狂犬病毒实验室检测方法综述
陈晶，刘晓慧，孙招金
（华南农业大学兽医学院，广东广州５１０４６２）
摘要：狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，死亡率几达１００％．狂犬病毒感染的早期诊断，为有效预防和控制狂犬病提供基础。本文就几种敏感有效的狂犬病实验室诊断方法进行综述．
关键词：狂犬病毒：检测；试验
中图分类号：Ｒ３７３．９
文献标识码：Ａ狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人兽共患传染病，ＯＩＥ将其列为Ｂ类疫病。我国狂犬病发病死亡人数仅次于印度，为世界第二，从１９５０年至２００５年，我国狂犬病共出现了５次流行高峰，前４次高峰约每１０年流行一次，流行范围几乎遍及全国。从近年来的流行情况看，第５次高峰正在形成，而且增长趋势仍在继续。据卫生部统计表明，包括“非典”疫情发生的２００３年在内，狂犬病的死亡人数在我国法定报告传染病中始终占据首位，狂犬病已成为严重危害我国公共卫生的重大疫病。据报道，１９８０—１９９９年狂犬病累计死亡总数已高达１０万人以上。因此，对该病检测方法的研究可为控制狂犬病在我国的流行提供技术保障。本文对狂犬病实验室诊断的常规技术进行了浅述，包括ＦＡＴ、ＲＴ—ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ试验，从敏感、快速、简便等几方面进行比较，为狂犬病实验室诊断提供参考。
１
实验室诊断依据
临床症状是诊断人和动物狂犬病的重要依据，
但单凭临床表现还不够，还需通过狂犬病病毒的实验室检测才能确诊人和动物狂犬病。１９０３年，
Ａｄｏｌｃｈｉ
Ｎｅｇｒｉ在狂犬病病毒感染组织细胞浆内
发现了嗜酸性包涵体一内基氏小体，后被命名为Ｎｅｇｒｉ小体。从此，Ｎｅｇｒｉ小体被认为是狂犬病病毒感染的特征性病变，将检测Ｎｅｇｒｉ小体作为狂犬病的确诊方法持续了几十年【ｌ】。随着实验室诊断技术的不断发展，许多研究报道狂犬病病毒的感染并非总会出现Ｎｅｇｒｉ小体。自病毒分离技术出现后，发现在狂犬病病毒感染的组织出现Ｎｅｇｒｉ小体的检出率只有５０９６～８０９６㈦。另有报道［３］，犬脑的包涵体阳性检出率为７０％＂９０％，人脑约７０％。由于Ｎｅｇｒｉ小体与狂犬病病毒感染不能严格对应，而１９５８年出现的荧光抗体试验（ＦＡＴ）由于与检测Ｎｅｇｒｉ小体
收稿日期：２００８—０４—２９
万方数据
文章编号：１００５－８５６７（２００８）０６－０００３－０３
相比具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，逐渐被广泛应用，作为检测新鲜组织中狂犬病病毒抗原的标准方法和首选方法。
由于狂犬病毒几乎可以感染所有的温血动物，所以狂犬病毒的实验室诊断首要是考虑安全问题，怀疑感染狂犬病的动物不能随便解剖，应送地方有关部门进行鉴定。实验室在接到怀疑感染该病毒的动物时，一定要在Ｐ３以上条件专业实验室进行操作，并且实验室人员必须做好技术上的准备方可进行接下来的工作。ＷＨＯ专家目前认可的检测方法有小鼠中和试验和快速荧光抑制试验（ＲＦＦＩＴ）等。这两种方法均针对狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体的检测。随着科学技术的发展，实验室也应用了越来越多的方法检测狂犬病毒。
２．１
荧光抗体方法（ＦＡＴ）在诊断狂犬病常规方
法中，ＦＡＴ法是ＷＨＯ和ＯＩＥ共同推荐的方法。该法可直接检测涂片，也能用于检测细胞培养或被接种小鼠的脑组织中狂犬病病毒抗原是否存在“】。自１９５０年被引用以来，在全球范围内被广泛应用于狂犬病的诊断，该方法既灵敏、特异性又高，应用价值非常高。对于新鲜病料，ＦＡＴ法可在几小时内得出可靠结果，准确率达９５％一－－９９％。与其它任何检测方法一样，ＦＡＴ法的可靠性取决于样品性质（如动物种类和自溶程度）、狂犬病病毒（或狂犬病病毒相关病毒）和操作人员的熟练程度【３］。ＦＡＴ法的特异性和灵敏度，部分程度上依赖于亲和力、梯度及特异性结合狂犬病病毒核蛋白的最佳荧光抗体。
最早的时候，从高免动物血液中纯化出免疫球蛋白作为抗体来源…】。单克隆抗体随着杂交瘤（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）技术的引进应运而生，并广泛应用于制备较纯的和特异的抗体。由于这种单克隆抗
２常用的实验室诊断技术
・４・
专题综述
体数量有限，特异性又各不相同，因此必须明确的是：我们在选择单克隆抗体的时候，应该把能够吸附所有的病毒的抗原变异株作为首要条件。而且所有实验条件必须评估好，无论在样品吸附前还是吸附后，都应该明确没有任何一个条件会对标记抗体的稳定性及亲和力产生不良作用［４】。Ｓｙｌｖｉａ等检测了８００多份来自１４种不同动物的怀疑有狂犬病病毒的脑组织，用新鲜病料同时用福尔马林固定，荧光抗体方法检测两种病料的阳性结果吻合率达９９．８％，未出现假阳性，对两种病料的特异性均达１００％。从而得出结论：用ＦＡＴ方法检测狂犬病毒抗原，用新鲜病料或用经福尔马林固定后的病料，效果是等同的【６】。
２．２免疫组织化学技术（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）本
技术出现于上世纪８０年代，在用福尔马林固定病理标本的切片上进行狂犬病病毒抗原检测，通常用于组织中的抗原或感染病毒组织的定性检测，用以诊断人和动物狂犬病。它是以狂犬病特异性单克隆抗体和多克隆抗体作为一抗，以过氧化酶或亲和素一生物素蛋白标记的种属特异性抗体为二抗。研究结果表明，免疫组织化学方法检测狂犬病毒较检测Ｎｅｇｒｉ小体方法更加敏感，且敏感性和稳定性与ＦＡＴ法相当。在无需昂贵设备的情况下即可进行狂犬病毒的定量检测，因而可作为ＦＡＴ检测法外的另一方法而予以重视和应用唧。近年来确立的直接快速免疫组织化学试验（ｄＲＩＴ），因其使用普通光学显微镜可以直接观察到结果，是ＤＦＡ法ＤＦＡ法（直接免疫荧光抗体试验）耗费资金的１／１０，被认为是有希望为发展中国家使用的一种检测手段［８】。２．３酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡ法最
初应用于免疫后动物和人血清中抗狂犬病病毒抗体的效价滴定，但后来经过改进后也可用来检测脑组织内的抗原。该法是先用抗狂犬病病毒阳性血清或ＩｇＧ包被４０孔板，加待测脑悬液，再用标记ＨＲＰ的阳性ＩｇＧ进行反应。亦可采用特异性抗体作为一抗与被检样品反应，然后再与酶标二抗进行反应。同时，设阳性及阴性抗原对照，如被测样品出现特异性显色，即可诊断为狂犬病［３】。用该方法检测狂犬病毒需要在感染细胞阳性率超过１０％（ＩＦＡ检测标准），检测效果较好，敏感性较ＩＦＡ差，会出现一定的假阳性和假阴性，检测的稳定性尚需进一步研究。２．４乳胶凝集试验（Ｌａｔｅｘ
ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ
ｔｅｓｔ。
万方数据
狂犬病毒实验室检测方法综述一陈晶，等
ＬＡＴ）ＬＡＴ法可检测患病动物脑和唾液中的狂犬病毒。Ｍａｄｈｕｓｕｄａｎａ等【９】报道，通过对狗的已知阳性和阴性脑和唾液样品中病毒抗原的检测，比较ＬＡＴ法和ＦＡＴ法的检测结果，前者敏感性高达９５．２％，特异性高达９８．７％，阳性符合率为９７．６％，阴性符合率为９７．４％。２．５病毒分离
取疑似动物脑或唾液腺等材料
用缓冲盐水碾磨成ｌｏ％孚Ｌ剂，脑内接种５－７日龄乳鼠，注射量为ｏ．０３ｍｇ／只，每份标本接种５只乳鼠。乳鼠在接种后继续由母鼠同窝哺养，３～４天后如发现哺乳能力减弱，痉挛，麻痹死亡，即可取脑检查包涵体，并制成抗原，作病毒鉴定［３］。２．６核酸检测法
２．６．１
ＲＴ－ＰＣＲ
本方法是荧光抗体方法的补充，
也可用于检测未知的狂犬病病毒。据报道【Ｊｏ］，对７个基因型的狂犬病病毒所有ＲＮＡ进行连续梯度稀释，并用标准化的ＲＴ—ＰＣＲ方法与已经报道的检测ＥＢＬＶ的ＲＴ－ＰＣＲ方法进行灵敏度比较。结果证明：用两种ＲＴ—ＰＥＲ方法均可以检测出７个基因型的狂犬病病毒，且检测出的阳性结果与用免疫荧光方法的结果完全一致。Ｄａｖｉｄ等用ＲＴ－ＰＣＲ方法对１０份已腐败的脑组织样品进行狂犬病病毒检测，结果全为阳性，其中７份是ＲＴ—ＰＣＲ阳性，而另３份又分离到病毒，做乳鼠脑内接种实验（ＭＩＴ）也是阳性，同时对这些样品作ＦＡＴ方法检测均为阴性；Ｓｕｐａｐｏｒｎ等研究人员对保存达１６年的狂犬病病人脑样品，经福尔马林固定，石蜡油嵌入一周后，用ＲＴ—ＰＣＲ方法检测出狂犬病毒Ｎ基因的１５０ｂｐ目的条带，但用免疫组化反应检测阳性率较低【ｕ】，从而得出结论：对自然感染狂犬病病毒的已经腐败降解的或者不再适用于其它实验室检测方法的脑组织，ＲＴ—ＰＣＲ方法是一种非常有效的分子生物学方法【吲。
２．６．２
ＴａｑＭａｎ试验结合ＴａｑＭａｎ朋基因型特异
探针的ＲＴ—ＰＣＲ的方法能快速有效鉴别病毒。被怀疑阳性的狂犬病病毒分离株可迸一步在单管封闭系统内操作完成检测，防止了潜在的ＰＣＲ产物污染【１３］。使用该方法，一个标准的ＲＴ—ＰＣＲ方法循环完成后几分钟内即可得出一个明确的结论［１０】。对于每个探针，可以通过调节Ｍ９２＋浓度及退火温度来优化条件。检测唾液样品，实时ＲＴ－ＰＣＲ比传统ＲＴ—ＰＥＲ的灵敏度高［１４】。Ｈｕｇｈｅｓ（２００４）设计一个检测组织样品狂犬病毒ＲＮＡ的ＴａｑＭａｎＰＣＲ方法，并证明该方法敏感性、特异性均较高。
狂犬病毒实验室检测方法综述一陈晶，等
狂犬病毒及相关病毒的Ｎ基因高度保守，因此常被选作设计探针结合位点的集中区ｎ叫。Ｅ１ｉｚａ－ｂｅｔｈ等［１５１针对１０６株狂犬病病毒及相关病毒分离株设计８个探针，并结合此探针的ＲＴ—ＰＣＲ方法快速灵敏，能区别早期确定的６种基因型的狂犬病毒及相关病毒。而且发现每种基因型都有特异区域，有助于不同探针的设计。但是寡核苷酸与目的基因之间的错配率明显会影响扩增结果；探针区的点突变可阻止探针的结合及荧光产生，从而导致假阴性。错配４个以上就可严重削弱阳性结果或产生阴性结果，这就直接限制了
ＴａｑＭａｎ
ＰＣＲ的扩增长度［１５】。
３结论
ＦＡＴ法及病毒分离或乳鼠脑内接种试验（ＭＩＴ）是从新鲜病料中诊断狂犬病毒的黄金标准方法。但随着脑组织降解，ＦＡＴ法的灵敏度也下降，病料组织放置室温４８ｈ或３７℃孵育７２ｈ后，检测结果即为阴性［１ｑ１７，ｍｌ。套式ＲＴ－ＰＣＲ是一种能检测包括典型狂犬病病毒及澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒基因型的一种分子生物学方法。用ＴａｑＭａｎ技术检测澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒（ＡＢＬＶ）并与套式、半套式ＲＴ—ＰＣＲ比较，结果套式ＰＣＲ与半套式ＰＣＲ相比，特异性要好或相等。而ＴａｑＭａｎ技术比前两种ＲＴ－ＰＣＲ方法的特异性更高，灵敏度也相对较高，能检测约
１０ｇｅｑ／ｕ
Ｌ，比套式ＲＴ－ＰＣＲ灵敏度高１０倍；操作
过程更加快速，传统ＲＴ－ＰＣＲ方法需１２～２０ｈ，而ＴａｑＭａｎ只需４ｈ，且交叉污染的可能性更小ｎ鲫。ＴａｑＭａｎ法和ＦＡＴ法具有完全对应的检测结果。
由于狂犬病正在成为危害人类生命的重大疫病之一，快速、准确的诊断狂犬病已经迫在眉睫了，同时，国际上也亟待一套规范化的统一的诊断程序。所以狂犬病诊断方法的研究在控制狂犬病的流行起着重要的作用。参考文献：
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作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：引用次数：
陈晶， 刘晓慧， 孙招金
华南农业大学兽医学院,广东,广州,510462
广东畜牧兽医科技
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1.学位论文 刘健 套式RT-PCR检测狂犬病毒方法的建立及其在上海地区犬、猫唾液样本的应用 2006
建立了狂犬病毒的套式RT-PCR检测方法，可以特异地检测出狂犬病毒ERA毒株的RNA，而对犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬细小病毒
(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCV)均呈阴性。该法能检出0.18fg的RNA，敏感性是普通RT-PCR的10000倍。并且检测了分别用PBS液和人唾液稀释的阳性脑组织病料，结果表明PBs液稀释的阳性病料和唾液稀释的阳性病料的检测结果是一致的，凝胶电泳观察均可以观察到特异的460bp的条带。研究表明应用套式RT-PCR法是可以检测出唾液中的狂犬病毒的。 对广西送检的疑似狂犬病的20份犬的脑组织进行RT-PCR检测，比较了套式RT-PCR和普通RT-PCR两种方法的阳性检出率。套式RT-PCR检出15份阳性，阳性率达到75％，测序结果表明15份阳性条带的序列为狂犬病毒的核酸序列，其中4个代表株与狂犬病毒ERA毒株的同源性在85.1％～85.5％之间；与狂犬病毒CVS株的同源性在85.9％～87％之间；相互间同源性在98％～99.6％之间，而普通RT-PCR检测没有出现任何条带。表明套式RT-PCR法在临床应用中可极大提高狂犬病毒的检出率，是实用的检测方法。 摸索了犬唾液样本的保存条件。通过对缓冲液的初步筛选，选定人唾液、PBS液+2％FCS(犊牛血清)和Hanks液+2％FCS作为样品保存的候选缓冲液，分别以这三种缓冲液为基础，不同保存时间，及不同温度保存，比较套式RT-PCR可以检测到病毒的最大稀释滴度。结果表明，PBS液+2％FXS最有利于狂犬病毒ERA毒株的保存；唾液其次；Hanks液+2％FCS虽然理论上缓冲能力最强，但是最不利于狂犬病毒ERA毒株的保存。在2日内可以检测的样本，应当4℃保存，避免冻融对病毒产生的损害；一周以内可以检测的样本应当加入抗生素，保存在-20℃；超过一周再检测的样本应当保存在-70℃，保存在-20℃虽然对套式RT-PCR检测影响不大，但是病毒量还是有所下降的。 2005年9月至2006年3月，对上海地区外观健康的犬、猫进行了唾液样本狂犬病毒的检测，共检测了1251份样本，其中流浪犬和咬人的犬355份；家养宠物犬694份；犬场宠物犬135份；家养宠物猫65份；流浪猫2份，结果未检出一例阳性，表明上海地区流浪犬、宠物犬和宠物猫唾液中不带狂犬病毒，目前对人群不存在传播狂犬病毒的潜在危险。
2.学位论文 周萍 狂犬病毒RT-PCR和荧光定量PCR检测方法的建立 2007
狂犬病的病原是狂犬病毒。对狂犬病毒的诊断，只有通过实验室诊断，才能得到准确结果，生前的临床症状和死后的组织病变仅可作为诊断的参考。近年来，随着分子生物学和基因工程方法的发展和应用，研究者们对狂犬病毒的结构，基因序列及其主要功能，发病机制都有了更进一步的认识，使得对狂犬病的诊断与预防也更完善，通过各毒株之间的序列比较证实，狂犬病毒核蛋白在各毒株之间基因序列高度保守，广泛用于狂犬病毒的检测、基因分型及核酸疫苗的研制等研究工作。 本实验先对国内各省市地区报导的狂犬病毒株序列进行比较，确定N基因上相对保守的区域，以兽用疫苗株HEP-Flury为阳性毒株，在其N基因的保守区域内设计引物，建立诊断狂犬病毒的RT-PCR方法。用此RT-PCR方法程序检测另四个狂犬病毒毒株：SN、SN10、G1N2、L16，结果均为阳性；检测犬细小病毒、犬瘟热病毒为阴性；该方法最低可检测到20ngHEP-Flury病毒的总RNA，或4×10个FFU。提取14只攻毒小鼠的海马回及延髓，用本方法与直接免疫荧光抗体试验分别进行检测,RT-PCR可检测到8个阳性，FAT可检测到6只小鼠的荧光斑点，说明用普通RT-PCR方法比直接免疫荧光染色法的敏感性更高。 本实验对N基因的保守区域又分别设计一对引物和荧光探针，建立了N基因部分片段的荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法。该方法对仪器和试剂的要求较高，但敏感性比普通RT-PCR方法高，本实验通过对该方法的灵敏度分析，认为荧光定量PCR的灵敏度要比普通。RT-PCR方法高。 本研究建立了检测狂犬病毒的普通RT-PCR方法及荧光定量PCR方法，为研制快速检测唾液、脑组织样品中的狂犬病毒的试剂盒打下良好基础。
3.学位论文 李志峰 广州及周边地区蝙蝠携带SARS（样）冠状病毒、狂犬病毒和禽流感病毒的初步流行病学调查 2006
研究背景：近年来发现蝙蝠是多种人兽共患疾病病毒的储存宿主，蝙蝠可以持续感染许多病毒而不表现临床症状。SARS首先在广东爆发，尽管先前对这种新病毒的致病性和分子特征的研究取得了成功，但仍没有找到SARS冠状病毒的来源。流行病学调查及果子狸体内检测到SARS样病毒，表明SARS冠状病毒(serveacuterespiratorysyndrome-associatedcoronavirus，SARS-CoV)可能来自野生动物，但随后的调查发现感染在野生或人工饲养的果子狸并不常见，而且果子狸在感染两种不同的SARS-CoV人分离株后，表现出明显的临床症状，提示果子狸可能不是SARS-CoV的自然宿主。果子狸可能只是SARS-CoV的中问宿主，SARS-CoV有可能是从别的野生动物(如在野生动物市场的野生动物)传播给果子狸。广东地区有食用果蝠的现象，野生动物市场每天汇集来自广州及周边地区的捕捉的果蝠，然后再分销至广州及周边城市的酒店和茶楼。这样就造成或增加了野生动物之间和野生动物与人接触的机会，也就增加了一些疾病在野生动物之间及在野生动物与人之间传播的可能，使得某些疾病跨物种传播成为可能。若果蝠携带SARS冠状病毒就有可能将SARS冠状病毒传染给人或其它动物(比如果子狸)，果蝠有可能是SARS-CoV和SARS样冠状病毒(SARS-like-CoV)冠状病毒的自然保菌宿主之一。研究发现蝙蝠与狂犬、乙脑等发病有一定的关系。禽流感病毒主要自然储存宿主是禽类，但是否还存在其他野生动物自然宿主，如果蝠，还有待于进一步调查研究。是果蝠可能携带的病毒以及与人类疾病、健康之间的关系和流行病学调查研究几乎空白。因此有必要对广州及周边地区的蝙蝠种类、分布、数量、生态习性等开展调查，对果蝠及其它蝙蝠可能携带SARS(样)冠状病毒(SARS(-like)-CoV)、狂犬病毒(Rabiesvirus，RV)与禽流感病毒
(Avianinfluenzavirus，AIV)的情况开展流行病学调查。 研究目的：1.对广州市及周边地区的蝙蝠种类、分布、生态习性等开展初步调查，为进一步深入开展该地区蝙蝠可能携带的重要传染病病毒及与当地人群之间的健康、疾病之间的关系的流行病学调查奠定基础。 2.对广州及周边地区和广州野生动物市场的蝙蝠携带SARS(样)冠状病毒的情况开展流行病学调查，为进一步阐明SARS源头及传播链提供线索。 3.对广州及周边地区和广州野生动物市场的蝙蝠携带狂犬病毒和禽流感病毒的情况开展流行病学调查，为狂犬病和禽流感疾病的预防提供更全面的理论依据。 研究方法：1.调查，走访、请教国内研究蝙蝠的专家教授，获取广州及周边地区蝙蝠的种类、分布、生态习性等资料。 2.在调查地区开展现场调查，了解是否有蝙蝠存在、蝙蝠的种类及与当地人群疾病、健康等可能存在的关系。 3.对广州的野生动物市场开展调查，了解野生动物市场私自销售的蝙蝠种类、数量、来源及分销地点。 4.捕捉蝙蝠，采集标本，并请研究蝙蝠的动物学专家对蝙蝠种类进行鉴定，对蝙蝠可能携带的SARS(样)冠状病毒、狂犬病毒和禽流感病毒采用细胞培养、RT-PCR、荧光PCR、基因芯片等多种方法进行病源学检测，检测过程严格质量控制。 质量控制：1.本次调查强化全程质量控制措施，标本与阳性对照采用统一的检测方法。 2.标本取材新鲜，采用病毒保存液制备病毒悬液，减少病毒可能的损失。提取的RNA经检测表明纯度较高，完整性好，含量较高。 3.分子生物学检测采用多对引物同时检测，降低了不同引物扩增效率不同的影响。除了阳性对照、阴性对照和空白对照，还设立了模拟对照，以排除标本和病毒保存液可能对RNA的提取、RT-PCR检测的干扰。优化检测反应条件。 4.上述实验对照全部成立，试验条件稳定重复性好，说明检测方法可靠。 5.为减少系统误差，减少检测的假阴性，对部分标本还采用并联检测法和重复一次检测。 通过上述严格的实验质量控制，优化检测条件，可以提高本次检测的灵敏度，减少假阴性，检测结果可信。 研究结果：1.本次调查发现广州市有4科9属15种蝙蝠。主要有：狐蝠科(Pteropodidae)：棕果蝠(Rousettusleschenaulti)，犬蝠(Cynpterussphinx)，短耳犬蝠(Cynopterusbrachotis)。菊头蝠科(Rhinolophidae)：中菊头蝠(Rhinolophusafffinis)，中华菊头蝠(Rhinolophussinicus)，小菊头蝠
(Rhinolophusblythi)。蹄蝠科(Hipposideridae)：小蹄蝠Hipposiderospomona。蝙蝠科(Vespertilionidae)：中华山蝠(Nyctalusvelutinus)，灰伏翼(Pipistrelluspulveratus)，小伏翼(Pipistrellustenuis)，东亚伏翼(Pipistrellusabramus)，扁颅蝠(Tylonycterispachypus)，小黄蝠
(Scotophiluskuhli)，大黄蝠(Scotophilusheathi)，彩蝠(Kerivoulapicta)。 2.广州及周边地区生活有可能携带虫媒病毒的多种蝙蝠，因此这些蝙蝠有可能携带罗斯河病毒、乙脑病毒、森林脑炎病毒、基孔肯亚病毒、登革病毒、狂犬病毒、SARS(样)冠状病毒和西尼罗河病毒等虫媒病毒。3.从2004年9月至2005年11月，本次调查从共收集分别属于两个亚目9个种的905只蝙蝠：犬蝠(Cynopterussphinx)395只、棕果蝠
(Rousettusleschenault)154只、普通长翼蝠(Miniopterusschreibersi)5只、普氏蹄蝠(Hipposiderospratti)7只、中华菊头蝠
(Rhinolophussinicus)15只、小黄蝠(Scotophiluskuhlii)52只、大耳双色蹄蝠(HipposiderosPomona)8只、中菊头蝠(Rhinolophusaffinis)228只及小菊头蝠(Rhinolophuspusillus)41只。 4.上述9个种905只蝙蝠的共计3043份标本(咽拭813，血清524，肺组织853，直肠粪便853)用新型冠状病毒(N-蛋白)测定试剂盒(酶联免疫法)、SARS-CoVRNA检测试剂盒、荧光PCR、基因芯片检测、RT-PCR和Vero-E6细胞分离培养等检测SARS(样)冠状病毒，结果未检测、分离到SARS(样)冠状病毒。 5.其中7个种的蝙蝠794只(犬蝠(Cynopterussphinx)330只、普氏蹄蝠(Hipposiderospratti)7只、棕果蝠
(Rousettusleschenault)154只、普通长翼蝠(Miniopterusschreibersi)5只、小黄蝠(Scotophiluskuhlii)52只、中菊头蝠(Rhinolophusaffinis)209只及小菊头蝠(Rhinolophuspusillus)37只)取得3391份标本(咽拭719，血清452，脑组织742，肺组织742，直肠组织742)，采用RT-PCR和Vero-E6细胞分离培养等检测狂犬病毒与禽流感病毒。结果未检测、分离到狂犬病毒和禽流感病毒。 结论：1.本次调查发现广州市有4科9属15种蝙蝠主要有：狐蝠科(Pteropodidae)：棕果蝠(Rousettusleschenaulti)，犬蝠(Cynpterussphinx)，短耳犬蝠(Cynopterusbrachotis)。菊头蝠科(Rhinolophidae)：中菊头蝠(Rhinolophusaffinis)，中华菊头蝠(Rhinolophussinicus)，小菊头蝠(Rhinolophusblythi)。蹄蝠科(Hipposideridae)：小蹄蝠Hipposiderospomona。蝙蝠科(Vespertilionidae)：中华山蝠(Nyctalusvelutinus)，灰伏翼(Pipistrelluspulveratus)，小伏翼(Pipistrellustenuis)，东亚伏翼(Pipstrellusabramus)，扁颅蝠(Tylonycterispachypus)，小黄蝠(Scotophiluskuhli)，大黄蝠
(Scotophilusheathi)，彩蝠(Kerivoulapicta)。这些蝙蝠有可能携带罗斯河病毒、乙脑病毒、森林脑炎病毒、基孔肯亚病毒、登革病毒、RV、SARS-CoV、SARS(-like)-CoV和西尼罗河病毒等虫媒病毒。 2.从2004年9月至2005年11月，本次调查的广州及周边地区的9个种的905只蝙蝠未检测和分离到SARS(样)冠状病毒、狂犬病毒及禽流感病毒。 3.调查未发现检测的病毒这可能与检测的蝙蝠的种类、每种蝙蝠的数量、蝙蝠携带的病毒量及调查的地区、时间有关。
4.学位论文 马益萍 检测犬狂犬病毒抗体的间接ELISA方法的建立 2008
本文进行了如下研究： 1.犬IgG的分离纯化和抗犬IgG单克隆抗体的制备 采用辛酸-硫酸铵盐析和Hiload 16/60 superdex 200 preppg凝胶柱层析法从犬血清中获得IgG，经SDS-PAGE电泳鉴定。用BCA法测定IgG浓度为2mg/ml。用纯化后的犬IgG，采用常规免疫法免疫6-8周龄雌性
BABL/c小鼠。取三次免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按10：1混合，用0.7ml 50％PEG 4000进行细胞融合，对杂交瘤细胞进行筛选，阳性孔经3次有限稀释法克隆，成功获得6株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，对6株McAb初步鉴定结果表明，其抗体类型均为IgG1，轻链都为κ链。腹水的间接ELISA效价介于1.3×104～6.6×106之间。Western-Blotting试验证实有3株细胞为分泌针对犬IgG轻链抗体的杂交瘤细胞株，有3株细胞为分泌针对犬IgG重链抗体的杂交瘤细胞株。 2.狂犬病毒核蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定 用纯化的重组RV N蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，通过间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞，阳性孔经3次有限稀释法克隆，成功获得1A4、7H3、7H6、7F6及7F7 5株能稳定传代并分泌抗重组RV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。各单克隆抗体腹水间接ELISA效价在104-106之间。5株单克隆抗体的亚类均为IgG1，轻链均为κ链。Western-blot分析表明，所获得的5株单克隆抗体与重组RV N蛋白均具有反应性。间接免疫荧光染色显示，7F6与7F7可识别病毒感染Vero细胞中的RV N蛋白。 3.抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定 用纯化的原核表达的RV G蛋白免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，经过3次免疫后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，通过间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞，阳性孔经3次有限稀释法克隆，成功获得1株(1D10)能稳定传代并分泌抗重组RV G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。间接ELISA效价2.56×104。单克隆抗体的亚类均为IgG1，轻链均为1(链。间接免疫荧光染色显示腹水IFA效价为1：400。 4.抗犬IgG单克隆抗体的纯化及其酶标记 复苏稳定分泌抗犬IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D4，按常规方法制各腹水。用辛酸～硫酸铵及
Protein G两步法纯化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，证明腹水经辛酸-硫酸铵及Protein G纯化后具有较高的纯度，可用于酶标记。采用过碘酸钠氧化法将犬IgG与辣根过氧化物酶连接，获得酶标鼠抗犬IgG，酶标记率为52.16％，克分子比为1.6；通过Dot-ELISA检测，发现HRP标记的鼠抗犬IgG在1：3000倍稀释时，可以与1024倍稀释的犬抗RV阳性血清起反应。 5.NP-ELISA抗体检测方法的建立 以原核表达的狂犬病毒核蛋白为抗原，建立了检测狂犬病毒抗体的间接ELISA方法。最佳反应体系为：抗原包被液为0.05M pH8.5的Tris-HCl缓冲液，抗原包被浓度为2ug/ml；封闭液为0.5％BSA/PBST，血清及二抗稀释液为含0.1％BSA的PBST缓冲液，待检血清的最佳稀释倍数为1：100，酶标抗体的最佳稀释倍数为1：2000；待检血清和酶标二抗孵育时间均为60min，底物反应时间10min。重复性试验、阻断性等试验表明，该方法重复性好、灵敏度高；与美国SYNBIOTICS试剂盒比较，本试剂盒的诊断敏感性为91.2％，特异性为90.7％，符合率为90.9％。
5.期刊论文 任雅萍. 李德新. 张全福. 谈易男. 魏然. 刘琴芝. 李川. 张云涛. 沈荣. 邹勇 狂犬病毒抗体ELISA检测试剂盒的改进研究 -微生物学免疫学进展2004,32(3)
为了提高狂犬病毒抗体检测的灵敏度和特异性,采用狂犬病毒单克隆抗体包被酶标板,再分别加入重组的狂犬病毒糖蛋白或细胞培养抗原做固相层的方法(抗体捕捉法),用传统的间接ELISA法做对照,按常规方法检测抗狂犬病毒抗体.结果显示,抗体捕捉法的非特异性反应低于间接法,而灵敏度达到0.5IU水平,高于间接法.在800份临床标本检测中,检出率明显高于间接法.用15份阳性血清作小鼠中和试验,并和抗体捕捉ELISA法比较具有高度的一致性.试验结果充分表明,该方法优于传统的ELISA间接法.因此可作为临床注射狂犬疫苗后检测血清中狂犬病毒抗体的常规方法.
6.学位论文 唐婕 狂犬病毒的电镜检测及其糖蛋白基因的克隆与序列分析 2007
狂犬病毒(Rabies Virus，RV)属于弹状病毒科(Rhabdoviriade)，狂犬病毒属(Lyssavirus)。在电镜下其外形具有明确子弹状形态特点，易于辨认。因此，电镜检查为狂犬病毒的形态鉴定提供了快速直观的诊断。狂犬病毒的糖蛋白是病毒粒子的重要成份，具有血凝活性，为病毒粒子与宿主细胞结合的受体位点提供桥梁，是唯一能产生中和抗体的病毒成分，它能影响狂犬病疫苗的免疫原性。本实验对狂犬病毒进行了电镜检测，旨在分析其形态特征，为狂犬病毒的诊断提供依据，并探讨了电子显微镜技术在病毒学研究中的应用。同时对狂犬病毒糖蛋白进行克隆与序列分析，为其基因工程疫苗的开发、基因免疫等提供科学研究基础。 本实验采用电镜负染技术、超薄切片法、高速离心等制样方法，通过电镜观察对狂犬病毒的形态结构、粒子大小、增殖方式、病毒在组织中的分布等进行了分析。根据GenBank发表的狂犬病毒糖蛋白核苷酸序列，利用Oliga软件设计两对特异性引物，通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了狂犬病毒 Flury-lep糖蛋白的全长 cDNA，将其插入克隆载体pMD-18T并测序。 结果表明：①在透射电子显微镜下狂犬病毒粒子呈显著的子弹状；②在扫描电子显微镜下观察到狂犬病毒能与鹅红细胞产生凝集反应，且附着在鹅红细胞表面；⑨测序结果及同源性分析表明，糖蛋白cDNA长1574bp，编码524个氨基酸。狂犬病毒株 Flury-lep的GP基因序列与 GenBank 公布的狂犬病毒株GP基因片段核苷酸序列的同源性为82.3％～96.3％，其编码产物的氨基酸序列同源性为88.4％～94.3％。 通过本实验，证明通过电镜技术对狂犬病毒的鉴定是可行的、有效的，为以后的病毒鉴定提供了快速的鉴定方法。在没有阳性血清或抗体的情况下，结合临床症状、流行病学调查研究及电镜技术可对病毒定性。本实验对狂犬病毒Flury-lep株的GP基因成功地进行了克隆与测序，为狂犬病毒分子流行病学的研究、选择抗原性强的疫苗毒株和基因工程疫苗的研制提供了理论基础和科学依据，并为Flury-Lep株的分子生物学特性研究奠定了基础。
7.期刊论文 徐葛林. 严家新. Larrous F. 祝玉桃. Cozette P. 薛红刚. 胡巧玲. Bourhy H. XU Ge-Lin. YAN Jia-xin. Larrous F. ZHU Yu-tao. Cozette P. XUE Hong-gang. HU Qiao-ling. Bourhy H 抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体在狂犬病街毒检测中的应用 -中华流行病学杂志2005,26(2)
目的测试抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体用于间接免疫荧光法检测已确认的狂犬病阳性及狂犬病阴性的动物脑组织标本的灵敏度和特异性.方法将巴斯德研究所狂犬病参考中心保存的来自不同国家的62份狂犬病街毒动物脑组织标本以及271份法国境内收集的正常动物脑组织标本,用上述间接免疫荧光检测,并以巴斯德研究所狂犬病参考中心提供的狂犬病毒酶联免疫吸附法、组织细胞分离法及直接免疫荧光法等三个试验作确认试验,进行比较.结果间接免疫荧光法可检测涵盖狂犬病毒7个基因型在内的所有62份街毒标本,对确认为狂犬病阴性的动物脑组织标本检测均为阴性,其特异性和灵敏度均达到100%.结论抗狂犬病毒核蛋白单抗作为间接免疫荧光法检测狂犬病毒具有良好的应用前景.
8.学位论文 汪霞 Ⅰ：抗狂犬病毒单抗对狂犬病街毒暴露后的治疗;Ⅱ：细胞培养法检测和分离狂犬病街毒的可行性研究 2008
目的:研究鼠抗狂犬病毒中和活性单抗2C、5C对狂犬病病毒暴露后的治疗效果。 方法:用三个病毒代表株CQ92、HN06和GX-4分别感染Balb/c小鼠腓肠肌，30min后用2C、5C和人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)进行治疗。 结果:2C、5C和HRIG对狂犬病病毒暴露后小鼠具有相近的保护率。 结论:鼠抗狂犬病毒中和活性单抗可用于狂犬病毒暴露后的治疗。
9.学位论文 程满荣 论文Ⅰ：体内外法检测抗狂犬病毒中和抗体的比较研究;论文Ⅱ：CTN疫苗株对中国狂犬病毒街毒代表株的保护性研究 2007
本文对体内外法检测抗狂犬病毒中和抗体的比较及CTN疫苗株对中国狂犬病毒街毒代表株的保护性进行了探讨。本研究从全国各地共分离到46株街毒株，其中从犬脑中分离到41株，人脑中分离到4株，鹿脑中1株。通过用MEGA生物信息学软件进行基因分析，挑选三株具有代表性的街毒株，用CTN疫苗免疫小鼠，然后用三株街毒株脑内和肌肉攻击，并作对照分析，观察CTN疫苗株对这三株代表街毒株保护效果。结果表明：原倍的CTN疫苗株对三株街毒株的脑内和肌肉攻击均是100％保护的；用CTN疫苗株生产的狂犬病疫苗总体上能有效预防我国狂犬病的流行。
10.期刊论文 张强. 唐青. 刘卫滨. 李浩. 梁国栋. ZHANG Qiang. TANG Qing. LIU Wei-bin. LI Hao. LIANG Guo-dong 狂犬病毒TaqMan PCR检测方法的建立 -中华流行病学杂志2006,27(10)
目的 建立检测狂犬病毒(RV)核蛋白(N)基因片段的TaqMan PCR检测方法.方法 针对RV N基因保守区域设计特异性引物与探针;优化检测体系中引物与探针的浓度;以体外转录的RV完整的N基因RNA作为定量分析模型;考核检测体系灵敏性、特异性、稳定性;初步用于RV的检测.结果 引物和探针具有良好的特异性,使用浓度分别为0.6μmol/L和0.2μmol/L,可检测到2700个RNA拷贝数,较传统RT-PCR检测方法敏感性提高了10倍;同一样品Ct值重复检测5次,变异系数均＜5%,表明检测体系具有较好的稳定性;通过所建立的检测体系,绘制了以模板拷贝数为分析指标的RV定量检测标准曲线,对实验室内保存毒株的检测结果显示TaqMan PCR检测比普通PCR检测更快捷、敏感.结论 所建立的RV TaqMan PCR可以用于RV的实验室检测,并且比普通PCR检测方法更灵敏、特异.
本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_gdxmsykj200806001.aspx
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狂犬病毒实验室检测方法综述
陈晶，刘晓慧，孙招金
（华南农业大学兽医学院，广东广州５１０４６２）
摘要：狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，死亡率几达１００％．狂犬病毒感染的早期诊断，为有效预防和控制狂犬病提供基础。本文就几种敏感有效的狂犬病实验室诊断方法进行综述．
关键词：狂犬病毒：检测；试验
中图分类号：Ｒ３７３．９
文献标识码：Ａ狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人兽共患传染病，ＯＩＥ将其列为Ｂ类疫病。我国狂犬病发病死亡人数仅次于印度，为世界第二，从１９５０年至２００５年，我国狂犬病共出现了５次流行高峰，前４次高峰约每１０年流行一次，流行范围几乎遍及全国。从近年来的流行情况看，第５次高峰正在形成，而且增长趋势仍在继续。据卫生部统计表明，包括“非典”疫情发生的２００３年在内，狂犬病的死亡人数在我国法定报告传染病中始终占据首位，狂犬病已成为严重危害我国公共卫生的重大疫病。据报道，１９８０—１９９９年狂犬病累计死亡总数已高达１０万人以上。因此，对该病检测方法的研究可为控制狂犬病在我国的流行提供技术保障。本文对狂犬病实验室诊断的常规技术进行了浅述，包括ＦＡＴ、ＲＴ—ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ试验，从敏感、快速、简便等几方面进行比较，为狂犬病实验室诊断提供参考。
１
实验室诊断依据
临床症状是诊断人和动物狂犬病的重要依据，
但单凭临床表现还不够，还需通过狂犬病病毒的实验室检测才能确诊人和动物狂犬病。１９０３年，
Ａｄｏｌｃｈｉ
Ｎｅｇｒｉ在狂犬病病毒感染组织细胞浆内
发现了嗜酸性包涵体一内基氏小体，后被命名为Ｎｅｇｒｉ小体。从此，Ｎｅｇｒｉ小体被认为是狂犬病病毒感染的特征性病变，将检测Ｎｅｇｒｉ小体作为狂犬病的确诊方法持续了几十年【ｌ】。随着实验室诊断技术的不断发展，许多研究报道狂犬病病毒的感染并非总会出现Ｎｅｇｒｉ小体。自病毒分离技术出现后，发现在狂犬病病毒感染的组织出现Ｎｅｇｒｉ小体的检出率只有５０９６～８０９６㈦。另有报道［３］，犬脑的包涵体阳性检出率为７０％＂９０％，人脑约７０％。由于Ｎｅｇｒｉ小体与狂犬病病毒感染不能严格对应，而１９５８年出现的荧光抗体试验（ＦＡＴ）由于与检测Ｎｅｇｒｉ小体
收稿日期：２００８—０４—２９
万方数据
文章编号：１００５－８５６７（２００８）０６－０００３－０３
相比具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，逐渐被广泛应用，作为检测新鲜组织中狂犬病病毒抗原的标准方法和首选方法。
由于狂犬病毒几乎可以感染所有的温血动物，所以狂犬病毒的实验室诊断首要是考虑安全问题，怀疑感染狂犬病的动物不能随便解剖，应送地方有关部门进行鉴定。实验室在接到怀疑感染该病毒的动物时，一定要在Ｐ３以上条件专业实验室进行操作，并且实验室人员必须做好技术上的准备方可进行接下来的工作。ＷＨＯ专家目前认可的检测方法有小鼠中和试验和快速荧光抑制试验（ＲＦＦＩＴ）等。这两种方法均针对狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体的检测。随着科学技术的发展，实验室也应用了越来越多的方法检测狂犬病毒。
２．１
荧光抗体方法（ＦＡＴ）在诊断狂犬病常规方
法中，ＦＡＴ法是ＷＨＯ和ＯＩＥ共同推荐的方法。该法可直接检测涂片，也能用于检测细胞培养或被接种小鼠的脑组织中狂犬病病毒抗原是否存在“】。自１９５０年被引用以来，在全球范围内被广泛应用于狂犬病的诊断，该方法既灵敏、特异性又高，应用价值非常高。对于新鲜病料，ＦＡＴ法可在几小时内得出可靠结果，准确率达９５％一－－９９％。与其它任何检测方法一样，ＦＡＴ法的可靠性取决于样品性质（如动物种类和自溶程度）、狂犬病病毒（或狂犬病病毒相关病毒）和操作人员的熟练程度【３］。ＦＡＴ法的特异性和灵敏度，部分程度上依赖于亲和力、梯度及特异性结合狂犬病病毒核蛋白的最佳荧光抗体。
最早的时候，从高免动物血液中纯化出免疫球蛋白作为抗体来源…】。单克隆抗体随着杂交瘤（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）技术的引进应运而生，并广泛应用于制备较纯的和特异的抗体。由于这种单克隆抗
２常用的实验室诊断技术
・４・
专题综述
体数量有限，特异性又各不相同，因此必须明确的是：我们在选择单克隆抗体的时候，应该把能够吸附所有的病毒的抗原变异株作为首要条件。而且所有实验条件必须评估好，无论在样品吸附前还是吸附后，都应该明确没有任何一个条件会对标记抗体的稳定性及亲和力产生不良作用［４】。Ｓｙｌｖｉａ等检测了８００多份来自１４种不同动物的怀疑有狂犬病病毒的脑组织，用新鲜病料同时用福尔马林固定，荧光抗体方法检测两种病料的阳性结果吻合率达９９．８％，未出现假阳性，对两种病料的特异性均达１００％。从而得出结论：用ＦＡＴ方法检测狂犬病毒抗原，用新鲜病料或用经福尔马林固定后的病料，效果是等同的【６】。
２．２免疫组织化学技术（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）本
技术出现于上世纪８０年代，在用福尔马林固定病理标本的切片上进行狂犬病病毒抗原检测，通常用于组织中的抗原或感染病毒组织的定性检测，用以诊断人和动物狂犬病。它是以狂犬病特异性单克隆抗体和多克隆抗体作为一抗，以过氧化酶或亲和素一生物素蛋白标记的种属特异性抗体为二抗。研究结果表明，免疫组织化学方法检测狂犬病毒较检测Ｎｅｇｒｉ小体方法更加敏感，且敏感性和稳定性与ＦＡＴ法相当。在无需昂贵设备的情况下即可进行狂犬病毒的定量检测，因而可作为ＦＡＴ检测法外的另一方法而予以重视和应用唧。近年来确立的直接快速免疫组织化学试验（ｄＲＩＴ），因其使用普通光学显微镜可以直接观察到结果，是ＤＦＡ法ＤＦＡ法（直接免疫荧光抗体试验）耗费资金的１／１０，被认为是有希望为发展中国家使用的一种检测手段［８】。２．３酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡ法最
初应用于免疫后动物和人血清中抗狂犬病病毒抗体的效价滴定，但后来经过改进后也可用来检测脑组织内的抗原。该法是先用抗狂犬病病毒阳性血清或ＩｇＧ包被４０孔板，加待测脑悬液，再用标记ＨＲＰ的阳性ＩｇＧ进行反应。亦可采用特异性抗体作为一抗与被检样品反应，然后再与酶标二抗进行反应。同时，设阳性及阴性抗原对照，如被测样品出现特异性显色，即可诊断为狂犬病［３】。用该方法检测狂犬病毒需要在感染细胞阳性率超过１０％（ＩＦＡ检测标准），检测效果较好，敏感性较ＩＦＡ差，会出现一定的假阳性和假阴性，检测的稳定性尚需进一步研究。２．４乳胶凝集试验（Ｌａｔｅｘ
ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ
ｔｅｓｔ。
万方数据
狂犬病毒实验室检测方法综述一陈晶，等
ＬＡＴ）ＬＡＴ法可检测患病动物脑和唾液中的狂犬病毒。Ｍａｄｈｕｓｕｄａｎａ等【９】报道，通过对狗的已知阳性和阴性脑和唾液样品中病毒抗原的检测，比较ＬＡＴ法和ＦＡＴ法的检测结果，前者敏感性高达９５．２％，特异性高达９８．７％，阳性符合率为９７．６％，阴性符合率为９７．４％。２．５病毒分离
取疑似动物脑或唾液腺等材料
用缓冲盐水碾磨成ｌｏ％孚Ｌ剂，脑内接种５－７日龄乳鼠，注射量为ｏ．０３ｍｇ／只，每份标本接种５只乳鼠。乳鼠在接种后继续由母鼠同窝哺养，３～４天后如发现哺乳能力减弱，痉挛，麻痹死亡，即可取脑检查包涵体，并制成抗原，作病毒鉴定［３］。２．６核酸检测法
２．６．１
ＲＴ－ＰＣＲ
本方法是荧光抗体方法的补充，
也可用于检测未知的狂犬病病毒。据报道【Ｊｏ］，对７个基因型的狂犬病病毒所有ＲＮＡ进行连续梯度稀释，并用标准化的ＲＴ—ＰＣＲ方法与已经报道的检测ＥＢＬＶ的ＲＴ－ＰＣＲ方法进行灵敏度比较。结果证明：用两种ＲＴ—ＰＥＲ方法均可以检测出７个基因型的狂犬病病毒，且检测出的阳性结果与用免疫荧光方法的结果完全一致。Ｄａｖｉｄ等用ＲＴ－ＰＣＲ方法对１０份已腐败的脑组织样品进行狂犬病病毒检测，结果全为阳性，其中７份是ＲＴ—ＰＣＲ阳性，而另３份又分离到病毒，做乳鼠脑内接种实验（ＭＩＴ）也是阳性，同时对这些样品作ＦＡＴ方法检测均为阴性；Ｓｕｐａｐｏｒｎ等研究人员对保存达１６年的狂犬病病人脑样品，经福尔马林固定，石蜡油嵌入一周后，用ＲＴ—ＰＣＲ方法检测出狂犬病毒Ｎ基因的１５０ｂｐ目的条带，但用免疫组化反应检测阳性率较低【ｕ】，从而得出结论：对自然感染狂犬病病毒的已经腐败降解的或者不再适用于其它实验室检测方法的脑组织，ＲＴ—ＰＣＲ方法是一种非常有效的分子生物学方法【吲。
２．６．２
ＴａｑＭａｎ试验结合ＴａｑＭａｎ朋基因型特异
探针的ＲＴ—ＰＣＲ的方法能快速有效鉴别病毒。被怀疑阳性的狂犬病病毒分离株可迸一步在单管封闭系统内操作完成检测，防止了潜在的ＰＣＲ产物污染【１３］。使用该方法，一个标准的ＲＴ—ＰＣＲ方法循环完成后几分钟内即可得出一个明确的结论［１０】。对于每个探针，可以通过调节Ｍ９２＋浓度及退火温度来优化条件。检测唾液样品，实时ＲＴ－ＰＣＲ比传统ＲＴ—ＰＥＲ的灵敏度高［１４】。Ｈｕｇｈｅｓ（２００４）设计一个检测组织样品狂犬病毒ＲＮＡ的ＴａｑＭａｎＰＣＲ方法，并证明该方法敏感性、特异性均较高。
狂犬病毒实验室检测方法综述一陈晶，等
狂犬病毒及相关病毒的Ｎ基因高度保守，因此常被选作设计探针结合位点的集中区ｎ叫。Ｅ１ｉｚａ－ｂｅｔｈ等［１５１针对１０６株狂犬病病毒及相关病毒分离株设计８个探针，并结合此探针的ＲＴ—ＰＣＲ方法快速灵敏，能区别早期确定的６种基因型的狂犬病毒及相关病毒。而且发现每种基因型都有特异区域，有助于不同探针的设计。但是寡核苷酸与目的基因之间的错配率明显会影响扩增结果；探针区的点突变可阻止探针的结合及荧光产生，从而导致假阴性。错配４个以上就可严重削弱阳性结果或产生阴性结果，这就直接限制了
ＴａｑＭａｎ
ＰＣＲ的扩增长度［１５】。
３结论
ＦＡＴ法及病毒分离或乳鼠脑内接种试验（ＭＩＴ）是从新鲜病料中诊断狂犬病毒的黄金标准方法。但随着脑组织降解，ＦＡＴ法的灵敏度也下降，病料组织放置室温４８ｈ或３７℃孵育７２ｈ后，检测结果即为阴性［１ｑ１７，ｍｌ。套式ＲＴ－ＰＣＲ是一种能检测包括典型狂犬病病毒及澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒基因型的一种分子生物学方法。用ＴａｑＭａｎ技术检测澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒（ＡＢＬＶ）并与套式、半套式ＲＴ—ＰＣＲ比较，结果套式ＰＣＲ与半套式ＰＣＲ相比，特异性要好或相等。而ＴａｑＭａｎ技术比前两种ＲＴ－ＰＣＲ方法的特异性更高，灵敏度也相对较高，能检测约
１０ｇｅｑ／ｕ
Ｌ，比套式ＲＴ－ＰＣＲ灵敏度高１０倍；操作
过程更加快速，传统ＲＴ－ＰＣＲ方法需１２～２０ｈ，而ＴａｑＭａｎ只需４ｈ，且交叉污染的可能性更小ｎ鲫。ＴａｑＭａｎ法和ＦＡＴ法具有完全对应的检测结果。
由于狂犬病正在成为危害人类生命的重大疫病之一，快速、准确的诊断狂犬病已经迫在眉睫了，同时，国际上也亟待一套规范化的统一的诊断程序。所以狂犬病诊断方法的研究在控制狂犬病的流行起着重要的作用。参考文献：
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狂犬病毒实验室检测方法综述
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：引用次数：
陈晶， 刘晓慧， 孙招金
华南农业大学兽医学院,广东,广州,510462
广东畜牧兽医科技
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相似文献(10条)
1.学位论文 刘健 套式RT-PCR检测狂犬病毒方法的建立及其在上海地区犬、猫唾液样本的应用 2006
建立了狂犬病毒的套式RT-PCR检测方法，可以特异地检测出狂犬病毒ERA毒株的RNA，而对犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬细小病毒
(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCV)均呈阴性。该法能检出0.18fg的RNA，敏感性是普通RT-PCR的10000倍。并且检测了分别用PBS液和人唾液稀释的阳性脑组织病料，结果表明PBs液稀释的阳性病料和唾液稀释的阳性病料的检测结果是一致的，凝胶电泳观察均可以观察到特异的460bp的条带。研究表明应用套式RT-PCR法是可以检测出唾液中的狂犬病毒的。 对广西送检的疑似狂犬病的20份犬的脑组织进行RT-PCR检测，比较了套式RT-PCR和普通RT-PCR两种方法的阳性检出率。套式RT-PCR检出15份阳性，阳性率达到75％，测序结果表明15份阳性条带的序列为狂犬病毒的核酸序列，其中4个代表株与狂犬病毒ERA毒株的同源性在85.1％～85.5％之间；与狂犬病毒CVS株的同源性在85.9％～87％之间；相互间同源性在98％～99.6％之间，而普通RT-PCR检测没有出现任何条带。表明套式RT-PCR法在临床应用中可极大提高狂犬病毒的检出率，是实用的检测方法。 摸索了犬唾液样本的保存条件。通过对缓冲液的初步筛选，选定人唾液、PBS液+2％FCS(犊牛血清)和Hanks液+2％FCS作为样品保存的候选缓冲液，分别以这三种缓冲液为基础，不同保存时间，及不同温度保存，比较套式RT-PCR可以检测到病毒的最大稀释滴度。结果表明，PBS液+2％FXS最有利于狂犬病毒ERA毒株的保存；唾液其次；Hanks液+2％FCS虽然理论上缓冲能力最强，但是最不利于狂犬病毒ERA毒株的保存。在2日内可以检测的样本，应当4℃保存，避免冻融对病毒产生的损害；一周以内可以检测的样本应当加入抗生素，保存在-20℃；超过一周再检测的样本应当保存在-70℃，保存在-20℃虽然对套式RT-PCR检测影响不大，但是病毒量还是有所下降的。 2005年9月至2006年3月，对上海地区外观健康的犬、猫进行了唾液样本狂犬病毒的检测，共检测了1251份样本，其中流浪犬和咬人的犬355份；家养宠物犬694份；犬场宠物犬135份；家养宠物猫65份；流浪猫2份，结果未检出一例阳性，表明上海地区流浪犬、宠物犬和宠物猫唾液中不带狂犬病毒，目前对人群不存在传播狂犬病毒的潜在危险。
2.学位论文 周萍 狂犬病毒RT-PCR和荧光定量PCR检测方法的建立 2007
狂犬病的病原是狂犬病毒。对狂犬病毒的诊断，只有通过实验室诊断，才能得到准确结果，生前的临床症状和死后的组织病变仅可作为诊断的参考。近年来，随着分子生物学和基因工程方法的发展和应用，研究者们对狂犬病毒的结构，基因序列及其主要功能，发病机制都有了更进一步的认识，使得对狂犬病的诊断与预防也更完善，通过各毒株之间的序列比较证实，狂犬病毒核蛋白在各毒株之间基因序列高度保守，广泛用于狂犬病毒的检测、基因分型及核酸疫苗的研制等研究工作。 本实验先对国内各省市地区报导的狂犬病毒株序列进行比较，确定N基因上相对保守的区域，以兽用疫苗株HEP-Flury为阳性毒株，在其N基因的保守区域内设计引物，建立诊断狂犬病毒的RT-PCR方法。用此RT-PCR方法程序检测另四个狂犬病毒毒株：SN、SN10、G1N2、L16，结果均为阳性；检测犬细小病毒、犬瘟热病毒为阴性；该方法最低可检测到20ngHEP-Flury病毒的总RNA，或4×10个FFU。提取14只攻毒小鼠的海马回及延髓，用本方法与直接免疫荧光抗体试验分别进行检测,RT-PCR可检测到8个阳性，FAT可检测到6只小鼠的荧光斑点，说明用普通RT-PCR方法比直接免疫荧光染色法的敏感性更高。 本实验对N基因的保守区域又分别设计一对引物和荧光探针，建立了N基因部分片段的荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法。该方法对仪器和试剂的要求较高，但敏感性比普通RT-PCR方法高，本实验通过对该方法的灵敏度分析，认为荧光定量PCR的灵敏度要比普通。RT-PCR方法高。 本研究建立了检测狂犬病毒的普通RT-PCR方法及荧光定量PCR方法，为研制快速检测唾液、脑组织样品中的狂犬病毒的试剂盒打下良好基础。
3.学位论文 李志峰 广州及周边地区蝙蝠携带SARS（样）冠状病毒、狂犬病毒和禽流感病毒的初步流行病学调查 2006
研究背景：近年来发现蝙蝠是多种人兽共患疾病病毒的储存宿主，蝙蝠可以持续感染许多病毒而不表现临床症状。SARS首先在广东爆发，尽管先前对这种新病毒的致病性和分子特征的研究取得了成功，但仍没有找到SARS冠状病毒的来源。流行病学调查及果子狸体内检测到SARS样病毒，表明SARS冠状病毒(serveacuterespiratorysyndrome-associatedcoronavirus，SARS-CoV)可能来自野生动物，但随后的调查发现感染在野生或人工饲养的果子狸并不常见，而且果子狸在感染两种不同的SARS-CoV人分离株后，表现出明显的临床症状，提示果子狸可能不是SARS-CoV的自然宿主。果子狸可能只是SARS-CoV的中问宿主，SARS-CoV有可能是从别的野生动物(如在野生动物市场的野生动物)传播给果子狸。广东地区有食用果蝠的现象，野生动物市场每天汇集来自广州及周边地区的捕捉的果蝠，然后再分销至广州及周边城市的酒店和茶楼。这样就造成或增加了野生动物之间和野生动物与人接触的机会，也就增加了一些疾病在野生动物之间及在野生动物与人之间传播的可能，使得某些疾病跨物种传播成为可能。若果蝠携带SARS冠状病毒就有可能将SARS冠状病毒传染给人或其它动物(比如果子狸)，果蝠有可能是SARS-CoV和SARS样冠状病毒(SARS-like-CoV)冠状病毒的自然保菌宿主之一。研究发现蝙蝠与狂犬、乙脑等发病有一定的关系。禽流感病毒主要自然储存宿主是禽类，但是否还存在其他野生动物自然宿主，如果蝠，还有待于进一步调查研究。是果蝠可能携带的病毒以及与人类疾病、健康之间的关系和流行病学调查研究几乎空白。因此有必要对广州及周边地区的蝙蝠种类、分布、数量、生态习性等开展调查，对果蝠及其它蝙蝠可能携带SARS(样)冠状病毒(SARS(-like)-CoV)、狂犬病毒(Rabiesvirus，RV)与禽流感病毒
(Avianinfluenzavirus，AIV)的情况开展流行病学调查。 研究目的：1.对广州市及周边地区的蝙蝠种类、分布、生态习性等开展初步调查，为进一步深入开展该地区蝙蝠可能携带的重要传染病病毒及与当地人群之间的健康、疾病之间的关系的流行病学调查奠定基础。 2.对广州及周边地区和广州野生动物市场的蝙蝠携带SARS(样)冠状病毒的情况开展流行病学调查，为进一步阐明SARS源头及传播链提供线索。 3.对广州及周边地区和广州野生动物市场的蝙蝠携带狂犬病毒和禽流感病毒的情况开展流行病学调查，为狂犬病和禽流感疾病的预防提供更全面的理论依据。 研究方法：1.调查，走访、请教国内研究蝙蝠的专家教授，获取广州及周边地区蝙蝠的种类、分布、生态习性等资料。 2.在调查地区开展现场调查，了解是否有蝙蝠存在、蝙蝠的种类及与当地人群疾病、健康等可能存在的关系。 3.对广州的野生动物市场开展调查，了解野生动物市场私自销售的蝙蝠种类、数量、来源及分销地点。 4.捕捉蝙蝠，采集标本，并请研究蝙蝠的动物学专家对蝙蝠种类进行鉴定，对蝙蝠可能携带的SARS(样)冠状病毒、狂犬病毒和禽流感病毒采用细胞培养、RT-PCR、荧光PCR、基因芯片等多种方法进行病源学检测，检测过程严格质量控制。 质量控制：1.本次调查强化全程质量控制措施，标本与阳性对照采用统一的检测方法。 2.标本取材新鲜，采用病毒保存液制备病毒悬液，减少病毒可能的损失。提取的RNA经检测表明纯度较高，完整性好，含量较高。 3.分子生物学检测采用多对引物同时检测，降低了不同引物扩增效率不同的影响。除了阳性对照、阴性对照和空白对照，还设立了模拟对照，以排除标本和病毒保存液可能对RNA的提取、RT-PCR检测的干扰。优化检测反应条件。 4.上述实验对照全部成立，试验条件稳定重复性好，说明检测方法可靠。 5.为减少系统误差，减少检测的假阴性，对部分标本还采用并联检测法和重复一次检测。 通过上述严格的实验质量控制，优化检测条件，可以提高本次检测的灵敏度，减少假阴性，检测结果可信。 研究结果：1.本次调查发现广州市有4科9属15种蝙蝠。主要有：狐蝠科(Pteropodidae)：棕果蝠(Rousettusleschenaulti)，犬蝠(Cynpterussphinx)，短耳犬蝠(Cynopterusbrachotis)。菊头蝠科(Rhinolophidae)：中菊头蝠(Rhinolophusafffinis)，中华菊头蝠(Rhinolophussinicus)，小菊头蝠
(Rhinolophusblythi)。蹄蝠科(Hipposideridae)：小蹄蝠Hipposiderospomona。蝙蝠科(Vespertilionidae)：中华山蝠(Nyctalusvelutinus)，灰伏翼(Pipistrelluspulveratus)，小伏翼(Pipistrellustenuis)，东亚伏翼(Pipistrellusabramus)，扁颅蝠(Tylonycterispachypus)，小黄蝠
(Scotophiluskuhli)，大黄蝠(Scotophilusheathi)，彩蝠(Kerivoulapicta)。 2.广州及周边地区生活有可能携带虫媒病毒的多种蝙蝠，因此这些蝙蝠有可能携带罗斯河病毒、乙脑病毒、森林脑炎病毒、基孔肯亚病毒、登革病毒、狂犬病毒、SARS(样)冠状病毒和西尼罗河病毒等虫媒病毒。3.从2004年9月至2005年11月，本次调查从共收集分别属于两个亚目9个种的905只蝙蝠：犬蝠(Cynopterussphinx)395只、棕果蝠
(Rousettusleschenault)154只、普通长翼蝠(Miniopterusschreibersi)5只、普氏蹄蝠(Hipposiderospratti)7只、中华菊头蝠
(Rhinolophussinicus)15只、小黄蝠(Scotophiluskuhlii)52只、大耳双色蹄蝠(HipposiderosPomona)8只、中菊头蝠(Rhinolophusaffinis)228只及小菊头蝠(Rhinolophuspusillus)41只。 4.上述9个种905只蝙蝠的共计3043份标本(咽拭813，血清524，肺组织853，直肠粪便853)用新型冠状病毒(N-蛋白)测定试剂盒(酶联免疫法)、SARS-CoVRNA检测试剂盒、荧光PCR、基因芯片检测、RT-PCR和Vero-E6细胞分离培养等检测SARS(样)冠状病毒，结果未检测、分离到SARS(样)冠状病毒。 5.其中7个种的蝙蝠794只(犬蝠(Cynopterussphinx)330只、普氏蹄蝠(Hipposiderospratti)7只、棕果蝠
(Rousettusleschenault)154只、普通长翼蝠(Miniopterusschreibersi)5只、小黄蝠(Scotophiluskuhlii)52只、中菊头蝠(Rhinolophusaffinis)209只及小菊头蝠(Rhinolophuspusillus)37只)取得3391份标本(咽拭719，血清452，脑组织742，肺组织742，直肠组织742)，采用RT-PCR和Vero-E6细胞分离培养等检测狂犬病毒与禽流感病毒。结果未检测、分离到狂犬病毒和禽流感病毒。 结论：1.本次调查发现广州市有4科9属15种蝙蝠主要有：狐蝠科(Pteropodidae)：棕果蝠(Rousettusleschenaulti)，犬蝠(Cynpterussphinx)，短耳犬蝠(Cynopterusbrachotis)。菊头蝠科(Rhinolophidae)：中菊头蝠(Rhinolophusaffinis)，中华菊头蝠(Rhinolophussinicus)，小菊头蝠(Rhinolophusblythi)。蹄蝠科(Hipposideridae)：小蹄蝠Hipposiderospomona。蝙蝠科(Vespertilionidae)：中华山蝠(Nyctalusvelutinus)，灰伏翼(Pipistrelluspulveratus)，小伏翼(Pipistrellustenuis)，东亚伏翼(Pipstrellusabramus)，扁颅蝠(Tylonycterispachypus)，小黄蝠(Scotophiluskuhli)，大黄蝠
(Scotophilusheathi)，彩蝠(Kerivoulapicta)。这些蝙蝠有可能携带罗斯河病毒、乙脑病毒、森林脑炎病毒、基孔肯亚病毒、登革病毒、RV、SARS-CoV、SARS(-like)-CoV和西尼罗河病毒等虫媒病毒。 2.从2004年9月至2005年11月，本次调查的广州及周边地区的9个种的905只蝙蝠未检测和分离到SARS(样)冠状病毒、狂犬病毒及禽流感病毒。 3.调查未发现检测的病毒这可能与检测的蝙蝠的种类、每种蝙蝠的数量、蝙蝠携带的病毒量及调查的地区、时间有关。
4.学位论文 马益萍 检测犬狂犬病毒抗体的间接ELISA方法的建立 2008
本文进行了如下研究： 1.犬IgG的分离纯化和抗犬IgG单克隆抗体的制备 采用辛酸-硫酸铵盐析和Hiload 16/60 superdex 200 preppg凝胶柱层析法从犬血清中获得IgG，经SDS-PAGE电泳鉴定。用BCA法测定IgG浓度为2mg/ml。用纯化后的犬IgG，采用常规免疫法免疫6-8周龄雌性
BABL/c小鼠。取三次免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按10：1混合，用0.7ml 50％PEG 4000进行细胞融合，对杂交瘤细胞进行筛选，阳性孔经3次有限稀释法克隆，成功获得6株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，对6株McAb初步鉴定结果表明，其抗体类型均为IgG1，轻链都为κ链。腹水的间接ELISA效价介于1.3×104～6.6×106之间。Western-Blotting试验证实有3株细胞为分泌针对犬IgG轻链抗体的杂交瘤细胞株，有3株细胞为分泌针对犬IgG重链抗体的杂交瘤细胞株。 2.狂犬病毒核蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定 用纯化的重组RV N蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，通过间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞，阳性孔经3次有限稀释法克隆，成功获得1A4、7H3、7H6、7F6及7F7 5株能稳定传代并分泌抗重组RV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。各单克隆抗体腹水间接ELISA效价在104-106之间。5株单克隆抗体的亚类均为IgG1，轻链均为κ链。Western-blot分析表明，所获得的5株单克隆抗体与重组RV N蛋白均具有反应性。间接免疫荧光染色显示，7F6与7F7可识别病毒感染Vero细胞中的RV N蛋白。 3.抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定 用纯化的原核表达的RV G蛋白免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，经过3次免疫后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，通过间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞，阳性孔经3次有限稀释法克隆，成功获得1株(1D10)能稳定传代并分泌抗重组RV G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。间接ELISA效价2.56×104。单克隆抗体的亚类均为IgG1，轻链均为1(链。间接免疫荧光染色显示腹水IFA效价为1：400。 4.抗犬IgG单克隆抗体的纯化及其酶标记 复苏稳定分泌抗犬IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D4，按常规方法制各腹水。用辛酸～硫酸铵及
Protein G两步法纯化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，证明腹水经辛酸-硫酸铵及Protein G纯化后具有较高的纯度，可用于酶标记。采用过碘酸钠氧化法将犬IgG与辣根过氧化物酶连接，获得酶标鼠抗犬IgG，酶标记率为52.16％，克分子比为1.6；通过Dot-ELISA检测，发现HRP标记的鼠抗犬IgG在1：3000倍稀释时，可以与1024倍稀释的犬抗RV阳性血清起反应。 5.NP-ELISA抗体检测方法的建立 以原核表达的狂犬病毒核蛋白为抗原，建立了检测狂犬病毒抗体的间接ELISA方法。最佳反应体系为：抗原包被液为0.05M pH8.5的Tris-HCl缓冲液，抗原包被浓度为2ug/ml；封闭液为0.5％BSA/PBST，血清及二抗稀释液为含0.1％BSA的PBST缓冲液，待检血清的最佳稀释倍数为1：100，酶标抗体的最佳稀释倍数为1：2000；待检血清和酶标二抗孵育时间均为60min，底物反应时间10min。重复性试验、阻断性等试验表明，该方法重复性好、灵敏度高；与美国SYNBIOTICS试剂盒比较，本试剂盒的诊断敏感性为91.2％，特异性为90.7％，符合率为90.9％。
5.期刊论文 任雅萍. 李德新. 张全福. 谈易男. 魏然. 刘琴芝. 李川. 张云涛. 沈荣. 邹勇 狂犬病毒抗体ELISA检测试剂盒的改进研究 -微生物学免疫学进展2004,32(3)
为了提高狂犬病毒抗体检测的灵敏度和特异性,采用狂犬病毒单克隆抗体包被酶标板,再分别加入重组的狂犬病毒糖蛋白或细胞培养抗原做固相层的方法(抗体捕捉法),用传统的间接ELISA法做对照,按常规方法检测抗狂犬病毒抗体.结果显示,抗体捕捉法的非特异性反应低于间接法,而灵敏度达到0.5IU水平,高于间接法.在800份临床标本检测中,检出率明显高于间接法.用15份阳性血清作小鼠中和试验,并和抗体捕捉ELISA法比较具有高度的一致性.试验结果充分表明,该方法优于传统的ELISA间接法.因此可作为临床注射狂犬疫苗后检测血清中狂犬病毒抗体的常规方法.
6.学位论文 唐婕 狂犬病毒的电镜检测及其糖蛋白基因的克隆与序列分析 2007
狂犬病毒(Rabies Virus，RV)属于弹状病毒科(Rhabdoviriade)，狂犬病毒属(Lyssavirus)。在电镜下其外形具有明确子弹状形态特点，易于辨认。因此，电镜检查为狂犬病毒的形态鉴定提供了快速直观的诊断。狂犬病毒的糖蛋白是病毒粒子的重要成份，具有血凝活性，为病毒粒子与宿主细胞结合的受体位点提供桥梁，是唯一能产生中和抗体的病毒成分，它能影响狂犬病疫苗的免疫原性。本实验对狂犬病毒进行了电镜检测，旨在分析其形态特征，为狂犬病毒的诊断提供依据，并探讨了电子显微镜技术在病毒学研究中的应用。同时对狂犬病毒糖蛋白进行克隆与序列分析，为其基因工程疫苗的开发、基因免疫等提供科学研究基础。 本实验采用电镜负染技术、超薄切片法、高速离心等制样方法，通过电镜观察对狂犬病毒的形态结构、粒子大小、增殖方式、病毒在组织中的分布等进行了分析。根据GenBank发表的狂犬病毒糖蛋白核苷酸序列，利用Oliga软件设计两对特异性引物，通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了狂犬病毒 Flury-lep糖蛋白的全长 cDNA，将其插入克隆载体pMD-18T并测序。 结果表明：①在透射电子显微镜下狂犬病毒粒子呈显著的子弹状；②在扫描电子显微镜下观察到狂犬病毒能与鹅红细胞产生凝集反应，且附着在鹅红细胞表面；⑨测序结果及同源性分析表明，糖蛋白cDNA长1574bp，编码524个氨基酸。狂犬病毒株 Flury-lep的GP基因序列与 GenBank 公布的狂犬病毒株GP基因片段核苷酸序列的同源性为82.3％～96.3％，其编码产物的氨基酸序列同源性为88.4％～94.3％。 通过本实验，证明通过电镜技术对狂犬病毒的鉴定是可行的、有效的，为以后的病毒鉴定提供了快速的鉴定方法。在没有阳性血清或抗体的情况下，结合临床症状、流行病学调查研究及电镜技术可对病毒定性。本实验对狂犬病毒Flury-lep株的GP基因成功地进行了克隆与测序，为狂犬病毒分子流行病学的研究、选择抗原性强的疫苗毒株和基因工程疫苗的研制提供了理论基础和科学依据，并为Flury-Lep株的分子生物学特性研究奠定了基础。
7.期刊论文 徐葛林. 严家新. Larrous F. 祝玉桃. Cozette P. 薛红刚. 胡巧玲. Bourhy H. XU Ge-Lin. YAN Jia-xin. Larrous F. ZHU Yu-tao. Cozette P. XUE Hong-gang. HU Qiao-ling. Bourhy H 抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体在狂犬病街毒检测中的应用 -中华流行病学杂志2005,26(2)
目的测试抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体用于间接免疫荧光法检测已确认的狂犬病阳性及狂犬病阴性的动物脑组织标本的灵敏度和特异性.方法将巴斯德研究所狂犬病参考中心保存的来自不同国家的62份狂犬病街毒动物脑组织标本以及271份法国境内收集的正常动物脑组织标本,用上述间接免疫荧光检测,并以巴斯德研究所狂犬病参考中心提供的狂犬病毒酶联免疫吸附法、组织细胞分离法及直接免疫荧光法等三个试验作确认试验,进行比较.结果间接免疫荧光法可检测涵盖狂犬病毒7个基因型在内的所有62份街毒标本,对确认为狂犬病阴性的动物脑组织标本检测均为阴性,其特异性和灵敏度均达到100%.结论抗狂犬病毒核蛋白单抗作为间接免疫荧光法检测狂犬病毒具有良好的应用前景.
8.学位论文 汪霞 Ⅰ：抗狂犬病毒单抗对狂犬病街毒暴露后的治疗;Ⅱ：细胞培养法检测和分离狂犬病街毒的可行性研究 2008
目的:研究鼠抗狂犬病毒中和活性单抗2C、5C对狂犬病病毒暴露后的治疗效果。 方法:用三个病毒代表株CQ92、HN06和GX-4分别感染Balb/c小鼠腓肠肌，30min后用2C、5C和人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)进行治疗。 结果:2C、5C和HRIG对狂犬病病毒暴露后小鼠具有相近的保护率。 结论:鼠抗狂犬病毒中和活性单抗可用于狂犬病毒暴露后的治疗。
9.学位论文 程满荣 论文Ⅰ：体内外法检测抗狂犬病毒中和抗体的比较研究;论文Ⅱ：CTN疫苗株对中国狂犬病毒街毒代表株的保护性研究 2007
本文对体内外法检测抗狂犬病毒中和抗体的比较及CTN疫苗株对中国狂犬病毒街毒代表株的保护性进行了探讨。本研究从全国各地共分离到46株街毒株，其中从犬脑中分离到41株，人脑中分离到4株，鹿脑中1株。通过用MEGA生物信息学软件进行基因分析，挑选三株具有代表性的街毒株，用CTN疫苗免疫小鼠，然后用三株街毒株脑内和肌肉攻击，并作对照分析，观察CTN疫苗株对这三株代表街毒株保护效果。结果表明：原倍的CTN疫苗株对三株街毒株的脑内和肌肉攻击均是100％保护的；用CTN疫苗株生产的狂犬病疫苗总体上能有效预防我国狂犬病的流行。
10.期刊论文 张强. 唐青. 刘卫滨. 李浩. 梁国栋. ZHANG Qiang. TANG Qing. LIU Wei-bin. LI Hao. LIANG Guo-dong 狂犬病毒TaqMan PCR检测方法的建立 -中华流行病学杂志2006,27(10)
目的 建立检测狂犬病毒(RV)核蛋白(N)基因片段的TaqMan PCR检测方法.方法 针对RV N基因保守区域设计特异性引物与探针;优化检测体系中引物与探针的浓度;以体外转录的RV完整的N基因RNA作为定量分析模型;考核检测体系灵敏性、特异性、稳定性;初步用于RV的检测.结果 引物和探针具有良好的特异性,使用浓度分别为0.6μmol/L和0.2μmol/L,可检测到2700个RNA拷贝数,较传统RT-PCR检测方法敏感性提高了10倍;同一样品Ct值重复检测5次,变异系数均＜5%,表明检测体系具有较好的稳定性;通过所建立的检测体系,绘制了以模板拷贝数为分析指标的RV定量检测标准曲线,对实验室内保存毒株的检测结果显示TaqMan PCR检测比普通PCR检测更快捷、敏感.结论 所建立的RV TaqMan PCR可以用于RV的实验室检测,并且比普通PCR检测方法更灵敏、特异.
本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_gdxmsykj200806001.aspx
下载时间：2009年11月6日