８［Ｐ］， １９９９．
［７］
靳朝霞， 杨少辉． 冬虫夏草的研究进展与发展趋势［Ｊ］． 天津医科大学学报， ２００５， １１（１）： １３７－１４０．
［８］［９］
肖宏亮， 高孔荣， 谭盈科． 冬虫夏草及其菌丝体研究进展［Ｊ］． 中国食用菌， １９９６， １６（２）： ３－５．
小原哲二郎， 鈴木隆雄．食品分析ハンドブック［Ｍ］． 建帛社， １９７５：２２５．
图７ 通气量对菌丝体产量的影响
Fig.7 Effects of different ventilation volumes on yield of
Cordyceps sinensis
mycelium
由图７可以看出，适当的通气量有利于虫草菌丝体及其产物的形成，随着通气量的增加，菌丝体及其产物的增长呈对数型趋势，但当达到１Ｌ／ｍｉｎ时，菌丝体及其产物增长缓慢，这可能与此时培养基中营养物尤其是生长限制因子的耗尽或ｐＨ值、氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜有关系。
３０２５多糖含量（ｇ／Ｌ）
２０１５１０５０
０
２５０
５００
１０００
１２５０
胞内多糖胞外多糖
通气量（ｍｌ／ｍｉｎ）
图８ 通气量对胞内多糖和胞外多糖产量的影响Fig.8 Effects of different ventilation volumes on yields ofintracellular polysaccharides and exopolysaccharides
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冬虫夏草液体发酵生产多糖和菌丝体的研究
吴彩琴，陈 野＊，郝 迎
（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 ３００４５７）
摘 要：本实验采用液体发酵冬虫夏草生产菌丝体和多糖。通过单因素试验，确定利用蔗糖酵母膏液体培养基发酵生产多糖和菌丝体的最佳条件为：接种量５％、温度２６℃、培养时间４ｄ，通气流量１Ｌ／ｍｉｎ。关键词：冬虫夏草；菌丝体；液体发酵；多糖
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｅｌｉａ ａｎｄ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ Ｌｉｑｕｉｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ
ＷＵ Ｃａｉ－ｑｉｎ，ＣＨＥＮ Ｙｅ＊，ＨＡＯ Ｙｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７， Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｍｙｃｅｌｉａ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ． Ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｙｉｅｌｄｓ， ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ，ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ， ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ａｓ ５％， １ Ｌ／ｍｉｎ， ２６ ℃ ａｎｄ ４ ｄａｙｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ；ｍｙｃｅｌｉｕｍ；ｌｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
中图分类号：ＴＳ２７２．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００９）０５－０１７１－０４
冬虫夏草又名“虫草”，是我国医药宝库中的一种名贵中药。它隶属于真菌界、真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、肉座菌目、麦角菌科［１］，其化学成分复杂，含有虫草菌素、核苷类、氨基酸、多肽、多糖类、糖醇、甾醇类、脂肪酸、酯、烷烃、多胺类物质等活性成分［２］，具有多种药理及活性功能。如：抑菌、抗肿瘤［３］、增强免疫力［４］、显著降低颅压、促进新陈代谢，抗疲劳［５］等，其中甾醇类有抗疟疾作用［６］，虫草菌素有抑菌、抗病毒和抗癌作用［７］。
由于冬虫夏草严格的寄生条件和特殊的地理环境，使其天然资源非常紧缺。随着人们保健意识的加强，保健系列产品的大量开发，加剧了人们对野生虫草的采挖和虫草繁殖环境的破坏，自然产量急剧减少，资源日趋枯竭。液体发酵生产冬虫夏草，可在一定程度上弥补野生虫草资源的不足。大量药理、药化及临床应用表明：人工虫草菌丝体和天然冬虫夏草具有相似的化学成分、药理作用和临床疗效［８］。本实验对冬虫夏草液体发酵产胞外多糖和菌丝体的发酵条件进行研究，以期为冬虫夏草多糖的工业化生产提供必要的理论基础。１
材料与方法
１．１材料与试剂
冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）取自日本筑波大学生命
科学研究科生物资源工学研究室。
高温α－淀粉酶（２００００Ｕ／ｍｌ）和糖化酶（１０×１０４Ｕ／ｍｌ）宜兴市生物工程公司；木瓜蛋白酶（０．５～２Ｕ／ｍｇ，固体）Ｓｉｇｍａ公司。１．２
仪器与设备
双层小容量恒温培养摇床（ＺＨＷＹ－２１２１Ｃ） 上海智城分析仪器制造有限公司；ＤＧＧ－１０１－ＯＢＳ电热鼓风干燥箱天津市天宇实验仪器有限公司；７２２Ｅ型可见光分光光度计 上海光谱仪器有限公司；定量泵 日本柴田科学仪器株式会社。１．３
培养基
斜面培养基（％）：含马铃薯汁２０、葡萄糖２．０、琼脂２．０；种子培养基（％）：含蔗糖２０、酵母膏２．０、ＫＨ２ＰＯ４ １．０、ＭｇＳＯ４ ０．６，ｐＨ值自然。１．４
培养方法
斜面培养：将保藏冬虫夏草菌种接种于ＰＤＡ斜面，２８℃恒温培养４～５ｄ，备用。
种子液培养：将活化的菌种接种于种子培养基中，
收稿日期：２００８－０３－１５
基金项目：天津市农业科技成果转化与推广项目（０５０２１６０）
作者简介：吴彩琴（１９８２－），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｃｑ＿１５９＠１６３．ｃｏｍ＊
172 2009, Vol. 30, No. 05
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在转速１３０ ｒ／ｍｉｎ、温度２６℃的摇床中培养３～４ｄ。
发酵培养：在１Ｌ的锥形瓶中加入蔗糖酵母膏培养基，分别按０．５％、１％、３％、５％和７％（Ｖ／Ｖ）接种量接入液体种子，选取２４、２６、２８和３０℃四个温度，发酵时间为２、３、４和５ｄ，通气量分别为０、２５０、５００、７５０和１０００ｍｌ／ｍｉｎ的条件下培养４ｄ。１．５１．５．１
检测方法
菌丝体产量的测定
用１００目的筛子过滤发酵液，得到的菌球用蒸馏水反复冲洗，然后放入干燥箱，在３５℃下烘干至恒重，称重量。１．５．２
胞内多糖含量测定［９］
取１ｇ干燥菌丝体于烧杯中，加入５０ｍｌ蒸馏水，添加０．１ｇ淀粉酶调节ｐＨ值至５．０，在６０℃下加热３０ｍｉｎ，再加入０．１ｇ木瓜蛋白酶，调节ｐＨ值至７．０，在６０℃下加热３０ｍｉｎ，然后加入０．２ｍｌ淀粉葡萄糖酶调节ｐＨ值至４．５，在６０℃下加热６０ｍｉｎ，最后加入４倍乙醇沉淀５ｈ，结晶过滤，得到的沉淀即为粗胞内多糖。１．５．３１．５．３．１
胞外多糖含量测定葡萄糖标准曲线的制作
释１０００倍的多糖水解液。取１ｍｌ多糖水解液，再加入ＤＮＳ试剂１ｍｌ，沸水浴加热５ｍｉｎ，取出冷却后加入蒸馏水８ｍｌ，摇匀，以表２第６管作为空白，用分光光度计于５４０ｎｍ
处测定吸光度（Ａ５４０ｎｍ）。按下式计算胞外多糖的含量。
１０００
胞外多糖含量（ｇ／Ｌ）＝Ａ５４０ｎｍ×——×稀释倍数×０．００１
Ｖ
式中：Ｖ为样品取样量。２２．１影响
接种是为发酵过程中提供生长旺盛、生命力强的种子，接种量的大小对于发酵周期、产量具有明显的影响，为确定最佳的接种量，研究以０．５％～７％的接种量接种于蔗糖和酵母膏组合培养基，温度２６℃的条件下培养４ｄ，其菌丝体的产量见图１，多糖产量见图２。
２．５菌丝体产量（ｇ／Ｌ）
２．０１．５１．００．５０
０．５
１
３接种量（％）
图１ 接种量对菌丝体产量的影响
Fig.1 Effects of different inoculation quantities on yield of
Cordyceps sinensis mycelium
５
７
结果与分析
接种量对菌丝体产量及胞内多糖和胞外多糖产量的
标准葡萄糖梯度溶液的配制：取５支大试管，分别按表１加入试剂。
表１ 葡萄糖溶液的配制
Table 1 Preparation of glucose solution of different cocentrations
from 1000μm/ml standard solution试剂
葡萄糖标准溶液（１０００μｇ／ｍｌ）
蒸馏水加入量（ｍｌ）葡萄糖最终浓度（μｇ／ｍｌ）
１１９１００
２２８２００
３４６４００
４６４６００
５８２８００
由图１可以看出，随着接种量的增加，菌丝体产量呈上升趋势，但是当接种量增长到５％时，菌丝体产
量基本接近７％时的产量，且呈现平缓的趋势，这是由
绘制标准曲线：另取６只试管，前５支分别加入上述不同梯度葡萄糖溶液１ｍｌ，第６管加入蒸馏水１ｍｌ。然后各管再加入３，５－二硝基水杨酸（ＤＮＳ）显色试剂１ｍｌ，沸水浴加热５ｍｉｎ，取出冷却后再加入蒸馏水８ｍｌ，摇匀，以第６管作为空白，分光光度计５４０ｎｍ处测定吸光度。
于开始菌丝体生长旺盛，代谢主要流向菌丝体生长，当生长到一定程度，培养基被完全利用，开始产生抑制菌丝体生长现象。
３．５３多糖含量（ｇ／Ｌ）
２．５２１．５１０．５０
０．５
１
３接种量（％）
图２ 不同接种量对胞内多糖和胞外多糖产量的影响Fig.2 Effects of different inoculation quantities on yields of
intracellular polysaccharides and exopolysaccharides
５
７
胞内多糖胞外多糖
以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。１．５．３．２
多糖的测定
取４０ｍｌ滤过菌丝的发酵液放入小烧杯中，先加入１６０ｍｌ的 ８０％乙醇溶液，静置１２ｈ，弃去上清液，取沉淀加少许水，沸水浴加热水解１ｈ，冷却后加６ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ ８ｍｌ水解１０ｍｉｎ，再用６ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ调ｐＨ值到中性（１滴酚酞试剂检测呈微红），然后转移至１００ｍｌ容量瓶中定容，过滤后取１０ｍｌ上清液稀释至１００ｍｌ，即为稀
※生物工程食品科学
2009, Vol. 30, No. 05173
由图２可知，随着接种量的增加，胞内多糖和胞外多糖的产量均呈上升趋势，与菌丝体生长趋势一致，接种量５％时的胞内多糖产量为０．９２ｇ／Ｌ，胞外多糖为３．１３ｇ／Ｌ，这与接种量７％时胞内多糖产量０．９３４ｇ／Ｌ，胞外多糖３．２３ｇ／Ｌ大体相当，因此从菌丝体、胞内多糖、胞外多糖的产量和接种成本方面考虑，选择５％为发酵培养基的接种量较为适宜。２．２
温度对菌丝体产量及胞内多糖和胞外多糖的产量影响微生物的生命活动都是由一系列生物化学反应组成的，这些反应都要在各种酶的催化下进行，而温度是保证酶活性的重要因素，因此，在发酵过程中，保证稳定合适的温度，具有重要意义。将菌种接种于蔗糖和酵母膏组合培养基，温度２４～３０℃的条件下培养４ｄ后菌丝体产量见图３，多糖产量见图４。
６菌丝体产量（ｇ／Ｌ）
５４３２１０
２４
２６２８温度（℃）
３０
糖产量增加，但２６～３０℃时，多糖产量下降，因此２６℃为适宜的培养温度。２．３
培养时间对菌丝体产量及胞内多糖和胞外多糖产量发酵周期是确定发酵终止时间的最终依据。以５％的接种量接种于蔗糖和酵母膏组合培养基，测定了１～６ｄ中菌丝体的生长和多糖产生情况，其结果分别如图５、６所示。
３．５菌丝体的产量（ｇ／Ｌ）
３．０２．５２．０１．５１．００．５０
１
２
３４天数（ｄ）
５
６
的影响
图５ 培养时间对菌丝体产量的影响
Fig.5 Effects of different fermentation time on yield of Cordyceps
sinensis
mycelium
由图５可以看出，菌丝体生长与发酵时间的关系呈典型的微生物生长曲线特性。其延滞期达到１ｄ，１ｄ后进入对数期，４ｄ后到达稳定期，此时，菌丝体的产量最大。到第６ｄ的时候，菌丝体出现明显的自溶现象，原因可能是其蛋白水解酶活力的增强而导致的。从观察的结果可得知代谢产物的不断增多，将会抑制菌丝体的增长，导致发酵液浓度增大，菌丝体自溶。
７６多糖含量（ｇ／Ｌ）
５４３２１０
１
２
３４天数（ｄ）
５
６
胞内多糖胞外多糖
图３ 温度对菌丝体产量的影响
Fig.3 Effects of different temperatures on yield of Cordyceps
sinensis
mycelium
由图３可以看出，冬虫夏草生长适宜的温度范围比较广，在２４～３０℃均能生长，但在２６℃下菌丝体的产量最大，随着温度的升高，产量下降，原因是温度升高，生长过快，菌球出现一定的自溶现象，菌丝体产量也开始下降。
１２１０多糖含量（ｇ／Ｌ）
８６４２０
２４
胞内多糖胞外多糖
图６ 不同培养时间对胞内多糖和胞外多糖产量的影响
Fig.6 Effects of different fermentation time on yields of intracellu-lar polysaccharides and exopolysaccharides
２６２８温度（℃）
３０
图４ 不同温度对胞内多糖和胞外多糖产量的影响
Fig.4 Effects of different temperatures on yields of intracellular
polysaccharides and exopolysaccharides
由图６可以看出，冬虫夏草菌在２ｄ进入对数期后至４ｄ菌丝体达到最大，此时胞内多糖和胞外多糖的量也最大，因此胞内多糖和胞外多糖的产生与菌丝体的量有一定的偶联性。在发酵进行５ｄ以后，菌丝体产量和胞内多糖、胞外多糖的产量均开始下降，这可能与菌丝体自溶过程中分泌的各种酶使胞内多糖和胞外多糖分解有关。因此为了取得菌丝体、胞内多糖、胞外多糖
由图４可以看出，温度的波动对胞内多糖和胞外多糖的产量影响很大，随着温度的升高，２４～２６℃时，多
174 2009, Vol. 30, No. 05
产量的最大值，选择最佳培养时间为４ｄ。
食品科学※生物工程
比较图７和图８可知，菌丝体产量的增长趋势与胞内多糖、胞外多糖的增长趋势一致，因此通气量选择１Ｌ／ｍｉｎ较合适。３
结 论
通过对冬虫夏草液体发酵生产多糖和菌丝体的发酵条件优化，初步得出冬虫夏草在蔗糖酵母膏液体培养基下发酵的最适条件：接种量５％、温度２６℃、培养时间４ｄ、通气流量为１Ｌ／ｍｉｎ。在此条件下，最高产量菌丝体能够达到１２．３ｇ／Ｌ；胞内多糖产量为５．８９ｇ／Ｌ，占到菌丝体重量的４７．９％；胞外多糖产量为２４．５ｇ／Ｌ。
固体栽培冬虫夏草周期长，劳动强度大，易受外界因素的影响，而液体发酵周期短，易于人工控制。
通气量的确定
通气量的大小直接影响到发酵培养液中的溶氧水平，过高和过低都不利于菌丝体的生长。溶氧过低，不足以满足虫草这种好氧菌的需要，溶氧过高，容易是菌丝体受到损伤。因此选择适宜的通气量对菌丝体的生长至关重要。在上述确定的条件下，研究通气量对菌丝生长和多糖产量的影响，结果见图７、８。
１４１２菌丝产量（ｇ／Ｌ）
１０８６４２０
０
２５０５００１０００通气量（ｍｌ／ｍｉｎ）
１２５０
２．４
选用合适的冬虫夏草发酵工艺，从发酵液中提取胞外多糖，从菌丝体中提取胞内多糖，可以缩短生产周期，降低成本。
参考文献：
［１］［２］［３］［４］
汪玲玲， 钟士清， 方祥． 等． 虫草多糖研究综述［Ｊ］． 微生物学杂志，２００３， ２３（１）： ４３－４５．
连云岚， 杨中林． 北虫草化学成分及药理作用研究进展［Ｊ］． 山西医药杂志， ２００６， ３５（１）： ４４－４６．
ＷＯＯ Ｊ Ｂ， ＬＥＲＭＥＲ Ｌ， ＣＨＩＬＴＯＮ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｓｔｅｒｏｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅｍｙｃｅｌｉａ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９９， ５１： ８９１－８９８．ＡＮＤＥＲＳＯＮ Ｊ． Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔ ｗｅａｐｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｔｈｌｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｎｅｗ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｗｏｒｌｄ， １９９４（１２）： １４．
［５］［６］
都兴范， 李亚杰， 王林华， 等． 北冬虫夏草的研究发展现状［Ｊ］． 辽宁农业科学， ２００３（４）： ２６－２８．
ＰＡＮ Ｔ Ｌ， ＧＯＴＯ Ｓ， ＣＨＥＮ Ｃ Ｌ． Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｇｅｎｔ ｈａｖｉｎｇ ｓｔｅｒｏｉｄ－ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｗａｓｐ （ｔｏｃｈｕｋａｓｏ）：Ｊａｐａｎ， ＷＯ９９４３６９８［Ｐ］， １９９９．
［７］
靳朝霞， 杨少辉． 冬虫夏草的研究进展与发展趋势［Ｊ］． 天津医科大学学报， ２００５， １１（１）： １３７－１４０．
［８］［９］
肖宏亮， 高孔荣， 谭盈科． 冬虫夏草及其菌丝体研究进展［Ｊ］． 中国食用菌， １９９６， １６（２）： ３－５．
小原哲二郎， 鈴木隆雄．食品分析ハンドブック［Ｍ］． 建帛社， １９７５：２２５．
图７ 通气量对菌丝体产量的影响
Fig.7 Effects of different ventilation volumes on yield of
Cordyceps sinensis
mycelium
由图７可以看出，适当的通气量有利于虫草菌丝体及其产物的形成，随着通气量的增加，菌丝体及其产物的增长呈对数型趋势，但当达到１Ｌ／ｍｉｎ时，菌丝体及其产物增长缓慢，这可能与此时培养基中营养物尤其是生长限制因子的耗尽或ｐＨ值、氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜有关系。
３０２５多糖含量（ｇ／Ｌ）
２０１５１０５０
０
２５０
５００
１０００
１２５０
胞内多糖胞外多糖
通气量（ｍｌ／ｍｉｎ）
图８ 通气量对胞内多糖和胞外多糖产量的影响Fig.8 Effects of different ventilation volumes on yields ofintracellular polysaccharides and exopolysaccharides