药 物 生 物 技 术
PharmaceuticalBiotechnology 2005,12(6):401~411401
#综 述#
合理的分子设计与工程化蛋白质药物
余 蓉
1,2
*
,吴梧桐
1*
,李灵玲
2
(1.中国药科大学 生命科学与技术学院,南京210009;2.四川大学华西药学院,成都610041)
摘 要 治疗性蛋白的分子设计与工程化已取得突破进展,基因工程药物已进入了第三代蛋白质治疗药物发展新阶段。文章重点介绍了蛋白质工程技术在优化蛋白质的疗效、稳定性、靶向性、特异性以及改善免疫原性和药代动力学等方面的分子设计策略,并结合本实验室的研究工作介绍了新近研究成功的蛋白质工程药物类型。对近年来在蛋白质工程药物研究中,常采用的的一些新技术,新方法,如点突变技术、融合蛋白技术、DNA改组技术、分子定向进化技术和蛋白质分子展示技术也作了简要讨论,同时还展望了合理的分子设计与蛋白质工程药物的发展前景。
关键词 蛋白质工程、合理分子设计、定点突变、定向进化
中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:100528915(2005)0620401211
一、蛋白质工程分子设计策略与应用
自从人类第一次采用定点突变技术对已知结构和机理的一种酶活性位点进行改造以来,蛋白质工程(ProteinEn2gineering)已经历了20年多的发展历程
(1)
1 蛋白质合理设计及其工程化程序
蛋白质分子的合理设计是以研究和应用生物分子多样性为核心的方法学为基础,综合应用结构生物学和生物信息学、计算机科学和基因工程学等一系列新技术开展新型蛋白质药物的创新研究。
1.1 基于结构生物学与生物信息学的分子设计
结构生物学对蛋白质的静态空间结构研究与其动态结构与功能关系的研究为蛋白质工程药物的合理设计提供理论依据,使药物分子设计的靶向性越来越明确。
研究人类3~4万个基因的碱基序列从而确定它们表达产物的氨基酸顺序正在逐渐实现,预测这些蛋白的空间结构,进而可实现针对性的药物设计。由于在蛋白质工程,结晶学和光谱学方面的进展,测定蛋白质结构的速度越来越快。在已知的结构中发现与新测定的生物大分子相似结构的概率也增加了;另外利用生物信息学的研究成果可以将蛋白质与所有已知结构进行比较,对靶蛋白和蛋白药物的理论模拟和结构预测就显得十分重要。对蛋白质高级结构高级结构的预测主要有三类:比较模型技术(同源建模),折叠识别方法和从头预测方法。通过结构预测与模拟为天然生物大分子的改性和基于靶结构的药物设计(即蛋白质工程)提供了理论依据。药物作用靶蛋白的X-衍射晶体结构数据库和生物大分子3D结构数据库对于合理药物设计都是非常宝贵的信息资源。已阐明结构的蛋白数量成几
,现在该技术已
能够对蛋白质的活力、特异性、稳定性和折叠性进行预期的设计改造,工程化的蛋白质已成功的应用于制药工业和许多重大疾病的治疗。蛋白质工程药物分子设计是第三代蛋白质工程药物的特征,研究蛋白质结构-功能-活性间的相互关系,设计蛋白质空间结构,并以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础,通过有控制的基因修饰和基因合成,对现有蛋白质加以定向改造、设计、构建,随后可通过高通量筛选技术的应用及加工工艺的发展等策略来获得有新药开发价值的生物分子,在这基础上进行设计新型蛋白质、多肽或其它代谢分子,包括疫苗、酶、抗体、治疗肽及其它一些生物分子,并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。运用这些方法基本上均可对所有的蛋白质序列和结构的修饰达到异常惊人的可控水平。随着蛋白质工程技术日新月异的发展,点突变技术、融合蛋白技术、DNA重组、定向进化、基因插入及基因打靶、展示技术、DNA或蛋白质芯片、药物生物信息学和计算机技术的运用,使得蛋白质工程药物研究的不断深入和完善,蛋白质工程药物新品种迅速增加,蛋白质工程药物将占据着越来越大的市场份额。并成为新型生物技术药物的快速发展前沿。
*收稿日期:2005202220 修回日期:2005208226
作者简介:余蓉,女,教授,中国药科大学攻读博士学位,主要从事生物制药研究E2mail:[email protected],
402
药物生物技术第12卷第6期
何级数递增,如应用广泛的蛋白质数据库(theproteindatabank,PDB)收载了蛋白质和核酸等生物大分子的3D结构、蛋白质X体衍射或NMR实验数据。用计算机构建全新蛋白质库,比较库中全新蛋白质与天然蛋白质,可以得到大量有用的信息。随着人类基因组和蛋白质组研究的进展,药物的靶标分子急剧增加,从复杂的生物信息中寻找合适的药物作用靶标是生物信息学的重要研究内容之一,通过基因组比较、同源性搜索、表达差异分析等寻找后选药物靶标。对于某种药靶,可预先选择天然存在的蛋白质作为其具有高亲和性和特异性的先导配体结构,然而有效天然蛋白在体内所呈现的完美性质常常不是作为药物性质的最优化,即不是所有的天然蛋白都能演化成药物而利用。因此,可利用已有的生物大分子结构和功能特性的认识,用生物信息学的方法通过计算机模拟和计算来/预测0目的蛋白的功能,对生物大分子信息处理分析为给予生物学的合理药物设计奠定了基础。第三代生物技术药物的目标是要尽可能使蛋白质的物理、化学和生物学性质可控化而达到最优化,而不是简单的模仿天然蛋白的生理作用或用抗体去封闭这种作用,未来的蛋白药物将被工程化设计而达到完全符合临床要求,包括降低免疫原性,改变对底物的特异性和对多种天然受体具有不同的活性拮抗剂,现在已诞生了为合理工程化设计蛋白的一些策略,可使不太理想的天然蛋白成为一个成功的药物。利用药靶去研发蛋白质类药物相对于小分子药物具有有两方面的低风险性,一方面,假如这种靶蛋白的活性能缓解疾病的症状,则这种靶蛋白自身就能发展成为药物(如EPO,干扰素,白介素,胰岛素,Ø因子以及各种生长因子和细胞因子);另一方面,假如这种靶蛋白质加重疾病的症状,则研发其中和抗体或可溶性的受体是一种必然合乎逻辑的研发策略,这种以疾病相关的蛋白为靶研发成功的生物药物有肿瘤坏死因子(TNT)、血管内皮生长因子和Her2
neu。此外,即使当一种靶的生物
功能未被完全阐明时也能研发治疗蛋白药物,单克隆抗体研发就是这样一个例子,利用相关生物学的资料(如对肿瘤特异性标志物的蛋白物的分析和鉴定)有价值的病因资料(如疾病靶活性传递的证据)可引导研究人员去研发对肿瘤具有唯一特异的单抗,通过功能受体(如依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和完全依赖细胞毒性消灭细胞表达靶蛋白。一个极成功的例子是Rituxan(Genentech),Rit2uxan结合CD20+,且高效拮抗CD20+B淋巴细胞,其有效性是通过CD20+肿瘤细胞的ADCC实际介导产生的。
的结构进行研究和预测并完成分子设计,再通过基因工程改造得到设计产物,并进行相关试验进行验证,根据验证结果进一步修正原初设计,并且往往要经过几次这样的循环才能获得成功。
一般可概括为如下5个阶段:
¹收集待研究蛋白质一级结构、立体结构、功能结构域及与相关蛋白质同源性等相关数据,为蛋白质分子提供依据和蓝本。
º详细分析研究对象的蛋白质结构模型,掌握其立体结构中影响生物活性、稳定性的关键部位,这可以通过研究已知的晶体结构,也可根据类似物的结构模建或其他预测方法研究。
»进行蛋白质分子设计,一类是小范围改造,二是较大程度的改造,三是蛋白质从头设计(denovoorabinitioproteindesign),即从蛋白质分子一级结构出发,设计制造自然界中不存在的全新蛋白,使之具有特定的空间结构和预期的生物功能,
¼完成了前期的信息收集整理和分子设计等理论工作,下一步就要回到实验研究中
½通过实验手段验证设计的分子是否符合要求,并对设计的分子进行结构与功能的评价。
112 蛋白质药物的研究程序
在蛋白质药物分子设计中必须了解相关蛋白质及其复合物、组装体的精细三维结构及其在各个水平上的运动和相互作用,特别是结构与功能的关系。蛋白质工程药物的设计研究过程(如图所示),首先通过生物信息学进行所研
,然其功能相关
图1 蛋白质工程药物研究程序
合理药物设计(最重要的是基于分子结构的药物设计
策略)以及各种新技术相互结合,使得各种方法在研究新药上相得益彰。现在蛋白质药物能通过合理/药物生物学0而改进,其既可以通过对靶蛋白自身的优化,或设计具有拮抗作用的抗体。最近一个完美的生物药物设计的例子是对生长激素受体(GHR)具有选择性的拮抗剂)Somavent,该药是与天然生长激素抑制剂有8个氨基酸不同的一种GHR)))特异选择性的拮抗剂,其既不活化也不抑制促乳素受体,因此在安全性方面明显改善,另一个例子是人TNF的突变体,其序列亚基是从原来天然细胞因子的激动剂变成具有抑制的作用的特异三连体复合物,这些例子说明生物药物不会长期仅限于模仿一种蛋白正常的生理作用,,还能通过合理蛋白设计去改造成为具有全新治疗活性的药物。2 蛋白质工程分子设计策略与应用
蛋白质工程不仅是药物新的研究手段,也是先进的生
表1 已批准上市的蛋白质工程药物
产品名称
Retavase(BoehringerMann2heim/centocor)
蛋白名称tPA改构物
蛋白质工程技术特点除去天然tPA5个结构域的3个结构域(N-端指形结构域、EGF结构域和Krigle2环结构域)保留天然tPA2个结构域B链CLys和Pro对换B链28位的Pro改为AspA链的Asp21突变为Gly,B链C末端加了2个Arg
Cys125ySer,缺失N端Ala,非糖基化
将B端Cys突变为Ser,去掉N端Met
人工合成的IFNA共有序列
改构物特性
产技术,它在药学的研究开发中起着重要的作用。在被批准的新药中,小分子药物所占的比例在不断减少,而蛋白质工程药物所占比例却呈稳定趋势上升。1999年,在FDA批准的40种新药中,蛋白质工程药物仅占12.5%;而在2002年,在被批准的26种新药中,蛋白质药物就占了34.6%.至今,在美国已有44种蛋白质工程药物通过FDA认可。它的产值在过去的五年里以28%的年增长率迅猛增长,仅2002年产值就高达324亿美元[2]。预计2010年蛋白质类药物年收入将超过590亿美元。现研究成功的蛋白质工程药物已达几十种,且在不断迅速增加。
加速血栓溶解作用,延长半衰期
急性心肌炎,延长半衰期将四聚体解聚为单体,快速起效NovoRapid解聚六聚体,快速起效在真皮内凝结,缓慢释放,产生长效作用
降低聚集作用增加特异性降低解聚作用,治疗多发性硬化症,增加产量比IFNA2a或IFNC2b具有更高抗病毒活性和NK细胞激活活性
产生较低分子量的产品,具有Ø因子全部活性,提高产量
将毒素靶向表达IL体的细胞、治癌
2受
Ecokinaee(GalenusMannhein)改构tPARapilysin(BoehringerMann2
heimHumalog&liprologElililly)
(Novolog)(NovoNordisk)Lantus(Aventis)Proleukin(Chiron)Betaseron(Bertex/Chiron)
快速胰岛素快速胰岛素长效胰岛素IL2突变体2FNB突变体
Infergen(Amgen)合成I型IFNA
Refacto(Geneticsinstitute)因子Ø改构物
IL2与白喉毒素融合蛋白
可溶性TNF受体
去除ØB结构域
Ontak(Seragen/Ligand)IL2与白喉毒素融合蛋白TNFR(p750)胞外配体部位与IgGFc片段融合
Thr103替换为Asn,Gln299替换为Asn
IleyLeu去除C端Tyr的磺酸基团
Enbrel(Immunex/Amgen)
增加亲和性和半衰期,抑制TNF活性治疗风湿性关节炎
延长半衰期,增加特异性,治疗急性心肌类
改变结合活性,治疗肝素诱导的Ò型血小板减少症
TNKase(Genentech/Roche)Refludan(Aventis)
tPA突变体突变型水蛭素
续 表
产品名称
Geref(Serone)
蛋白名称
人生长激素释放激素hGH-RH(合成)抗CD33单抗
蛋白质工程技术特点N末端合成物
改构物特性可发挥生物活性的最少分子片段
减少免疫原性,靶向毒素,治疗急性髓性白血病
细胞靶向治疗I型Gauchers症
比人源分子活性高50倍,治疗骨质疏松症
有利于表达生产用于骨髓移植
有利于表达治疗嗜中性细胞减少症有利于表达,治疗血小板减少症克隆的稀有干扰素,用于癌症、丙型肝炎降低了免疫原性,激活应答功能和能力,减少免疫原性提高靶向性,针对细胞表面含IL2受体的结合
减少免疫原性,治急性肾移植排斥反应减少免疫原性,治疗呼吸道疾病
减少免疫原性,治急性肾移植排斥反应增加亲和性,减少免疫原性,治疗转移乳腺癌
减少免疫原性,治疗CD20阳性B细胞非何杰金淋巴瘤延长半衰期,治疗肝炎延长半衰期,治疗白血病减少症
降低免疫原性,治疗白血病
延长半衰期,与受体结合减弱,治疗贫血延长半衰期,新的作用模式,治疗肢端肥大症
Mylotarg(AHP/celltech)人源化,融合于Calicheamicin
Cerezyme(Genzyme)Miacalcin(Novartis)LeuKine(Immunex)Neupogcn(Amgen)
Neumega(Geneticsinstitute)RoferonA(Roche)
葡萄糖脑苷脂酶
人工合成降钙素(CalcitoninSalman)突变体GM
CSF
Arg49yHis糖基化与人源序列50%一致Pro23yLeu,糖基化
N端增加Met的非糖基化形式缺失Pro
干扰素23位lysyArg(IFN-2b,23位Arg)
由小鼠抗体可变区与人抗体衡定区组成
定向TNFA的嵌合型单抗、人鼠嵌合抗体
针对IL2受体的A链的单抗人鼠嵌合抗体
人源化单抗由人抗体序列融合鼠单抗CDRs(抗原结合区)人源化单抗针对IL2受体
突变体GCSF突变型IL-11稀有干扰素2a
Mabthera(HoffmanLaRuche)嵌合抗体
Remicade(Centocor)
Simulect(Novartic/Medlm2mune)
抗TNF单抗
抗IL2受体A单抗
Synagis(MedImmune)Abbott抗F(融合)蛋白单抗Zenapax(proteinDesignLabs)
抗IL2受体A单抗
Herceptin(Genentech/Roche)抗HER2单抗人源化单抗
Rituxan(IDEC/Genetech/Roche)抗CD20单抗PEGazys(Schering-plough)Neulasta(Amgen)Oncaspar(Enzon)Aranesp(Amgen)
Somavert(Genetech/Seragen/Pharmacia)
PEGINFAPEGCSFPEGPEG-EPO
人鼠嵌合抗体聚乙二醇修饰INFA聚乙二醇修饰GCSF聚乙二醇修饰天冬酰胺酶增加糖基化位点,PEG修饰EPO
聚乙二醇修饰结合位点突变
PEG-GH
余 蓉等:合理的分子设计与工程化蛋白质药物
蛋白质工程技术是创造生物技术新药的有效方法,本实验室在多个技术领域已取得明显成效(3) 如应用PEG修饰L天冬酰胺酶和A干扰素;应用定点突变技术改善人降钙素的溶解素的溶解性能和降低L天冬酰胺酶的免疫原性;应用融合蛋白方法构建新型溶栓剂r-pA-Hiru2din;通过分子设计构建成功pro2p2ro2GHRH2Gly2Gly2cyspro2pro2PTH2Gly2Gly等。
蛋白质工程药物发展经历了3个阶段:第一阶段许多未经修饰的天然蛋白质被开发为药物。像胰岛素、EPO(促红细胞生成素)、IFN(干扰素)、G-CSF(粒细胞菌落刺激因子)和Ø因子等。第二阶段的蛋白质工程药物是在第一代的基础上加以简单的工程技术修饰,如已经上市的由Amgen公司生产的超糖基化的促红细胞生成素Aranesp、由Roche公司生产的经过聚乙二醇修饰的干扰素-APE2Gasys和由Amgen公司生产的经过聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子Neupogen。它们较未修饰的天然蛋白质有着更优良的药代动力学性质,然而经过这样改造修饰的蛋白质,药效有很大幅度的降低,为了克服这些缺陷,第三代蛋白质工程药物就应运而生。它们的出现旨在优化蛋白药物的生物学性质和理化性质。优化的机理包括:一级结构的优化处理,化学和蛋白翻译后的修饰以及融合蛋白的应用等。经过改造后的第三代蛋白质工程药物在保留着很高的活力的同时,理化性质(如溶解性、稳定性)、药代动力学性质、生物学性质(亲和力、底物特异性、免疫原性)方面都有显著的改善。蛋白质工程技术在生物新药的研究中的应用大致有8个方面:¹提高药效活性;º提高靶向性;»提高稳定性、改善药代动力学特性;¼提高工业生产效率;½降低蛋白类药物引起的免疫反应;¾获得具有新功能的蛋白质分子;¿获得特定蛋白的拮抗物或类似物;À模拟原型蛋白质分子结构开发小分子模拟肽类药物。2.1 理化性质方面的改善
蛋白治疗剂的理化性质明显地决定其在研发、制造和临床使用中的性能,具有研发价值的蛋白治疗剂往往被要求其溶解度高,且在纯化,制备贮存和给药过程中保留活性,但许多感兴趣的治疗性蛋白却常常以低浓度天然表达,且代谢迅速。现已经应用一系列设计和工程学的手段策略去改善其性质,如溶能性、稳定性同时保留所期望的生物学活性。利用蛋白质工程技术,可以提高蛋白药物的抗氧化能力;增强对抗蛋白酶的降解能力,从而简化分离纯化过程并提高收率;改变蛋白的pH值或温度稳定范围,扩大其使用范围;增大蛋白的溶解性,减少聚集作用,有利于药物发挥药效。
(1)高蛋白药物的稳定性
蛋白药物暴露在各种压力下将导致蛋白质不折叠或降解,采用合理优化方法,蛋白质能被重新构造使其结构蛋白酶405
温度的变化;pH以及溶液的条件等,一种简单的稳定策略是置换游离的半胱氨酸,这样可以防止不希望的分子内部或分子间的二硫键的合成,半胱氨酸变成丝氨酸的突变已经成功地应用于一系列蛋白药物,包括G
CSF和IFN2
vs16,结果使贮存期延长,半胱氨酸被丝氨酸突变也在FGF(成纤维细胞生长因子)上显示其半寿期增加。通过优化蛋白质的分子间相互作用可显著改善稳定性。早期的方法是应用合理的计算机设计方法去优化完善内部相互作用和掩蔽疏水基团于蛋白结构内部,进一步完善二级结构的氢键和电子相互作用也能改善蛋白质的稳定性。最近,这些原理已经应用到临床治疗蛋白质G
CSF和hGH。
CSF
采用蛋白质设计所设计出的hGH突变体具有促进细胞增殖活性,且热稳定性野生型的蛋白高16t。优化G突变体显示热稳定性提高,贮存期增加5)10倍,且同时保留了所期望的生物活性。采用蛋白质工程技术在蛋白质提高抗氧化能力方面也取得成功,人体血浆内的卵磷脂-胆固醇乙酰转移酶(LCAT)极易受到氧化作用的破坏,通过分析其分子结构推测可能是由活性部位附近两个游离的半胱氨酸衍生化造成的,加入可逆的抑制剂修饰巯基可保护酶免其被氧化,将两个游离的半胱氨酸突变为甘氨酸可增加酶的抗氧化能力。在Cu2+存在下,野生型酶只具有27%的活性,而突变体具有46%的活性。若将两个半胱氨
[4]
酸都突变为甘氨酸,可保留65%的活性。改进蛋白药物
热稳定性的方法也有减小内腔体积、引入盐桥、减少表面积与体积比、除去氧化还原基、埋蔽暴露的疏水基和除去B支链。Bogin等人对一种从极耐热菌中提取出来的乙醇脱氢酶Thermoanaerobacterbrockii(TbADH)进行三维结构的测定,发现其分子内部存在着(Glu224子对和 (Lys257
Asp237
Arg304
Lys254)的离Glu165)离子对的
网状结构,推测这种结构是使其具有很强耐热性的关键。然后对与其同源的Clostridiumbeijerinckii(CbADH)进行定点突变,改变其对应的氨基酸使突变体(单点突变、两点突变、四点突变)热稳定性得到普遍提高,而且这种改善具有加和性,四点组合突变体V224E/S254K/Q165E/M304RCbADH的热稳定性得到最大的提高。对这个突变体进行三维结构的测定,发现其确实存在着离子对和盐桥结构,这对引入的盐桥对增强分子四级结构的稳定给予肯
[5]定。另一种稳定化策略是减少蛋白水解酶的敏感性。假
如已知蛋白中某一特定的位点已存在被蛋白酶水解的明显倾向,则可采取修饰使其不能与酶特异性配对。在蛋白质柔韧的环上常常存在易被蛋白酶水解的位点。因此,另一种设计策略是制造可减少柔性的突变体。溶栓剂就是这样一类蛋白治疗剂,其对蛋白水解酶的易感性尤为重要,因为许多凝血因子可被特异的蛋白酶激活或灭活。例如提高了抗蛋白水解酶作用的Øa因子蛋白质工程突变体,氨酸易
406
血酶、FXa、活化蛋白C裂解。
(2)增强蛋白药物的溶解性能
药物生物技术第12卷第6期
改造的目的就是要防止其形成寡聚体,可以通过将B28位Pro替换为Asp,改变分子表面电荷,让它们带上同种性质的负电荷,由于排斥作用避免了寡聚体的形成;也可以通过交换B28Pro和B29Lys,干扰分子之间由B链碳末端形成的B片层的作用,从而降低聚合效应,使胰岛素快速起作用。这些保留生物活性的快速单体胰岛素现已上市。蛋白质工程还研究了缓慢释放的胰岛素,将LysB29的E-氨基和长链饱和脂肪酸进行酰化反应,通过这样的修饰,胰岛素将会在皮下组织中与饱和脂肪酸结合蛋白)白蛋白结合,从而延长其进入到血液中的时间。
(2)聚乙二醇修饰 PEG是一种非常柔性和可溶聚体,其作为蛋白药物的化学修饰剂已被广泛认可,PGC修饰是通过增加蛋白的有效的大小而有力地改善PK,当这种被PEG修饰的蛋白一般小于70Ds都有明显效果。PEG修饰也能减少免疫原性和减少聚合。虽然对不同分子量大小的PEG结合蛋白有许多化学修饰的种类,但最有效的方法一般是对N端游离的半胱氨酸进行PEG化。有几种PEG修饰的治疗蛋白已经投入市场或进行最后临床研究。如对干扰素A2b和干扰素A2a的PEG修饰能显著增加其血清半寿期5070倍以及充分减低血清浓度的变化。另一个成功的例子是PEG修饰的天冬酰胺酶(Pegaspargase)获FDA批准用于治疗急性淋巴细胞性白血病。Pegaspargase是共价连接5kDa的线性mPEG而形成,其中的PEG由琥珀酸活化,修饰位点为赖氨酸的E氨基。修饰后ASP的半衰期由原来的20h提高到357h(62.6~600h),同时也减少了诱发变态反应的几率,降低了免疫原性[6]。
(3)融合蛋白技术可通过直接操纵分子大小的方法使蛋白质自身共价结合常常会明显改善PK性质,一种治疗蛋白与另一种已知其较长血清半寿期的蛋白质(典型的是白蛋白、抗体的Fc段)融合将十分明显增加PK。Amgen和Wyeth.sEnbrel已投放市场用于治疗风湿关节炎的et2anertep是一种融合蛋白,其组成是p57骨坏死细胞受体(TNFR)细胞外的结构域与人的IgG的Fc段融合,它改善PK性质的主要机理是通过增加了分子大小和介导了内吞再循环;另外,还由于Fc是一种二聚体,其对TNFA的亲和性比单一的TNFR高50~1000倍。抗血栓的水蛭素蛋白也是融合一种蛋白质,在这种融合过程中连结蛋白质与肽需要一种非常独特的盘旋扭曲结构才能特异性的结合白蛋白。另外一个例子是在增加结合了白蛋白的抗组织因子D3H44肽也将其半寿期增加大约40倍。
(4)胞吞运输 一些在体内与细胞表面受体结合的蛋白质药物会受到胞吞运输的影响,细胞表面受体及其结合的配体能够通过胞吞作用进入细胞,又可以经过循环再次回到细胞表面。该过程的转运相互关系是高度系统依赖的,在内涵体分隔区的pH是低于其在血清中的pH。由于有是依赖值。许蛋白溶解性的解决将有力促进研发进程,可溶性原核表达可明显减少成本和增加产量。现在,越来越多的评论关注蛋白治疗剂一旦给药应确保可溶性。多聚体能引起活性减少,生物利用度降低和增加免疫原性。目前已有几种策略已成功的用于减少蛋白的聚合和提高可溶性表达。置换不成对的半胱氨酸能防止不期望的分子之间二硫键的形成。因为蛋白质分子中的游离的半胱氨酸(Cys)易在分子内部和分子之间形成二硫键,形成聚集状态,影响药物的可溶性和稳定性,降低生物利用度。将半胱氨酸(Cys)突变为丝氨酸(Ser)以防止其二硫键的形成,可以增加药物的溶解度,增强其贮藏稳定性。Chiron公司生产的Proleukin、Berlex/Chiron公司生产的Betaseron就是通过突变游离半胱氨酸以改善蛋白药物理化性质的成功例子。`另外翻译后和化学修饰也能有助于防止多聚体形成,用极性的残基取代暴露在外非极性的残基能够改善纯化蛋白的溶解性,这种策略已在霍乱毒素A1(它是一种有效的辅药)结构域改造中获得成功。在6种所产生的突变体中,有一种保留了全部的活性和稳定性,在溶解性方面已明显的改善。改变蛋白质带电荷的量和等电点也能影响其溶解度。例如在一种对肾细胞癌靶向的单链抗体的C末端加上5个谷氨酸而增加了它的溶解性。目前溶解度的障碍或多或少已成为制剂研究中的难题而必须加以足够的考虑。该难题的跨越将有待于蛋白质化学的彻底阐明后。以产生表达产量恒定的蛋白,并具有最佳溶解性和最低限度地影响其结构和功能。2.2 药代动力学性质的改善
通过PEG化,糖基化,融合成具有更长血清半寿期的蛋白体以及改变寡聚状态和调整受体介导的作用以及除去蛋白水解酶的敏感性等方法均可达到改善PK性质。对某一特定蛋白代谢主导路线和清除路线的知识将明显有助于我们决定这些策略中何种是最合适的,对于低分子量的蛋白质,肾脏过滤占主导的,因此可鼓励在增加其有效分子大小方面进行改造。在受体与配体系统PK常取决于受体介导的消除与肾清除的相互影响。亲和性和特异性修饰是许多治疗剂优化策略的重要组成。这样的受体介导的消除可能在许多蛋白质的有效性方面扮演十分重要作用,即使当这种受体是如何介导的机理还未被明确认识。目前蛋白质工程技术通过改变蛋白药物在体内形成的寡聚状态、聚乙二醇修饰、融合蛋白、胞吞运输等策略有效地完善药物的药代动学性质,提高其生物利用度。
(1)改变蛋白药物在体内形成的寡聚状态 一种蛋白的分子量大小、溶解性将影响注射后的吸收率。天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体,延缓了胰岛素从
余 蓉等:合理的分子设计与工程化蛋白质药物
体当其通过内吞途径时,可从它们相应的受体中释放出来重新循环,最近报道利用胞吞运输循环的pH依赖性运用合理的工程方法获得具有PK改善优点的G
CSF突变
体,内涵体中pH值比血清中的低,组氨酸在血清中显中性但在相对酸性的囊泡中则带上正电荷。将与受体结合有关的氨基酸突变为组氨酸,在细胞表面能够照常与受体结合,经过胞吞作用后能够更有效地将药物释放出来。这种突变型蛋白相比野生型的蛋白半寿期延长,药效提高。这个例子说明利用生物学知识的积累而进行合理工程设计方法是有能力创造更完美的治疗药物。
(5)糖基化糖基位点的特异结合将为改善PK而增添又一途径,Amgen公司的超糖基化EPO(Aranesp),是于N端附加了两个糖基化,附加的糖基化使其血清半寿期增加了3倍,同时减少了大约4倍的体外结合。这样Aransep就成为了修饰后能改善体内有效性而不减少特异活性的又一成功例子。未来的努力着眼与如何正确确定是从N-端联结或从O端联结糖基化位点以最佳保持蛋白的结构与功能的关系。2.3 生物学性质方面的改善
(1)改变酶对底物的专一性
通过比较同源蛋白家族在底物特异性方面的差异,找到引起功能多样性的主要因素,从而重新设计突变蛋白药物。枯草杆菌蛋白酶家族包括:¹细菌枯草杆菌蛋白酶BPN,它的底物特异性不强。º酵母加工酶kex2,它的作用要求底物含有P2
P1(P指底物的氨基酸序列。)»哺乳动
P1
物激素原内肽酶furin,它的作用要求底物含有P4P2
407
法是通过突变与MHCÒ型结合的肽而阻止T细胞活化,除去MHC结合的抗原表位将提供更多的温和方法去减少免疫性,这种策略将优于除去抗体的抗原表位的方法,因为MHC分子的多样体仅仅由1~2@103遗传因子突变体,尽管抗体总体估计大约有108。目前合理设计方法存在的挑战是鉴别突变体的序列、评估该突变体MHC抗原表位结合潜力且同时保留结构与功能。
降低免疫原性的另一种策略是聚乙二醇(PEG)修饰,由于PEG本身的免疫原性极低,其聚醚骨架很难被酶降解。当PEG与多肽或蛋白质结合后,其分子量比药物本身大很多,同时PEG有强大的亲水性,给药物添加了屏蔽层。PEG长链的屏蔽作用使蛋白质不被当作异源物质识别,避免了抗体的产生,降低蛋白质的免疫原性,同时PEG使蛋白药物的药代动力学性质改变。
人源化抗体也可降低免疫原性,人源化抗体就是将抗原结合区域嫁接到人抗体上,这样抗体上的外源轻链降低到最小,免疫原性也就最小。通过CDR移植已构建了30多种改型的人源化鼠抗,并通过序列分析比较和计算机模拟进行分子设计,对FR区特定碱基进行替换,保证了改型后抗体亲和力不下降,这种抗体被称之为第二代基因工程抗体(蛋白质工程抗体)。人源化抗体如治疗脊髓性白血病的AN-Tl一CD33等,其免疫反应可以忽略不计.
总之采用各种蛋白质工程技术有望使蛋白免疫原性难题的全面解决,将明显改善蛋白治疗剂的安全性和有效性,并产生新一类的人源全新蛋白进入临床。2.4 药物传输性质的改善
蛋白质或多肽药物靶向传输的目标已经开始逐步的实现。例如,应用DNA技术,X-光衍射测定结构的技术和蛋白质工程技术,再结合有关的受体介导的细胞内吞机制和细胞膜运输等有关细胞生物学的深入理解,已设计出基因编码的具有惊人细胞毒性功效和选择性的融合蛋白毒素。目前特异针对细胞表面受体的融合蛋白药物(白喉毒素融合蛋白,假单胞菌外毒素A融合蛋白、葡萄球菌成孔毒素不断获得成功[9]。融合的单抗纤溶酶原激活剂在抗血栓方面已显示出更好的效力和选择性,最近报道了白介素12(IL12)与抗体的单链Fv片段(scFv)的融合蛋白已实现了靶向传输到与血管新生有关的靶标而增强了白介素12的抗肿瘤活性[10]。针对细胞表面或细胞外靶标的重组融合蛋白质的合理设计将提供一系列独特的生物药物。根据抗原提呈细胞表面受体与配体相互作用机制,可设计特异靶向嵌合疫苗,即将抗原多肽或蛋白质特异性靶向APC,从而增强免疫应答效应。这种嵌合疫苗可使一些无免疫原性或免疫原性很弱的肿瘤特异性抗原转变成强免疫原性的抗原,因此特异性靶向抗原提呈细胞的蛋白质工程修饰嵌合疫苗的研究为我[11]。
序列。Ballinger等人在BPN中突变了两个氨基酸而使其底物特异性类似kex2,再接下来引入第三个突变碱基,使其特异性类似furin,从而改变了酶作用底物的特异性[7]。
(2)提高酶的活性Reidhaar2Olson构建了55种单一氨基酸人甲状旁腺激素(hPTH)突变体,其中,有9种突变体活性都有所增加。它们的突变位置要么位于螺旋中间区域(如Lys13),要么位于C端螺旋区域(如Glu19,Val21,Glu22,Lys27,Asp30)。大多数的活性增加都是因为将带电的残基替换为中性的残基像Ser,Asn或Gln。活性增加最高的的是Glu19换为Ser,活性为原来的2.45倍。单一氨基酸引起活性的微小变化,而多种氨基酸联合突变将会引起活性更大的改变,其中活性增加最高的一种联合突变体rhPTH,活性提高15倍。这种突变体包括6种单一氨基酸的突变,其中4种是将带电的氨基酸残基换为中性的侧链[8]。
(3)降低免疫原性
蛋白药物产生有害免疫反应明显阻碍了蛋白药物的发展,消除免疫性的最普遍的方法是突变位于蛋白序列和结构的抗原表位,抗原表位对刺激免疫系统最具反应性,通过合理置换表面残基已取得了一些成功成果,这样产生低亲和
408
2.5 亲和性和特异性的改善
药物生物技术第12卷第6期
种为/开放0构象,其能结合细胞内粘附部分子1(ICAM1),另一种是/关闭0构象,其对ICAM1非常低亲和性。天然的蛋白在关闭构象时休息,当接受信号后改变为开放构象,有学者用了两种明显策略制造一种锁住构象intergrinI结构域的突变体。第一种策略是导入成对的半胱氨酸形成二硫键使其在关闭与开放的构象中相容共处。第二种策略是在结构域的核心设计突变,使其选择稳定开放构象。
合理设计能用于改善一种治疗蛋白与其它生物分子相互作用的亲和性和特异性。在这些情况中,增加与靶蛋白结合的亲和性可导致生物活性的增加,而在另一些情况中,可通过减少对非靶分子的亲和性而降低不期望的生物活性,亲和性增加的例子是通过改变蛋白质电荷而诞生的新一代hTSH超级拮抗体,hTSH(humanthyroreopin)受体具有负电荷,突变则导入带正电荷的残基或在外围环上置换负电荷残基可增加活性,最好的一个突变体显示出在受体结合亲和性方面增加了50000倍,而体内活性增加了1000倍。
融合蛋白是将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白基因的片段组合在一起,这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上。IP10
scFv是一种新型的融合蛋白,它是由鼠体内具有趋
10)和针对酸性异
化因子功能的C素诱导蛋白(IP
二、蛋白质工程药物分子设计常用技术
目前蛋白质工程作为第三代基因工程,开创了按人类意愿设计创造蛋白的新时期,蛋白质工程技术作为先进的研发手段,它的不断发展大大加快了研究开发蛋白质药物的步伐,将使蛋白质工程药物更加显示出其诱人的前景,带来更大的经济效益和社会效益。下面主要介绍几种重要的蛋白质工程技术,其应用实例见表2。1 定点突变技术(Site2directedmutagenesis)
定点突变的前提是已知蛋白质分子的结构和功能,因此也称为理性分子设计。定点突变又分为三类:一类是通过寡核苷酸介导的基因突变;第二类是盒式突变或片段取代突变;第三类是利用聚合酶链反应(PCR),以双链DNA为模板进行的基因突变。PCR技术的出现为基因的突变,基因的剪接开辟了一条极其有效、极其敏捷的道路。另外由tRNA介导的蛋白质活性[13]、改变酶的特异性[14]、分析特定氨基酸的作用[15]等很多方面都成为必不可少的研究手段。2 外定向进化技术(directedevolutioninvitro)
体外定向进化是蛋白质工程的新策略.它不需要事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制,而是在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择),使基因发生大量变异,并定向选择出所需性质或功能,从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情.
体外定向进化属于非合理设计,定向进化=随机突变+高通量筛选,它适宜于任何蛋白质分子,大大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围.特别是它能够解决合理设计所不能解决的问题。目前发展出来的定向进化策略有:
(1)易错PCR(errorpronePCR,EPPCR)是利用低保真度TaqDNA聚合酶,或者改变PCR反应体系的条件,在新链DNA聚合过程中随机引入错配碱基,经多轮PCR扩增,构建序列多种多样的突变库。由于不改变基因长度,突变频率控制在适度范围,能有效地获得有益突变体。利用错误倾向PCR改造从厌氧菌Neocallimastixpatriciarum中提取出来的木聚糖酶的催化功能结构域,使酶具有更强的耐碱性。在所挑选出来的6个突变木聚糖酶中,出现了8个氨基酸的改变。野生型酶在pH8.5时已没有活性,而此时突变pH6.0铁蛋白(AIF)的单链Fv片段(scFv)中特定区域融合而成。将融合蛋白导入小鼠的NS0骨髓瘤细胞中进行表达可以发现,它抗AIF的scFv片段特异性没有改变,仍然具有相同的亲和力常数。融合蛋白能够与分泌酸性异铁蛋白的人肝癌SMMC7721细胞、已活化的表达CXCR3受体的小鼠T淋巴瘤细胞结合。IP10
scFv融合蛋白不管是在
溶液中还是结合在SMMC7721细胞上,都能显著地诱导T细胞的趋向性。实验结果表明,IP10scFv蛋白具有肿瘤细胞特异性抗体和IP)10趋化因子的双生物学功能,表明其具有在体外对肿瘤细胞诱导更强免疫应答的可能[12]。
合理的设计也用于制造全新作用机理和可控空间结构的全新蛋白质研究。如4-螺旋捆束细胞因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、hGH和IL6已通过工程手段创造了受体拮抗剂而非兴奋剂。大多数4螺旋捆束的细胞因子移动家族在细胞表面功能形成多重的蛋白质与蛋白质相互作用而引发信号。例如,VEGF形成同源二聚体,结合两种VEGF受体,而IL6对IL6辅受体和gp130是低亲和力的结合,拮抗剂VEGF突变体是按照同源二聚体设计的,每一个二聚体含有一个功能结合位点。一种IL6超级抑制剂通过选择性的突变而创造出来,即分解与gp130结合而产生不与其反应的突变体,该突变表现出对IL6辅受体的亲和性增加。特别感兴趣的例子是一种细胞因子拮抗剂)))hGH突变体的设计,其最近已成功完成了临床研究用于治疗肢端肥大症,hGH含有两上明显受体结合位点和二聚体化位点,hGH含有在第二受体结合位点上的点突变。这样就阻碍了受体二聚化,通过噬菌体呈示技术鉴别的另外8个突变是增加了对第一个位点的受体结合亲和力。
许多蛋白经历构象变化而形成功能中心。在这种情况下,合理设计方法能驱使构象趋于符合治疗所需的状态。一种值得注关注的例子是整合蛋白(integrmI)结构域I,一
余 蓉等:合理的分子设计与工程化蛋白质药物
突变技术构建一个组合突变体(xyn
CDBFV),酶的耐碱性
409
Hu2IFN22A的285000倍及小鼠自身活性最高的Mu2IFN2A4的3.5倍[17]。Sabine等利用DNAshuffling技术,获得的scFv(4d5Flu)突变体热稳定性热动力学常数比原scFv提高了4kcalmol,在E.coli中的产量提高了2倍,与抗原的结合常数则提高了20倍。DNA改组技术与易错PCR常常联合使用以获得更具优良性质的蛋白质.在提高大肠杆菌碱性磷酯酶(EAP)的催化活性实验中,进化过程通过两轮易错PCR和一轮DNA改组及快速灵敏的筛选程序最终挑选出有益突变体。突变体S2163的活性为1500单位/mg蛋白,比野生型EAP高40倍。.亲本D101S突变体的Km值为2384LM,而S2163突变体的Km值降低到1491LM,kcat/Km比值也相应增加了5.8倍。结果表明,突变EAP的催化活性和动力学性质都得到很大的改善[18]。
和耐热性有更大的改善。它在60t的耐热性和pH10.0时的耐碱性都比野生型的木聚糖酶高[16]。
(2)DNA改组技术(DNAshuffling)DNA改组已成功地对A-IFN家族成员(85%~97%的同源性)进行了改
进,它能有选择性地改进了自然状态下的IFN,大大增强了IFN的活性,更为重要的是减低了毒副作用。对人A2干扰素(A2IFN)基因家族的改进,产生了1026个不同的突变体,并用噬菌体表面呈现技术筛选和分析重组的IFN,获得了比IFN2A活性约高40倍的突变体。DNAshuffling用来优化药用蛋白,提高药用蛋白的临床应用价值方面的优势是有目共睹。Chang等人将20多个人类IFN2A(氨基酸同源性在85%~98%)基因作为初级文库进行DNAshuffling,筛选到3个突变体IFN2CH2.122.3。其中IFN2CH2.3抗病毒活性为Hu2IFN2A1的185倍、
表2 蛋白质工程技术原理及应用实例
蛋白工程技术
原 理
应用实例
1.构建了人甲状旁腺激素(hPTH)的单一突变体和组合
突变体,活性有所提高[8]2.改变SfBgly50酶对底物(葡萄糖苷、岩藻糖苷和半乳糖苷)的特异性[10]
3.分析CYP2D1和CYP2D2中43、45位氨基酸在酶催化功能中的作用[11]易错PCR(errorpronePCR,EPPCR)在新链DNA聚合过程中随机引入错配碱基,经多轮PCR扩增,构建序列多种多样的突变库改造从厌氧菌Neocallimastixpatriciarum中提取出来的木聚糖酶的催化功能结构域,使酶具有更强的耐碱性[16]1.获得组合突变体,提高乳酸氧化酶的热稳定性[13]2.联合易错PCR改善大肠杆菌碱性磷酯酶(EAP)催化活性和动力学性质[17]
定点突变技术(Site2di2rectedmutagenesis)
利用三联密码子的一个或两个突变来改变氨基酸,利用某个位置氨基酸的改变进而研究蛋白质结构、稳定性和催化特性的变化
DNA改组技术(DNAshuffling)
先切割产生随机大小的DNA片段,再用无引物PCR将其连接成为接近目的基因长度的DNA分子,最后进行扩增得全长基因将不同来源的功能结构域经过组合,产生具有新的生物学功能的杂合多肽。其中,渐进式切割产生杂合酶技术已用于构建ITCHY文库
用一套随机序列引物,产生互补于模板不同位置的短DNA片段库.然后进行类似于DNA改组的全长基因装配反应,获得多样性文库
把常规的退火和延伸合并为一步,并缩短其反应时间,从而只能合成出非常短的新生链,与不同模板退火而继续延伸,直到产生完整的基因长度
杂合酶(hybridenzymes)
将鼠源的scFv片添加到大肠杆菌B-半乳糖苷酶的N-末端获得了多功能性的杂合酶[19]
随机引物体外重组法(randompriminginvitrorecombination,PRP)构建具有多功能双加氧活性的联苯双加氧酶(BphDox)优化后的酶作用底物范围扩大,不仅保留了原来的2,3-双加氧活性,还获得了3,4-双加氧化活性[20]
交错延伸(straggerexten2sionprocess)联合易错PCR用于提高酯酶KCTC1767的热稳定性和对底物浓度的耐受性[21]
把来蛋白,可产性的蛋,杂合蛋
410
药物生物技术第12卷第6期
术。该策略对细胞因子可能特别有效(因为它们是靠二聚体或多个受体发挥作用)。通过改组头孢霉素酶基因家族,快速进化了拉氧头孢(moxolactamase)活性,从嵌合体药物蛋白库中,可以发现许多新的药物活性。Alcala.Pilar等人将鼠源的scFv片添加到大肠杆菌B半乳糖苷酶的N末端获得了功能性的杂合酶。这种融合蛋白非常稳定,仍然保持着原来酶的特异活性,而且还能与口蹄疫病毒特定性地结合。此外,因为这种抗原靶向的酶与抗原结合时具有酶活性,因此能作为单步免疫分析中的反应物。以上实验结果说明了鉴于大肠杆菌B半乳糖苷酶结构的柔韧性,可以利用其作为载体,携带具有特异性结合性
质的功能结构域大片段,这将大大促进涉及到抗原靶向性的生物技术的利用[19]。
(4)随机引物体外重组法(randompriminginvitrore2combination,PRP)是用一套随机序列引物,产生互补于模板不同位置的短DNA片段库.然后进行类似于DNA改组的全长基因装配反应,获得多样性文库.与DNA改组相比,RPR具有以下优点:可用单链DNA或RNA为模板.且对模板量要求少,大大降低了亲本组分,便利筛选;克服了DNA改组中DNase具有的序列偏爱性,保证了子代全长基因中突变和交叉的随机性。
Suenaga利用随机引物体外重组法对假假单孢菌KF707中联苯双加氧酶的bphA1基因进行了改造,优化后的酶不仅保留了原来的2,3双加氧活性,还获得了3,4双加氧化活性[20]。
(5)交错延伸(straggerextensionprocess)是在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,并大大缩短其反应时间(55t,5s),从而只能合成出非常短的新生链,经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸.此过程反复进行,直到产生完整的基因长度,结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子.
交错延伸PCR和易错PCR已联合应用提高KCTC1767的稳定性和对底物浓度的耐受性。KCTC1767是一种具有光学选择性的酯酶,它作为生物催化剂应用于酮洛芬的生产,但是它的结构稳定性和热稳定性都比较差,因此需要进一步的改造。KimJi2Heui.利用定向进化技术提高了KCTC1767的稳定性。经过两轮连续的易错PCR和交错延伸PCR,获得了最佳突变体652。652的催化效率比野生型的提高了1.2倍,而且此突变体更具有抵抗高浓度底物对酶的抑制作用[21]。未来的10年将会发现大量的作用靶点,一旦一个蛋白质被认为是药物作用靶点,它的生物配体就很自然地成为了候选药物,并随后进行深入的合理设计的优化研究。人类基因组全部cDNA的获得,高通量筛选蛋白质突变体库技术也取得了飞快的进展,生物信息学的利用均给蛋白质工程技术提供了强有力的支撑,尤其是在识别和新
技术。如应用生物质谱直接用来检测配体。,利用酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质相互作用,应用各种展示技术(包括噬菌体展示技术、细菌展示技术,酵母细胞展示技术,哺乳动物细胞展示技术。核糖体展示技术等),筛选和鉴定目的蛋白均取得良好的结果和广泛的应用。
蛋白质工程综合基因工程、分子生物学、细胞学等众多学科的前沿技术,为生物制药行业提供了前所未有的动力。通过X射线、分光光度计、核磁共振、圆二色谱、电镜等技术获得某些结构信息,借助电子计算模拟三维图像对蛋白质进行能量和动力学研究,应用新兴的生物信息研究技术为蛋白质工程的高效、理性和创造性奠定了更强有力的基础,创建了药物设计的新模式。蛋白工程技术为药物的研究提供的有效的技术平台,加快了开发理想蛋白质工程药物的进程。伴随着合理蛋白质设计技术的持续发展和应用,必将明显的改善已有蛋白质治疗剂的有效性和安全性以及产生完全崭新的蛋白类别和作用模式,蛋白质工程药物将占据着越来越大的市场份额。尽管相对于小分子的药物化学而言,药物生物学仍在幼年期,但生物药物在制药工业的药物研发中所显示出的巨大潜力,成功的生物制药公司的销售额已经开始超过了一些小分子药物公司,例如,2002年Amgan报道销售额为50亿美元,已超过如Baye、Schering这样已成立多年的著名药厂,甚至超过了像Rochen这样有100年历史的小分子药物生产制造公司,该公司现在排名最前的15种产品中有8种是蛋白药物,占其2003年上半年50亿美元的销售额的60%(22)。尽管这样例子是有限的,蛋白药物还存在口服生物利用度不足和潜在免疫原性,合理的分子设计蛋白药物已经开始走向实际的应用,改变一种典型内源性蛋白成为一种成功的治疗药物常常必须优化一系列参数,例如稳定性、溶解度、PK、免疫性,以保护或甚至提高功效,已经出现的许多策略和方法去改变这些参数,我们期待随着合理蛋白设计技术的特点发展和应用,必将明显地改善已有蛋白治疗剂的有效性和安全性,以及产生完全崭新的蛋白类别和作用模式。
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RationalDesignandEngineeringofTherapeuticProteins
YURong1,2,WUWu2tong1,*,LILing2ling2
(11SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing,210009;21WestChinaSchoolofpharmacy,SichuanUniversity,Chengdu,610041China)
Abstract Theproteinsmoleculardesignisanimportantmethodtodevelopnewbiotechdrugs.Thepro2teinengineeringtechniquehasbecomeaeffectivestratagemtoimprovevariantproperitiesoftherapeuticproteins,includingenhancedthermostability,bioactivespecifity,targeteddeliverty,decreaseinimmunityandimprovingpharmacokinetics.
Numeroustherapeuticproteinsproducedbyproteinengineeringhasbeendevelopedandusedinclin2ic,asparaginaseandcalcitoninbysitedirectedmutagenesis,PEGIFNA2b,CpAHirudin,proproGHRHGlyGlyCysandproproPTHGlyglyhasbeendesignedanddevelopedsucessful2lyinourLab.
Sitedirectedmutagenesis,DNAsuffling,directedevolution,expressionoffusionproteinspromotethecreationofnewtherpeuticproteins,tendsonrationaldesignandengineeringoftherapeuticproteinswerediscussed.
药 物 生 物 技 术
PharmaceuticalBiotechnology 2005,12(6):401~411401
#综 述#
合理的分子设计与工程化蛋白质药物
余 蓉
1,2
*
,吴梧桐
1*
,李灵玲
2
(1.中国药科大学 生命科学与技术学院,南京210009;2.四川大学华西药学院,成都610041)
摘 要 治疗性蛋白的分子设计与工程化已取得突破进展,基因工程药物已进入了第三代蛋白质治疗药物发展新阶段。文章重点介绍了蛋白质工程技术在优化蛋白质的疗效、稳定性、靶向性、特异性以及改善免疫原性和药代动力学等方面的分子设计策略,并结合本实验室的研究工作介绍了新近研究成功的蛋白质工程药物类型。对近年来在蛋白质工程药物研究中,常采用的的一些新技术,新方法,如点突变技术、融合蛋白技术、DNA改组技术、分子定向进化技术和蛋白质分子展示技术也作了简要讨论,同时还展望了合理的分子设计与蛋白质工程药物的发展前景。
关键词 蛋白质工程、合理分子设计、定点突变、定向进化
中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:100528915(2005)0620401211
一、蛋白质工程分子设计策略与应用
自从人类第一次采用定点突变技术对已知结构和机理的一种酶活性位点进行改造以来,蛋白质工程(ProteinEn2gineering)已经历了20年多的发展历程
(1)
1 蛋白质合理设计及其工程化程序
蛋白质分子的合理设计是以研究和应用生物分子多样性为核心的方法学为基础,综合应用结构生物学和生物信息学、计算机科学和基因工程学等一系列新技术开展新型蛋白质药物的创新研究。
1.1 基于结构生物学与生物信息学的分子设计
结构生物学对蛋白质的静态空间结构研究与其动态结构与功能关系的研究为蛋白质工程药物的合理设计提供理论依据,使药物分子设计的靶向性越来越明确。
研究人类3~4万个基因的碱基序列从而确定它们表达产物的氨基酸顺序正在逐渐实现,预测这些蛋白的空间结构,进而可实现针对性的药物设计。由于在蛋白质工程,结晶学和光谱学方面的进展,测定蛋白质结构的速度越来越快。在已知的结构中发现与新测定的生物大分子相似结构的概率也增加了;另外利用生物信息学的研究成果可以将蛋白质与所有已知结构进行比较,对靶蛋白和蛋白药物的理论模拟和结构预测就显得十分重要。对蛋白质高级结构高级结构的预测主要有三类:比较模型技术(同源建模),折叠识别方法和从头预测方法。通过结构预测与模拟为天然生物大分子的改性和基于靶结构的药物设计(即蛋白质工程)提供了理论依据。药物作用靶蛋白的X-衍射晶体结构数据库和生物大分子3D结构数据库对于合理药物设计都是非常宝贵的信息资源。已阐明结构的蛋白数量成几
,现在该技术已
能够对蛋白质的活力、特异性、稳定性和折叠性进行预期的设计改造,工程化的蛋白质已成功的应用于制药工业和许多重大疾病的治疗。蛋白质工程药物分子设计是第三代蛋白质工程药物的特征,研究蛋白质结构-功能-活性间的相互关系,设计蛋白质空间结构,并以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础,通过有控制的基因修饰和基因合成,对现有蛋白质加以定向改造、设计、构建,随后可通过高通量筛选技术的应用及加工工艺的发展等策略来获得有新药开发价值的生物分子,在这基础上进行设计新型蛋白质、多肽或其它代谢分子,包括疫苗、酶、抗体、治疗肽及其它一些生物分子,并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。运用这些方法基本上均可对所有的蛋白质序列和结构的修饰达到异常惊人的可控水平。随着蛋白质工程技术日新月异的发展,点突变技术、融合蛋白技术、DNA重组、定向进化、基因插入及基因打靶、展示技术、DNA或蛋白质芯片、药物生物信息学和计算机技术的运用,使得蛋白质工程药物研究的不断深入和完善,蛋白质工程药物新品种迅速增加,蛋白质工程药物将占据着越来越大的市场份额。并成为新型生物技术药物的快速发展前沿。
*收稿日期:2005202220 修回日期:2005208226
作者简介:余蓉,女,教授,中国药科大学攻读博士学位,主要从事生物制药研究E2mail:[email protected],
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药物生物技术第12卷第6期
何级数递增,如应用广泛的蛋白质数据库(theproteindatabank,PDB)收载了蛋白质和核酸等生物大分子的3D结构、蛋白质X体衍射或NMR实验数据。用计算机构建全新蛋白质库,比较库中全新蛋白质与天然蛋白质,可以得到大量有用的信息。随着人类基因组和蛋白质组研究的进展,药物的靶标分子急剧增加,从复杂的生物信息中寻找合适的药物作用靶标是生物信息学的重要研究内容之一,通过基因组比较、同源性搜索、表达差异分析等寻找后选药物靶标。对于某种药靶,可预先选择天然存在的蛋白质作为其具有高亲和性和特异性的先导配体结构,然而有效天然蛋白在体内所呈现的完美性质常常不是作为药物性质的最优化,即不是所有的天然蛋白都能演化成药物而利用。因此,可利用已有的生物大分子结构和功能特性的认识,用生物信息学的方法通过计算机模拟和计算来/预测0目的蛋白的功能,对生物大分子信息处理分析为给予生物学的合理药物设计奠定了基础。第三代生物技术药物的目标是要尽可能使蛋白质的物理、化学和生物学性质可控化而达到最优化,而不是简单的模仿天然蛋白的生理作用或用抗体去封闭这种作用,未来的蛋白药物将被工程化设计而达到完全符合临床要求,包括降低免疫原性,改变对底物的特异性和对多种天然受体具有不同的活性拮抗剂,现在已诞生了为合理工程化设计蛋白的一些策略,可使不太理想的天然蛋白成为一个成功的药物。利用药靶去研发蛋白质类药物相对于小分子药物具有有两方面的低风险性,一方面,假如这种靶蛋白的活性能缓解疾病的症状,则这种靶蛋白自身就能发展成为药物(如EPO,干扰素,白介素,胰岛素,Ø因子以及各种生长因子和细胞因子);另一方面,假如这种靶蛋白质加重疾病的症状,则研发其中和抗体或可溶性的受体是一种必然合乎逻辑的研发策略,这种以疾病相关的蛋白为靶研发成功的生物药物有肿瘤坏死因子(TNT)、血管内皮生长因子和Her2
neu。此外,即使当一种靶的生物
功能未被完全阐明时也能研发治疗蛋白药物,单克隆抗体研发就是这样一个例子,利用相关生物学的资料(如对肿瘤特异性标志物的蛋白物的分析和鉴定)有价值的病因资料(如疾病靶活性传递的证据)可引导研究人员去研发对肿瘤具有唯一特异的单抗,通过功能受体(如依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和完全依赖细胞毒性消灭细胞表达靶蛋白。一个极成功的例子是Rituxan(Genentech),Rit2uxan结合CD20+,且高效拮抗CD20+B淋巴细胞,其有效性是通过CD20+肿瘤细胞的ADCC实际介导产生的。
的结构进行研究和预测并完成分子设计,再通过基因工程改造得到设计产物,并进行相关试验进行验证,根据验证结果进一步修正原初设计,并且往往要经过几次这样的循环才能获得成功。
一般可概括为如下5个阶段:
¹收集待研究蛋白质一级结构、立体结构、功能结构域及与相关蛋白质同源性等相关数据,为蛋白质分子提供依据和蓝本。
º详细分析研究对象的蛋白质结构模型,掌握其立体结构中影响生物活性、稳定性的关键部位,这可以通过研究已知的晶体结构,也可根据类似物的结构模建或其他预测方法研究。
»进行蛋白质分子设计,一类是小范围改造,二是较大程度的改造,三是蛋白质从头设计(denovoorabinitioproteindesign),即从蛋白质分子一级结构出发,设计制造自然界中不存在的全新蛋白,使之具有特定的空间结构和预期的生物功能,
¼完成了前期的信息收集整理和分子设计等理论工作,下一步就要回到实验研究中
½通过实验手段验证设计的分子是否符合要求,并对设计的分子进行结构与功能的评价。
112 蛋白质药物的研究程序
在蛋白质药物分子设计中必须了解相关蛋白质及其复合物、组装体的精细三维结构及其在各个水平上的运动和相互作用,特别是结构与功能的关系。蛋白质工程药物的设计研究过程(如图所示),首先通过生物信息学进行所研
,然其功能相关
图1 蛋白质工程药物研究程序
合理药物设计(最重要的是基于分子结构的药物设计
策略)以及各种新技术相互结合,使得各种方法在研究新药上相得益彰。现在蛋白质药物能通过合理/药物生物学0而改进,其既可以通过对靶蛋白自身的优化,或设计具有拮抗作用的抗体。最近一个完美的生物药物设计的例子是对生长激素受体(GHR)具有选择性的拮抗剂)Somavent,该药是与天然生长激素抑制剂有8个氨基酸不同的一种GHR)))特异选择性的拮抗剂,其既不活化也不抑制促乳素受体,因此在安全性方面明显改善,另一个例子是人TNF的突变体,其序列亚基是从原来天然细胞因子的激动剂变成具有抑制的作用的特异三连体复合物,这些例子说明生物药物不会长期仅限于模仿一种蛋白正常的生理作用,,还能通过合理蛋白设计去改造成为具有全新治疗活性的药物。2 蛋白质工程分子设计策略与应用
蛋白质工程不仅是药物新的研究手段,也是先进的生
表1 已批准上市的蛋白质工程药物
产品名称
Retavase(BoehringerMann2heim/centocor)
蛋白名称tPA改构物
蛋白质工程技术特点除去天然tPA5个结构域的3个结构域(N-端指形结构域、EGF结构域和Krigle2环结构域)保留天然tPA2个结构域B链CLys和Pro对换B链28位的Pro改为AspA链的Asp21突变为Gly,B链C末端加了2个Arg
Cys125ySer,缺失N端Ala,非糖基化
将B端Cys突变为Ser,去掉N端Met
人工合成的IFNA共有序列
改构物特性
产技术,它在药学的研究开发中起着重要的作用。在被批准的新药中,小分子药物所占的比例在不断减少,而蛋白质工程药物所占比例却呈稳定趋势上升。1999年,在FDA批准的40种新药中,蛋白质工程药物仅占12.5%;而在2002年,在被批准的26种新药中,蛋白质药物就占了34.6%.至今,在美国已有44种蛋白质工程药物通过FDA认可。它的产值在过去的五年里以28%的年增长率迅猛增长,仅2002年产值就高达324亿美元[2]。预计2010年蛋白质类药物年收入将超过590亿美元。现研究成功的蛋白质工程药物已达几十种,且在不断迅速增加。
加速血栓溶解作用,延长半衰期
急性心肌炎,延长半衰期将四聚体解聚为单体,快速起效NovoRapid解聚六聚体,快速起效在真皮内凝结,缓慢释放,产生长效作用
降低聚集作用增加特异性降低解聚作用,治疗多发性硬化症,增加产量比IFNA2a或IFNC2b具有更高抗病毒活性和NK细胞激活活性
产生较低分子量的产品,具有Ø因子全部活性,提高产量
将毒素靶向表达IL体的细胞、治癌
2受
Ecokinaee(GalenusMannhein)改构tPARapilysin(BoehringerMann2
heimHumalog&liprologElililly)
(Novolog)(NovoNordisk)Lantus(Aventis)Proleukin(Chiron)Betaseron(Bertex/Chiron)
快速胰岛素快速胰岛素长效胰岛素IL2突变体2FNB突变体
Infergen(Amgen)合成I型IFNA
Refacto(Geneticsinstitute)因子Ø改构物
IL2与白喉毒素融合蛋白
可溶性TNF受体
去除ØB结构域
Ontak(Seragen/Ligand)IL2与白喉毒素融合蛋白TNFR(p750)胞外配体部位与IgGFc片段融合
Thr103替换为Asn,Gln299替换为Asn
IleyLeu去除C端Tyr的磺酸基团
Enbrel(Immunex/Amgen)
增加亲和性和半衰期,抑制TNF活性治疗风湿性关节炎
延长半衰期,增加特异性,治疗急性心肌类
改变结合活性,治疗肝素诱导的Ò型血小板减少症
TNKase(Genentech/Roche)Refludan(Aventis)
tPA突变体突变型水蛭素
续 表
产品名称
Geref(Serone)
蛋白名称
人生长激素释放激素hGH-RH(合成)抗CD33单抗
蛋白质工程技术特点N末端合成物
改构物特性可发挥生物活性的最少分子片段
减少免疫原性,靶向毒素,治疗急性髓性白血病
细胞靶向治疗I型Gauchers症
比人源分子活性高50倍,治疗骨质疏松症
有利于表达生产用于骨髓移植
有利于表达治疗嗜中性细胞减少症有利于表达,治疗血小板减少症克隆的稀有干扰素,用于癌症、丙型肝炎降低了免疫原性,激活应答功能和能力,减少免疫原性提高靶向性,针对细胞表面含IL2受体的结合
减少免疫原性,治急性肾移植排斥反应减少免疫原性,治疗呼吸道疾病
减少免疫原性,治急性肾移植排斥反应增加亲和性,减少免疫原性,治疗转移乳腺癌
减少免疫原性,治疗CD20阳性B细胞非何杰金淋巴瘤延长半衰期,治疗肝炎延长半衰期,治疗白血病减少症
降低免疫原性,治疗白血病
延长半衰期,与受体结合减弱,治疗贫血延长半衰期,新的作用模式,治疗肢端肥大症
Mylotarg(AHP/celltech)人源化,融合于Calicheamicin
Cerezyme(Genzyme)Miacalcin(Novartis)LeuKine(Immunex)Neupogcn(Amgen)
Neumega(Geneticsinstitute)RoferonA(Roche)
葡萄糖脑苷脂酶
人工合成降钙素(CalcitoninSalman)突变体GM
CSF
Arg49yHis糖基化与人源序列50%一致Pro23yLeu,糖基化
N端增加Met的非糖基化形式缺失Pro
干扰素23位lysyArg(IFN-2b,23位Arg)
由小鼠抗体可变区与人抗体衡定区组成
定向TNFA的嵌合型单抗、人鼠嵌合抗体
针对IL2受体的A链的单抗人鼠嵌合抗体
人源化单抗由人抗体序列融合鼠单抗CDRs(抗原结合区)人源化单抗针对IL2受体
突变体GCSF突变型IL-11稀有干扰素2a
Mabthera(HoffmanLaRuche)嵌合抗体
Remicade(Centocor)
Simulect(Novartic/Medlm2mune)
抗TNF单抗
抗IL2受体A单抗
Synagis(MedImmune)Abbott抗F(融合)蛋白单抗Zenapax(proteinDesignLabs)
抗IL2受体A单抗
Herceptin(Genentech/Roche)抗HER2单抗人源化单抗
Rituxan(IDEC/Genetech/Roche)抗CD20单抗PEGazys(Schering-plough)Neulasta(Amgen)Oncaspar(Enzon)Aranesp(Amgen)
Somavert(Genetech/Seragen/Pharmacia)
PEGINFAPEGCSFPEGPEG-EPO
人鼠嵌合抗体聚乙二醇修饰INFA聚乙二醇修饰GCSF聚乙二醇修饰天冬酰胺酶增加糖基化位点,PEG修饰EPO
聚乙二醇修饰结合位点突变
PEG-GH
余 蓉等:合理的分子设计与工程化蛋白质药物
蛋白质工程技术是创造生物技术新药的有效方法,本实验室在多个技术领域已取得明显成效(3) 如应用PEG修饰L天冬酰胺酶和A干扰素;应用定点突变技术改善人降钙素的溶解素的溶解性能和降低L天冬酰胺酶的免疫原性;应用融合蛋白方法构建新型溶栓剂r-pA-Hiru2din;通过分子设计构建成功pro2p2ro2GHRH2Gly2Gly2cyspro2pro2PTH2Gly2Gly等。
蛋白质工程药物发展经历了3个阶段:第一阶段许多未经修饰的天然蛋白质被开发为药物。像胰岛素、EPO(促红细胞生成素)、IFN(干扰素)、G-CSF(粒细胞菌落刺激因子)和Ø因子等。第二阶段的蛋白质工程药物是在第一代的基础上加以简单的工程技术修饰,如已经上市的由Amgen公司生产的超糖基化的促红细胞生成素Aranesp、由Roche公司生产的经过聚乙二醇修饰的干扰素-APE2Gasys和由Amgen公司生产的经过聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子Neupogen。它们较未修饰的天然蛋白质有着更优良的药代动力学性质,然而经过这样改造修饰的蛋白质,药效有很大幅度的降低,为了克服这些缺陷,第三代蛋白质工程药物就应运而生。它们的出现旨在优化蛋白药物的生物学性质和理化性质。优化的机理包括:一级结构的优化处理,化学和蛋白翻译后的修饰以及融合蛋白的应用等。经过改造后的第三代蛋白质工程药物在保留着很高的活力的同时,理化性质(如溶解性、稳定性)、药代动力学性质、生物学性质(亲和力、底物特异性、免疫原性)方面都有显著的改善。蛋白质工程技术在生物新药的研究中的应用大致有8个方面:¹提高药效活性;º提高靶向性;»提高稳定性、改善药代动力学特性;¼提高工业生产效率;½降低蛋白类药物引起的免疫反应;¾获得具有新功能的蛋白质分子;¿获得特定蛋白的拮抗物或类似物;À模拟原型蛋白质分子结构开发小分子模拟肽类药物。2.1 理化性质方面的改善
蛋白治疗剂的理化性质明显地决定其在研发、制造和临床使用中的性能,具有研发价值的蛋白治疗剂往往被要求其溶解度高,且在纯化,制备贮存和给药过程中保留活性,但许多感兴趣的治疗性蛋白却常常以低浓度天然表达,且代谢迅速。现已经应用一系列设计和工程学的手段策略去改善其性质,如溶能性、稳定性同时保留所期望的生物学活性。利用蛋白质工程技术,可以提高蛋白药物的抗氧化能力;增强对抗蛋白酶的降解能力,从而简化分离纯化过程并提高收率;改变蛋白的pH值或温度稳定范围,扩大其使用范围;增大蛋白的溶解性,减少聚集作用,有利于药物发挥药效。
(1)高蛋白药物的稳定性
蛋白药物暴露在各种压力下将导致蛋白质不折叠或降解,采用合理优化方法,蛋白质能被重新构造使其结构蛋白酶405
温度的变化;pH以及溶液的条件等,一种简单的稳定策略是置换游离的半胱氨酸,这样可以防止不希望的分子内部或分子间的二硫键的合成,半胱氨酸变成丝氨酸的突变已经成功地应用于一系列蛋白药物,包括G
CSF和IFN2
vs16,结果使贮存期延长,半胱氨酸被丝氨酸突变也在FGF(成纤维细胞生长因子)上显示其半寿期增加。通过优化蛋白质的分子间相互作用可显著改善稳定性。早期的方法是应用合理的计算机设计方法去优化完善内部相互作用和掩蔽疏水基团于蛋白结构内部,进一步完善二级结构的氢键和电子相互作用也能改善蛋白质的稳定性。最近,这些原理已经应用到临床治疗蛋白质G
CSF和hGH。
CSF
采用蛋白质设计所设计出的hGH突变体具有促进细胞增殖活性,且热稳定性野生型的蛋白高16t。优化G突变体显示热稳定性提高,贮存期增加5)10倍,且同时保留了所期望的生物活性。采用蛋白质工程技术在蛋白质提高抗氧化能力方面也取得成功,人体血浆内的卵磷脂-胆固醇乙酰转移酶(LCAT)极易受到氧化作用的破坏,通过分析其分子结构推测可能是由活性部位附近两个游离的半胱氨酸衍生化造成的,加入可逆的抑制剂修饰巯基可保护酶免其被氧化,将两个游离的半胱氨酸突变为甘氨酸可增加酶的抗氧化能力。在Cu2+存在下,野生型酶只具有27%的活性,而突变体具有46%的活性。若将两个半胱氨
[4]
酸都突变为甘氨酸,可保留65%的活性。改进蛋白药物
热稳定性的方法也有减小内腔体积、引入盐桥、减少表面积与体积比、除去氧化还原基、埋蔽暴露的疏水基和除去B支链。Bogin等人对一种从极耐热菌中提取出来的乙醇脱氢酶Thermoanaerobacterbrockii(TbADH)进行三维结构的测定,发现其分子内部存在着(Glu224子对和 (Lys257
Asp237
Arg304
Lys254)的离Glu165)离子对的
网状结构,推测这种结构是使其具有很强耐热性的关键。然后对与其同源的Clostridiumbeijerinckii(CbADH)进行定点突变,改变其对应的氨基酸使突变体(单点突变、两点突变、四点突变)热稳定性得到普遍提高,而且这种改善具有加和性,四点组合突变体V224E/S254K/Q165E/M304RCbADH的热稳定性得到最大的提高。对这个突变体进行三维结构的测定,发现其确实存在着离子对和盐桥结构,这对引入的盐桥对增强分子四级结构的稳定给予肯
[5]定。另一种稳定化策略是减少蛋白水解酶的敏感性。假
如已知蛋白中某一特定的位点已存在被蛋白酶水解的明显倾向,则可采取修饰使其不能与酶特异性配对。在蛋白质柔韧的环上常常存在易被蛋白酶水解的位点。因此,另一种设计策略是制造可减少柔性的突变体。溶栓剂就是这样一类蛋白治疗剂,其对蛋白水解酶的易感性尤为重要,因为许多凝血因子可被特异的蛋白酶激活或灭活。例如提高了抗蛋白水解酶作用的Øa因子蛋白质工程突变体,氨酸易
406
血酶、FXa、活化蛋白C裂解。
(2)增强蛋白药物的溶解性能
药物生物技术第12卷第6期
改造的目的就是要防止其形成寡聚体,可以通过将B28位Pro替换为Asp,改变分子表面电荷,让它们带上同种性质的负电荷,由于排斥作用避免了寡聚体的形成;也可以通过交换B28Pro和B29Lys,干扰分子之间由B链碳末端形成的B片层的作用,从而降低聚合效应,使胰岛素快速起作用。这些保留生物活性的快速单体胰岛素现已上市。蛋白质工程还研究了缓慢释放的胰岛素,将LysB29的E-氨基和长链饱和脂肪酸进行酰化反应,通过这样的修饰,胰岛素将会在皮下组织中与饱和脂肪酸结合蛋白)白蛋白结合,从而延长其进入到血液中的时间。
(2)聚乙二醇修饰 PEG是一种非常柔性和可溶聚体,其作为蛋白药物的化学修饰剂已被广泛认可,PGC修饰是通过增加蛋白的有效的大小而有力地改善PK,当这种被PEG修饰的蛋白一般小于70Ds都有明显效果。PEG修饰也能减少免疫原性和减少聚合。虽然对不同分子量大小的PEG结合蛋白有许多化学修饰的种类,但最有效的方法一般是对N端游离的半胱氨酸进行PEG化。有几种PEG修饰的治疗蛋白已经投入市场或进行最后临床研究。如对干扰素A2b和干扰素A2a的PEG修饰能显著增加其血清半寿期5070倍以及充分减低血清浓度的变化。另一个成功的例子是PEG修饰的天冬酰胺酶(Pegaspargase)获FDA批准用于治疗急性淋巴细胞性白血病。Pegaspargase是共价连接5kDa的线性mPEG而形成,其中的PEG由琥珀酸活化,修饰位点为赖氨酸的E氨基。修饰后ASP的半衰期由原来的20h提高到357h(62.6~600h),同时也减少了诱发变态反应的几率,降低了免疫原性[6]。
(3)融合蛋白技术可通过直接操纵分子大小的方法使蛋白质自身共价结合常常会明显改善PK性质,一种治疗蛋白与另一种已知其较长血清半寿期的蛋白质(典型的是白蛋白、抗体的Fc段)融合将十分明显增加PK。Amgen和Wyeth.sEnbrel已投放市场用于治疗风湿关节炎的et2anertep是一种融合蛋白,其组成是p57骨坏死细胞受体(TNFR)细胞外的结构域与人的IgG的Fc段融合,它改善PK性质的主要机理是通过增加了分子大小和介导了内吞再循环;另外,还由于Fc是一种二聚体,其对TNFA的亲和性比单一的TNFR高50~1000倍。抗血栓的水蛭素蛋白也是融合一种蛋白质,在这种融合过程中连结蛋白质与肽需要一种非常独特的盘旋扭曲结构才能特异性的结合白蛋白。另外一个例子是在增加结合了白蛋白的抗组织因子D3H44肽也将其半寿期增加大约40倍。
(4)胞吞运输 一些在体内与细胞表面受体结合的蛋白质药物会受到胞吞运输的影响,细胞表面受体及其结合的配体能够通过胞吞作用进入细胞,又可以经过循环再次回到细胞表面。该过程的转运相互关系是高度系统依赖的,在内涵体分隔区的pH是低于其在血清中的pH。由于有是依赖值。许蛋白溶解性的解决将有力促进研发进程,可溶性原核表达可明显减少成本和增加产量。现在,越来越多的评论关注蛋白治疗剂一旦给药应确保可溶性。多聚体能引起活性减少,生物利用度降低和增加免疫原性。目前已有几种策略已成功的用于减少蛋白的聚合和提高可溶性表达。置换不成对的半胱氨酸能防止不期望的分子之间二硫键的形成。因为蛋白质分子中的游离的半胱氨酸(Cys)易在分子内部和分子之间形成二硫键,形成聚集状态,影响药物的可溶性和稳定性,降低生物利用度。将半胱氨酸(Cys)突变为丝氨酸(Ser)以防止其二硫键的形成,可以增加药物的溶解度,增强其贮藏稳定性。Chiron公司生产的Proleukin、Berlex/Chiron公司生产的Betaseron就是通过突变游离半胱氨酸以改善蛋白药物理化性质的成功例子。`另外翻译后和化学修饰也能有助于防止多聚体形成,用极性的残基取代暴露在外非极性的残基能够改善纯化蛋白的溶解性,这种策略已在霍乱毒素A1(它是一种有效的辅药)结构域改造中获得成功。在6种所产生的突变体中,有一种保留了全部的活性和稳定性,在溶解性方面已明显的改善。改变蛋白质带电荷的量和等电点也能影响其溶解度。例如在一种对肾细胞癌靶向的单链抗体的C末端加上5个谷氨酸而增加了它的溶解性。目前溶解度的障碍或多或少已成为制剂研究中的难题而必须加以足够的考虑。该难题的跨越将有待于蛋白质化学的彻底阐明后。以产生表达产量恒定的蛋白,并具有最佳溶解性和最低限度地影响其结构和功能。2.2 药代动力学性质的改善
通过PEG化,糖基化,融合成具有更长血清半寿期的蛋白体以及改变寡聚状态和调整受体介导的作用以及除去蛋白水解酶的敏感性等方法均可达到改善PK性质。对某一特定蛋白代谢主导路线和清除路线的知识将明显有助于我们决定这些策略中何种是最合适的,对于低分子量的蛋白质,肾脏过滤占主导的,因此可鼓励在增加其有效分子大小方面进行改造。在受体与配体系统PK常取决于受体介导的消除与肾清除的相互影响。亲和性和特异性修饰是许多治疗剂优化策略的重要组成。这样的受体介导的消除可能在许多蛋白质的有效性方面扮演十分重要作用,即使当这种受体是如何介导的机理还未被明确认识。目前蛋白质工程技术通过改变蛋白药物在体内形成的寡聚状态、聚乙二醇修饰、融合蛋白、胞吞运输等策略有效地完善药物的药代动学性质,提高其生物利用度。
(1)改变蛋白药物在体内形成的寡聚状态 一种蛋白的分子量大小、溶解性将影响注射后的吸收率。天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体,延缓了胰岛素从
余 蓉等:合理的分子设计与工程化蛋白质药物
体当其通过内吞途径时,可从它们相应的受体中释放出来重新循环,最近报道利用胞吞运输循环的pH依赖性运用合理的工程方法获得具有PK改善优点的G
CSF突变
体,内涵体中pH值比血清中的低,组氨酸在血清中显中性但在相对酸性的囊泡中则带上正电荷。将与受体结合有关的氨基酸突变为组氨酸,在细胞表面能够照常与受体结合,经过胞吞作用后能够更有效地将药物释放出来。这种突变型蛋白相比野生型的蛋白半寿期延长,药效提高。这个例子说明利用生物学知识的积累而进行合理工程设计方法是有能力创造更完美的治疗药物。
(5)糖基化糖基位点的特异结合将为改善PK而增添又一途径,Amgen公司的超糖基化EPO(Aranesp),是于N端附加了两个糖基化,附加的糖基化使其血清半寿期增加了3倍,同时减少了大约4倍的体外结合。这样Aransep就成为了修饰后能改善体内有效性而不减少特异活性的又一成功例子。未来的努力着眼与如何正确确定是从N-端联结或从O端联结糖基化位点以最佳保持蛋白的结构与功能的关系。2.3 生物学性质方面的改善
(1)改变酶对底物的专一性
通过比较同源蛋白家族在底物特异性方面的差异,找到引起功能多样性的主要因素,从而重新设计突变蛋白药物。枯草杆菌蛋白酶家族包括:¹细菌枯草杆菌蛋白酶BPN,它的底物特异性不强。º酵母加工酶kex2,它的作用要求底物含有P2
P1(P指底物的氨基酸序列。)»哺乳动
P1
物激素原内肽酶furin,它的作用要求底物含有P4P2
407
法是通过突变与MHCÒ型结合的肽而阻止T细胞活化,除去MHC结合的抗原表位将提供更多的温和方法去减少免疫性,这种策略将优于除去抗体的抗原表位的方法,因为MHC分子的多样体仅仅由1~2@103遗传因子突变体,尽管抗体总体估计大约有108。目前合理设计方法存在的挑战是鉴别突变体的序列、评估该突变体MHC抗原表位结合潜力且同时保留结构与功能。
降低免疫原性的另一种策略是聚乙二醇(PEG)修饰,由于PEG本身的免疫原性极低,其聚醚骨架很难被酶降解。当PEG与多肽或蛋白质结合后,其分子量比药物本身大很多,同时PEG有强大的亲水性,给药物添加了屏蔽层。PEG长链的屏蔽作用使蛋白质不被当作异源物质识别,避免了抗体的产生,降低蛋白质的免疫原性,同时PEG使蛋白药物的药代动力学性质改变。
人源化抗体也可降低免疫原性,人源化抗体就是将抗原结合区域嫁接到人抗体上,这样抗体上的外源轻链降低到最小,免疫原性也就最小。通过CDR移植已构建了30多种改型的人源化鼠抗,并通过序列分析比较和计算机模拟进行分子设计,对FR区特定碱基进行替换,保证了改型后抗体亲和力不下降,这种抗体被称之为第二代基因工程抗体(蛋白质工程抗体)。人源化抗体如治疗脊髓性白血病的AN-Tl一CD33等,其免疫反应可以忽略不计.
总之采用各种蛋白质工程技术有望使蛋白免疫原性难题的全面解决,将明显改善蛋白治疗剂的安全性和有效性,并产生新一类的人源全新蛋白进入临床。2.4 药物传输性质的改善
蛋白质或多肽药物靶向传输的目标已经开始逐步的实现。例如,应用DNA技术,X-光衍射测定结构的技术和蛋白质工程技术,再结合有关的受体介导的细胞内吞机制和细胞膜运输等有关细胞生物学的深入理解,已设计出基因编码的具有惊人细胞毒性功效和选择性的融合蛋白毒素。目前特异针对细胞表面受体的融合蛋白药物(白喉毒素融合蛋白,假单胞菌外毒素A融合蛋白、葡萄球菌成孔毒素不断获得成功[9]。融合的单抗纤溶酶原激活剂在抗血栓方面已显示出更好的效力和选择性,最近报道了白介素12(IL12)与抗体的单链Fv片段(scFv)的融合蛋白已实现了靶向传输到与血管新生有关的靶标而增强了白介素12的抗肿瘤活性[10]。针对细胞表面或细胞外靶标的重组融合蛋白质的合理设计将提供一系列独特的生物药物。根据抗原提呈细胞表面受体与配体相互作用机制,可设计特异靶向嵌合疫苗,即将抗原多肽或蛋白质特异性靶向APC,从而增强免疫应答效应。这种嵌合疫苗可使一些无免疫原性或免疫原性很弱的肿瘤特异性抗原转变成强免疫原性的抗原,因此特异性靶向抗原提呈细胞的蛋白质工程修饰嵌合疫苗的研究为我[11]。
序列。Ballinger等人在BPN中突变了两个氨基酸而使其底物特异性类似kex2,再接下来引入第三个突变碱基,使其特异性类似furin,从而改变了酶作用底物的特异性[7]。
(2)提高酶的活性Reidhaar2Olson构建了55种单一氨基酸人甲状旁腺激素(hPTH)突变体,其中,有9种突变体活性都有所增加。它们的突变位置要么位于螺旋中间区域(如Lys13),要么位于C端螺旋区域(如Glu19,Val21,Glu22,Lys27,Asp30)。大多数的活性增加都是因为将带电的残基替换为中性的残基像Ser,Asn或Gln。活性增加最高的的是Glu19换为Ser,活性为原来的2.45倍。单一氨基酸引起活性的微小变化,而多种氨基酸联合突变将会引起活性更大的改变,其中活性增加最高的一种联合突变体rhPTH,活性提高15倍。这种突变体包括6种单一氨基酸的突变,其中4种是将带电的氨基酸残基换为中性的侧链[8]。
(3)降低免疫原性
蛋白药物产生有害免疫反应明显阻碍了蛋白药物的发展,消除免疫性的最普遍的方法是突变位于蛋白序列和结构的抗原表位,抗原表位对刺激免疫系统最具反应性,通过合理置换表面残基已取得了一些成功成果,这样产生低亲和
408
2.5 亲和性和特异性的改善
药物生物技术第12卷第6期
种为/开放0构象,其能结合细胞内粘附部分子1(ICAM1),另一种是/关闭0构象,其对ICAM1非常低亲和性。天然的蛋白在关闭构象时休息,当接受信号后改变为开放构象,有学者用了两种明显策略制造一种锁住构象intergrinI结构域的突变体。第一种策略是导入成对的半胱氨酸形成二硫键使其在关闭与开放的构象中相容共处。第二种策略是在结构域的核心设计突变,使其选择稳定开放构象。
合理设计能用于改善一种治疗蛋白与其它生物分子相互作用的亲和性和特异性。在这些情况中,增加与靶蛋白结合的亲和性可导致生物活性的增加,而在另一些情况中,可通过减少对非靶分子的亲和性而降低不期望的生物活性,亲和性增加的例子是通过改变蛋白质电荷而诞生的新一代hTSH超级拮抗体,hTSH(humanthyroreopin)受体具有负电荷,突变则导入带正电荷的残基或在外围环上置换负电荷残基可增加活性,最好的一个突变体显示出在受体结合亲和性方面增加了50000倍,而体内活性增加了1000倍。
融合蛋白是将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白基因的片段组合在一起,这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上。IP10
scFv是一种新型的融合蛋白,它是由鼠体内具有趋
10)和针对酸性异
化因子功能的C素诱导蛋白(IP
二、蛋白质工程药物分子设计常用技术
目前蛋白质工程作为第三代基因工程,开创了按人类意愿设计创造蛋白的新时期,蛋白质工程技术作为先进的研发手段,它的不断发展大大加快了研究开发蛋白质药物的步伐,将使蛋白质工程药物更加显示出其诱人的前景,带来更大的经济效益和社会效益。下面主要介绍几种重要的蛋白质工程技术,其应用实例见表2。1 定点突变技术(Site2directedmutagenesis)
定点突变的前提是已知蛋白质分子的结构和功能,因此也称为理性分子设计。定点突变又分为三类:一类是通过寡核苷酸介导的基因突变;第二类是盒式突变或片段取代突变;第三类是利用聚合酶链反应(PCR),以双链DNA为模板进行的基因突变。PCR技术的出现为基因的突变,基因的剪接开辟了一条极其有效、极其敏捷的道路。另外由tRNA介导的蛋白质活性[13]、改变酶的特异性[14]、分析特定氨基酸的作用[15]等很多方面都成为必不可少的研究手段。2 外定向进化技术(directedevolutioninvitro)
体外定向进化是蛋白质工程的新策略.它不需要事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制,而是在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择),使基因发生大量变异,并定向选择出所需性质或功能,从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情.
体外定向进化属于非合理设计,定向进化=随机突变+高通量筛选,它适宜于任何蛋白质分子,大大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围.特别是它能够解决合理设计所不能解决的问题。目前发展出来的定向进化策略有:
(1)易错PCR(errorpronePCR,EPPCR)是利用低保真度TaqDNA聚合酶,或者改变PCR反应体系的条件,在新链DNA聚合过程中随机引入错配碱基,经多轮PCR扩增,构建序列多种多样的突变库。由于不改变基因长度,突变频率控制在适度范围,能有效地获得有益突变体。利用错误倾向PCR改造从厌氧菌Neocallimastixpatriciarum中提取出来的木聚糖酶的催化功能结构域,使酶具有更强的耐碱性。在所挑选出来的6个突变木聚糖酶中,出现了8个氨基酸的改变。野生型酶在pH8.5时已没有活性,而此时突变pH6.0铁蛋白(AIF)的单链Fv片段(scFv)中特定区域融合而成。将融合蛋白导入小鼠的NS0骨髓瘤细胞中进行表达可以发现,它抗AIF的scFv片段特异性没有改变,仍然具有相同的亲和力常数。融合蛋白能够与分泌酸性异铁蛋白的人肝癌SMMC7721细胞、已活化的表达CXCR3受体的小鼠T淋巴瘤细胞结合。IP10
scFv融合蛋白不管是在
溶液中还是结合在SMMC7721细胞上,都能显著地诱导T细胞的趋向性。实验结果表明,IP10scFv蛋白具有肿瘤细胞特异性抗体和IP)10趋化因子的双生物学功能,表明其具有在体外对肿瘤细胞诱导更强免疫应答的可能[12]。
合理的设计也用于制造全新作用机理和可控空间结构的全新蛋白质研究。如4-螺旋捆束细胞因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、hGH和IL6已通过工程手段创造了受体拮抗剂而非兴奋剂。大多数4螺旋捆束的细胞因子移动家族在细胞表面功能形成多重的蛋白质与蛋白质相互作用而引发信号。例如,VEGF形成同源二聚体,结合两种VEGF受体,而IL6对IL6辅受体和gp130是低亲和力的结合,拮抗剂VEGF突变体是按照同源二聚体设计的,每一个二聚体含有一个功能结合位点。一种IL6超级抑制剂通过选择性的突变而创造出来,即分解与gp130结合而产生不与其反应的突变体,该突变表现出对IL6辅受体的亲和性增加。特别感兴趣的例子是一种细胞因子拮抗剂)))hGH突变体的设计,其最近已成功完成了临床研究用于治疗肢端肥大症,hGH含有两上明显受体结合位点和二聚体化位点,hGH含有在第二受体结合位点上的点突变。这样就阻碍了受体二聚化,通过噬菌体呈示技术鉴别的另外8个突变是增加了对第一个位点的受体结合亲和力。
许多蛋白经历构象变化而形成功能中心。在这种情况下,合理设计方法能驱使构象趋于符合治疗所需的状态。一种值得注关注的例子是整合蛋白(integrmI)结构域I,一
余 蓉等:合理的分子设计与工程化蛋白质药物
突变技术构建一个组合突变体(xyn
CDBFV),酶的耐碱性
409
Hu2IFN22A的285000倍及小鼠自身活性最高的Mu2IFN2A4的3.5倍[17]。Sabine等利用DNAshuffling技术,获得的scFv(4d5Flu)突变体热稳定性热动力学常数比原scFv提高了4kcalmol,在E.coli中的产量提高了2倍,与抗原的结合常数则提高了20倍。DNA改组技术与易错PCR常常联合使用以获得更具优良性质的蛋白质.在提高大肠杆菌碱性磷酯酶(EAP)的催化活性实验中,进化过程通过两轮易错PCR和一轮DNA改组及快速灵敏的筛选程序最终挑选出有益突变体。突变体S2163的活性为1500单位/mg蛋白,比野生型EAP高40倍。.亲本D101S突变体的Km值为2384LM,而S2163突变体的Km值降低到1491LM,kcat/Km比值也相应增加了5.8倍。结果表明,突变EAP的催化活性和动力学性质都得到很大的改善[18]。
和耐热性有更大的改善。它在60t的耐热性和pH10.0时的耐碱性都比野生型的木聚糖酶高[16]。
(2)DNA改组技术(DNAshuffling)DNA改组已成功地对A-IFN家族成员(85%~97%的同源性)进行了改
进,它能有选择性地改进了自然状态下的IFN,大大增强了IFN的活性,更为重要的是减低了毒副作用。对人A2干扰素(A2IFN)基因家族的改进,产生了1026个不同的突变体,并用噬菌体表面呈现技术筛选和分析重组的IFN,获得了比IFN2A活性约高40倍的突变体。DNAshuffling用来优化药用蛋白,提高药用蛋白的临床应用价值方面的优势是有目共睹。Chang等人将20多个人类IFN2A(氨基酸同源性在85%~98%)基因作为初级文库进行DNAshuffling,筛选到3个突变体IFN2CH2.122.3。其中IFN2CH2.3抗病毒活性为Hu2IFN2A1的185倍、
表2 蛋白质工程技术原理及应用实例
蛋白工程技术
原 理
应用实例
1.构建了人甲状旁腺激素(hPTH)的单一突变体和组合
突变体,活性有所提高[8]2.改变SfBgly50酶对底物(葡萄糖苷、岩藻糖苷和半乳糖苷)的特异性[10]
3.分析CYP2D1和CYP2D2中43、45位氨基酸在酶催化功能中的作用[11]易错PCR(errorpronePCR,EPPCR)在新链DNA聚合过程中随机引入错配碱基,经多轮PCR扩增,构建序列多种多样的突变库改造从厌氧菌Neocallimastixpatriciarum中提取出来的木聚糖酶的催化功能结构域,使酶具有更强的耐碱性[16]1.获得组合突变体,提高乳酸氧化酶的热稳定性[13]2.联合易错PCR改善大肠杆菌碱性磷酯酶(EAP)催化活性和动力学性质[17]
定点突变技术(Site2di2rectedmutagenesis)
利用三联密码子的一个或两个突变来改变氨基酸,利用某个位置氨基酸的改变进而研究蛋白质结构、稳定性和催化特性的变化
DNA改组技术(DNAshuffling)
先切割产生随机大小的DNA片段,再用无引物PCR将其连接成为接近目的基因长度的DNA分子,最后进行扩增得全长基因将不同来源的功能结构域经过组合,产生具有新的生物学功能的杂合多肽。其中,渐进式切割产生杂合酶技术已用于构建ITCHY文库
用一套随机序列引物,产生互补于模板不同位置的短DNA片段库.然后进行类似于DNA改组的全长基因装配反应,获得多样性文库
把常规的退火和延伸合并为一步,并缩短其反应时间,从而只能合成出非常短的新生链,与不同模板退火而继续延伸,直到产生完整的基因长度
杂合酶(hybridenzymes)
将鼠源的scFv片添加到大肠杆菌B-半乳糖苷酶的N-末端获得了多功能性的杂合酶[19]
随机引物体外重组法(randompriminginvitrorecombination,PRP)构建具有多功能双加氧活性的联苯双加氧酶(BphDox)优化后的酶作用底物范围扩大,不仅保留了原来的2,3-双加氧活性,还获得了3,4-双加氧化活性[20]
交错延伸(straggerexten2sionprocess)联合易错PCR用于提高酯酶KCTC1767的热稳定性和对底物浓度的耐受性[21]
把来蛋白,可产性的蛋,杂合蛋
410
药物生物技术第12卷第6期
术。该策略对细胞因子可能特别有效(因为它们是靠二聚体或多个受体发挥作用)。通过改组头孢霉素酶基因家族,快速进化了拉氧头孢(moxolactamase)活性,从嵌合体药物蛋白库中,可以发现许多新的药物活性。Alcala.Pilar等人将鼠源的scFv片添加到大肠杆菌B半乳糖苷酶的N末端获得了功能性的杂合酶。这种融合蛋白非常稳定,仍然保持着原来酶的特异活性,而且还能与口蹄疫病毒特定性地结合。此外,因为这种抗原靶向的酶与抗原结合时具有酶活性,因此能作为单步免疫分析中的反应物。以上实验结果说明了鉴于大肠杆菌B半乳糖苷酶结构的柔韧性,可以利用其作为载体,携带具有特异性结合性
质的功能结构域大片段,这将大大促进涉及到抗原靶向性的生物技术的利用[19]。
(4)随机引物体外重组法(randompriminginvitrore2combination,PRP)是用一套随机序列引物,产生互补于模板不同位置的短DNA片段库.然后进行类似于DNA改组的全长基因装配反应,获得多样性文库.与DNA改组相比,RPR具有以下优点:可用单链DNA或RNA为模板.且对模板量要求少,大大降低了亲本组分,便利筛选;克服了DNA改组中DNase具有的序列偏爱性,保证了子代全长基因中突变和交叉的随机性。
Suenaga利用随机引物体外重组法对假假单孢菌KF707中联苯双加氧酶的bphA1基因进行了改造,优化后的酶不仅保留了原来的2,3双加氧活性,还获得了3,4双加氧化活性[20]。
(5)交错延伸(straggerextensionprocess)是在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,并大大缩短其反应时间(55t,5s),从而只能合成出非常短的新生链,经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸.此过程反复进行,直到产生完整的基因长度,结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子.
交错延伸PCR和易错PCR已联合应用提高KCTC1767的稳定性和对底物浓度的耐受性。KCTC1767是一种具有光学选择性的酯酶,它作为生物催化剂应用于酮洛芬的生产,但是它的结构稳定性和热稳定性都比较差,因此需要进一步的改造。KimJi2Heui.利用定向进化技术提高了KCTC1767的稳定性。经过两轮连续的易错PCR和交错延伸PCR,获得了最佳突变体652。652的催化效率比野生型的提高了1.2倍,而且此突变体更具有抵抗高浓度底物对酶的抑制作用[21]。未来的10年将会发现大量的作用靶点,一旦一个蛋白质被认为是药物作用靶点,它的生物配体就很自然地成为了候选药物,并随后进行深入的合理设计的优化研究。人类基因组全部cDNA的获得,高通量筛选蛋白质突变体库技术也取得了飞快的进展,生物信息学的利用均给蛋白质工程技术提供了强有力的支撑,尤其是在识别和新
技术。如应用生物质谱直接用来检测配体。,利用酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质相互作用,应用各种展示技术(包括噬菌体展示技术、细菌展示技术,酵母细胞展示技术,哺乳动物细胞展示技术。核糖体展示技术等),筛选和鉴定目的蛋白均取得良好的结果和广泛的应用。
蛋白质工程综合基因工程、分子生物学、细胞学等众多学科的前沿技术,为生物制药行业提供了前所未有的动力。通过X射线、分光光度计、核磁共振、圆二色谱、电镜等技术获得某些结构信息,借助电子计算模拟三维图像对蛋白质进行能量和动力学研究,应用新兴的生物信息研究技术为蛋白质工程的高效、理性和创造性奠定了更强有力的基础,创建了药物设计的新模式。蛋白工程技术为药物的研究提供的有效的技术平台,加快了开发理想蛋白质工程药物的进程。伴随着合理蛋白质设计技术的持续发展和应用,必将明显的改善已有蛋白质治疗剂的有效性和安全性以及产生完全崭新的蛋白类别和作用模式,蛋白质工程药物将占据着越来越大的市场份额。尽管相对于小分子的药物化学而言,药物生物学仍在幼年期,但生物药物在制药工业的药物研发中所显示出的巨大潜力,成功的生物制药公司的销售额已经开始超过了一些小分子药物公司,例如,2002年Amgan报道销售额为50亿美元,已超过如Baye、Schering这样已成立多年的著名药厂,甚至超过了像Rochen这样有100年历史的小分子药物生产制造公司,该公司现在排名最前的15种产品中有8种是蛋白药物,占其2003年上半年50亿美元的销售额的60%(22)。尽管这样例子是有限的,蛋白药物还存在口服生物利用度不足和潜在免疫原性,合理的分子设计蛋白药物已经开始走向实际的应用,改变一种典型内源性蛋白成为一种成功的治疗药物常常必须优化一系列参数,例如稳定性、溶解度、PK、免疫性,以保护或甚至提高功效,已经出现的许多策略和方法去改变这些参数,我们期待随着合理蛋白设计技术的特点发展和应用,必将明显地改善已有蛋白治疗剂的有效性和安全性,以及产生完全崭新的蛋白类别和作用模式。
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RationalDesignandEngineeringofTherapeuticProteins
YURong1,2,WUWu2tong1,*,LILing2ling2
(11SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing,210009;21WestChinaSchoolofpharmacy,SichuanUniversity,Chengdu,610041China)
Abstract Theproteinsmoleculardesignisanimportantmethodtodevelopnewbiotechdrugs.Thepro2teinengineeringtechniquehasbecomeaeffectivestratagemtoimprovevariantproperitiesoftherapeuticproteins,includingenhancedthermostability,bioactivespecifity,targeteddeliverty,decreaseinimmunityandimprovingpharmacokinetics.
Numeroustherapeuticproteinsproducedbyproteinengineeringhasbeendevelopedandusedinclin2ic,asparaginaseandcalcitoninbysitedirectedmutagenesis,PEGIFNA2b,CpAHirudin,proproGHRHGlyGlyCysandproproPTHGlyglyhasbeendesignedanddevelopedsucessful2lyinourLab.
Sitedirectedmutagenesis,DNAsuffling,directedevolution,expressionoffusionproteinspromotethecreationofnewtherpeuticproteins,tendsonrationaldesignandengineeringoftherapeuticproteinswerediscussed.