目录
1 2
基因沉默的概述 RNA干扰
3
4
基因沉默的应用实例
RNAi的生物学意义
1.基因沉默
• 定义：基因沉默（gene silencing）是指 生物体中特定基因由于种种原因不表达或 者是表达减少的现象。
基因沉默现象首先在转基因植物中发现，接着 在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆 续发现。
基因沉默发生的水平
由于DNA 甲基化、 异染色质化以及位 置效应等引起的
转录水平上的 基因沉默
即在基因转录后的水平上 通过对靶标RNA进行特异 性降解而使基因失活
转录后基因沉默
基因沉默的方法
（一）转录水平基因沉默：
• 1.基因及其启动子甲基化 • 2.同源基因间的反式失活 • 3.后成修饰作用导致的基因沉默 • 4.重复序列 • 5.位置效应
（二）转录后水平基因沉默
共 抑 制
基因 压制
RNA干 扰
2.RNA干扰
• RNA干扰（RNAi）：是指在进化过程中高度保
守的、由双链RNA（dsRNA）诱发的、同源mRNA高 效特异性降解的现象。
RNAi的特征
（1）RNAi是转录后水平的基因沉默机制； （2）RNAi具有很高的特异性； （3）RNAi是以催化放大的方式进行的，因而 RNAi抑制基因表达具有高效性； （4）RNAi可以穿过细胞界限抑制基因表达而 且可以遗传； （5）dsRNA需要大于等于21个碱基 （6）ATP依赖性
RNAi的分子机制
• 相关酶及复合体----• Dicer：RNase III 特异核酸酶
• 一种与RNAi有关的RNaseIII家族的酶，是生物进化中非常 保守的序列，可以将dsRNA切割形成21-23nt的siRNA。
• RdRP：(RNA-dependent RNA polymerase)
• 以单链RNA为模板，按碱基配对原则合成其互补链，形成 双链RNA。
RNAi 的 原 理
RNAi的基本过程
siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA， 消耗能量； RISC（RNA-induced silencing complex）形 成：与RNAi辅助蛋白——argonaute家族分子、 RNA依赖性聚合酶结合形成RISC，消耗ATP能 量； RISC 活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的 复合体转变成活性形式； 阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下， RISC识别并切割互补的靶RNA。
RNAi研究的一般技术路线
siRNA 的设计
• siRNA（small interfering RNAs，siRNAs） 即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并 将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链 RNA分子。
一般设计原则：
（1）从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并 记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。 GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更 为有效。 （ 2 ）将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除 那些和其他编码序列同源的序列。 （ 3 ）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设 计4-5个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序
列。
负对照
（1）一个完整的siRNA实验应该有负对照。 （2）作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有 相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。 （ 3 ）通常的做法是将选中的 siRNA 序列打乱，同样 要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。
制备siRNAs的方法
化学 合成 体外 转录
用 RNaseIII 消化长片断 siRNA表 双链RNA制 siRNA表 达载体 备siRNA 达框架
体外转录
• 以DNA Oligo为模板，通过体外转录合成siRNAs， 成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化 学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的 规模受到限制。 • 值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳 定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的 1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果， 从而使转染效率更高。 • 最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种 siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 • 不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。 长期研究
转染细胞
• 将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达 框架转导至真核细胞中的方法主要有以下 几种： • 1.磷酸钙共沉淀 • 2.电穿孔法 • 3. DEAE-葡聚糖和polybrene • 4.机械法 • 5.阳离子脂质体试剂
为了达到高的转染效率，在转染实验过程 中，需要注意以下几点：
• 1.纯化siRNA • 2.避免RNA酶污染 • 3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转 染的重复性 • 4.避免使用抗生素
3.基因沉默的应用实例
抗肿瘤策略
抗病毒 RNAi技术在功能基因 组中的应用 RNAi 技术在法医学中 的应用
抗肿瘤策略
RNA干扰CYP17基因抑制 前列腺癌细胞生长
CYP17基因
• CYP17基因位于染色体10q24.编码细胞色素P450cl7 a酶,后者介导着17、20裂解酶和17a羟化 酶的活性,他们是由胆固醇合成睾酮过程中的两个 关键酶,在人体性激素的合成中起非常重要的作用, 在前列腺肿瘤的发生、发展及转移中起重要作用。
策略
• 利用RNAi降解CYP17mRNA,使CYP17基因所编码蛋白 的合成明显降低,降低CYP17基因蛋白对其下游基 因的调控,在很大程度上阻断了肿瘤细胞的应答, 建立一种基因修饰前列腺癌治疗策略,提高前列腺 癌的治疗效果。
新鲜前列 腺癌标本
组织中总 RNA的提取
反转录
siRNA的 制备
siRNA
合成cDNA 第一条链 PCR
模板DNA 体外转录
慢性病毒载体法
• 慢病毒(lentivius)属于逆转录病毒，具有 以下的优点：
①可以感染非分裂期细胞。 ②容纳外源性基因片段大。 ③可以长期表达。 ④不产生任何有效的细胞免疫应答,可作为一种体外 基因运输的工具。 ⑤慢病毒载体介导的转基因表达能持续时间长。
• 慢病毒载体(LV)介导的RNAi可使siRNA转录 结构完整地整合到肿瘤细胞的DNA
链上,稳 定而持久地产生siRNA,从而发挥RNAi作用, 下调目标基因的表达,是建立CYP17RNAi前 列腺癌细胞模型的理想工具。
研究结果
• 干扰组的细胞生长曲线较对照组细胞出现 明显的压低,同时细胞活力明显降低,这一 结果提示在CYP17基因被干扰后,前列腺癌 细胞的增殖能力明显减弱,肿瘤细胞的生长 能力被抑制。
对照组
实验组
研究结论
• 建立裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射CYP17 重组慢病毒载体组的生长速度较对照组明 显减慢。CYP17重组慢病毒载体组可抑制已 形成的裸鼠前列腺癌移植瘤在裸鼠体内的 生长和CYP17高表达。
4.RNAi的生物学意义
• 随着后基因组学时代的到来，RNAi作为一 种有效、经济的分析基因功能的技术，不 仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学) 的发展,还有可能设计出RNAi 芯片,高通量 地筛选药物靶基因,逐条检测人类基因组的 表达抑制情况来明确基因的功能,并且它还 将应用于基因治疗、新药开发、生物医学 研究等领域。
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基因沉默的概述 RNA干扰
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基因沉默的应用实例
RNAi的生物学意义
1.基因沉默
• 定义：基因沉默（gene silencing）是指 生物体中特定基因由于种种原因不表达或 者是表达减少的现象。
基因沉默现象首先在转基因植物中发现，接着 在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆 续发现。
基因沉默发生的水平
由于DNA 甲基化、 异染色质化以及位 置效应等引起的
转录水平上的 基因沉默
即在基因转录后的水平上 通过对靶标RNA进行特异 性降解而使基因失活
转录后基因沉默
基因沉默的方法
（一）转录水平基因沉默：
• 1.基因及其启动子甲基化 • 2.同源基因间的反式失活 • 3.后成修饰作用导致的基因沉默 • 4.重复序列 • 5.位置效应
（二）转录后水平基因沉默
共 抑 制
基因 压制
RNA干 扰
2.RNA干扰
• RNA干扰（RNAi）：是指在进化过程中高度保
守的、由双链RNA（dsRNA）诱发的、同源mRNA高 效特异性降解的现象。
RNAi的特征
（1）RNAi是转录后水平的基因沉默机制； （2）RNAi具有很高的特异性； （3）RNAi是以催化放大的方式进行的，因而 RNAi抑制基因表达具有高效性； （4）RNAi可以穿过细胞界限抑制基因表达而 且可以遗传； （5）dsRNA需要大于等于21个碱基 （6）ATP依赖性
RNAi的分子机制
• 相关酶及复合体----• Dicer：RNase III 特异核酸酶
• 一种与RNAi有关的RNaseIII家族的酶，是生物进化中非常 保守的序列，可以将dsRNA切割形成21-23nt的siRNA。
• RdRP：(RNA-dependent RNA polymerase)
• 以单链RNA为模板，按碱基配对原则合成其互补链，形成 双链RNA。
RNAi 的 原 理
RNAi的基本过程
siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA， 消耗能量； RISC（RNA-induced silencing complex）形 成：与RNAi辅助蛋白——argonaute家族分子、 RNA依赖性聚合酶结合形成RISC，消耗ATP能 量； RISC 活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的 复合体转变成活性形式； 阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下， RISC识别并切割互补的靶RNA。
RNAi研究的一般技术路线
siRNA 的设计
• siRNA（small interfering RNAs，siRNAs） 即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并 将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链 RNA分子。
一般设计原则：
（1）从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并 记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。 GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更 为有效。 （ 2 ）将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除 那些和其他编码序列同源的序列。 （ 3 ）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设 计4-5个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序
列。
负对照
（1）一个完整的siRNA实验应该有负对照。 （2）作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有 相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。 （ 3 ）通常的做法是将选中的 siRNA 序列打乱，同样 要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。
制备siRNAs的方法
化学 合成 体外 转录
用 RNaseIII 消化长片断 siRNA表 双链RNA制 siRNA表 达载体 备siRNA 达框架
体外转录
• 以DNA Oligo为模板，通过体外转录合成siRNAs， 成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化 学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的 规模受到限制。 • 值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳 定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的 1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果， 从而使转染效率更高。 • 最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种 siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 • 不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。 长期研究
转染细胞
• 将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达 框架转导至真核细胞中的方法主要有以下 几种： • 1.磷酸钙共沉淀 • 2.电穿孔法 • 3. DEAE-葡聚糖和polybrene • 4.机械法 • 5.阳离子脂质体试剂
为了达到高的转染效率，在转染实验过程 中，需要注意以下几点：
• 1.纯化siRNA • 2.避免RNA酶污染 • 3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转 染的重复性 • 4.避免使用抗生素
3.基因沉默的应用实例
抗肿瘤策略
抗病毒 RNAi技术在功能基因 组中的应用 RNAi 技术在法医学中 的应用
抗肿瘤策略
RNA干扰CYP17基因抑制 前列腺癌细胞生长
CYP17基因
• CYP17基因位于染色体10q24.编码细胞色素P450cl7 a酶,后者介导着17、20裂解酶和17a羟化 酶的活性,他们是由胆固醇合成睾酮过程中的两个 关键酶,在人体性激素的合成中起非常重要的作用, 在前列腺肿瘤的发生、发展及转移中起重要作用。
策略
• 利用RNAi降解CYP17mRNA,使CYP17基因所编码蛋白 的合成明显降低,降低CYP17基因蛋白对其下游基 因的调控,在很大程度上阻断了肿瘤细胞的应答, 建立一种基因修饰前列腺癌治疗策略,提高前列腺 癌的治疗效果。
新鲜前列 腺癌标本
组织中总 RNA的提取
反转录
siRNA的 制备
siRNA
合成cDNA 第一条链 PCR
模板DNA 体外转录
慢性病毒载体法
• 慢病毒(lentivius)属于逆转录病毒，具有 以下的优点：
①可以感染非分裂期细胞。 ②容纳外源性基因片段大。 ③可以长期表达。 ④不产生任何有效的细胞免疫应答,可作为一种体外 基因运输的工具。 ⑤慢病毒载体介导的转基因表达能持续时间长。
• 慢病毒载体(LV)介导的RNAi可使siRNA转录 结构完整地整合到肿瘤细胞的DNA
链上,稳 定而持久地产生siRNA,从而发挥RNAi作用, 下调目标基因的表达,是建立CYP17RNAi前 列腺癌细胞模型的理想工具。
研究结果
• 干扰组的细胞生长曲线较对照组细胞出现 明显的压低,同时细胞活力明显降低,这一 结果提示在CYP17基因被干扰后,前列腺癌 细胞的增殖能力明显减弱,肿瘤细胞的生长 能力被抑制。
对照组
实验组
研究结论
• 建立裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射CYP17 重组慢病毒载体组的生长速度较对照组明 显减慢。CYP17重组慢病毒载体组可抑制已 形成的裸鼠前列腺癌移植瘤在裸鼠体内的 生长和CYP17高表达。
4.RNAi的生物学意义
• 随着后基因组学时代的到来，RNAi作为一 种有效、经济的分析基因功能的技术，不 仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学) 的发展,还有可能设计出RNAi 芯片,高通量 地筛选药物靶基因,逐条检测人类基因组的 表达抑制情况来明确基因的功能,并且它还 将应用于基因治疗、新药开发、生物医学 研究等领域。