改良的人脐带间充质干细胞培养方法

·技术与方法·

改良的人脐带间充质干细胞培养方法

郝白露

杨瑞峰

彭祥炽

赵

凯

李红钢

胡

廉

熊承良

430030）华中科技大学同济医学院计划生育研究所/生殖医学中心（武汉，摘

要

目的：建立人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）的分离和培养方法，探讨hUCMSCs的成脂成骨分化潜能。方

法：用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞，流式细胞仪检测其免疫表型；用不同并对其进行鉴定。结果：改良的hUCMSCs培养方法培养细胞的培养体系诱导hUCMSCs向成骨细胞及成脂细胞分化，

在相同的培养时间内，改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍，是传统组织块法的20～30纯度更高，

CD90、CD44、CD105，CD45、CD34；茜素红染色及油红O染色证实倍，细胞呈长梭形生长；高表达CD73、不表达CD31、证实了hUCMSCs的增殖能力和了hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论：建立了hUCMSCs的培养新方法，为其治疗应用提供支持。多向分化潜能，

关键词人脐带间充质干细胞细胞培养

doi：10．3969/j．issn．1004－8189．2012．12

免疫表型

诱导分化

ThemodifiedculturemethodofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsHaoBailu，YangRuifeng，PengXiangzhi，ZhaoKai，XiongChengliang*

ReproductiveMedicalCenter/ResearchInstituteforFamilyPlanning，TongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScience＆Technology，Wuhan430030

Correspondingauthor：XiongChengliang：clxiong951@sina．com

Objective：Toestablishamethodtoisolateandculturehumanumbilicalcordmesenchymalstemcells（hUCMSCs）

Abstract

invitroandtostudyhUCMSCs＇differentiationpotentialtowardsosteoblastsandlipoblasts．Methods：Mesenchymalstemcellswereisolatedfromhumanumbilicalcordbyenzymedigestion，conventionaltissueadherenceandmodifiedtissueadherence．Theimmunophenotypesweredetectedbyflowcytometry．Thecellswereinducedtodifferentiateintoosteoblastsandlipoblastsbydifferentculturesystems．Results：ThemodifiedculturemethodofhUCMSCswasestablished．Thecellswereofhigherpu-rity，andtheprimarycellnumberwas2－3timesasthatachievedwithconventionalenzymedigestionmethodand20－30timesasthatofconventionaltissueblockculture．TheadherentcellsshowedaspindleshapeandwerepositiveforCD73，CD90，CD44andCD105，butnegativeforCD31，CD45andCD34．Afterinduction，thedifferentiatedcellswerepositiveforalizarinredstainingandoilredOstaining．Conclusion：AneffectivelyculturemethodofhUCMSCswasestablished，andthecellscandifferentiateintoosteoblastsandlipoblasts．Keywords

Humanumbilicalcordmesenchymalstemcells；Cellculture；Immunophenotype；Inductionanddifferentiation

间充质干细胞是普遍存在于不同组织的多潜能成体干细胞

［1］

［2］

，可刺激组织生长和修复，增强组

［3］

标准培养条件下可贴附于塑料器皿；②表达CD105、CD73、CD109，并且不表达造血细胞标志物如CD45、CD34、CD14、CD11b；③在体外培养条件下能够向成脂肪细胞、成软骨细胞分化骨细胞、

［5］

织的再生能力，影响免疫调节有着极为广阔的应用前景

［4］

，在细胞治疗领域

。尽管间充质干细胞

。骨髓间充

但至今尚未发现特异表达一些已知的表面标志物，

性的表面标志基因，为了解决这一问题，国际细胞治疗学会提出3个最低标准定义间充质干细胞：①在

项目基金：湖北省科技厅研究与开发项目（2008BCC007）收稿日期：2012－06－06

质干细胞已经在临床上得到了应用，近几年寻找新型和更具潜力的间充质干细胞已成为研究热点之一。人脐带间充质细胞（hUCMSCs）已经在神经疾病

［6，7］

［8］［9］

、癌症、糖尿病、心脏病等动物模型中证

实有治疗效果。若进一步应用于临床，最重要的就是体外扩增达到有效的临床治疗剂量证细胞的特性，免疫抑制能力

［11］

［10］

修回日期：2012－10－18

，其次是保

通讯作者：clxiong951@sina．com

，多向分化潜

能

［12］

。鉴于此，本文从培养hUCMSCs的方法学入5%CO2培养块，共放置10个培养瓶。置于37℃、箱中孵育，以后每天用300μl的培养液湿润组织块，再弃去多余的液体，当有细胞从组织块中游出后，逐渐向培养瓶中增加培养液（但避免组织块漂起），当将贴壁细胞和组织块分达到80%～90%融合度时，别传代。

1．3．2改进的传代培养

①贴壁细胞传代：加入胰

待细胞悬浮后用2倍体积的完全培养蛋白酶2ml，

基终止消化，以1500r/min离心10min，弃上清。用完全培养基重悬细胞转入T25培养瓶中，每个培养瓶中补足3ml培养液，以后每周换2次液。②组织块传代：将有细胞游出的组织块小心挑出，移入新的培养皿，间隔5mm种植，加少量完全培养基湿润底部即可，待其贴壁后再补加一定量的完全培养基。待观察到有细胞从组织块游出后，隔天换液，待游出组织块细胞达到一定密度后传代。1．3．3免疫表型鉴定

取第3代细胞，消化细胞后

离心弃去上清液，加PBS洗2次，用PBS重悬细胞使每管的细胞量达到分装到10个1．5mlEP管中，

107个、液体量为100μl，避光。分别加入5μlAPC、PE或FITC标记的CD73、CD105、CD90、CD44、CD45、CD31、CD34，PE的同型对照和空以及FITC、白对照。4℃孵育30min后，用1mlPBS洗2遍，1500r/min离心10min，200μlPBS重悬细胞，流式细胞仪检测分析。

1．3．4细胞的多向分化潜能及其鉴定

消化体外扩

增的第3代细胞，以1︰2的比例传代到6孔板中，待其达到70%～80%融合度时，将培养液换为成骨诱导分化培养液（用高糖DMEM配置的完全培养0．1μmol/L地塞米松、50μmol/L抗坏血酸、基、

10mmol/Lβ－磷酸甘油）［17］及成脂诱导分化培养液（用高糖DMEM配置的完全培养基：1μmol/L地200μmol/L吲哚美辛、10μg/ml胰岛素、塞米松、异丁基甲基黄嘌呤），每4天半量换液，于3周后行茜油红O染色进行鉴定。以未加诱导液只用高素红、

糖DMEM配制的完全培养基培养的hUCMSCs作为阴性对照组同时进行染色

［17］

手，力求能有效地扩增出足够数量的间充质干细胞，为临床应用提供细胞来源。

1材料和方法

1．1材料来源

正常健康顺产男婴脐带组织（来自湖北省武汉经产妇知情同意。实验方市同济生殖专科医院），案经医院伦理委员会批准。1．2主要试剂及仪器

低糖DMEM培养基（美国GIBCO公司），高糖DMEM培养基（美国GIBCO公司），胎牛血清FBS（美国GBICO公司），双抗（青霉素－链霉素，美国GIBCO公司），地塞米松、β－甘油磷酸钠等（美国Sigma），APC、PE或FITC标记的CD73、CD105、CD45、CD90、CD44、CD31、CD34。1．3hUCMSCs的分离与培养

采集脐带后，放入运输液中（100ml低糖DMEM、1ml双抗、1μg/ml两性霉素）低温保存，带回实验室12h内进行处理。将脐带置于超净工作台，剥去动静脉，用PBS洗去残留的血液，用不同方法培养细胞，观察细胞的生长、变化1．3．1原代培养

［13，14］

。

①酶消化法：剪碎处理过的组织，

加入适量1mg/ml胶原酶II混匀，放入CO2培养箱37℃，12h。后加入胰蛋白酶，37℃，10min。将液中，

体加入离心管中，以＞2000r/min离心10min，将沉10%FBS、1ml双淀物用完全培养液（低糖DMEM、抗）重悬，移入10个培养瓶中培养

［10］

。倒置显微镜

下观察，细胞贴壁后半量换液，弃去未贴壁的细胞。当细胞达到80%～90%融合度，用胰蛋白酶消化传代。②传统组织块法：在去血管后的组织上剪取1～3mm3组织块小心放入T25培养瓶底部，间隔0.5cm，每个瓶中放置约30个小块，共放置10个培养瓶。向培养瓶中加入250μl完全培养液（湿润组5%CO2培养箱中孵育。置于37℃、织块底部即可），

于第3天加入完全培养基3ml，以后隔天观察细胞，并根据情况换液，当细胞达到80%～90%融合度时，将贴壁细胞消化传代

［5，13，15，16］

。

。③改良组织块

法：用微量加样器取少量培养液到T25培养瓶中润湿培养瓶底部，弃去多余的培养液，在去血管后的组

3织上，取1～3mm组织块，以0．5cm的间距放置到

2结果

2．1细胞形态学及生长特点2．1．1酶消化法

24h可见少量倒置显微镜下观察，

贴壁的圆形细胞，但杂细胞较多，大部分为悬浮的血

湿润了的T25培养瓶中，每个瓶中放置约30个组织

细胞，以后贴壁细胞渐多，但散在分布于瓶底；3～5d可见到贴壁细胞形态呈锤形或多角形，以后细胞数量逐渐增多；培养10d，局部可达到80%～90%的融10个培养瓶的细胞总数15．8合度，细胞消化计数，d。细胞按1︰2或1︰1传代，×105个，见图1b、第2天、第3天连续观察发现，有较少的细胞贴壁，以后每3～4d换液1次，于第10天观察，大部分细局部细胞有融合现象，待胞仍散在分布且形态改变，

其生长到80%～90%的融合度时，可再次传代，但细胞数量递减。

2．1．2传统组织块法培养第11天肉眼观察，瓶中

贴壁的组织块数剩余较少。倒置相差显微镜观察，可看到有韧性的厚小组织块周围游出梭形细胞，形态均一并迅速生长，在2～3d内达到80%～90%的较薄的组织小块没有梭形细胞游出，或部分融合度，

地方细胞散在分布及形成小克隆。对细胞进行消化10传代，在消化前一天全量换液。细胞消化计数，

c。细胞个培养瓶的细胞总数1．3×10个，见图1a、

10～15d细胞铺满底，按1︰1传代，漩涡状密集分布，生长较一致

。

a组织块法培养第11天，组织小块周围游出梭形细胞；b酶消化法培养第8d，逐渐增多的纺锤形细胞；c组织块法培养第13天，细胞融合度80%～90%；d酶消化法培养第10天，细胞融合度80%～90%

图1

两种培养方法人脐带间充质干细胞生长特点显微镜下观察（×200）

2．1．3改良组织块法培养第13天肉眼观察，瓶中表1

细胞特点

不同培养方法细胞特点的比较

酶消

化法410－/+－/+15．8

+好/纯

传统组

织块法原代组织传代组织1113++1．3

1315++12．5

27++++14．8

所有的组织块都保持在原位。倒置显微镜下观察，游出细胞的组织块数较多，且细胞梭形生长，均一一2～3d迅速生长达到80%～90%的致，补充液体后，10个培养瓶的细胞总数细胞消化计数，融合度，

12.5×105个。2．1．4改进的传代培养

细胞按1︰2或1︰1传

10～15d细胞铺满底，代，漩涡状密集分布，生长较一致。可再次传代。有细胞游出的组织块集中接种于4个培养皿中，第2天即可观察到有细胞从组织块游出，以后隔天换液，可观察到不断有细胞游出组织块，且纯度高状态好，待细胞达到一定密度后再次将细胞和组织块分别传代，共传代3次。细胞消化计数，在第1次传代后4个皿中的细胞总数5．8×

105个，第2次传代后5．5×10个，第3次传后3．5

×105个，合计14．8×10个。见表1。

细胞开始游出时间（d）

达到80%融合度时间（d）原代细胞纯度原代细胞状态原代细胞总数（×105个）－不好/不纯

++非常好/非常纯

在以上各种培养方法中，由于酶消化法所得到的传代后细胞较少，而传统组织块法所得到的原代所以选择改良的组织块培养法和改进的细胞较少，

传代培养法所培养的细胞做为以下实验所用细胞。2．2免疫表型鉴定

hUCMSCs高表达CD73、经流式细胞仪检测，

CD90、CD44、CD105，不表达造血系标志CD31、CD45、CD34。见图2。

图2人脐带间充质干细胞免疫表型流或细胞仪检测结果

2．3hUCMSCs向成骨细胞诱导分化

成骨诱导后细胞形态逐渐由长梭形变形成方形、三角性、鳞片形等。诱导3周后，茜素红染色可见细胞间红色矿化基质沉积，而未诱导细胞则无。b。说明hUCMSCs在体外特定环境下具有见图3a、

向成骨细胞分化的潜能。

2．4hUCMSCs向成脂细胞诱导分化

脂肪诱导分化2周，可见细胞质内脂滴形成并3周时用油红O染色，逐渐增多，脂滴被染成红色，d。说明hUCMSCs在而未诱导细胞则无。见图3c、

体外特定环境下具有向脂肪细胞分化的潜能

。

a人脐带间充质干细胞茜素红染色阳性，胞浆中有大量的钙盐沉积（×200）；c人脐带间充质干细胞油红O染色阳性，脂滴被染成红色（×800）；b，d未加诱导液的人脐带间充质干细胞分别经茜素红和油红O染色后的阴性对照（×200）

图3

人脐带间充质干细胞诱导分化鉴定结果

3讨论

华通胶是存在于羊膜上皮和脐血管之间的胚胎黏液结缔组织

［18］

在本实验中，细胞在体外培养3～4代后细胞形态均一，从形态上观察，细胞呈成纤维样生长，平行排列或漩涡状。流式细胞仪检测发现细胞高表达CD73、CD90、CD44、CD105，不表达造血系标志CD31、CD45、CD34。在常规诱导下，hUCMSCs能分化为脂肪和成骨细胞，也证实了其具有较强的可塑性和多向分化潜能。

由于华通胶来源的间充质干细胞来源于胎儿组同时具备了部分胚胎干细胞和成体干细胞的特织，

性，与成体干细胞相比更加原始，增殖能力更加强大。但就分化能力而言，在相同培养条件下，一定程度上取决于不同的干细胞所表达的基因的差异性

［10］

。脐带属于胎儿来源的组织，因此

华通胶来源的间充质干细胞承载了胎儿的一些特比如更强的增殖和分化能力，较低的免疫原性。性，

在胎盘屏障的保护下，在分离细胞的过程中，细胞不宜受到病毒或细菌的污染。由于这些突出的特性，hUCMSCs可以作为细胞替代治疗的理想的种子细胞

［6，8，19，20］

。

本实验采用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从足月胎儿脐带中成功分离、培养出间充质干细胞。在传代过程中，不仅将细胞传代，也将组织块传代，充分利用组织块获得更多的原代细胞。对比3种原代培养方法，酶消化法可在短时间内获得细胞，但混有较多的杂细胞，容易污染，经多次换液和传代才可得到纯化，而且酶的消化时间难以掌握。消化时间长可能损伤细胞，致使细胞不易贴壁，不易难以离心获得足够量传代；消化时间短液体较黏稠，

每次实验细胞。因此需要多次实验才能摸索出来，又会由于酶的效力的变化，同样的时间可能获得的细胞数量和质量都不稳定。传统的组织块法由于所加液体多，虽然可以很快地洗去瓶中所混有的血细胞等杂细胞，但液体的浮力使组织块漂起，使其丧失了长出细胞的能力，减少了细胞数量。改良组织块法每次加液量较少，但经多次换液后，也可达到和传统方法同样的纯化效果，待细胞长出时，瓶中几乎没有杂细胞，同时保证了组织块不漂起，细胞数量也得到了保证。改良的传代法，不仅将细胞传代，也将有生长细胞能力的组织块一同传代，这些组织块在新的培养瓶中可较快地长出细胞，纯度更高，状态更好，可能是由于解除了细胞间的接触抑制，也可能与更新了的培养环境有关。将改良的组织块法和改良的传代培养法相结合，细胞的数量有了显著的增加，在相同的培养时间内，原代培养所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍，是传统组织块法的20～30倍。传代后，酶消化法所培养的细胞在形态和贴壁能力上不够稳定，略差于其它两种方法。由此可以得出结论，改良的组织块法适用于细胞纯度和细胞数量要求较高的实验，而酶消化法适用于短时间内获得大量细胞的实验，但酶的种类和消化时间还需进一步摸索，以保证获得高质量的细胞。

，比如有文献给出了华通胶来源的间充质干

细胞和骨髓来源的间充质干细胞在基因表达上的差前者表达大部分的胚胎干细胞的表面标志基因，异，

ABCG2，BRIX，如NANOG，DNMTB3，GABRB3，

CD9，GAL，GRB7，KIT，LIN28，NR5A2，NR6A1，REX1，其表达水平虽然很低，但远高于后者的表达水平，说明前者的增殖能力强于后者，更强的表达内胚层和神经系的标志基因，如FLT1，GATA4，GA-TA6，ISL1，LAMA1，SOX17，SERPINA1，NESTIN，GFAP，SEMA3A，说明前者较后者更倾向于向内胚层系和神经系方向分化

［12］

。这些差异性为临床选

择不同来源的干细胞治疗疾病提供了依据。骨髓来源的间充质干细胞，随着年龄的老化，干细胞数目有所下降，取材有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集自体骨髓，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。而脐带来源的间充质干细胞恰好弥补了这些不足。

间充质干细胞能向多系分化，诱导外周免疫耐受，并且可以向损伤组织迁移，抑制受损组织释放免疫因子，促进细胞的再生。尽管间充质干细胞来源于许多成体组织，但在体内的增殖频率很低，体外扩增是能够达到临床治疗剂量的必须途径

［10］

。本实

验建立了一套体外稳定培养扩增hUCMSCs的方法，所培养的细胞成分单一、数量较多、生物学性状稳定，并能使其在体外诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化，为其进一步应用于组织工程和细胞治疗提供了实验依据

［12］

。

参考文献

SunQuanhong，ZhangLiang，ZhangHongtian，etal．CograftedWh-arton＇sjellycells－derivedneurospheresandBDNFpromotefunctional

recoveryafterratspinalcordtransection［J］．NeurochemRes，2009，34：2030－2090．2

PetasA，GarganiS，FelesakisA，etal．EffectivenessofprotocolfortheisolationofWharton＇sJellystemcellsinlarge－scaleapplications［J］．InVitroCell．Dev．Biol．－Animal，2009，45：573－576．3

ShyuWC，LiHung，etal．EnhancementofneuroplasticityDingDC，

throughupregulationofβ1－integrininhumanumbilicalcord－de-rivedstromalcellimplantedstrokemodel［J］．NeurobiologyofDis-2007，339－353．ease，4

TomarG，SrivastavaR，GupatN，etal．Humangingiva－derivedmesenchymalstemcellsaresuperiortobonemarrow－derivedmesen-chymalstemcellsforcelltherapyinregenerativemedicine［J］．Bio-chemicalandBiophysicalResearchCommunications，2010，393：377－383．5

WuGuoyan，QuanKeyi，LiMing，etal．Humanumbilicalcord－de-rivedschwann－likecelltransplantationcombinedwithneurotrophin－3administrationindyskinesiaofratswithspinalcordinjury［J］．2011，36：783－792．NeurochemRes，6

VijaL，VerrecchiaF，LargheroJ，etal．Mesenchymalstemcells：Stemcelltherapyperspectivesfortype1diabetes［J］．DiabetesandMetabolism，2009，35：85－93．7

HerichandanA，BuhringH．ProspectiveisolationofhumanMSC［J］．BestPractice＆ResearchClinicalHaematology，2011，24：25－36．8

BabamiE，Berrih－AkninS，MillerA，etal．Mesenchymalstemcellsasanimmunomodulatorytherapeuticstrategyforautoimmunediseases［J］．AutoimmunityReviews，2011，10：410－415．9

KadamS，TiwariS，BhondeT，etal．Simultaneousisolationofvas-cularendothelialcellsandmesenchymalstemcellsfromthehumanJ］．InVitroCellDevBiol－Animal，2009，45：23－umbilicalcord［27．10

ApelA，GrothaA，SchlesingerS，etal．Suitabilityofhumanmes-enchymalstemcellsforgenetherapydependsontheexpansionme-J］．ExperimentalCellResearch，2009，315：498－507．dium［

HoogduignM，BaanC．Theimmunomodulatorypropertiesofmesen-．Internationalchymalstemcellsandtheiruseforimmunotherapy［J］2010，10：1496－1500．Immunopharmacology，

12GaoPeng，DingQiang，WuZhong，etal．TherapeuticpotentialofhumanmesenchymalstemcellsproducingIL－12inamousexeno-2010，290：graftmodelofrenalcellcarcinoma［J］．CancerLetters，157－166．

13IsabeL，HartmannTH．Umbilicalcordtissue－derivedmesenchy-malstemcellsgrowbestunderGMP－compliantcultureconditionsandmaintaintheirphenotypicandfunctionalproperties［J］．JournalofImmunologicalMethods，2010，363：80－89．

14MscA，PhdA，MscP，etal．Useofadiposetissue－derivedmes-enchymalstemcellsforexperimentaltendinitistherapyinequines［J］．JournalofEquineVeterinaryScience，2011，31：26－34．

15TroyerD，WeissM．Wharton＇sjelly－derivedcellsareaprimitivestromalcellpopulation［J］．StemCells，2008，26：591－599．

16王跃春，李业霞，段阿林，等．人脐带间充质干细胞的快速分离、纯化及冻存［J］．中国病理生理杂志，2010，26（8）：1658－1661．

17郑志娟，庄文欣，付文玉，等．人脐带间充质干细胞的研究进J］．解剖科学进展，2008，（1）：100－104．展［

18DonSG．Isolation，cultureandosteogenicdifferentiationofmesen-chymalstemcellsfromhumanumbilicalcord：Ultrastructureofcellmembraneobservedusingatomicforcemicroscope［J］．Journalof2010，14（1）：ClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearch，290－295．

19BahirvaniA，etal．Long－termexpansionandNekantiU，RaoV，

pluripotentmarkerarrayanalysisofWharton＇sjelly－derivedmesen-chymalstemcells［J］．StemCellsDev，2010，19：117－130．

20XuQiang，XuBainan，etal．NT－3－secretinghumanShangAijia，

umbilicalcordmesenchymalstromalcelltransplantationforthetreat-mentofacutespinalcordinjuryinrats［J］．BrainResearch，2011，1391：123－133．

［责任编辑：张

璐］

《中国计划生育学杂志》2012年度全国优秀通联站、优秀发行通联站

一、优秀通联站贵州省河北省天津市

北京市云南省海南省

甘肃省浙江省

广东省河南省

湖北省

江苏省

山西省福建省

黑龙江省

深圳市

大连市

宁波市

广西壮族自治区

上海市

辽宁省

新疆维吾尔自治区内蒙古自治区

二、优秀发行通联站

宁夏回族自治区

吉林省