#综 述#
蛋白酶抑制剂及其在抗虫基因工程中的应用*
Proteinase Inhibitors a nd Their A pplication in Insect-resistant Gene Engineering
柳武革1 薛庆中2
Liu Wuge Xue Qingzhong
1. 广东省农科院水稻研究所, 广州510640
1. R ice Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Science, Guangzhou 5106402. 浙江大学华家池校区农学系, 杭州310029
2. D epartment of Agronomy, Zhejiang University, Huajiachi campus, Hangzhou 310029
摘 要: 蛋白酶抑制剂可以抑制昆虫的生长和发育, 近年来在抗虫基因工程得到了广泛的应用。本文综述了蛋白酶抑制剂及其抗虫性, 蛋白酶抑制剂转基因植物的研究概况, 同时探讨了蛋白酶抑制剂在抗虫基因工程中的利用前景、存在问题和解决途径。
关键词: 蛋白酶抑制剂; 抗虫; 基因工程
A bstra ct:Proteinase inhibitors, which can inhibitor t he growth and development of a rnge of insects, have been widely used in insect-resistant gene engineering in r ecent years. The r evies will focus on the pr oteinese inhibitors and their insect-re 2si stance. progress in the research of transformed plants with proteinase inhibitor genes. In addition, the prospects, exist ing problems of application of proteinase inhibitors gene engineering and resolving ways will be discussed. K e y words:Proteinase inhibitors; insect-resistance; gene engineer ing
天然的蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor ) 是对蛋白水解酶有抑制活性的一种水分子蛋白质, 普遍存在于植物、动物和微生物中[7, 30]。当蛋白酶抑制剂被昆虫摄食并在体内积累时, 它就会抑制肠道内蛋白水解酶的活性, 并能刺激消化酶的过量合成和分泌, 引起某些必需氨基酸(如甲硫氨酸) 的缺乏, 扰乱昆虫的正常代谢, 最终导致昆虫发育不正常甚至死亡。因此, 蛋白酶抑制剂在植物对害虫和病原体的侵染防御系统中具有十分重要的作用[9,31]。
自Hilder 等[18,19]首次将豇豆蛋白酶抑制剂(Cowpea Trypsin Inhibitor, CpTI ) 基因转入烟草并获得抗虫转基因植株以来, 利用蛋白酶抑制剂基因获得抗虫转基因植物取得了很大的进展。本文首先简要介绍了蛋白酶抑制剂及其抗虫性, 然后着重就近年来蛋白酶抑制剂基因转基因研究、存在问题和策略作一简要综述。1 蛋白酶抑制剂及其抗虫性
迄今为止, 自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂[30]。其中, 只有丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基蛋白酶抑制剂可以明显抑制昆虫的生长和发育。目前, 在转基因中应用的主要是丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基蛋白酶抑制剂, 其中丝氨酸蛋白酶抑制剂又可以分为Bowman-Birk 家族、Kunitz 家族、PI -I 和PI-II 家族等不同的类型[7, 30]。
1. 1 Bowman-Birk 家族
Bowman-Birk 家族蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂的一个主要类型, 氨基酸组分为70个左右, 分子量为8000左右, 分子内通常含有7对二硫键, 具有两个与相同或不同的蛋白酶作用的活性中
心。目前应用最多的Bowman-Birk 家族蛋白酶抑制剂基因是CpT I 基因, 它具有两个抑制活性中心, 可同时竞争性抑制两个胰蛋白酶分子。
CpT I 对于许多在农业生产上造成重大经济损失的害虫都具有抗性[6], 其中包括鳞翅目的烟草芽蛾(H eliothis Viresc ens) 、棉铃虫(H eliothis ar miger 2a ) 、海灰翅夜蛾(Spodopter a littor alis ) 和玉米螟(Chilo partellus) ; 鞘翅目的玉米根叶甲(Diabrotica undecimpunctata ) 、四纹豆象(Callosobruc hus macu 2latus) 和杂拟谷盗(Tribolium conf usum) ; 直翅目的蝗虫(Locusta migr atoria ) 等。此外, 用纯化的CpTI 饲喂昆虫也证实了其具有较强的抗虫能力。CpTI 广泛的抗虫谱是其应用于基因工程的最主要优点。1. 2 Kunitz 家族
Kunitz 家族蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂的另外一个主要类型, 它主要存在于豆类的种子中。从分子的一级结构来看, 约有180个氨基酸, 分子量在20kD 左右, 分子内只有两对二硫键和一个与酶作用的活性位点。这种蛋白酶抑制剂在种子中存在同工抑制剂, 到目前为止已发现有T i a 、T i b 、T i 、T i -f 、Ti -s 等多种类型, 它们之间仅存在少数几个氨基酸的差异, 如T i a 和Ti c 只有一个氨基酸的差异, Ti Gly y Ti Glu ; 它们的活性中心均为Arg 63-Ile 64, 其中以Ti c 对胰蛋白酶的抑制作用最强。研究表明, Kunitz 家族蛋白酶抑制剂的抗虫性要明显好于豇豆胰蛋白酶抑制剂[1]。1. 3 PI-I 和PI-II 家族
PI-I 和PI-II 家族蛋白酶抑制剂是一类创伤诱导型表达的蛋白酶抑制剂。其中PI-I 家族包括马铃薯蛋白酶抑制剂I (Potato Proteinase Inhibitor I, PI-I) 和番茄蛋白酶抑制剂I(Tomato Proteinase Inhibitor I, T I-I) , 成熟肽的分子量8. 1kD, 只有一个活性中心, 主要抑制胰凝乳蛋白酶, 对胰蛋白酶的抑制作用较弱; PI-II 家族包括马铃薯蛋白酶抑制剂II(Potato Proteinase Inhibitor II, PI-II) 和番茄蛋白酶抑制剂II (Tomato Proteinase Inhibitor II, TI -II) , 成熟肽的单体分子量12. 3kD, 有两个活性中心, 可同时抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。PI -I 和PI -II 家族蛋白酶抑制剂主要对鳞翅目昆虫其作用, 其中PI-II 蛋白酶抑制剂的抗虫性要优于PI
[27]
a
55
c
55
c
a
a
-I [25]。
1. 4 巯基蛋白酶抑制剂
巯基蛋白酶抑制剂和豇豆胰蛋白酶抑制剂的抗虫谱具有互补性。在一些丝氨酸蛋白酶抑制剂含量甚丰的植物器官, 如豇豆的种子, 也会被豇豆象所摄食, 它就是用巯基蛋白酶来完成消化的, 因此CpTi 对它不起作用[9]。
目前, 水稻[10]和玉米[11]的巯基蛋白酶抑制剂的cDNA 都已被克隆, 并推导出其氨基酸序列, 其中水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryza cystatin OC) 有两种, OCI 和OCII, 成熟蛋白分别由102和107个氨基酸组成; Abe 等克隆出的玉米巯基蛋白酶抑制剂(Corn cystatin, CC) cDNA 全长960bp, 含完整的编码序列, 成熟的CC 为135个氨基酸, 和OCI 、OCII 具有很高的同源性, 都具有保守区Gly-Val-Val -Ala-Gly 。巯基蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂相比, 它们没有前导肽, 分子内也没有二硫键。研究发现, 巯基蛋白酶抑制剂对米象(Sitophilus o 2ryzae) 、杂拟谷盗、赤拟谷盗(T ribolium castaneun) 、大谷盗(T enebroides mauritanicus) 等谷仓害虫的蛋白酶消化酶具有明显的抑制作用[6]。
[11]
2 蛋白酶抑制剂基因的转基因研究
1987年, 英国Durham 大学的Hider 等人利用农杆菌叶盘转化法首次将编码CpT I 的cDNA 转化到烟草植株中。DNA 分子杂交结果证实了转基因烟草基因组整合了多拷贝未重排的CpTI cD 2NA, 并能稳定遗传; Western 杂交表明CpT I 基因在转基因烟草中能正确表达; 从而证实了利用蛋白酶抑制剂基因进行抗虫转基因植物育种是一种行之有效的方法。
到目前为止, 至少已有15种不同来源的蛋白酶抑制剂的cDNA 或基因被克隆, 并转入不同植物, 其中大部分均获得对昆虫具有明显抗性的转基因植株。表1为近年来利用蛋白酶抑制剂获得的转基因植物。
在抗虫转基因植物中应用的主要是来源于植物的胰蛋白酶抑制剂基因和巯基蛋白酶抑制剂基因, 此外, 利用来源于昆虫烟草天蛾(Manduca sexta ) 并经过适当改造的弹性蛋白酶抑制剂基因、胰蛋白酶抑制剂基因和胰凝乳蛋白酶抑制剂基因也获得了具
)
[18,19]
有抗虫性的转基因烟草、苜蓿和棉花[33,34]。
个非常复杂的过程, 目的基因的有效表达不仅受到载体(启动子, 终止子, 目的基因的修饰等) 的影响, 还会受到宿主植物特性(不同的遣传背景, 不同部位
及发育阶段) 的影响。
3. 1 不同的启动子和外源基因的改造对基因表达的影响
表1 近年来利用蛋白酶抑制剂基因已经获得的转基因植物
蛋白酶抑制剂
(cowpea trpsin inhibitor)
PEG 法导入源
大麦胰蛋白酶抑制剂Cme (barley trypsin inhibitor) 南瓜胰蛋白酶抑制剂CMT I (squash trypsin inhibitor) 大豆丝氨酸蛋白酶抑制剂C-II (soybean serine-proteinase inhibitor) 大豆丝氨酸蛋白酶抑制PI-IC
(soybean serine-proteinase inhibitor) 大豆Kunitz 型蛋白酶抑制剂SKT I, Kti 3(soybean Kunitz trypsin inhibi tor) 芥菜丝氨酸蛋白酶抑制剂MT I-2(mustard serine-proteinase inhibi tor) 海芋蛋白酶抑制剂GTPI (giant taro protei nase i n hi bitor) 马铃薯蛋白酶抑制剂I PI (potato proteinase i nh i bitor I) 马铃薯蛋白酶抑制剂II PI-II (potato proteinase i nh i bitor II)
基因枪法
番茄蛋白酶抑制剂I T I-I (tomato protei nase inhibitor I) 番茄蛋白酶抑制剂II T I-II (tomato protei nase inhibitor I) 水稻巯基蛋白酶抑制剂OC-I (rice cysteine-proteinase inhibitor) 玉米巯基蛋白酶抑制剂CC (corn cystatin)
烟草天蛾蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitors)
电融合法导入原生质体农杆菌介导
CaMV35S Ppcl
烟草[33], 棉花[33], 苜蓿[34]
CaMV35S
水稻[21]
农杆菌介导农杆菌介导
CaMV35S CaMC35S
烟草[25]
烟草[29], 油菜[32], 杨树[32]
农杆菌介导
Pin2CaMv35S
水稻[15, 38]
烟草[23, 25], 苜蓿[23], 龙葵[23]
农杆菌介导
CaMV35S
烟草[25], 莴苣[32], 桦树[23]
农杆菌介导农杆菌介导
CaMV35S rbc S CaMV35S
烟草[32], 矮牵牛[32]烟草[35]
农杆菌介导
CaM35S
烟草[32], 拟南芥[32]
农杆菌介导农杆菌介导
CaMV35S CaMV35S
农杆菌介导
CaMV35S
烟草[32], 马铃薯[32], 番茄[32], 油菜[32], 杨树[32]烟草[32], 马铃薯[32]烟草[1, 14, 24], 马铃薯[32]
农杆菌介导
CaMV35S
烟草[32]
生质体
农杆菌介导
Actl CaMV35S
转基因方法启动子获得的转基因植物
烟草[4, 19], 马铃薯[28], 番茄[32], 甘薯[32], 油菜[32], 莴苣[32], 草莓[17, 22], 太阳花[32], 苹果树[22][36, 37]烟草[32]
3 蛋白酶抑制剂基因的表达特性
外源蛋白酶抑制剂基因在大多数转基因植物中都能表达, 但是由于高等生物存在着复杂的基因表达调控系统, 外源基因在转基因植物中的表达是一
注:Actl:水稻Acti n 基因启动子; Pin2:马铃薯PI-II 诱导启动子; Ppcl:磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Phosphoenollpyruvate carboxylase) 启动子; rbcS:拟南芥RuB P 羧化酶小亚基atslA 启动子
Wu 等[35]将未经改造的海芋蛋白酶抑制剂(gi 2ant taro proteinase inhibitor , GPT I) 基因分别与CaMV 35S 启动子和rbc S 启动子构建两个质粒p35SAM 和prbcAM8, 同时将经过PCR 改造的CP 2T I 基因与CaMV35S 启动子构建质粒p35SAM8KDEL; 这三个质粒在转基因烟草叶片中的平均表达水平差异很大。其中, 质粒prbcAM8的平均表达水平最高, 占可溶性蛋白的0. 22%; 质粒p35SAM 为0. 11%; 基因改造后的质粒p35SAM8-KDEL 的平均表达水平最低, 仅占可溶性蛋白的
0. 06%。不同启动子作用下外源基因的表达是不同的, 而且基因的修饰和改造也会影响基因的表达。3. 2 不同的转基因植物中表达存在差异
javier 等[23]将番茄T I-I 基因在同样的启动子CaMC35S 作用下转入3种不同的植物, 龙葵、烟草和苜蓿中, 从mRNA 水平和蛋白水平对TI-I 基因的表达进行了研究。结果发现, TI -I 基因在龙葵叶片中的表达量最高, 达125L g/g 组织; 烟草叶片中为75L g/g 组织, 在苜蓿叶片中最低, 为25L g/g 组织。这表明外源基因的转录速率(the rate of tran 2scription) 和mRNA 的降解速率(the rate of degrada 2tion) 在不同的植物中是不一样的。
3. 3 不同的组织和不同的发育时期表达存在差异我们实验室对CpTI 转基因水稻研究表明, Cp 2T I 基因的表达在不同的水稻组织存在差异, 总的趋势是叶片的表达高于茎; CpT I 基因的表达在不同的发育阶段存在差异, 大多数转基因品系随着植株的生长发育和衰老, CpT I 蛋白的含量逐渐降低(待发表) 。从理论上讲, 非特异性启动子(CaMV35S 启动子) 作用下的外源基因的表达在植株中不应存在差异。但是许多研究表明, 组成型启动子在某些组织细胞类型中(如叶片, 花粉) 的活性要高于另外一些(如根, 茎杆, 叶柄)
[16]
tion) 和基因扩增(gene amplifying) 等现象, 导致同一转基因株系后代的Southern blot 杂交图谱发生变异, 进一步会影响外源基因在不同世代表达的稳定性。
除此之外, 环境因子(高温, 干旱) 都会影响外源基因的表达。
[2]
4 蛋白酶抑制剂基因的利用前景、存在问题及策略
蛋白酶抑制剂基因在抗虫转基因植物中占有十分重要的位置[9]。首先从杀虫机理来看, 它的作用位点是酶的活性中心, 而这些位点是昆虫长期进化过程中最保守的部位, 产生突变的可能性很小, 因此基本上可以排除害虫通过突变产生抗性的可能; 其次, 蛋白酶抑制的抗虫谱比较广泛, 如豇豆胰蛋白酶抑制剂可以抗很多种害虫, 包括鳞翅目、鞘翅目及直翅目的一些害虫。最为重要的是, 现已证实蛋白酶抑制剂转入食用作物中, 对人畜没有副作用。这主要是由于人畜和昆虫的消化机制不一样, 蛋白酶抑制剂在进入胃中被酸性的胃蛋白酶所消化(目前酸性蛋白酶抑制剂除了在赛莨菪属的一些植物中发现外, 其它植物中还未有发现) 。另外, 一些研究还表明, 食用天然的植物蛋白酶抑制剂具有抗肠癌的作用, 而且由于CpTI 中富含赖氨酸, 它在转基因植物中的积累可能会提高食物的品质和营养价值[9, 30]。然而蛋白酶抑制剂基因在抗虫转基因植物中的应用仍存在两方面的问题。
其一, 由于蛋白酶抑制剂的抗虫机理和苏云金杆菌毒蛋白存在本质的区别, 因此要想获得Bt 转基因植物的抗虫效果, 所要求的蛋白酶抑制剂表达水平远高于Bt 的表达水平。有些转基因植物的蛋白酶抑制剂表达量较低, 昆虫取食后, 其体内剩余的消化蛋白酶足以维持它的正常发育和生长。Hoffman 等[20]对转Bt 基因和转CpTI 基因烟草进行田间人工接种棉铃虫测试, 结果发现前者的抗虫效果明显好于后者。
其二, 近年来的一些研究表明, 害虫可以适应转基因植物中表达的蛋白酶抑制剂。
Wu 等[35]以对照烟草和GT PI 转基因烟草的叶片分别饲喂棉铃虫幼虫, 结果发现, 两者对幼虫的致死率之间没有显著差异。进一步分析棉铃虫幼虫肠
)
。另外, 上于老化细胞中基因
[5]
表达的钝化和表达产物的降解以及植物翻译的偏好, 都会影响发育过程中外源基因的表达3. 4 不同的转基因株系间表达存在差异
。
Xu 等[36,37]对10个不同的R 0代CpT I 转基因水稻植株中CpT I 蛋白的表达量进行测定, 结果表明不同的转基因植株间差异很大。其中R 010植株表达量最大, 约占可溶性蛋白的2. 7%, R 012植株最少, 约占可溶性蛋白的0. 3%, 两者相差8倍之多。Duan 等发现, 不同的PI-II 转基因水稻P 0代表达的PI-II 蛋白也存在很大的差异, 变化范围为可溶性蛋白含量的0. 25%~1. 90%。不同转基因植株外源基因的表达差异可能是由插入的拷贝数[15]、不同的随机整合位点[15]以及在宿主染色体中存在的完整性[2]等因素造成的。3. 5 不同世代的转基因植株表达存在差异外源基因在传递过程中, 可能由于外源基因的基因丢失(gene losing) 、基因重组(gene recombina 2
[15,38]
道内的消化酶活性, 表明胰蛋白酶的活性被抑制了68%, 而对抑制剂不敏感的糜蛋白酶和弹性蛋白酶的活性分别增加了26%和16%, 这就补偿了被抑制剂抑制的那部分胰蛋白酶活性。
Broadway
[12, 13]
过共转化的方法将CpTI 基因和Bt 毒素基因共同转入烟草中, 获得了高抗虫的转双基因烟草。另外对现有的不同转单基因作物可以通过常规育种的方法进行抗性基因的聚合。我们实验室也正在对已获得的CpT I 、PI-II 转基因水稻进行花药培养和杂交育种工作, 着手构建双转基因纯合水稻, 以期获得得高抗螟虫的转基因水稻。
¼使蛋白酶抑制剂基因只有在受到害虫侵袭时, 或者只在容易被害虫侵染的组织器官中, 或者只在一定的条件下(如化学物质的调控) 才高效的表达; 在一定程度上降低对害虫的选择压力, 延缓转基因作物的抗性寿命。需要选择组织特异性表达和昆虫诱导型表达的启动子来调控外源基因的表达, 使植物在受到害虫攻击时才经济有效地表达抗虫基因。马铃薯蛋白酶抑制剂PI -II 基因的启动子就是损伤诱导型调控启动子, 它在抗虫基因工程中具有较大应用潜力。
综上所述, 利用蛋白酶抑制剂获得抗虫转基因植物研究取得了很大的进展, 但在增强蛋白酶抑制剂基因的表达、实现转基因植物的实用化方面仍有很多工作要做。
参考文献
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、Jongsma
[26]
等研究指出, 以添
加蛋白酶抑制剂的饲料喂昆虫幼虫时, 从幼虫肠道内提取的丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶均对蛋白酶抑
制剂不敏感; 而与之相反的是, 以不添加蛋白酶抑制剂的饲料喂时, 从虫体内提取的丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶均对蛋白酶抑制剂敏感, 这可以认为是昆虫的一种适应性反应。Jongsma [26]就发现转PI-II 基因的烟草对甜菜夜蛾(Spodoptera e xigua ) 的生长发育并未产生不良影响, 甜菜夜蛾通过诱导产生对PI-II 不敏感的消化酶来产生抗性。这可能是昆虫适应植物蛋白酶抑制剂的一种机制。
针对以上的一些问题, 人们可以采取如下有效的措施[3]:
¹分离更多的抗虫基因。如Bt 基因, 植物凝集素(lectin) 基因, 壳多糖酶(chitinase) 基因, 核糖体灭活蛋白(RIP) 基因, 以及其它一些从蜘蛛、蝎子中分离的编码具有杀虫作用的小肽(30-40氨基酸) 的杀虫肽基因。
º对已有的基因进行适当的分子改造, 以提高表达量。如使用高效表达的强启动子和植物偏好的密码子, 或者对不同来源的基因进行人工拼接和重组, 提高CpT I 的表达量。中科院遗传研究所利用不同的启动子及8因子对CpT I 基因进行修饰
[6]
,
得到了不同的植物表达质粒。其中8因子来自烟草花叶病毒126kD 蛋白基因转录序列5c 末端的非转译区, 由68bp 组成, 能促进mRNA 的翻译。利用CaMV35S 启动子串联8因子调控的CpTI 基因转化烟草, 转基因烟草中CpTI 的表达显著提高, 但是高效表达引发转基因烟草白化。
最近, H ilder 认为他们首次克隆的CpTI 基因在第36bp 处和154bp 处各有一个起始密码子AT G, 而第一个ATG 可能是假的起始密码子(1999, 私人通讯) , 因此我们实验室正在设计引物进行亚克隆和转基因工作, 可望提高转基因植物的抗虫效果。»同时使用两个或两个以上的抗虫目的基因来转化农作物, 以期获得良好的抗生。赵荣敏等[8]通
18 Hilder VA, et al. Plant Molecular B iology, 1989, 13:70119 Hilder VA, et al. Nature, 1987, 300:16020 Hoffman MP, et al. J Econ Ento, 1992, 85:251621 Ire K, et al. Plant Molecular Biology, 1996, 30:14922 James DL, et al. Phytoparasitica, 1992, 20:83
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38 Xue QZ, et al. Rice Genetics III, IRRI P. O. Box933, Manila, Philip
-pines, 1996, 239
#国外动态#
开发在短时间内检测出VRE 耐性基因的PCR 系统
5日经生物技术61999年7月5日号第12页报道:勇永制药公司与庆应义塾大学医学部附属医院中央临床检查部讲师小林芳夫等使用聚合酶链反应法(基因扩增法) 和微注射法成功地开发出在2. 5小时内就能检测出VRE 耐性基因的系统。
使用这次开发的系统观察从American Type Culture Collection 中得到的菌株, 确认能检测并鉴定药剂耐性基因。另外, 正在使用临床分离株评价该系统的有效性。该成果于6月19~20日在松山市召开的微生物快速诊断研究会上发表。
据勇永制药公司称, 开发检测VRE 耐性基因的基因检测系统尚无先例。勇永制药公司打算作为研究用试剂向秋口地区出售。
VRE 是具有广谱抗药性的细菌, 对甲氧西林耐性黄色葡萄球菌有效的抗生素) ) ) 万古酶素和用于其它细菌感染症的所有抗生素具有抗性, 存在于健康人体内。但是入院患者有时由于VRE 的感染会引起病症加重。因此作为新的院内感染致病菌受到关注。根据万古霉素耐性度和万古霉素的类似体) ) ) 对¦ ·É«Ó的耐性度将VRE 对万古霉素的耐性分为3组) ) ) VanA 、VanB 、VanC 。研究人员还得知作为耐性基因分别有vanA 、vanB 、vanC, 而vanC 又被分为vanC-1、vanC-2和vanC-3。勇永公司和庆应义塾大学所开发的系统可特异性检测出vanA 、vanB 、vanC-1、vanC-2/3基因。该系统可将在平板培养获得的菌与PCR 反应液混合, 在PCR 装置中在95度下反应10分钟后, 再在94度15秒、60度15秒、72度15秒反复30次。其菌在PCR 管内溶菌, 进行PCR 反应。扩增试剂中含有特异扩增4种基因的底物, 在一个管内能同时扩增4种耐性基因。扩增试剂与变性试剂混合后分别添加到固定了vanA 、vanB 、vanC-1、vanC-2/3基因检测探针的穴式液闪中, 使其进行杂交反应并进行检测。
孙国凤
)
#综 述#
蛋白酶抑制剂及其在抗虫基因工程中的应用*
Proteinase Inhibitors a nd Their A pplication in Insect-resistant Gene Engineering
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Liu Wuge Xue Qingzhong
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摘 要: 蛋白酶抑制剂可以抑制昆虫的生长和发育, 近年来在抗虫基因工程得到了广泛的应用。本文综述了蛋白酶抑制剂及其抗虫性, 蛋白酶抑制剂转基因植物的研究概况, 同时探讨了蛋白酶抑制剂在抗虫基因工程中的利用前景、存在问题和解决途径。
关键词: 蛋白酶抑制剂; 抗虫; 基因工程
A bstra ct:Proteinase inhibitors, which can inhibitor t he growth and development of a rnge of insects, have been widely used in insect-resistant gene engineering in r ecent years. The r evies will focus on the pr oteinese inhibitors and their insect-re 2si stance. progress in the research of transformed plants with proteinase inhibitor genes. In addition, the prospects, exist ing problems of application of proteinase inhibitors gene engineering and resolving ways will be discussed. K e y words:Proteinase inhibitors; insect-resistance; gene engineer ing
天然的蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor ) 是对蛋白水解酶有抑制活性的一种水分子蛋白质, 普遍存在于植物、动物和微生物中[7, 30]。当蛋白酶抑制剂被昆虫摄食并在体内积累时, 它就会抑制肠道内蛋白水解酶的活性, 并能刺激消化酶的过量合成和分泌, 引起某些必需氨基酸(如甲硫氨酸) 的缺乏, 扰乱昆虫的正常代谢, 最终导致昆虫发育不正常甚至死亡。因此, 蛋白酶抑制剂在植物对害虫和病原体的侵染防御系统中具有十分重要的作用[9,31]。
自Hilder 等[18,19]首次将豇豆蛋白酶抑制剂(Cowpea Trypsin Inhibitor, CpTI ) 基因转入烟草并获得抗虫转基因植株以来, 利用蛋白酶抑制剂基因获得抗虫转基因植物取得了很大的进展。本文首先简要介绍了蛋白酶抑制剂及其抗虫性, 然后着重就近年来蛋白酶抑制剂基因转基因研究、存在问题和策略作一简要综述。1 蛋白酶抑制剂及其抗虫性
迄今为止, 自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂[30]。其中, 只有丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基蛋白酶抑制剂可以明显抑制昆虫的生长和发育。目前, 在转基因中应用的主要是丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基蛋白酶抑制剂, 其中丝氨酸蛋白酶抑制剂又可以分为Bowman-Birk 家族、Kunitz 家族、PI -I 和PI-II 家族等不同的类型[7, 30]。
1. 1 Bowman-Birk 家族
Bowman-Birk 家族蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂的一个主要类型, 氨基酸组分为70个左右, 分子量为8000左右, 分子内通常含有7对二硫键, 具有两个与相同或不同的蛋白酶作用的活性中
心。目前应用最多的Bowman-Birk 家族蛋白酶抑制剂基因是CpT I 基因, 它具有两个抑制活性中心, 可同时竞争性抑制两个胰蛋白酶分子。
CpT I 对于许多在农业生产上造成重大经济损失的害虫都具有抗性[6], 其中包括鳞翅目的烟草芽蛾(H eliothis Viresc ens) 、棉铃虫(H eliothis ar miger 2a ) 、海灰翅夜蛾(Spodopter a littor alis ) 和玉米螟(Chilo partellus) ; 鞘翅目的玉米根叶甲(Diabrotica undecimpunctata ) 、四纹豆象(Callosobruc hus macu 2latus) 和杂拟谷盗(Tribolium conf usum) ; 直翅目的蝗虫(Locusta migr atoria ) 等。此外, 用纯化的CpTI 饲喂昆虫也证实了其具有较强的抗虫能力。CpTI 广泛的抗虫谱是其应用于基因工程的最主要优点。1. 2 Kunitz 家族
Kunitz 家族蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂的另外一个主要类型, 它主要存在于豆类的种子中。从分子的一级结构来看, 约有180个氨基酸, 分子量在20kD 左右, 分子内只有两对二硫键和一个与酶作用的活性位点。这种蛋白酶抑制剂在种子中存在同工抑制剂, 到目前为止已发现有T i a 、T i b 、T i 、T i -f 、Ti -s 等多种类型, 它们之间仅存在少数几个氨基酸的差异, 如T i a 和Ti c 只有一个氨基酸的差异, Ti Gly y Ti Glu ; 它们的活性中心均为Arg 63-Ile 64, 其中以Ti c 对胰蛋白酶的抑制作用最强。研究表明, Kunitz 家族蛋白酶抑制剂的抗虫性要明显好于豇豆胰蛋白酶抑制剂[1]。1. 3 PI-I 和PI-II 家族
PI-I 和PI-II 家族蛋白酶抑制剂是一类创伤诱导型表达的蛋白酶抑制剂。其中PI-I 家族包括马铃薯蛋白酶抑制剂I (Potato Proteinase Inhibitor I, PI-I) 和番茄蛋白酶抑制剂I(Tomato Proteinase Inhibitor I, T I-I) , 成熟肽的分子量8. 1kD, 只有一个活性中心, 主要抑制胰凝乳蛋白酶, 对胰蛋白酶的抑制作用较弱; PI-II 家族包括马铃薯蛋白酶抑制剂II(Potato Proteinase Inhibitor II, PI-II) 和番茄蛋白酶抑制剂II (Tomato Proteinase Inhibitor II, TI -II) , 成熟肽的单体分子量12. 3kD, 有两个活性中心, 可同时抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。PI -I 和PI -II 家族蛋白酶抑制剂主要对鳞翅目昆虫其作用, 其中PI-II 蛋白酶抑制剂的抗虫性要优于PI
[27]
a
55
c
55
c
a
a
-I [25]。
1. 4 巯基蛋白酶抑制剂
巯基蛋白酶抑制剂和豇豆胰蛋白酶抑制剂的抗虫谱具有互补性。在一些丝氨酸蛋白酶抑制剂含量甚丰的植物器官, 如豇豆的种子, 也会被豇豆象所摄食, 它就是用巯基蛋白酶来完成消化的, 因此CpTi 对它不起作用[9]。
目前, 水稻[10]和玉米[11]的巯基蛋白酶抑制剂的cDNA 都已被克隆, 并推导出其氨基酸序列, 其中水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryza cystatin OC) 有两种, OCI 和OCII, 成熟蛋白分别由102和107个氨基酸组成; Abe 等克隆出的玉米巯基蛋白酶抑制剂(Corn cystatin, CC) cDNA 全长960bp, 含完整的编码序列, 成熟的CC 为135个氨基酸, 和OCI 、OCII 具有很高的同源性, 都具有保守区Gly-Val-Val -Ala-Gly 。巯基蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂相比, 它们没有前导肽, 分子内也没有二硫键。研究发现, 巯基蛋白酶抑制剂对米象(Sitophilus o 2ryzae) 、杂拟谷盗、赤拟谷盗(T ribolium castaneun) 、大谷盗(T enebroides mauritanicus) 等谷仓害虫的蛋白酶消化酶具有明显的抑制作用[6]。
[11]
2 蛋白酶抑制剂基因的转基因研究
1987年, 英国Durham 大学的Hider 等人利用农杆菌叶盘转化法首次将编码CpT I 的cDNA 转化到烟草植株中。DNA 分子杂交结果证实了转基因烟草基因组整合了多拷贝未重排的CpTI cD 2NA, 并能稳定遗传; Western 杂交表明CpT I 基因在转基因烟草中能正确表达; 从而证实了利用蛋白酶抑制剂基因进行抗虫转基因植物育种是一种行之有效的方法。
到目前为止, 至少已有15种不同来源的蛋白酶抑制剂的cDNA 或基因被克隆, 并转入不同植物, 其中大部分均获得对昆虫具有明显抗性的转基因植株。表1为近年来利用蛋白酶抑制剂获得的转基因植物。
在抗虫转基因植物中应用的主要是来源于植物的胰蛋白酶抑制剂基因和巯基蛋白酶抑制剂基因, 此外, 利用来源于昆虫烟草天蛾(Manduca sexta ) 并经过适当改造的弹性蛋白酶抑制剂基因、胰蛋白酶抑制剂基因和胰凝乳蛋白酶抑制剂基因也获得了具
)
[18,19]
有抗虫性的转基因烟草、苜蓿和棉花[33,34]。
个非常复杂的过程, 目的基因的有效表达不仅受到载体(启动子, 终止子, 目的基因的修饰等) 的影响, 还会受到宿主植物特性(不同的遣传背景, 不同部位
及发育阶段) 的影响。
3. 1 不同的启动子和外源基因的改造对基因表达的影响
表1 近年来利用蛋白酶抑制剂基因已经获得的转基因植物
蛋白酶抑制剂
(cowpea trpsin inhibitor)
PEG 法导入源
大麦胰蛋白酶抑制剂Cme (barley trypsin inhibitor) 南瓜胰蛋白酶抑制剂CMT I (squash trypsin inhibitor) 大豆丝氨酸蛋白酶抑制剂C-II (soybean serine-proteinase inhibitor) 大豆丝氨酸蛋白酶抑制PI-IC
(soybean serine-proteinase inhibitor) 大豆Kunitz 型蛋白酶抑制剂SKT I, Kti 3(soybean Kunitz trypsin inhibi tor) 芥菜丝氨酸蛋白酶抑制剂MT I-2(mustard serine-proteinase inhibi tor) 海芋蛋白酶抑制剂GTPI (giant taro protei nase i n hi bitor) 马铃薯蛋白酶抑制剂I PI (potato proteinase i nh i bitor I) 马铃薯蛋白酶抑制剂II PI-II (potato proteinase i nh i bitor II)
基因枪法
番茄蛋白酶抑制剂I T I-I (tomato protei nase inhibitor I) 番茄蛋白酶抑制剂II T I-II (tomato protei nase inhibitor I) 水稻巯基蛋白酶抑制剂OC-I (rice cysteine-proteinase inhibitor) 玉米巯基蛋白酶抑制剂CC (corn cystatin)
烟草天蛾蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitors)
电融合法导入原生质体农杆菌介导
CaMV35S Ppcl
烟草[33], 棉花[33], 苜蓿[34]
CaMV35S
水稻[21]
农杆菌介导农杆菌介导
CaMV35S CaMC35S
烟草[25]
烟草[29], 油菜[32], 杨树[32]
农杆菌介导
Pin2CaMv35S
水稻[15, 38]
烟草[23, 25], 苜蓿[23], 龙葵[23]
农杆菌介导
CaMV35S
烟草[25], 莴苣[32], 桦树[23]
农杆菌介导农杆菌介导
CaMV35S rbc S CaMV35S
烟草[32], 矮牵牛[32]烟草[35]
农杆菌介导
CaM35S
烟草[32], 拟南芥[32]
农杆菌介导农杆菌介导
CaMV35S CaMV35S
农杆菌介导
CaMV35S
烟草[32], 马铃薯[32], 番茄[32], 油菜[32], 杨树[32]烟草[32], 马铃薯[32]烟草[1, 14, 24], 马铃薯[32]
农杆菌介导
CaMV35S
烟草[32]
生质体
农杆菌介导
Actl CaMV35S
转基因方法启动子获得的转基因植物
烟草[4, 19], 马铃薯[28], 番茄[32], 甘薯[32], 油菜[32], 莴苣[32], 草莓[17, 22], 太阳花[32], 苹果树[22][36, 37]烟草[32]
3 蛋白酶抑制剂基因的表达特性
外源蛋白酶抑制剂基因在大多数转基因植物中都能表达, 但是由于高等生物存在着复杂的基因表达调控系统, 外源基因在转基因植物中的表达是一
注:Actl:水稻Acti n 基因启动子; Pin2:马铃薯PI-II 诱导启动子; Ppcl:磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Phosphoenollpyruvate carboxylase) 启动子; rbcS:拟南芥RuB P 羧化酶小亚基atslA 启动子
Wu 等[35]将未经改造的海芋蛋白酶抑制剂(gi 2ant taro proteinase inhibitor , GPT I) 基因分别与CaMV 35S 启动子和rbc S 启动子构建两个质粒p35SAM 和prbcAM8, 同时将经过PCR 改造的CP 2T I 基因与CaMV35S 启动子构建质粒p35SAM8KDEL; 这三个质粒在转基因烟草叶片中的平均表达水平差异很大。其中, 质粒prbcAM8的平均表达水平最高, 占可溶性蛋白的0. 22%; 质粒p35SAM 为0. 11%; 基因改造后的质粒p35SAM8-KDEL 的平均表达水平最低, 仅占可溶性蛋白的
0. 06%。不同启动子作用下外源基因的表达是不同的, 而且基因的修饰和改造也会影响基因的表达。3. 2 不同的转基因植物中表达存在差异
javier 等[23]将番茄T I-I 基因在同样的启动子CaMC35S 作用下转入3种不同的植物, 龙葵、烟草和苜蓿中, 从mRNA 水平和蛋白水平对TI-I 基因的表达进行了研究。结果发现, TI -I 基因在龙葵叶片中的表达量最高, 达125L g/g 组织; 烟草叶片中为75L g/g 组织, 在苜蓿叶片中最低, 为25L g/g 组织。这表明外源基因的转录速率(the rate of tran 2scription) 和mRNA 的降解速率(the rate of degrada 2tion) 在不同的植物中是不一样的。
3. 3 不同的组织和不同的发育时期表达存在差异我们实验室对CpTI 转基因水稻研究表明, Cp 2T I 基因的表达在不同的水稻组织存在差异, 总的趋势是叶片的表达高于茎; CpT I 基因的表达在不同的发育阶段存在差异, 大多数转基因品系随着植株的生长发育和衰老, CpT I 蛋白的含量逐渐降低(待发表) 。从理论上讲, 非特异性启动子(CaMV35S 启动子) 作用下的外源基因的表达在植株中不应存在差异。但是许多研究表明, 组成型启动子在某些组织细胞类型中(如叶片, 花粉) 的活性要高于另外一些(如根, 茎杆, 叶柄)
[16]
tion) 和基因扩增(gene amplifying) 等现象, 导致同一转基因株系后代的Southern blot 杂交图谱发生变异, 进一步会影响外源基因在不同世代表达的稳定性。
除此之外, 环境因子(高温, 干旱) 都会影响外源基因的表达。
[2]
4 蛋白酶抑制剂基因的利用前景、存在问题及策略
蛋白酶抑制剂基因在抗虫转基因植物中占有十分重要的位置[9]。首先从杀虫机理来看, 它的作用位点是酶的活性中心, 而这些位点是昆虫长期进化过程中最保守的部位, 产生突变的可能性很小, 因此基本上可以排除害虫通过突变产生抗性的可能; 其次, 蛋白酶抑制的抗虫谱比较广泛, 如豇豆胰蛋白酶抑制剂可以抗很多种害虫, 包括鳞翅目、鞘翅目及直翅目的一些害虫。最为重要的是, 现已证实蛋白酶抑制剂转入食用作物中, 对人畜没有副作用。这主要是由于人畜和昆虫的消化机制不一样, 蛋白酶抑制剂在进入胃中被酸性的胃蛋白酶所消化(目前酸性蛋白酶抑制剂除了在赛莨菪属的一些植物中发现外, 其它植物中还未有发现) 。另外, 一些研究还表明, 食用天然的植物蛋白酶抑制剂具有抗肠癌的作用, 而且由于CpTI 中富含赖氨酸, 它在转基因植物中的积累可能会提高食物的品质和营养价值[9, 30]。然而蛋白酶抑制剂基因在抗虫转基因植物中的应用仍存在两方面的问题。
其一, 由于蛋白酶抑制剂的抗虫机理和苏云金杆菌毒蛋白存在本质的区别, 因此要想获得Bt 转基因植物的抗虫效果, 所要求的蛋白酶抑制剂表达水平远高于Bt 的表达水平。有些转基因植物的蛋白酶抑制剂表达量较低, 昆虫取食后, 其体内剩余的消化蛋白酶足以维持它的正常发育和生长。Hoffman 等[20]对转Bt 基因和转CpTI 基因烟草进行田间人工接种棉铃虫测试, 结果发现前者的抗虫效果明显好于后者。
其二, 近年来的一些研究表明, 害虫可以适应转基因植物中表达的蛋白酶抑制剂。
Wu 等[35]以对照烟草和GT PI 转基因烟草的叶片分别饲喂棉铃虫幼虫, 结果发现, 两者对幼虫的致死率之间没有显著差异。进一步分析棉铃虫幼虫肠
)
。另外, 上于老化细胞中基因
[5]
表达的钝化和表达产物的降解以及植物翻译的偏好, 都会影响发育过程中外源基因的表达3. 4 不同的转基因株系间表达存在差异
。
Xu 等[36,37]对10个不同的R 0代CpT I 转基因水稻植株中CpT I 蛋白的表达量进行测定, 结果表明不同的转基因植株间差异很大。其中R 010植株表达量最大, 约占可溶性蛋白的2. 7%, R 012植株最少, 约占可溶性蛋白的0. 3%, 两者相差8倍之多。Duan 等发现, 不同的PI-II 转基因水稻P 0代表达的PI-II 蛋白也存在很大的差异, 变化范围为可溶性蛋白含量的0. 25%~1. 90%。不同转基因植株外源基因的表达差异可能是由插入的拷贝数[15]、不同的随机整合位点[15]以及在宿主染色体中存在的完整性[2]等因素造成的。3. 5 不同世代的转基因植株表达存在差异外源基因在传递过程中, 可能由于外源基因的基因丢失(gene losing) 、基因重组(gene recombina 2
[15,38]
道内的消化酶活性, 表明胰蛋白酶的活性被抑制了68%, 而对抑制剂不敏感的糜蛋白酶和弹性蛋白酶的活性分别增加了26%和16%, 这就补偿了被抑制剂抑制的那部分胰蛋白酶活性。
Broadway
[12, 13]
过共转化的方法将CpTI 基因和Bt 毒素基因共同转入烟草中, 获得了高抗虫的转双基因烟草。另外对现有的不同转单基因作物可以通过常规育种的方法进行抗性基因的聚合。我们实验室也正在对已获得的CpT I 、PI-II 转基因水稻进行花药培养和杂交育种工作, 着手构建双转基因纯合水稻, 以期获得得高抗螟虫的转基因水稻。
¼使蛋白酶抑制剂基因只有在受到害虫侵袭时, 或者只在容易被害虫侵染的组织器官中, 或者只在一定的条件下(如化学物质的调控) 才高效的表达; 在一定程度上降低对害虫的选择压力, 延缓转基因作物的抗性寿命。需要选择组织特异性表达和昆虫诱导型表达的启动子来调控外源基因的表达, 使植物在受到害虫攻击时才经济有效地表达抗虫基因。马铃薯蛋白酶抑制剂PI -II 基因的启动子就是损伤诱导型调控启动子, 它在抗虫基因工程中具有较大应用潜力。
综上所述, 利用蛋白酶抑制剂获得抗虫转基因植物研究取得了很大的进展, 但在增强蛋白酶抑制剂基因的表达、实现转基因植物的实用化方面仍有很多工作要做。
参考文献
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、Jongsma
[26]
等研究指出, 以添
加蛋白酶抑制剂的饲料喂昆虫幼虫时, 从幼虫肠道内提取的丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶均对蛋白酶抑
制剂不敏感; 而与之相反的是, 以不添加蛋白酶抑制剂的饲料喂时, 从虫体内提取的丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶均对蛋白酶抑制剂敏感, 这可以认为是昆虫的一种适应性反应。Jongsma [26]就发现转PI-II 基因的烟草对甜菜夜蛾(Spodoptera e xigua ) 的生长发育并未产生不良影响, 甜菜夜蛾通过诱导产生对PI-II 不敏感的消化酶来产生抗性。这可能是昆虫适应植物蛋白酶抑制剂的一种机制。
针对以上的一些问题, 人们可以采取如下有效的措施[3]:
¹分离更多的抗虫基因。如Bt 基因, 植物凝集素(lectin) 基因, 壳多糖酶(chitinase) 基因, 核糖体灭活蛋白(RIP) 基因, 以及其它一些从蜘蛛、蝎子中分离的编码具有杀虫作用的小肽(30-40氨基酸) 的杀虫肽基因。
º对已有的基因进行适当的分子改造, 以提高表达量。如使用高效表达的强启动子和植物偏好的密码子, 或者对不同来源的基因进行人工拼接和重组, 提高CpT I 的表达量。中科院遗传研究所利用不同的启动子及8因子对CpT I 基因进行修饰
[6]
,
得到了不同的植物表达质粒。其中8因子来自烟草花叶病毒126kD 蛋白基因转录序列5c 末端的非转译区, 由68bp 组成, 能促进mRNA 的翻译。利用CaMV35S 启动子串联8因子调控的CpTI 基因转化烟草, 转基因烟草中CpTI 的表达显著提高, 但是高效表达引发转基因烟草白化。
最近, H ilder 认为他们首次克隆的CpTI 基因在第36bp 处和154bp 处各有一个起始密码子AT G, 而第一个ATG 可能是假的起始密码子(1999, 私人通讯) , 因此我们实验室正在设计引物进行亚克隆和转基因工作, 可望提高转基因植物的抗虫效果。»同时使用两个或两个以上的抗虫目的基因来转化农作物, 以期获得良好的抗生。赵荣敏等[8]通
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-pines, 1996, 239
#国外动态#
开发在短时间内检测出VRE 耐性基因的PCR 系统
5日经生物技术61999年7月5日号第12页报道:勇永制药公司与庆应义塾大学医学部附属医院中央临床检查部讲师小林芳夫等使用聚合酶链反应法(基因扩增法) 和微注射法成功地开发出在2. 5小时内就能检测出VRE 耐性基因的系统。
使用这次开发的系统观察从American Type Culture Collection 中得到的菌株, 确认能检测并鉴定药剂耐性基因。另外, 正在使用临床分离株评价该系统的有效性。该成果于6月19~20日在松山市召开的微生物快速诊断研究会上发表。
据勇永制药公司称, 开发检测VRE 耐性基因的基因检测系统尚无先例。勇永制药公司打算作为研究用试剂向秋口地区出售。
VRE 是具有广谱抗药性的细菌, 对甲氧西林耐性黄色葡萄球菌有效的抗生素) ) ) 万古酶素和用于其它细菌感染症的所有抗生素具有抗性, 存在于健康人体内。但是入院患者有时由于VRE 的感染会引起病症加重。因此作为新的院内感染致病菌受到关注。根据万古霉素耐性度和万古霉素的类似体) ) ) 对¦ ·É«Ó的耐性度将VRE 对万古霉素的耐性分为3组) ) ) VanA 、VanB 、VanC 。研究人员还得知作为耐性基因分别有vanA 、vanB 、vanC, 而vanC 又被分为vanC-1、vanC-2和vanC-3。勇永公司和庆应义塾大学所开发的系统可特异性检测出vanA 、vanB 、vanC-1、vanC-2/3基因。该系统可将在平板培养获得的菌与PCR 反应液混合, 在PCR 装置中在95度下反应10分钟后, 再在94度15秒、60度15秒、72度15秒反复30次。其菌在PCR 管内溶菌, 进行PCR 反应。扩增试剂中含有特异扩增4种基因的底物, 在一个管内能同时扩增4种耐性基因。扩增试剂与变性试剂混合后分别添加到固定了vanA 、vanB 、vanC-1、vanC-2/3基因检测探针的穴式液闪中, 使其进行杂交反应并进行检测。
孙国凤
)