学号：200751032
北京化工大学
本科生毕业论文开题报告
论文题目：自动化普洱茶发酵工艺的微生物检测和控制
学 院 名 称：生命科学与技术学院
姓 名 ：王宁
学 号：200751032
专 业 班 级：生实0701班
指导老师：吕杰
开题日期：2010. 11. 25
一、课题来源：自选
项目名称: 自动化普洱茶发酵工艺的微生物的检测和控制
二、文献综述部分
2.1 普洱茶简介 属于黑茶，因产地旧属云南普洱府（今普洱市），故得名。现在泛指普洱茶区生产的茶，是以公认普洱茶区的云南大叶种晒青毛茶为原料，经过后发酵加工成的散茶和紧压茶。外形色泽褐红，内质汤色红浓明亮，香气独特陈香，滋味醇厚回甘，叶底褐红。有生茶和熟茶之分，生茶自然发酵，熟茶人工催熟。“越陈越香”被公认为是普洱茶区别其他茶类的最大特点，“香陈九畹芳兰气，品尽千年普洱情。”普洱茶是“可入口的古董”，不同于别的茶贵在新，普洱茶贵在“陈”往往会随着时间逐渐升值[1]。
普洱茶(Pu-Er tea)是以特定地理范围内的云南大叶种茶制成的晒青毛茶作原料，在特定地理范围内加工制造而成。广义的“普洱茶”包括普洱生茶(Pu-Er raw tea)，普洱陈茶(Pu-Er aging tea)和普洱熟茶(Pu-Er ripe tea)三大系列。普洱生茶是未经过发酵生产的晒青毛茶，既可作为绿茶饮用又可通过自然发酵过程转化为普洱陈茶。普洱陈茶系普洱生茶在一定条件下经过自然发酵形成。普洱熟茶是用“渥堆”方式进行人工后发酵生产。目前，人工后发酵的普洱熟茶已成为普洱茶的主流品种之一。普洱茶(Pu—Er tea) 的原料是来自传统食品资源的原料茶叶并按食品安全及卫生要求制备的晒青毛茶。任何不满足这些要求的原料及制备工艺均不能制造普洱茶。在实际生产中通常采用六至十级晒青毛茶作为渥堆
[2]发酵制造普洱茶的原料。
2.2 普洱茶生产工艺简介
普洱茶是以云南大叶种芽叶为原料，经杀青、揉捻、晒干等工序制成的各种嫩度的晒青毛茶，再经整形，熟成、归堆、拼配、杀菌或压制成型的各种级别的散茶或压制茶[1]。普洱茶的加工工艺流程为:云南大叶种鲜叶-杀青-揉捻-干燥-毛茶分级归堆-增湿-渥堆-风干陈化-筛分拣剔拼配-灭菌-压制-干燥。其中增湿渥堆发酵是普洱茶品质形成的关键工序[1]。渥堆发酵实质上是以微生物代谢为中心，通过其胞外酶、微生物热以及微生物自身代谢的综合作用而形成黑茶独特的
品质[2]。成品茶其外形条索肥壮、重实，色泽褐红，呈猪肝色; 内质汤色红浓明亮; 具独特的陈香; 滋味醇厚回甜，叶底厚实呈褐红色[3]。
普洱茶的发酵首先也是按照红茶发酵的轨道进行。红茶的发酵只是三到四个小时，而普洱茶的发酵，以渥堆来说，至少也要三至四个星期。只是，普洱茶的发酵，在初期的数个小时，也是以自身的酶的作用进行变色的化学反应。但随着微生物的滋生和大量的繁殖，微生物的作用就变为主导。其中。黑曲霉的生长最为旺盛。黑曲霉是一种常见的真苗．其分泌的酶类最为众多。其优异的酶解的效果已被广泛用于食品加工，比方：酱油、果汁等。黑曲霉能分泌淀粉酶将茶叶中的碳水化合物转化为糖份，而黑曲霉所分泌的纤维素酶可将茶叶中的纤维素转化为葡萄糖。普洱茶的发酵，也就围绕着由糖出发，而发展成为的糖酵解作用，以糖为基质所发生的物质转化全部主导普洱茶的发酵过程．而糖酵解的最终产物也是普洱茶风味的主要组成部分[4]。
普洱茶以其独特的生产方式-渥堆发酵以及在贮藏陈化中微生物的作用，形成了自己良好的品质特征，甘滑、醇厚和陈香等，微生物代谢的有益物质更是增强了普洱茶的保健功效[5]。微生物生命活动和代谢产物是普洱茶品质形成的重要因子，普洱茶制作过程中微生物变化是极其复杂的，有的微生物自始至终对普洱茶品质形成发挥着积极的作用，有的微生物是在普洱茶加工的某一阶段发挥着形成普洱茶独特风格的作用，有的微生物则不利于普洱茶品质的形成[6]。
在普洱茶整个发酵过程中，霉菌数量最多，其次是酵母，细菌最少，放线菌几乎没有。其中霉菌和酵母菌起主要作用，霉菌以曲霉为主要种类，酵母以产生酒精和产酯等生香酵母为主要类型；细菌起辅助作用。普洱茶在渥堆阶段微生物 数量远远高于普洱茶制作的其他阶段，渥堆可能是普洱茶发酵最为关键的阶段。因此，微生物在云南普洱茶品质形成中起决定性的作用。正是由于微生物的作用，使色泽黄绿、滋味纯正尚涩、香气清鲜纯正的晒青毛茶转变为色泽红褐、滋味醇和回甘、香气陈醇的普洱茶。因此，应当控制普洱茶发酵过程中的每一个工序，提高有利于普洱茶品质提高的微生物种类的比例，防止对普洱茶品质有影响的微生物种类的滋生，从而生产出品质更加优良、口感风格更好的普洱茶[7]。
2.3 目的意义
普洱茶是采用独特工艺加工而成的一种茶叶，其在自动化渥堆发酵过程中，
能够使茶叶内的物质在各种微生物胞外酶及水热作用时，发生的转化、异构、降解、聚合、偶联等反应更加完全，形成了特殊香气成分更多和滋味更完美。经过我们在自动化发酵过程中的检测和控制，使发酵的效率更高。
2.4 微生物在普洱茶发酵过程中的应用
普洱茶发酵是一个典型的微生物固体发酵过程，一般认为在这个过程中霉菌和酵母起到主导作用。微生物在普洱茶的发酵过程中发挥着重要的作用，传统普洱茶发酵生产依靠环境微生物自然接种进行，由于参与发酵的微生物种类不明、杂菌多，使得发酵过程不稳定、生产周期长、产品质量不稳定。为缩短发酵时间、提高普洱茶品质，早在20世纪80年代末，研究者就开始尝试利用从传统普洱茶生产中分离到的有益优势微生物菌株进行人T 接种、发酵生产普洱茶。
普洱茶发酵的研究至今停留在菌种筛选、温度水分等环境因素和个别菌种接种量对普洱茶发酵时间以及品质影响等方面。鉴于传统微生物学方法的局限性，对普洱茶发酵过程中微生物的种群构成及演化、代谢途径网络以及微生物对普洱茶特征成分和功效成分的影响都无法给出科学的解释。可以说普洱茶发酵过程仍处于黑箱状态。本研究拟采用现代分子生物学方法，对普洱茶自动化渥堆过程中不同的阶段中微生物的群落构成及其演替进行全面系统分析，掌握微生物种群间相互关系，明确不同发酵时期的特征微生物及其功能，探讨普洱茶发酵过程中微生物与普洱茶功效（降血糖、血脂和抗肿瘤）之间的关系。
2.5 普洱茶的研究现状
普洱茶是由云南大叶茶树鲜叶加工而成的晒青绿毛茶经过后续加工渥堆制得的茶品，包括用晒青绿毛茶精制整理或蒸压成型后储存陈化的产品，以及采用二十世纪七十年代以来经技术改革创新，采用晒青绿毛茶经过增湿渥堆、后熟陈化以及其他创新熟成工艺制得的产品[10]。普洱茶具有条索肥壮重实、耐贮耐泡、香型韵味变化丰富、滋味浓醇回甘、叶底肥厚柔软，风味风格和喜好群体多样化等特点。大量研究证实:普洱茶具有较强的消食去腻、生津止渴、解乏除烦、解酒、降血脂等多种保健功能，因此日益受到世人青睐。
普洱茶不但保留着中国历代传统的加工工艺，而且也进行了一些积极的工艺改进。1973年云南茶叶进出口公司昆明茶厂在传统普洱茶加工方法的基础上用晒青毛茶经高温高湿人工速成的后发酵的方法压制成圆形的现代式渥堆普洱[11][12](图l) ，称为渥堆普洱茶，亦称熟饼或者后发酵茶。目前，采用云南传统方法加工压制成圆形的普洱茶，也属于黑茶类，一般称为传统普洱茶或称青饼(生饼) 或者后
发酵茶。云南普洱茶的加工工艺是古代制法的晒青过程和现代制法的渥堆发酵过程的绝妙结合，从而形成了普洱茶独特的风味。
普洱熟茶( Pu - erh ripe tea)是以云南特产的大叶茶(C. sinensis var. assamica) 等大叶种茶的晒青毛茶(普洱青茶, Pu - erh green tea)为原料, 经后发酵过程再加工的茶类[13] .后发酵过程是在湿仓和渥堆条件下进行的人工快速自动氧化和微生物共同作用的陈化过程. 梁名志等[14]在研究普洱茶渥堆发酵过程中理化指标的变化时得出结论, 茶坯经发水增湿归堆后, 其含水量随着翻堆次数的增加, 茶坯含水率逐渐减少; 堆温则随着翻堆次数的增加而升高, 但不同的堆层其温度不同, 中层温度较下层的高. 李敏[15]在普洱茶品质形成的研究中分析, 不同温度渥堆品质有差异, 恒温处理对普洱茶品质的形成不利, 渥堆结束后温度处理的茶样滋味呈苦味, 香气也显霉味, 没有形成普洱茶醇、甘、香的品质. 不同干燥方式对普洱茶品质形成有影响, 其中晾干较有利于普洱茶的品质形成. 晒干 滋味收敛性强, 香气辛辣有日晒气; 烘干的滋味稍苦涩, 香气也不如晾干纯. 因此, 可以看出水分、温度和干燥方式对普洱茶的最终品质的形成有重要的影响. 此外, 龚淑英等[16]在探索普洱茶贮藏过程中的最佳条件:贮藏时茶叶含水量和周围环境温度升高, 最佳品质出现时间提前, 55 ℃/12%的处理最佳品质出现在贮藏45 d左右, 37 ℃/9%的处理最佳品质出现在贮藏135 d 左右, 处理后感官品质明显优于常规发酵. 茶多酚、可溶性糖随着贮藏时间延长、贮藏温度提高而下降, 且茶叶含水量高者下降幅度大. 氨基酸随着贮藏时间延长、贮藏温度提高而下降, 但与茶叶含水量相关性不大.
中山大学何国藩等[17]研究认为，由于微生物的呼吸代谢与物质分解产生了大量的热量使堆内的温度上升到60℃，通过翻堆，将只有30一4O ℃茶堆外围的茶叶转入堆心，而将堆心的茶叶转于堆面。这种温度环境的变化很重要，因为60℃左右是许多酶促反应的适宜温度，而35℃左右是微生物的适宜生长温度。茶叶在培养微生物迅速繁殖后，获得由它们产生的大量酶类，又高温下迅速进行生化反应。如此反复多次，最后将茶叶细胞中的酶促底物作用完毕，便是渥堆结束。
温琼英等[18]在研究黑茶渥堆过程中微生物种群的变化时，通过传统渥堆和无菌渥堆的比较发现，无菌渥堆中由于微生物含量极低，堆温几乎不变; 所以湿热
作用的热源是微生物新陈代谢的呼吸热。叶温的升高，一方面加大了湿热作用强度，另一方面加快了微生物酶促反应的速率。
目前，对于普洱茶中微生物的研究越来越多，随着研究的不断深入，人们逐步了解了参与渥堆发酵的微生物及其在普洱茶渥堆发酵中的重要性[24]。韩俊等[25]在针对普洱茶加工过程中微生物及酶系变化的研究中，发现黑曲霉、青霉、根霉、灰绿曲霉和酵母等微生物存在于普洱茶的整个加工过程中，渥堆初期黑曲霉最多，约占微生物总数的80%。黑曲酶代谢产生的水解酶，在渥堆中期，表现为增加趋势，在渥堆后期低温嗜干的灰绿曲霉开始繁殖。在渥堆水分适度时，大量酵母的生长对普洱茶甜醇滋味的形成有重要作用。茶叶中的主要生化成分均随渥堆时间延长而剧烈变化，茶叶中的特征性物质茶多酚在整个加工过程呈下降趋势，而甜醇物质呈增加趋势。
普洱茶生产工艺中，其特殊的渥堆工艺使得其加工过程中有大量的微生物存在。微生物来源有两个:一是晒青毛茶原有的，二是渥堆发酵时环境中的。一般渥堆都是在敞开的条件下进行的，所以空气，添加的水，本身在发酵槽的微生物就进入茶叶中。
中山大学何国藩等【17】对广东普洱茶渥堆过程中微生物群落的分析认为:渥堆中微生物类群，种别繁多，其中以真菌占绝对优势，特别是渥堆早期，霉菌最先发展起来，中后期则渐让位于酵母菌。细菌早期较多，以后逐渐下降，到后期已经极少，未发现有致病菌。放线菌早期不显著，后期有所发展。这是各种微生物之间拮抗作用。由于霉菌能利用各种多糖作碳源，进行糖代谢，产生大量的双糖和单糖，当酵母和霉菌大量繁衍时，也抑制了细菌的生长。
但是，对普洱茶发酵过程中微生物及其应用的研究还主要集中在霉菌、酵母几种优势微生物，缺乏对微生物生态系统的整体研究；对于不同微生物对普洱茶发酵有何影响，对促进普洱茶特征成分的变化有何作用，目前研究得还不够清楚；在添加外源有益微生物以缩短发酵时间、提高普洱茶品质方面虽然有研究者作了一些尝试，也有一定的效果，但还没有形成完整和成熟的工艺。
改进后的现代自动化普洱茶工艺流程图
鲜叶（云南大叶种）
↓
杀青
↓
揉捻
↓
晒干
↓
蒸压成型←筛分及拣剔分配←青毛茶
↓
自动化发酵过程
↓
风干陈化
↓
再干燥
↓
普洱散茶←筛分及拣剔拼配→蒸压成型
↓
普洱紧压茶
2.6本课题的创新之处
1. 经过我们对自动化发酵过程中微生物的检测和控制，对设备和发酵条件进行科学的更新和设计，使普洱茶的发酵实现全调控发酵；
2．利用分子生物学手段系统研究参与普洱茶发酵不同阶段的各种微生物类群，全面了解普洱茶发酵过程中的微生物生态系统组成；
3. 系统研究普洱茶发酵过程中微生物的产酶特性、主要酶类活性及酶谱变化规律，及其对促进普洱茶特征成分变化及品质形成的作用；
4. 研究该微生物生态系统中各种微生物类群在普洱茶发酵不同阶段的生长变化规律，为人工接种微生物应用于普洱茶的发酵生产提供依据。
2.7 参考文献目录
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三. 研究计划部分
3.1本课题的主要研究内容
1、利用分子生态学方法和传统微生物方法结合，系统全面分析普洱茶自动化渥
堆过程中微生物群落构成及演变，对发酵的工艺进行微生物的检测和控制，使普洱茶的发酵在人为地全调控下进行。
在渥堆过程的各个时期采样，进行一下分析；
1）PCR 变性凝胶电泳（PCR-DGGE ）
提取发酵样品提取全DNA ，PCR 扩增霉菌和酵母（18SrDNA 和ITS ）和细菌（16SrDNA ）特异基因。通过PCR-DGGE 和DNA 测序分析各发酵时期微生物种群组成、演变。
微生物分离培养
对采取的样品进行分离培养，建立普洱茶菌种库。对所有菌株进行分类学测序鉴定。
2）荧光定量PCR 法测定渥堆过程中总霉菌数、总细菌数、优势种数、功能菌种
数量及变化规律。
2、渥堆过程中微生物代谢反应及其作用的研究
对有代表意义的样品进行全RNA 和mRNA 提取，建立cDNA 文库，通过对cDNA 库的测序和表达，分析渥堆过程中主要酶反应及其基因，结合DGGE 结果和菌种库，建立影响普洱茶品质和功效成分形成的代谢途径网络。
3、普洱茶发酵过程控制的研究：
通过对以上成果和数据分析，建立普洱茶发酵过程微生物代谢分子模型、探
索重要微生物及酶（或mRNA ）快速检测方法，开发发酵过程中微生物代谢动态调控技术。
4、微生物代谢与普洱茶功效之间关系的研究
结合项目组其他专家的成果，分析儿茶发酵过程中微生物代谢对普洱茶功效的影响。拟采用纯菌种和混合菌发酵技术，分析发酵过程及产物在降血脂降血糖和抗肿瘤上的作用及其机理。
3.2研究方案
3.2.1技术方案（技术路线、技术措施）
3.2.1.1PCR 变性凝胶电泳（PCR-DGGE ）
用匀浆机拍打茶叶进行匀浆，用DNA 试剂盒提取全DNA ，跑电泳，PCR 扩增霉菌细菌酵母的特异基因，通过PCR-DGGE 和DNA 测序分析各发酵时期微生物种群组成、演变。半定量确定优势种。
3.2.1.2微生物分离培养
（1）初步定为渥堆前，翻堆中间、翻堆时分别取样；
（2）制备菌悬液；
（3）培养分两个平行：做10-4、10-5、10-6等3 个稀释度，涂布到平板上，用LB
培养基、马丁氏培养基、YEPD 培养基、MRS 培养基放在25℃、37℃、50℃、60℃四个温度下分别恒温培养，之后进行分离筛菌，并对分离出的细菌、酵母菌和霉菌进行初步的鉴定；
（4）用斜面培养基保存；
对保存的菌种进行纯化，挑取霉菌、细菌单菌落PCR ，电泳检测，用纯化DNA 片段的试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA ，随后进行DNA 片段的克隆实验，过夜培养后，挑选白色菌落，使用PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
3.2.1.3测含水量：
1. 烘干小铝盒，标号，分别测重量并记录；
2. 每个样测5g 左右茶样，放入烘箱103℃烘5~6h，测茶叶质量；
3.计算含水率；
3.2.1.4测温度：
每天分早中晚测量发酵样品的温度，以便分析温度与微生物之间的关系，从而
对发酵条件进行改善。
3.2.2实施方案所需要的条件
①各种0净台、灭菌锅、电泳槽、PCR 仪、紫外分光光度计等。
3.2.3拟解决的关键问题
①分析自动化渥堆发酵过程中随着温度变化、含水量变化与微生物的变化的关系。
②分析渥堆过程中微生物群落构成和变化、确定各阶段主要微生物种类。
3.3 预期的研究成果及创新点
3.3.1预期研究成果：
1、对普洱茶发酵工艺进行微生物的检测和控制，实现普洱茶发酵的全调控。
2、建立普洱茶发酵菌种库，分离得到不少于100株菌株。全部进行rRNA 基因测
序和分类鉴定，对照PCR-DGGE 结果，确认获得全部优势菌种。
3、定量PCR 法测定不同渥堆时期霉菌（含酵母）、细菌及不少于5种重要微生物
的数量及其变化规律。
4、确定破茶叶细胞壁菌种和生理、培养特性。
3.3.2创新点：
1、 自动化渥堆发酵过程中的翻堆采用机械自动化，与以前所研究中的传统翻堆
取样有所不同；
2、 通过对自动化普洱茶发酵工艺的检测和调控，实现全调控发酵，使发酵更有
效率，更环保。
3、 用新方法，结合现代分子生物学与微生物学研究茶叶中的微生物；
3.4本课题的难点分析：
1、取样器的设置
2、普洱茶发酵工艺条件的检测及控制
3、普洱茶自动化发酵过程中发酵设备的设计
3.5 工作计划进度
2010.11-2011.2 文献查阅，制定实验计划；
2011.2-3 尝试各种方法提取DNA 、RNA ，进行试剂盒的筛选；
2011.3-4 在云南取样，并对自动化发酵过程的微生物进行检测
2011.4 对在云南得到的微生物匀浆液进行分析，找到最适宜普洱茶发酵的
条件
2011.5-6 通过我们得到的普洱茶发酵工艺最适条件，在云南普洱茶生产基
地对生产设备进行更新或者重新设计，以实现普洱茶的全调控发
酵
云南的普洱茶分为普洱生茶和普洱熟茶，近年来，普洱茶越来越受广大消费 者的喜爱，在云南，茶叶产生的综合产值可以达到70-80 亿元，对云南的经济发展有极大的推动作用。生产普洱茶的方式很独特，是通过渥堆发酵和后期存放中 微生物的代谢作用实现的。发酵成熟的普洱茶有甘滑、陈香和醇厚的特点，发酵 过程中微生物的代谢产物中部分产物对后期普洱茶的品质形成有影响，代谢产物 中的有益物质决定了普洱茶的保健功效[1]。
张宏达[2]认为，植物茶树属于山茶科山茶属，它的的芽叶和嫩茎经过加工可 以制得茶饮品，茶叶栽培起源国是中国，之后逐渐传播到世界其他国家，茶叶的 种植和加工经过数千年的发展，茶叶渐渐变成一种健康的饮品，茶叶的品种繁多， 茶叶的功能和风味也各有不同，而且茶叶的加工流程和技术也不太相同，所以得 到的茶叶的种类也非常丰富。云南的普洱茶源于云南的古普洱府，主要产自于思 茅、西双版纳、昆明、临沧、下关等地区，普洱茶简单的制作流程为，先把大叶 种茶的鲜叶经过晒青杀青制成晒青毛茶，然后再经过渥堆发酵，最后经过后期存 放。包括用晒青绿毛茶蒸压成型或精制整理后储存陈化得到的产品，还包括采用 晒青绿毛茶经过增湿渥堆、后期陈化及其他创新的工艺得到的产品[3]。大量研究证实:普洱茶可以生津止渴、解乏除烦、消食去腻、降血脂和解酒，所以近年来越来越受人们的欢迎。有数据证实，统计近20 多年来销量增加最快的茶叶，普洱茶是销量增加最快的茶叶中的一种，也越来越受香港、台湾以及世界其他国家人们的欢迎。在国内，普洱茶的市场以各大城市为先导不断热起来，尤其这几年来，在市场推广、加工和科研这些方面普洱茶产业也突飞猛进。
云南的普洱茶在保证传统的加工流程不变的基础上，进行了部分工艺技术的 改进。例如，在1973年，隶属云南茶叶进出口公司的昆明茶厂，在保证传统的普 洱茶前期晒青不变的前提下，后期发酵时，经过高温和高湿的人工速成的后发酵 方法，把普洱茶压制成了圆形，得到了现代式的渥堆普洱茶[4][5](图l-1) ，这种茶叶被称为渥堆普洱茶，现在也被叫作后发酵茶或者熟茶饼茶。普洱熟茶有独特的风味和品质，还有很多保健功效，这跟它的加工工艺密切相关，原来的普洱茶主要靠晒青之后放置保存，采用这种方法压制成的圆形普洱茶是生茶，也被称为青饼，或者生饼，属于黑茶类。而现在的普洱熟茶在晒青后又进行了现代的渥堆发酵，压制成圆形，成为熟饼。
产自云南的大叶种茶经过加工得到晒青毛茶(即普洱青茶) ，晒青毛茶在经过后发酵过程得到了普洱熟茶 [6].普洱茶的后发酵阶段是指在湿仓和渥堆环境
下，经过的人工的快速的自动氧化及微生物作用同时进行的阶段，也称为陈化的过程. 梁名志 [7] 在研究普洱茶的渥堆发酵过程中的理化指标时, 推理出结果：经过潮水增湿渥堆, 茶叶的含水量会随着翻堆次数的增加, 逐渐降低; 随着翻堆次数逐渐的增多，渥堆温度会升高, 但是渥堆上中下层的堆温都不一样，例如下层由于靠地面近，比中层温度低。李敏等[8]认为，不同干燥方式和不同温度等对茶叶的处理，形成茶叶的品质会有很大差别，例如，不同干燥方式处理时，晒干处理的茶叶有日晒气，辛辣味，滋味的收敛性比较强，
滋味苦，而自然晾干就对茶叶品质的形成比较有利；茶叶发酵过程中的每个阶段 温度不同，最后形成的普洱茶才有甘、醇、香的特点，但是经过恒温处理过的茶 叶，香气里有霉味，味道也很苦，所以恒温处理不利于普洱茶的品质的形成。由 此可以得出, 水分、干燥方法和温度处理方式都跟最后形成的普洱茶的滋味、香 气等品质的形成息息相关。此外, 龚淑英[9]在研究最佳普洱茶的贮存的条件时得 到:在贮存普洱茶时，随着环境的温度和茶叶的含水量增高，发现最佳的普洱茶 品质会提前出现。例如，当含水量为9%，环境温度为37℃时，普洱茶的最佳品质 会出现在贮存一百三十五天左右，当含水量为12%，环境温度为55℃时，普洱茶 的最佳品质会出现在贮存四十五天左右，经过处理的普洱茶的口感等品质较常规 发酵的普洱茶好。茶叶中各种成分随着贮存时间和贮存温度的不同，也会有所不 同：随着贮存时间的延长，贮存温度的提高，茶叶中的茶多酚和可溶性糖会下降, 下降的幅度跟含水量也有关系，含水量越高，下降的幅度就会越大；随着贮存时 间的延长，贮存温度的提高，茶叶中氨基酸的含量也会下降，但是下降幅度跟含 水量没有太大关系.
13号线望京西 15号线 后沙峪 顺27物流西
学号：200751032
北京化工大学
本科生毕业论文开题报告
论文题目：自动化普洱茶发酵工艺的微生物检测和控制
学 院 名 称：生命科学与技术学院
姓 名 ：王宁
学 号：200751032
专 业 班 级：生实0701班
指导老师：吕杰
开题日期：2010. 11. 25
一、课题来源：自选
项目名称: 自动化普洱茶发酵工艺的微生物的检测和控制
二、文献综述部分
2.1 普洱茶简介 属于黑茶，因产地旧属云南普洱府（今普洱市），故得名。现在泛指普洱茶区生产的茶，是以公认普洱茶区的云南大叶种晒青毛茶为原料，经过后发酵加工成的散茶和紧压茶。外形色泽褐红，内质汤色红浓明亮，香气独特陈香，滋味醇厚回甘，叶底褐红。有生茶和熟茶之分，生茶自然发酵，熟茶人工催熟。“越陈越香”被公认为是普洱茶区别其他茶类的最大特点，“香陈九畹芳兰气，品尽千年普洱情。”普洱茶是“可入口的古董”，不同于别的茶贵在新，普洱茶贵在“陈”往往会随着时间逐渐升值[1]。
普洱茶(Pu-Er tea)是以特定地理范围内的云南大叶种茶制成的晒青毛茶作原料，在特定地理范围内加工制造而成。广义的“普洱茶”包括普洱生茶(Pu-Er raw tea)，普洱陈茶(Pu-Er aging tea)和普洱熟茶(Pu-Er ripe tea)三大系列。普洱生茶是未经过发酵生产的晒青毛茶，既可作为绿茶饮用又可通过自然发酵过程转化为普洱陈茶。普洱陈茶系普洱生茶在一定条件下经过自然发酵形成。普洱熟茶是用“渥堆”方式进行人工后发酵生产。目前，人工后发酵的普洱熟茶已成为普洱茶的主流品种之一。普洱茶(Pu—Er tea) 的原料是来自传统食品资源的原料茶叶并按食品安全及卫生要求制备的晒青毛茶。任何不满足这些要求的原料及制备工艺均不能制造普洱茶。在实际生产中通常采用六至十级晒青毛茶作为渥堆
[2]发酵制造普洱茶的原料。
2.2 普洱茶生产工艺简介
普洱茶是以云南大叶种芽叶为原料，经杀青、揉捻、晒干等工序制成的各种嫩度的晒青毛茶，再经整形，熟成、归堆、拼配、杀菌或压制成型的各种级别的散茶或压制茶[1]。普洱茶的加工工艺流程为:云南大叶种鲜叶-杀青-揉捻-干燥-毛茶分级归堆-增湿-渥堆-风干陈化-筛分拣剔拼配-灭菌-压制-干燥。其中增湿渥堆发酵是普洱茶品质形成的关键工序[1]。渥堆发酵实质上是以微生物代谢为中心，通过其胞外酶、微生物热以及微生物自身代谢的综合作用而形成黑茶独特的
品质[2]。成品茶其外形条索肥壮、重实，色泽褐红，呈猪肝色; 内质汤色红浓明亮; 具独特的陈香; 滋味醇厚回甜，叶底厚实呈褐红色[3]。
普洱茶的发酵首先也是按照红茶发酵的轨道进行。红茶的发酵只是三到四个小时，而普洱茶的发酵，以渥堆来说，至少也要三至四个星期。只是，普洱茶的发酵，在初期的数个小时，也是以自身的酶的作用进行变色的化学反应。但随着微生物的滋生和大量的繁殖，微生物的作用就变为主导。其中。黑曲霉的生长最为旺盛。黑曲霉是一种常见的真苗．其分泌的酶类最为众多。其优异的酶解的效果已被广泛用于食品加工，比方：酱油、果汁等。黑曲霉能分泌淀粉酶将茶叶中的碳水化合物转化为糖份，而黑曲霉所分泌的纤维素酶可将茶叶中的纤维素转化为葡萄糖。普洱茶的发酵，也就围绕着由糖出发，而发展成为的糖酵解作用，以糖为基质所发生的物质转化全部主导普洱茶的发酵过程．而糖酵解的最终产物也是普洱茶风味的主要组成部分[4]。
普洱茶以其独特的生产方式-渥堆发酵以及在贮藏陈化中微生物的作用，形成了自己良好的品质特征，甘滑、醇厚和陈香等，微生物代谢的有益物质更是增强了普洱茶的保健功效[5]。微生物生命活动和代谢产物是普洱茶品质形成的重要因子，普洱茶制作过程中微生物变化是极其复杂的，有的微生物自始至终对普洱茶品质形成发挥着积极的作用，有的微生物是在普洱茶加工的某一阶段发挥着形成普洱茶独特风格的作用，有的微生物则不利于普洱茶品质的形成[6]。
在普洱茶整个发酵过程中，霉菌数量最多，其次是酵母，细菌最少，放线菌几乎没有。其中霉菌和酵母菌起主要作用，霉菌以曲霉为主要种类，酵母以产生酒精和产酯等生香酵母为主要类型；细菌起辅助作用。普洱茶在渥堆阶段微生物 数量远远高于普洱茶制作的其他阶段，渥堆可能是普洱茶发酵最为关键的阶段。因此，微生物在云南普洱茶品质形成中起决定性的作用。正是由于微生物的作用，使色泽黄绿、滋味纯正尚涩、香气清鲜纯正的晒青毛茶转变为色泽红褐、滋味醇和回甘、香气陈醇的普洱茶。因此，应当控制普洱茶发酵过程中的每一个工序，提高有利于普洱茶品质提高的微生物种类的比例，防止对普洱茶品质有影响的微生物种类的滋生，从而生产出品质更加优良、口感风格更好的普洱茶[7]。
2.3 目的意义
普洱茶是采用独特工艺加工而成的一种茶叶，其在自动化渥堆发酵过程中，
能够使茶叶内的物质在各种微生物胞外酶及水热作用时，发生的转化、异构、降解、聚合、偶联等反应更加完全，形成了特殊香气成分更多和滋味更完美。经过我们在自动化发酵过程中的检测和控制，使发酵的效率更高。
2.4 微生物在普洱茶发酵过程中的应用
普洱茶发酵是一个典型的微生物固体发酵过程，一般认为在这个过程中霉菌和酵母起到主导作用。微生物在普洱茶的发酵过程中发挥着重要的作用，传统普洱茶发酵生产依靠环境微生物自然接种进行，由于参与发酵的微生物种类不明、杂菌多，使得发酵过程不稳定、生产周期长、产品质量不稳定。为缩短发酵时间、提高普洱茶品质，早在20世纪80年代末，研究者就开始尝试利用从传统普洱茶生产中分离到的有益优势微生物菌株进行人T 接种、发酵生产普洱茶。
普洱茶发酵的研究至今停留在菌种筛选、温度水分等环境因素和个别菌种接种量对普洱茶发酵时间以及品质影响等方面。鉴于传统微生物学方法的局限性，对普洱茶发酵过程中微生物的种群构成及演化、代谢途径网络以及微生物对普洱茶特征成分和功效成分的影响都无法给出科学的解释。可以说普洱茶发酵过程仍处于黑箱状态。本研究拟采用现代分子生物学方法，对普洱茶自动化渥堆过程中不同的阶段中微生物的群落构成及其演替进行全面系统分析，掌握微生物种群间相互关系，明确不同发酵时期的特征微生物及其功能，探讨普洱茶发酵过程中微生物与普洱茶功效（降血糖、血脂和抗肿瘤）之间的关系。
2.5 普洱茶的研究现状
普洱茶是由云南大叶茶树鲜叶加工而成的晒青绿毛茶经过后续加工渥堆制得的茶品，包括用晒青绿毛茶精制整理或蒸压成型后储存陈化的产品，以及采用二十世纪七十年代以来经技术改革创新，采用晒青绿毛茶经过增湿渥堆、后熟陈化以及其他创新熟成工艺制得的产品[10]。普洱茶具有条索肥壮重实、耐贮耐泡、香型韵味变化丰富、滋味浓醇回甘、叶底肥厚柔软，风味风格和喜好群体多样化等特点。大量研究证实:普洱茶具有较强的消食去腻、生津止渴、解乏除烦、解酒、降血脂等多种保健功能，因此日益受到世人青睐。
普洱茶不但保留着中国历代传统的加工工艺，而且也进行了一些积极的工艺改进。1973年云南茶叶进出口公司昆明茶厂在传统普洱茶加工方法的基础上用晒青毛茶经高温高湿人工速成的后发酵的方法压制成圆形的现代式渥堆普洱[11][12](图l) ，称为渥堆普洱茶，亦称熟饼或者后发酵茶。目前，采用云南传统方法加工压制成圆形的普洱茶，也属于黑茶类，一般称为传统普洱茶或称青饼(生饼) 或者后
发酵茶。云南普洱茶的加工工艺是古代制法的晒青过程和现代制法的渥堆发酵过程的绝妙结合，从而形成了普洱茶独特的风味。
普洱熟茶( Pu - erh ripe tea)是以云南特产的大叶茶(C. sinensis var. assamica) 等大叶种茶的晒青毛茶(普洱青茶, Pu - erh green tea)为原料, 经后发酵过程再加工的茶类[13] .后发酵过程是在湿仓和渥堆条件下进行的人工快速自动氧化和微生物共同作用的陈化过程. 梁名志等[14]在研究普洱茶渥堆发酵过程中理化指标的变化时得出结论, 茶坯经发水增湿归堆后, 其含水量随着翻堆次数的增加, 茶坯含水率逐渐减少; 堆温则随着翻堆次数的增加而升高, 但不同的堆层其温度不同, 中层温度较下层的高. 李敏[15]在普洱茶品质形成的研究中分析, 不同温度渥堆品质有差异, 恒温处理对普洱茶品质的形成不利, 渥堆结束后温度处理的茶样滋味呈苦味, 香气也显霉味, 没有形成普洱茶醇、甘、香的品质. 不同干燥方式对普洱茶品质形成有影响, 其中晾干较有利于普洱茶的品质形成. 晒干 滋味收敛性强, 香气辛辣有日晒气; 烘干的滋味稍苦涩, 香气也不如晾干纯. 因此, 可以看出水分、温度和干燥方式对普洱茶的最终品质的形成有重要的影响. 此外, 龚淑英等[16]在探索普洱茶贮藏过程中的最佳条件:贮藏时茶叶含水量和周围环境温度升高, 最佳品质出现时间提前, 55 ℃/12%的处理最佳品质出现在贮藏45 d左右, 37 ℃/9%的处理最佳品质出现在贮藏135 d 左右, 处理后感官品质明显优于常规发酵. 茶多酚、可溶性糖随着贮藏时间延长、贮藏温度提高而下降, 且茶叶含水量高者下降幅度大. 氨基酸随着贮藏时间延长、贮藏温度提高而下降, 但与茶叶含水量相关性不大.
中山大学何国藩等[17]研究认为，由于微生物的呼吸代谢与物质分解产生了大量的热量使堆内的温度上升到60℃，通过翻堆，将只有30一4O ℃茶堆外围的茶叶转入堆心，而将堆心的茶叶转于堆面。这种温度环境的变化很重要，因为60℃左右是许多酶促反应的适宜温度，而35℃左右是微生物的适宜生长温度。茶叶在培养微生物迅速繁殖后，获得由它们产生的大量酶类，又高温下迅速进行生化反应。如此反复多次，最后将茶叶细胞中的酶促底物作用完毕，便是渥堆结束。
温琼英等[18]在研究黑茶渥堆过程中微生物种群的变化时，通过传统渥堆和无菌渥堆的比较发现，无菌渥堆中由于微生物含量极低，堆温几乎不变; 所以湿热
作用的热源是微生物新陈代谢的呼吸热。叶温的升高，一方面加大了湿热作用强度，另一方面加快了微生物酶促反应的速率。
目前，对于普洱茶中微生物的研究越来越多，随着研究的不断深入，人们逐步了解了参与渥堆发酵的微生物及其在普洱茶渥堆发酵中的重要性[24]。韩俊等[25]在针对普洱茶加工过程中微生物及酶系变化的研究中，发现黑曲霉、青霉、根霉、灰绿曲霉和酵母等微生物存在于普洱茶的整个加工过程中，渥堆初期黑曲霉最多，约占微生物总数的80%。黑曲酶代谢产生的水解酶，在渥堆中期，表现为增加趋势，在渥堆后期低温嗜干的灰绿曲霉开始繁殖。在渥堆水分适度时，大量酵母的生长对普洱茶甜醇滋味的形成有重要作用。茶叶中的主要生化成分均随渥堆时间延长而剧烈变化，茶叶中的特征性物质茶多酚在整个加工过程呈下降趋势，而甜醇物质呈增加趋势。
普洱茶生产工艺中，其特殊的渥堆工艺使得其加工过程中有大量的微生物存在。微生物来源有两个:一是晒青毛茶原有的，二是渥堆发酵时环境中的。一般渥堆都是在敞开的条件下进行的，所以空气，添加的水，本身在发酵槽的微生物就进入茶叶中。
中山大学何国藩等【17】对广东普洱茶渥堆过程中微生物群落的分析认为:渥堆中微生物类群，种别繁多，其中以真菌占绝对优势，特别是渥堆早期，霉菌最先发展起来，中后期则渐让位于酵母菌。细菌早期较多，以后逐渐下降，到后期已经极少，未发现有致病菌。放线菌早期不显著，后期有所发展。这是各种微生物之间拮抗作用。由于霉菌能利用各种多糖作碳源，进行糖代谢，产生大量的双糖和单糖，当酵母和霉菌大量繁衍时，也抑制了细菌的生长。
但是，对普洱茶发酵过程中微生物及其应用的研究还主要集中在霉菌、酵母几种优势微生物，缺乏对微生物生态系统的整体研究；对于不同微生物对普洱茶发酵有何影响，对促进普洱茶特征成分的变化有何作用，目前研究得还不够清楚；在添加外源有益微生物以缩短发酵时间、提高普洱茶品质方面虽然有研究者作了一些尝试，也有一定的效果，但还没有形成完整和成熟的工艺。
改进后的现代自动化普洱茶工艺流程图
鲜叶（云南大叶种）
↓
杀青
↓
揉捻
↓
晒干
↓
蒸压成型←筛分及拣剔分配←青毛茶
↓
自动化发酵过程
↓
风干陈化
↓
再干燥
↓
普洱散茶←筛分及拣剔拼配→蒸压成型
↓
普洱紧压茶
2.6本课题的创新之处
1. 经过我们对自动化发酵过程中微生物的检测和控制，对设备和发酵条件进行科学的更新和设计，使普洱茶的发酵实现全调控发酵；
2．利用分子生物学手段系统研究参与普洱茶发酵不同阶段的各种微生物类群，全面了解普洱茶发酵过程中的微生物生态系统组成；
3. 系统研究普洱茶发酵过程中微生物的产酶特性、主要酶类活性及酶谱变化规律，及其对促进普洱茶特征成分变化及品质形成的作用；
4. 研究该微生物生态系统中各种微生物类群在普洱茶发酵不同阶段的生长变化规律，为人工接种微生物应用于普洱茶的发酵生产提供依据。
2.7 参考文献目录
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三. 研究计划部分
3.1本课题的主要研究内容
1、利用分子生态学方法和传统微生物方法结合，系统全面分析普洱茶自动化渥
堆过程中微生物群落构成及演变，对发酵的工艺进行微生物的检测和控制，使普洱茶的发酵在人为地全调控下进行。
在渥堆过程的各个时期采样，进行一下分析；
1）PCR 变性凝胶电泳（PCR-DGGE ）
提取发酵样品提取全DNA ，PCR 扩增霉菌和酵母（18SrDNA 和ITS ）和细菌（16SrDNA ）特异基因。通过PCR-DGGE 和DNA 测序分析各发酵时期微生物种群组成、演变。
微生物分离培养
对采取的样品进行分离培养，建立普洱茶菌种库。对所有菌株进行分类学测序鉴定。
2）荧光定量PCR 法测定渥堆过程中总霉菌数、总细菌数、优势种数、功能菌种
数量及变化规律。
2、渥堆过程中微生物代谢反应及其作用的研究
对有代表意义的样品进行全RNA 和mRNA 提取，建立cDNA 文库，通过对cDNA 库的测序和表达，分析渥堆过程中主要酶反应及其基因，结合DGGE 结果和菌种库，建立影响普洱茶品质和功效成分形成的代谢途径网络。
3、普洱茶发酵过程控制的研究：
通过对以上成果和数据分析，建立普洱茶发酵过程微生物代谢分子模型、探
索重要微生物及酶（或mRNA ）快速检测方法，开发发酵过程中微生物代谢动态调控技术。
4、微生物代谢与普洱茶功效之间关系的研究
结合项目组其他专家的成果，分析儿茶发酵过程中微生物代谢对普洱茶功效的影响。拟采用纯菌种和混合菌发酵技术，分析发酵过程及产物在降血脂降血糖和抗肿瘤上的作用及其机理。
3.2研究方案
3.2.1技术方案（技术路线、技术措施）
3.2.1.1PCR 变性凝胶电泳（PCR-DGGE ）
用匀浆机拍打茶叶进行匀浆，用DNA 试剂盒提取全DNA ，跑电泳，PCR 扩增霉菌细菌酵母的特异基因，通过PCR-DGGE 和DNA 测序分析各发酵时期微生物种群组成、演变。半定量确定优势种。
3.2.1.2微生物分离培养
（1）初步定为渥堆前，翻堆中间、翻堆时分别取样；
（2）制备菌悬液；
（3）培养分两个平行：做10-4、10-5、10-6等3 个稀释度，涂布到平板上，用LB
培养基、马丁氏培养基、YEPD 培养基、MRS 培养基放在25℃、37℃、50℃、60℃四个温度下分别恒温培养，之后进行分离筛菌，并对分离出的细菌、酵母菌和霉菌进行初步的鉴定；
（4）用斜面培养基保存；
对保存的菌种进行纯化，挑取霉菌、细菌单菌落PCR ，电泳检测，用纯化DNA 片段的试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA ，随后进行DNA 片段的克隆实验，过夜培养后，挑选白色菌落，使用PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
3.2.1.3测含水量：
1. 烘干小铝盒，标号，分别测重量并记录；
2. 每个样测5g 左右茶样，放入烘箱103℃烘5~6h，测茶叶质量；
3.计算含水率；
3.2.1.4测温度：
每天分早中晚测量发酵样品的温度，以便分析温度与微生物之间的关系，从而
对发酵条件进行改善。
3.2.2实施方案所需要的条件
①各种0净台、灭菌锅、电泳槽、PCR 仪、紫外分光光度计等。
3.2.3拟解决的关键问题
①分析自动化渥堆发酵过程中随着温度变化、含水量变化与微生物的变化的关系。
②分析渥堆过程中微生物群落构成和变化、确定各阶段主要微生物种类。
3.3 预期的研究成果及创新点
3.3.1预期研究成果：
1、对普洱茶发酵工艺进行微生物的检测和控制，实现普洱茶发酵的全调控。
2、建立普洱茶发酵菌种库，分离得到不少于100株菌株。全部进行rRNA 基因测
序和分类鉴定，对照PCR-DGGE 结果，确认获得全部优势菌种。
3、定量PCR 法测定不同渥堆时期霉菌（含酵母）、细菌及不少于5种重要微生物
的数量及其变化规律。
4、确定破茶叶细胞壁菌种和生理、培养特性。
3.3.2创新点：
1、 自动化渥堆发酵过程中的翻堆采用机械自动化，与以前所研究中的传统翻堆
取样有所不同；
2、 通过对自动化普洱茶发酵工艺的检测和调控，实现全调控发酵，使发酵更有
效率，更环保。
3、 用新方法，结合现代分子生物学与微生物学研究茶叶中的微生物；
3.4本课题的难点分析：
1、取样器的设置
2、普洱茶发酵工艺条件的检测及控制
3、普洱茶自动化发酵过程中发酵设备的设计
3.5 工作计划进度
2010.11-2011.2 文献查阅，制定实验计划；
2011.2-3 尝试各种方法提取DNA 、RNA ，进行试剂盒的筛选；
2011.3-4 在云南取样，并对自动化发酵过程的微生物进行检测
2011.4 对在云南得到的微生物匀浆液进行分析，找到最适宜普洱茶发酵的
条件
2011.5-6 通过我们得到的普洱茶发酵工艺最适条件，在云南普洱茶生产基
地对生产设备进行更新或者重新设计，以实现普洱茶的全调控发
酵
云南的普洱茶分为普洱生茶和普洱熟茶，近年来，普洱茶越来越受广大消费 者的喜爱，在云南，茶叶产生的综合产值可以达到70-80 亿元，对云南的经济发展有极大的推动作用。生产普洱茶的方式很独特，是通过渥堆发酵和后期存放中 微生物的代谢作用实现的。发酵成熟的普洱茶有甘滑、陈香和醇厚的特点，发酵 过程中微生物的代谢产物中部分产物对后期普洱茶的品质形成有影响，代谢产物 中的有益物质决定了普洱茶的保健功效[1]。
张宏达[2]认为，植物茶树属于山茶科山茶属，它的的芽叶和嫩茎经过加工可 以制得茶饮品，茶叶栽培起源国是中国，之后逐渐传播到世界其他国家，茶叶的 种植和加工经过数千年的发展，茶叶渐渐变成一种健康的饮品，茶叶的品种繁多， 茶叶的功能和风味也各有不同，而且茶叶的加工流程和技术也不太相同，所以得 到的茶叶的种类也非常丰富。云南的普洱茶源于云南的古普洱府，主要产自于思 茅、西双版纳、昆明、临沧、下关等地区，普洱茶简单的制作流程为，先把大叶 种茶的鲜叶经过晒青杀青制成晒青毛茶，然后再经过渥堆发酵，最后经过后期存 放。包括用晒青绿毛茶蒸压成型或精制整理后储存陈化得到的产品，还包括采用 晒青绿毛茶经过增湿渥堆、后期陈化及其他创新的工艺得到的产品[3]。大量研究证实:普洱茶可以生津止渴、解乏除烦、消食去腻、降血脂和解酒，所以近年来越来越受人们的欢迎。有数据证实，统计近20 多年来销量增加最快的茶叶，普洱茶是销量增加最快的茶叶中的一种，也越来越受香港、台湾以及世界其他国家人们的欢迎。在国内，普洱茶的市场以各大城市为先导不断热起来，尤其这几年来，在市场推广、加工和科研这些方面普洱茶产业也突飞猛进。
云南的普洱茶在保证传统的加工流程不变的基础上，进行了部分工艺技术的 改进。例如，在1973年，隶属云南茶叶进出口公司的昆明茶厂，在保证传统的普 洱茶前期晒青不变的前提下，后期发酵时，经过高温和高湿的人工速成的后发酵 方法，把普洱茶压制成了圆形，得到了现代式的渥堆普洱茶[4][5](图l-1) ，这种茶叶被称为渥堆普洱茶，现在也被叫作后发酵茶或者熟茶饼茶。普洱熟茶有独特的风味和品质，还有很多保健功效，这跟它的加工工艺密切相关，原来的普洱茶主要靠晒青之后放置保存，采用这种方法压制成的圆形普洱茶是生茶，也被称为青饼，或者生饼，属于黑茶类。而现在的普洱熟茶在晒青后又进行了现代的渥堆发酵，压制成圆形，成为熟饼。
产自云南的大叶种茶经过加工得到晒青毛茶(即普洱青茶) ，晒青毛茶在经过后发酵过程得到了普洱熟茶 [6].普洱茶的后发酵阶段是指在湿仓和渥堆环境
下，经过的人工的快速的自动氧化及微生物作用同时进行的阶段，也称为陈化的过程. 梁名志 [7] 在研究普洱茶的渥堆发酵过程中的理化指标时, 推理出结果：经过潮水增湿渥堆, 茶叶的含水量会随着翻堆次数的增加, 逐渐降低; 随着翻堆次数逐渐的增多，渥堆温度会升高, 但是渥堆上中下层的堆温都不一样，例如下层由于靠地面近，比中层温度低。李敏等[8]认为，不同干燥方式和不同温度等对茶叶的处理，形成茶叶的品质会有很大差别，例如，不同干燥方式处理时，晒干处理的茶叶有日晒气，辛辣味，滋味的收敛性比较强，
滋味苦，而自然晾干就对茶叶品质的形成比较有利；茶叶发酵过程中的每个阶段 温度不同，最后形成的普洱茶才有甘、醇、香的特点，但是经过恒温处理过的茶 叶，香气里有霉味，味道也很苦，所以恒温处理不利于普洱茶的品质的形成。由 此可以得出, 水分、干燥方法和温度处理方式都跟最后形成的普洱茶的滋味、香 气等品质的形成息息相关。此外, 龚淑英[9]在研究最佳普洱茶的贮存的条件时得 到:在贮存普洱茶时，随着环境的温度和茶叶的含水量增高，发现最佳的普洱茶 品质会提前出现。例如，当含水量为9%，环境温度为37℃时，普洱茶的最佳品质 会出现在贮存一百三十五天左右，当含水量为12%，环境温度为55℃时，普洱茶 的最佳品质会出现在贮存四十五天左右，经过处理的普洱茶的口感等品质较常规 发酵的普洱茶好。茶叶中各种成分随着贮存时间和贮存温度的不同，也会有所不 同：随着贮存时间的延长，贮存温度的提高，茶叶中的茶多酚和可溶性糖会下降, 下降的幅度跟含水量也有关系，含水量越高，下降的幅度就会越大；随着贮存时 间的延长，贮存温度的提高，茶叶中氨基酸的含量也会下降，但是下降幅度跟含 水量没有太大关系.
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