使用Lumio技术快速检测体外表达的蛋白质
简介
众所周知，蛋白质体外合成系统是一种快速、有效地表达蛋白质的方式。然而，通常体外基因的表达会产生一些阻遏问题。相比之下，Invitrogen的ExpresswayPlus表达系统提供了一种直接、简便的方法用于获得高产量的功能性活性蛋白质。现在，我们推出一种改进的Expressway Plus系统，即使用Lumio技术来快速检测蛋白质产物。Lumio技术是基于FLAsH( Fluorescein Arsenical Hairpin)技术，是一种联胂的荧光素衍生物和四半胱氨酸序列的耦合物（图1）。该四半胱氨酸序列由“Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys””组成，其中的Xaa指非半胱氨酸的氨基酸。我们通常选择的Xaa-Xaa是Pro-Gly，因为有报道指出pico-molar的离解常数与FLAsH一致。
配合使用改进的Expressway Plus系统，Lumio技术可用于快速、简便的检测体外表达的蛋白质产物。该试剂盒的关键组成部分是pEXP3-DEST载体、Lumio绿色检测试剂和一种改进的无细胞的提取物（来源于一种大肠杆菌slyD突变株）。这种多用途的Lumio技术可以监测Expressway Plus体外合成反应中生成蛋白质的协同翻译过程。Lumio试剂的独特性就在于其能够进行显著的转换，即通过与四半胱氨酸序列结合，完全没有荧光的状态转变成一种具有高度荧光的状态。您可以利用这种新的特性，对不断生成的蛋白质进行实时快速的地观察、分析。若采用一个标准的荧光板reader，监测体外反应的混合物中Lumio序列实时快速地整合到新合成的蛋白质中。由于Lumio的绿色检测试剂具有结合位点专一性的特点，所以能够对蛋白质表达水平定量分析。
此外，Lumio绿色检测试剂可以在电泳以前直接添加到蛋白质样品中。电泳以后，利用标准的紫外检测仪或激光凝胶扫描仪，就可以立即显示出蛋白质产物，而无须使用放射性物质。Lumio试剂非常牢固地共价结合到四半胱氨酸序列上，这就减少了许多处理蛋白质凝胶的步骤，诸如固定、染色、脱色、干燥等操作。另外，与使用放射标记氨基酸相比，所有安全性、处理一次性废品等常规项目都可以省去。Lumio技术在检测和分析蛋白质体外合成产物方面具有极大的优势，并且彻底变革了评价无细胞系统中蛋白质表达的方法。
材料和方法
pEXP3-DEST表达载体的构建
我们使用pEXP1质粒构建了具有N-末端及TEV蛋白酶剪切位点的pEXP3-DEST载体。通过将入门载体、目标载体和LR ClonaseTM酶混合，UltimateTM人ORF激酶入门载体，CAT、GFP和GUS与pEXP3-DEST载体进行重组。孵育一小时后，该混合物转化到常TOP10 E.coli化学感受态细胞中，然后涂板、挑取克隆，用于载体扩增和分离DNA。
蛋白质合成
标准的Expressway附加蛋白质合成反应的方法：将4μl无DNA酶/无RNA酶的水，20μl 2.5X的IVPS Plus大肠杆菌反应缓冲液，1μl T7 RNA聚合酶，以及20μl IVPS Plus大肠杆菌提取物置于2ml试管中预先混合，冰浴；添加1mg DNA模板，用水定容至反应的终体积50μl，然后充分混合。在37℃温育两小时进行反应或在96孔板上并置于荧光仪中。在体内产生腺苷酸激酶1。
在凝胶中检测
凝胶样品的制备方法：将50μl反应物中的5μl样品在20μl 100%的丙酮中4℃孵育超过20分钟，析出沉淀。然后将反应物置于微型离心机内以最大速度离心5分钟。将丙酮吸出，然后将沉淀颗粒重新悬于50μl 一倍的Lumio绿色检测试剂中。将1ul该物进样到4-12% NuPAGE?梯度凝胶中。使用紫外检测仪或Typhoon 8600可调式成像仪对凝胶进行检测。为得到所有蛋白质的条带，可先将凝胶用考马斯亮蓝染色。
实时监测蛋白质表达
将50μl体外蛋白质合成的反应物与20μM Lumio绿色检测试剂在96孔板中37℃孵育，直接通过分子光谱仪Max GeminiXS 读板仪实时检测Lumio序列的整合。将激发光波长设定在500nm，同时发射光设定在535nm。在两小时的孵育时间内，每十分钟收集一次读数。对GFP产物的实时监测可以通过类似的方式进行，只不过不需要添加Lumio绿色荧光检测试剂。
结果与讨论
Expressway Plus表达系统与Lumio技术
为最大程度发挥Lumio标记技术，我们构建了一个大肠杆菌slyD突变株，对Expressway Plus系统进行了重新设计。该突变株的构建减少了Lumio检测试剂与内源性slyD蛋白的非特异性结合，为检测四半胱氨酸标记的蛋白质提供了一个最优的背景。此外，有报道指出在组氨酸标记的蛋白质纯化过程中slyD是主要的污染。因此，这就使得Expressway Plus Lumio无细胞提取物成为下游纯化组氨酸标记的蛋白质最理想的首选。
对来源于大肠杆菌SlyD突变株的S30提取物的功能性评价
可将Expressway Plus S30提取物作为对照，对来源于大肠杆菌slyD突变株的提取物翻译的性能进行评估。将现有的大肠杆菌S30提取物作为对照，测量来源于大肠杆菌slyD突变株的S30中的翻译、折叠、绿色荧光蛋白（GFP）发色团的生成率。从图2中可以看出大肠杆菌slyD突变株表达出比通用的S30提取物产生大约两倍的功能性GFP。同时，我们对于大肠杆菌slyD突变株的S30和正常S30提取物中的GFP蛋白和β-葡萄糖醛酸糖苷酶的生成量进行了检测，发现从大肠杆菌slyD突变株的S30提取物中上述两种蛋白质的表达水平较高。（图2B）图2 比较来源于大肠杆菌的Expressway Plus S30的提取物和ExpresswayPlus Lumio技术S30的提取
凝胶内检测
我们通过在体外表达四半胱氨酸标记的氯霉素乙酰转移酶（CAT）、绿色荧光蛋白（GFP）及葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS），来检测使用Expressway Plus系统后，Lumio试剂生成强荧光性蛋白质的能力。然后，将表达的蛋白质用Lumio绿色检测试剂进行标记，进行电泳分离，使用Typhoon激光凝胶扫描仪或紫外标准检测仪对凝胶进行检测（图3A和3B）。在两个图中，四半胱氨酸标记的蛋白质以非常惊人地醒目地显现于低背景之上。将荧光物的显影图的结果与所有蛋白质的电泳条带进行比对（图3C），表明由于采用Lumio试剂的Lumio序列后的检测敏感度以及简便性提高。图3D证明了通过使用Lumio检测试剂进行凝胶内检测，可以很轻松地检测到小至仅5ng纯化的腺苷酸激酶1。与改进的氨基酸分析方法相比，将统一化学剂量为1：1的Lumio试剂与四半胱氨酸序列结合，产生了一致的蛋白质标记物，并且也许能对蛋白质表达水平进行定量估计而无须利用放射性标记。
图3 运用Lumio技术和Lumio绿色检测试剂采用ExpresswayPlus表达系统对合成的蛋白质进行凝胶内检测
A.typhoon激光扫描仪 B.紫外检测仪
Lumio试剂的实时整合
可采用Lumio技术，直接对于无细胞提取物的反应进行实时监测来观察蛋白质生成。按常规方法建立体外转录/翻译反应体系（参照材料与方法），然后将Lumio绿色检测试剂添加到反应物当中，37℃孵育。在反应进行过程中，可以通过一个标准荧光仪检测到荧光的增强（图4A）。与载体DNA对照组进行比较，可以看到Lumio序列荧光大约增加了2-3倍。图4B的显示协同翻译的被测蛋白运用胶内检测来作比较。
UltimateTM人ORF克隆的筛选
采用GatewayTM技术和收集UltimateTM人ORF克隆可以证明在使用Lumio技术的情况下，通过Expressway附加系统可以简便地检测表达的蛋白质。运用GatewayTM技术，可以将人ORF克隆重组到pEXP3-DEST载体中，在Expressway附加Lumio系统中表达，采用胶内检测以及Lumio检测试剂实时监测（图5）。这一结果说明使用Lumio检测试剂是一种快速、有效的检测基因表达的方法，并且，不必要制备抗体和采用放射性标记。 图5 通过采用pEXP3-DEST载体，人ORFs在 A. 凝胶内检测
结论
我们新设计的Expressway Plus表达系统与Lumio技术在检测和分析体外表达蛋白质方面有着非常大的优势。通过与四半胱氨酸结合样品立即发生显著的转变，成为具有高度荧光的物种；再同少量的内源性蛋白标记的背景物混合，使ExpresswayPlus表达系统和Lumio技术在检测蛋白质的体外表达并保证蛋白质活性方面成为非常有效的方法。尽管ExpresswayPlus表达系统和Lumio技术是唯一与Lumio绿色检测试剂非常匹配的方案，最初的ExpresswayPlus表达系统同样与Lumio技术兼容。我们已经向您展示ExpresswayPlus表达系统和Lumio技术在凝胶中检测蛋白质以及通过掌握Lumio的荧光实时检测蛋白质方面是可以调整的。最后要说明的是，单一的Lumio试剂分子与一个四半胱氨酸序列的独特位点特异性结合,使我们能进行蛋白质表达水平的定量分析,而无须使用放射性标记。
使用Lumio技术快速检测体外表达的蛋白质
简介
众所周知，蛋白质体外合成系统是一种快速、有效地表达蛋白质的方式。然而，通常体外基因的表达会产生一些阻遏问题。相比之下，Invitrogen的ExpresswayPlus表达系统提供了一种直接、简便的方法用于获得高产量的功能性活性蛋白质。现在，我们推出一种改进的Expressway Plus系统，即使用Lumio技术来快速检测蛋白质产物。Lumio技术是基于FLAsH( Fluorescein Arsenical Hairpin)技术，是一种联胂的荧光素衍生物和四半胱氨酸序列的耦合物（图1）。该四半胱氨酸序列由“Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys””组成，其中的Xaa指非半胱氨酸的氨基酸。我们通常选择的Xaa-Xaa是Pro-Gly，因为有报道指出pico-molar的离解常数与FLAsH一致。
配合使用改进的Expressway Plus系统，Lumio技术可用于快速、简便的检测体外表达的蛋白质产物。该试剂盒的关键组成部分是pEXP3-DEST载体、Lumio绿色检测试剂和一种改进的无细胞的提取物（来源于一种大肠杆菌slyD突变株）。这种多用途的Lumio技术可以监测Expressway Plus体外合成反应中生成蛋白质的协同翻译过程。Lumio试剂的独特性就在于其能够进行显著的转换，即通过与四半胱氨酸序列结合，完全没有荧光的状态转变成一种具有高度荧光的状态。您可以利用这种新的特性，对不断生成的蛋白质进行实时快速的地观察、分析。若采用一个标准的荧光板reader，监测体外反应的混合物中Lumio序列实时快速地整合到新合成的蛋白质中。由于Lumio的绿色检测试剂具有结合位点专一性的特点，所以能够对蛋白质表达水平定量分析。
此外，Lumio绿色检测试剂可以在电泳以前直接添加到蛋白质样品中。电泳以后，利用标准的紫外检测仪或激光凝胶扫描仪，就可以立即显示出蛋白质产物，而无须使用放射性物质。Lumio试剂非常牢固地共价结合到四半胱氨酸序列上，这就减少了许多处理蛋白质凝胶的步骤，诸如固定、染色、脱色、干燥等操作。另外，与使用放射标记氨基酸相比，所有安全性、处理一次性废品等常规项目都可以省去。Lumio技术在检测和分析蛋白质体外合成产物方面具有极大的优势，并且彻底变革了评价无细胞系统中蛋白质表达的方法。
材料和方法
pEXP3-DEST表达载体的构建
我们使用pEXP1质粒构建了具有N-末端及TEV蛋白酶剪切位点的pEXP3-DEST载体。通过将入门载体、目标载体和LR ClonaseTM酶混合，UltimateTM人ORF激酶入门载体，CAT、GFP和GUS与pEXP3-DEST载体进行重组。孵育一小时后，该混合物转化到常TOP10 E.coli化学感受态细胞中，然后涂板、挑取克隆，用于载体扩增和分离DNA。
蛋白质合成
标准的Expressway附加蛋白质合成反应的方法：将4μl无DNA酶/无RNA酶的水，20μl 2.5X的IVPS Plus大肠杆菌反应缓冲液，1μl T7 RNA聚合酶，以及20μl IVPS Plus大肠杆菌提取物置于2ml试管中预先混合，冰浴；添加1mg DNA模板，用水定容至反应的终体积50μl，然后充分混合。在37℃温育两小时进行反应或在96孔板上并置于荧光仪中。在体内产生腺苷酸激酶1。
在凝胶中检测
凝胶样品的制备方法：将50μl反应物中的5μl样品在20μl 100%的丙酮中4℃孵育超过20分钟，析出沉淀。然后将反应物置于微型离心机内以最大速度离心5分钟。将丙酮吸出，然后将沉淀颗粒重新悬于50μl 一倍的Lumio绿色检测试剂中。将1ul该物进样到4-12% NuPAGE?梯度凝胶中。使用紫外检测仪或Typhoon 8600可调式成像仪对凝胶进行检测。为得到所有蛋白质的条带，可先将凝胶用考马斯亮蓝染色。
实时监测蛋白质表达
将50μl体外蛋白质合成的反应物与20μM Lumio绿色检测试剂在96孔板中37℃孵育，直接通过分子光谱仪Max GeminiXS 读板仪实时检测Lumio序列的整合。将激发光波长设定在500nm，同时发射光设定在535nm。在两小时的孵育时间内，每十分钟收集一次读数。对GFP产物的实时监测可以通过类似的方式进行，只不过不需要添加Lumio绿色荧光检测试剂。
结果与讨论
Expressway Plus表达系统与Lumio技术
为最大程度发挥Lumio标记技术，我们构建了一个大肠杆菌slyD突变株，对Expressway Plus系统进行了重新设计。该突变株的构建减少了Lumio检测试剂与内源性slyD蛋白的非特异性结合，为检测四半胱氨酸标记的蛋白质提供了一个最优的背景。此外，有报道指出在组氨酸标记的蛋白质纯化过程中slyD是主要的污染。因此，这就使得Expressway Plus Lumio无细胞提取物成为下游纯化组氨酸标记的蛋白质最理想的首选。
对来源于大肠杆菌SlyD突变株的S30提取物的功能性评价
可将Expressway Plus S30提取物作为对照，对来源于大肠杆菌slyD突变株的提取物翻译的性能进行评估。将现有的大肠杆菌S30提取物作为对照，测量来源于大肠杆菌slyD突变株的S30中的翻译、折叠、绿色荧光蛋白（GFP）发色团的生成率。从图2中可以看出大肠杆菌slyD突变株表达出比通用的S30提取物产生大约两倍的功能性GFP。同时，我们对于大肠杆菌slyD突变株的S30和正常S30提取物中的GFP蛋白和β-葡萄糖醛酸糖苷酶的生成量进行了检测，发现从大肠杆菌slyD突变株的S30提取物中上述两种蛋白质的表达水平较高。（图2B）图2 比较来源于大肠杆菌的Expressway Plus S30的提取物和ExpresswayPlus Lumio技术S30的提取
凝胶内检测
我们通过在体外表达四半胱氨酸标记的氯霉素乙酰转移酶（CAT）、绿色荧光蛋白（GFP）及葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS），来检测使用Expressway Plus系统后，Lumio试剂生成强荧光性蛋白质的能力。然后，将表达的蛋白质用Lumio绿色检测试剂进行标记，进行电泳分离，使用Typhoon激光凝胶扫描仪或紫外标准检测仪对凝胶进行检测（图3A和3B）。在两个图中，四半胱氨酸标记的蛋白质以非常惊人地醒目地显现于低背景之上。将荧光物的显影图的结果与所有蛋白质的电泳条带进行比对（图3C），表明由于采用Lumio试剂的Lumio序列后的检测敏感度以及简便性提高。图3D证明了通过使用Lumio检测试剂进行凝胶内检测，可以很轻松地检测到小至仅5ng纯化的腺苷酸激酶1。与改进的氨基酸分析方法相比，将统一化学剂量为1：1的Lumio试剂与四半胱氨酸序列结合，产生了一致的蛋白质标记物，并且也许能对蛋白质表达水平进行定量估计而无须利用放射性标记。
图3 运用Lumio技术和Lumio绿色检测试剂采用ExpresswayPlus表达系统对合成的蛋白质进行凝胶内检测
A.typhoon激光扫描仪 B.紫外检测仪
Lumio试剂的实时整合
可采用Lumio技术，直接对于无细胞提取物的反应进行实时监测来观察蛋白质生成。按常规方法建立体外转录/翻译反应体系（参照材料与方法），然后将Lumio绿色检测试剂添加到反应物当中，37℃孵育。在反应进行过程中，可以通过一个标准荧光仪检测到荧光的增强（图4A）。与载体DNA对照组进行比较，可以看到Lumio序列荧光大约增加了2-3倍。图4B的显示协同翻译的被测蛋白运用胶内检测来作比较。
UltimateTM人ORF克隆的筛选
采用GatewayTM技术和收集UltimateTM人ORF克隆可以证明在使用Lumio技术的情况下，通过Expressway附加系统可以简便地检测表达的蛋白质。运用GatewayTM技术，可以将人ORF克隆重组到pEXP3-DEST载体中，在Expressway附加Lumio系统中表达，采用胶内检测以及Lumio检测试剂实时监测（图5）。这一结果说明使用Lumio检测试剂是一种快速、有效的检测基因表达的方法，并且，不必要制备抗体和采用放射性标记。 图5 通过采用pEXP3-DEST载体，人ORFs在 A. 凝胶内检测
结论
我们新设计的Expressway Plus表达系统与Lumio技术在检测和分析体外表达蛋白质方面有着非常大的优势。通过与四半胱氨酸结合样品立即发生显著的转变，成为具有高度荧光的物种；再同少量的内源性蛋白标记的背景物混合，使ExpresswayPlus表达系统和Lumio技术在检测蛋白质的体外表达并保证蛋白质活性方面成为非常有效的方法。尽管ExpresswayPlus表达系统和Lumio技术是唯一与Lumio绿色检测试剂非常匹配的方案，最初的ExpresswayPlus表达系统同样与Lumio技术兼容。我们已经向您展示ExpresswayPlus表达系统和Lumio技术在凝胶中检测蛋白质以及通过掌握Lumio的荧光实时检测蛋白质方面是可以调整的。最后要说明的是，单一的Lumio试剂分子与一个四半胱氨酸序列的独特位点特异性结合,使我们能进行蛋白质表达水平的定量分析,而无须使用放射性标记。