阿魏酸酯酶活性的分光光度法测定及影响因素研究_刘元元

DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.13.013

阿魏酸酯酶活性的分光光度法测定

及影响因素研究

刘元元，徐泽平

(1. 山东轻工业学院，山东济南250353;

2. 山东京博控股股份有限公司技术中心，山东滨州256500)

要：分别以去淀粉麦麸和对硝基苯酚阿魏酸酯为底物，研究了紫外－可见光分光光度法测定阿魏酸酯酶酶活的方

法，通过测定阿魏酸的释放量和对硝基苯酚的释放量来计算阿魏酸酯酶的活力，并研究了酶活测定的影响因素。同摘

RSD 值为0.65%。并将此方法对去淀粉麦麸分光光度法测定酶活进行了方法学验证，得到平均回收率达99.86%，时，

与对硝基苯酚阿魏酸酯分光光度计法及HPLC 法测定阿魏酸酯酶酶活进行了比较，结果表明去淀粉麦麸分光光度计法测定阿魏酸酯酶酶活具有稳定性好，相对偏差较小的优点且简便可行。关键词：阿魏酸酯酶，酶活测定，去淀粉麦麸，对硝基苯酚阿魏酸酯，分光光度法，影响因素

1

1，2，*

Study on the determination of ferulic acid esterase enzyme activity

with spectrophotometer method and its impact factors

2，*

LIU Yuan －yuan 1，XU Ze －ping 1，

(1.Shandong Polytechnic University ，Jinan 250353，China ;

2.Shandong chambroad Co. ，Ltd. ，Technology Center ，Binzhou 256500，China )

Abstract :The UV －Vis spectrophotometer methods to determination the ferulic acid esterase enzyme activity was studied using destarchedwheat bran (DSWB ) and 4－nitrophenyl ferulate as the substrates respectively . The enzyme activity was calculated by measuring the quantities of ferulic acid released and the quantities of p －nitrophenol released . The factors influencing the enzyme activity determination were also investigated . The method for the determination the ferulic acid esterase enzyme activity using DWB substrate was validated with the average recovery of 99.86%and RSD was 0.65%. It was compared with the method of 4－nitrophenyl ferulate spectrophotometer and the method of HPLC . The results showed that the DSWB spectrophotometer method had advantages of a good stability ，smaller relative deviation ，simple and feasible .

Key words :Ferulic acid esterase ; enzyme activity determination ; Destarchedwheat bran (DSWB ) ; 4－Nitrophenyl ferulate ; Spectrophotometer method ; impact factor 中图分类号：TS207.3

文献标识码：B

文章编号：1002－0306（2013）13－0284－05

糖或羟基肉桂酸之间的酯健。当其作用于天然纤维

素材料时，可以水解阿魏酸与半纤维素之间的酯键，从而破坏细胞壁的骨架结构，使得纤维素原料结构

［4］

疏松，这样各种胞壁降解酶类更容易接近底物而加阿魏酸酯酶可用于阿魏酸的速降解细胞壁。因此，生产，纸浆和纸的加工及促进饲料的吸收利用。这些酶不仅有能力解构植物生物量也能合成结构新颖

［5］

并可用于保健和工业领域的生物活性成分。阿魏酸酯酶活性的检测主要是通过检测阿魏酸的释放量

［1］

来确定酶活力，也有利用人工合成的底物，根据与

阿魏酸酯酶（E.C.3.1.1.73），又称肉桂酸酯酶或肉桂酸水解酶，是一种胞外羧酸酯酶括阿魏酸的一些衍生物）酸分离出来

［3］

［2］

［1］

，其催化的主

阿魏酸酯+H 2O =阿魏酸+多糖（包要反应是：多糖

。它能水解阿魏酸甲酯、

低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏

。植物细胞壁的降解过程中，阿魏酸酯

酶主要降解细胞壁多糖或果胶中的阿拉伯糖或半乳

收稿日期：2012－12－11

*通讯联系人

作者简介：刘元元(1987－) ，女，硕士研究生，研究方向:发酵工程。

檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾

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阿魏酸成酯物质固定的摩尔比，测定与其结合的物

［6－7］

。质的释放量来进行阿魏酸定量进而计算出酶活

［8］

GC 法［9］，阿魏酸的含量测定多采用HPLC 法、结果

准确、精密度高，但费用较高、费时，不适合快速分析

阿魏酸，溶于适量乙醇，定容至100mL ，得1.00mg /mL 的

反式阿魏酸标准溶液。从阿魏酸标准溶液中分别取0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mL 溶液依次用乙醇定容至100mL ，7、9、11、13μg /mL 的反式阿得浓度依次为5、魏酸标准溶液。以乙醇为空白，在320nm 下测定溶液的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，以反式阿魏酸的浓度（μg /mL ）为横坐标制作标准曲线，并计算

［15］

线性回归方程。1.2.1.2

对硝基苯酚标准曲线制作以DMSO ：2.5%

Triton X－100=1ʒ9 （v /v ）的混合液为溶剂，将对硝基

0.3、0.4、0.5、0.6mmol /L 浓度的溶液。苯酚配制成0.2、

混匀后于410nm 波长处测定吸光度，分别以对硝基苯酚浓度和所测得的吸光度为横坐标和纵坐标制作

［16］

标准曲线。1.2.21.2.2.1

酶活测定

去淀粉麦麸为底物测定阿魏酸酯酶酶活（去

淀粉麦麸UV －Vis 法）取待测酶液10mL 于试管放入55ħ 水浴中预热5min ，加入0.33g 底物，摇中，

恒温反应15min ，边反应边混匀，沸水灭酶，终止匀，

20min ），反应。反应液离心（4000r /min ，取上清液稀

取该溶液1mL 加入4mL 乙醇，摇匀，释至适当倍数，

20min ），离心（4000r /min ，于320nm 下测定吸光度并计算反式阿魏酸产量，按式（1）计算阿魏酸酯酶的

活力。

酶活定义：在反应条件下，每分钟降解底物生成1μmoL 阿魏酸所需要的酶量为一个酶活单位。酶活（μmol /mL ）=（m ˑ V ˑ W ）/（M ˑ t ）式（1）式中：m －从曲线上查得的标准阿魏酸的微克数（μg /mL ）；V －反应液总体积（mL ）；W －酶的稀释倍数，从原酶溶液稀释到待测酶溶液过程中历次稀释的倍数之积；M －阿魏酸分子量（194.19）；t －反应时间（min ）。1.2.2.2

阿魏酸对硝基苯酯为底物测定阿魏酸酯酶

100μL 10.5mmol /L 酶活（对硝基苯酚UV－Vis 法）

800μL 含有2.5%阿魏酸对硝基苯酯的DMSO 溶液，

（V /V ）Triton X －100的0.1mol /L 磷酸钠缓冲溶液

（pH6.5）和100μL 待测酶液，在55ħ 反应30min 后于410nm 波长下测定阿魏酸对硝基苯酯释放对硝基苯酚的吸光度，计算对硝基苯酚的浓度，进而计算阿魏酸酯酶的酶活。

酶活定义：在反应条件下，每分钟降解1μmol 对硝基苯酚阿魏酸酯所需的酶量为一个酶活单位。1.2.31.2.3.1

酶活测定影响因素的研究

不同底物对酶活的影响用0.1mg /mL 阿魏0.1mg /mL 阿魏酸甲酯、去淀粉麦麸、酸乙酯、

10.5mmol /L 阿魏酸对硝基苯酯作为底物，在55ħ 反应30min ，比较不同底物对酶活的影响。为考察底物

在不加酶的情况下，分别用本身对酶活测定的影响，

UV－Vis法和HPLC 法相同的方法处理去淀粉麦麸，

观察是否有酶活表现。1.2.3.2

温度对酶活影响

在30 70ħ 范围内（间隔

5ħ ），分别以去淀粉麦麸和阿魏酸对硝基苯酯为底

410nm 下测定不同温度下的酶活，物，于320、分析不

大量样品。薄层扫描法也是常用的阿魏酸含量测定

［10］

方法之一，该法快速，但灵敏度不够理想。此外，

［11］

还有高效毛细管电泳法，该方法的特点是简单、高

样品用量小、易自动化操作，但费用也较效快速、

大

［12］

。本研究根据阿魏酸在极性溶液如甲醇、乙醇、

水中于320nm 左右有一最大吸收峰，将提取液直接

或用不同极性溶剂萃取阿魏酸后，利用紫外可见光分光光度计（UV－Vis 法）进行定量测定进而计算阿魏酸酯酶的活性。由于测定结果易受样品中其他组分，如多糖、蛋白质、淀粉等的干扰，造成测定结果的

［12］

准确性、灵敏度降低，因此，本研究还对阳性偏高，

测定阿魏酸酯酶活性可能造成影响的因素进行了研

并与人工合成的对硝基苯酚阿魏酸酯为底物测究，

定酶活的方法及HPLC 测定法进行比较。

1

1.1

GR

材料与方法

材料与仪器

反式阿魏酸标准品

美国Sigma 公司；阿魏酸

Alfa 东京仁成工业株式会社；阿魏酸甲酯

Aesar ；对硝基苯酚、Triton 无水对甲苯磺酸、吡啶、

X－100、1，3－二环己基碳化二二甲基亚砜（DMSO ）、二甲基甲酰胺（DMF ）均为上海天呈AR 亚胺（DCC ）、试剂；氯仿、三氟乙酸、阿魏酸乙酯、无水乙醇、冰醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等均为国产分析纯；麦麸

市售。

［13］

去淀粉麦麸的制备：称取适量麦麸，过50目筛去杂，按1ʒ30 （v /v ）加水，煮沸2h ，冷却至室温，抽滤，

去离子水淘洗4 5 遍，按1ʒ10 （v /v ）加水混匀，加入中温淀粉酶（25u /mL ）和中性蛋白酶（1/1000（w /v ）），调pH6.5，55ħ 水浴搅拌反应4h ，抽滤，漂洗4 6 次，挤

50ħ 下干燥，粉碎，备用。压脱水，

［14］

对硝基苯酚阿魏酸酯的合成：9.04g （0.11mol ）

0.4g 无水对甲苯磺酸、35mL 干燥吡啶对硝基苯酚、

依次加入三口烧瓶，搅拌使之溶解，冷却至0ħ ，加入

DCC 11.22g （溶于10mL DMF ），保持温度0 3ħ ，滴加7.6g 阿魏酸（溶于20mL 干燥吡啶），于室温反应24h ，0 5ħ 放置过夜，加入10mL 冰醋酸搅拌1h ，过20mL DMF 洗涤，滤饼用20mL 干燥吡啶、合并滤滤，

搅拌产生沉淀，过滤，滤饼经液和洗液于50g 碎冰中，

水洗后干燥得粗品。粗品用氯仿重结晶得白色固体

阿魏酸对硝基苯酯。经HPLC 测定，其含量为98.0%。

LC－20ATHPLC 光分光光度计锅

日本岛津；UV1700紫外可见

苏州岛津；HH 型电子数显恒温水浴

江苏金坛市中大仪器；DL－5低速大容量冷冻离心机上海安亭科学仪器；1000μL 移液枪芬兰百得Genex 。

1.2

1.2.1

实验方法

标准曲线制作

阿魏酸标准曲线制作

精密称取0.1000g 反式

1.2.1.1

同温度对酶活的影响。每个稀释倍数重复3次。

1.2.3.3

去淀粉麦麸粒径的影响称取适量麦麸，过

50目筛去杂，再分别进一步粉碎至80目和125目，再按1.1中去淀粉分麦麸的制备方法处理。于320nm 下分别测定50、80和125目不同粒径去淀粉麦麸为底物时的吸光度并计算酶活。

1.2.3.4去淀粉麦麸处理方法的影响酶法处理：按1.1中去淀粉分麦麸的制备方法处理。酸碱法处理：称取适量麦麸，过50目筛去杂，按1ʒ30 （v /v ）加水，煮沸2h ，冷却至室温，抽滤，去离子水淘洗4 5 遍，按1ʒ10 （v /v ）加入2%（w /v ）的NaOH 溶液，室温下处理2h ，抽滤，漂洗至中性，按1ʒ10 （v /v ）加入2%（v /v ）的HCl 溶液，室温下处理2h ，抽滤，漂洗4 6 次，挤压50ħ 下干燥，脱水，粉碎。于320nm 下分别测定酶法和酸碱法处理的去淀粉麦麸为底物时的吸光度并计算酶活。

（n =3），当以阿魏酸乙酯为底物时，测定的吸光度值比灭活后的酶液的吸光度低，因此阿魏酸乙酯不适于在此方法中作为底物使用。

在不加酶的情况下，用测定酶活相同的方法处发现有微弱的酶活表现，分别为理去淀粉麦麸，

（0.0202ʃ 0.0011）U /mL （n =5）（去淀粉麦麸UV －Vis ）和（0.0004ʃ 0.0776）U /mL （n =5）（HPLC ）。其中UV －Vis 法测定的酶活仅为加酶情况下的0.0116%，可忽略不计

。

1.3去淀粉麦麸UV 法的方法学验证

根据分光光度计的准确度范围（吸光度0.2 0.8

3200、6400倍，之间），分别将酶液稀释2400、再测定酶活力。

1.3.1精密度试验

3种稀释度的酶液分别取10mL

放入20mL 试管内，按酶活测定方法测定酶活。每个

图1不同底物测定酶活大小

Fig.1the determination of the ferulic acid esterase enzyme activity 注：1. 去淀粉麦麸；2. 阿魏酸对硝基苯酯；

3. 阿魏酸甲酯；4. 不加酶时去淀粉麦麸为底物。

2.2.2

温度对酶活测定的影响温度对酶活测定的

影响见图2。由图2可见，以去淀粉麦麸和阿魏酸对

稀释度重复取5次。

1.3.2准确性试验3种稀释度的酶液，每个稀释度分别稀释5次，各取稀释液10mL 放入20mL 试管，按酶活测定方法测定酶活。

1.3.3加样回收率试验称取反式阿魏酸0.100g 溶于100mL 无水乙醇，配制成1mg /mL 的阿魏酸溶液，60、70、80、再用无水乙醇配制成浓度分别为50、

90μg /mL 的阿魏酸溶液。将酶液稀释到2400倍，使1mL 不同浓度的酶液与底物反应后，取1mL 反应液、

1mL 无水乙醇混合均匀后，阿魏酸溶液、测定吸光度，计算酶活。

最适温度均为55ħ

。硝基苯酯为底物时，

2

2.1

结果与讨论

线性关系考察

2.1.1

阿魏酸标准曲线以阿魏酸浓度（μg /mL ）为

横坐标，所测定的吸光度值（A ）为纵坐标作标准曲线

（见图1），R 2=计算得回归方程y =0.0868x +0.0003，0.9993。该曲线表明，在阿魏酸浓度为0 15μg /mL 范围内，阿魏酸浓度与吸光度有良好的线性关系。2.1.2对硝基苯酚标准曲线以对硝基苯酚浓度（mmol /L ）为横坐标，所测的吸光度值（A ）为纵坐标

R 2=计算得回归方程y =1.586x－0.068，作标准曲线，

0.998。该曲线表明，阿魏酸浓度为0 0.6mmol /L 范

围内，对硝基苯酚浓度与吸光度有良好的线性关系。

图2温度对酶活测定结果的影响

Fig.2The influence of temperature on the results of enzyme activity determination 注：a. 去淀粉麦麸；b. 对硝基苯酚阿魏酸酯。

酶的催化作用受温度的影响很大，提高温度可以增加酶促反应的速度，但酶的化学本质是蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，当反应速度达到最大值以后，随着温度的升反应速度反而逐渐下降，甚至停止反应。反应高，

速度达到最大值时的温度即为酶作用的最适温度。高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间长短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的

［17］

方向移动。2.2.3

80、去淀粉麦麸粒径对酶活的影响以50、

125目3种不同粒径的去淀粉麦麸作底物时，所测定所测得的吸的酶活平均值基本接近。随粒径减小，

2.2

2.2.1

酶活测定影响因素

底物对酶活的影响

底物对酶活的影响见图

1。测定阿魏酸酯酶酶活所选4种底物中，以去淀粉麦麸作底物时所测酶活最高为（173.652ʃ 0.998）U /mL （n =3），以阿魏酸对硝基苯酯为底物时所测酶活仅次于去淀粉麦麸，为（135.183ʃ 3.531）U /mL （n =3），所得酶活虽然较高，但离散度较大，没有去淀粉麦麸为底物时测定的酶活稳定。以阿魏酸甲酯作底物时，所测定的酶活为（22.933ʃ 3.6112）U /mL

光度值的离散度逐渐增大，说明所溶出的其他物质的干扰作用加大，结果的稳定性变差，因此无需对50目粒径的去淀粉麦麸做进一步的粉碎。

2.2.4去淀粉麦麸处理方法的影响用淀粉酶和蛋蛋白等对白酶处理去淀粉麦麸的目的是去除淀粉、

测定结果的干扰作用。用碱处理后再用酸处理同样可以达到去淀粉和蛋白等杂质的作用。2种不同方法处理后测定酶的结果表明，酶法处理所测得的酶活略高于酸碱法处理的结果，但二者之间的差异不显著（p ＞0.05）。

苯酯UV－Vis 法测定的酶活为HPLC 法测定所得结果的5倍左右，不同方法测定阿魏酸酯酶酶活具有一定的对应关系。其中去淀粉麦麸UV －Vis 法与HPLC 法具有显著的相关性（R 2=0.9997）。Q Yue ［18］

等报道在以阿魏酸甲酯为底物时，分别用UV－Vis 法和HPLC 测得的阿魏酸酯酶酶活结果具有高度相

2

关性（R ＞0.98）同样也是UV－Vis 法的测定值高于HPLC 法。所不同的是Q Yue 等所使用的测定波长为340nm ，且在335nm 下测定的结果不具有连贯性。说明测定波长也有一定的影响。

表2去淀粉麦麸UV 法的准确性（n =5）

2.3

2.3.1

去淀粉麦麸UV－Vis法的方法学研究

测定方法的精密度

3200、分别对稀释2400、

6400倍的酶液进行酶活测定，并计算标准偏差（STDEV ）和相对标准偏差（RSD ）。结果见表1。随酶液稀释倍数的增加，所测定的酶活逐渐降低。各稀释倍数的5个平行样之间的RSD 值小于4%，说明该测定方法具有一定的精密度。

Table 2The accuracy test of DSWB spectrophotometer method （n =5）

样本数12345平均值STDEV RSD （%）

2400300.513320.467314.766313.340321.179317.446.862.16

稀释倍数3200210.062223.365205.882205.501181.177211.208.373.96

6400154.981168.664175.505176.075163.533170.945.983.50

表1

去淀粉麦麸UV 法的精密度（n =5）Table 1The precision test of

稀释倍数3200200.181194.100203.981208.542191.059199.577.123.57

DSWB spectrophotometer method （n =5）

样本数12345平均值STDEV RSD （%）2.3.2

2400348.924349.684325.237334.006319.041335.3812.333.68

6400161.822166.953177.785163.818163.533164.032.141.30

表3去淀粉麦麸UV－Vis法的平均加样回收率（n =5）Table 3The average recovery of the added index test

DSWB spectrophotometer method （n =5）

序号

酶液吸光度（A ）阿魏酸浓度（μg /mL）加阿魏酸吸光度（A ）理论吸光度（A ）实测吸光度（A ）回收率（%）平均回收率（%）相对标准偏差RSD （%）

150

260

370

480

590

0.5970.5970.5970.5970.5970.1450.1740.2030.2320.2610.7420.7710.8000.8290.8580.7420.7700.8010.8270.852100.0399.91100.1899.8199.40

99.860.65

测定方法的准确性按一定稀释倍数对待测

酶液分别稀释5次，再测定不同稀释倍数酶液的酶并计算标准偏差（STDEV ）和相对标准偏差活，

（RSD ）。结果见表2。结果表明，各个稀释酶液的样品所测定的酶活之间的RSD 值小于4%，说明该方法具有一定的准确性。

3结论

2.3.3

样品稀释2400倍后测定的

平均加样回收率结果见表3。5个样品的平均加样

平均加样回收率

分光光度法测定阿魏酸酯酶酶活是较有应用前

主要是利用游离阿魏酸或其酯类衍景的分析方法，

［19－20］

。生物具有不同吸收光谱的特征建立的分析方法

该方法需要检测的吸光度变化范围很小，技术上还

RSD 值为0.65%，回收率为99.86%，说明该方法具有

较高的可信度。

2.4不同酶活测定方法测定酶活的比较

将待测酶液稀释2400倍后，分别采用HPLC 法和不同底物的UV－Vis法对同一样品进行测定，所得结果见表4。去淀粉麦麸UV－Vis 法测定的酶活为HPLC 法测定所得结果的7倍左右，以阿魏酸对硝基

没有被多数人所采纳。近年发展起来一种不成熟，

较好的方法是通过测定人工合成的底物4－硝基苯酚阿魏酸酯（4－NPF）释放出的4－硝基苯酚的量来计算

［21］

阿魏酸酯酶的活性。该方法简单易行，底物也较但合成该底物的物质成本较高且毒性较容易获得，

Table 4测定方法

表4UV 法与HPLC 法测定的酶活比较（n =5）

The experiment results comparison between the UV－Vismethod and the HPLC method （n =5）

2400269.612ʃ 0.86734.949ʃ 2.960185.176ʃ 3.033

不同稀释倍数下的酶活（U /mL）

3200

168.168ʃ 3.99826.448ʃ 2.953132.269ʃ 1.027

6400173.134ʃ 1.09623.670ʃ 0.917114.905ʃ 2.030

去淀粉麦麸UV－Vis法

HPLC 法阿魏酸对硝基苯酯UV－Vis法

大，缓冲液中的溶解度低，稳定性较差。

本研究采用紫外分光光度计以去淀粉麦麸为底

进而计算阿魏酸酯物直接测定游离阿魏酸的含量，

酶活性的方法是在前人方法的基础上加以改良得

［22］

来。本研究的结果表明，在阿魏酸酯酶对底物作用之后，溶液的吸光度有较大的变化，很容易被测定出来，且方法学验证结果表明，分光光度法具有一定的准确性和精密度，其RSD 都在4%以内，尤其是具

RSD 0.65%，有很好的加样回收率99.86%，说明紫外分光光度法用于测定阿魏酸酯酶活性具有一定的可

行性。

去淀粉麦麸UV 法测定阿魏酸酯酶活性所得酶活测定结果高于HPLC 法测定的结果，但与HPLC 法可用于大量样品酶活所得结果具有很好的相关性，的初步测定。

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檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾

(上接第279页)

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DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.13.013

阿魏酸酯酶活性的分光光度法测定

及影响因素研究

刘元元，徐泽平

(1. 山东轻工业学院，山东济南250353;

2. 山东京博控股股份有限公司技术中心，山东滨州256500)

要：分别以去淀粉麦麸和对硝基苯酚阿魏酸酯为底物，研究了紫外－可见光分光光度法测定阿魏酸酯酶酶活的方

法，通过测定阿魏酸的释放量和对硝基苯酚的释放量来计算阿魏酸酯酶的活力，并研究了酶活测定的影响因素。同摘

RSD 值为0.65%。并将此方法对去淀粉麦麸分光光度法测定酶活进行了方法学验证，得到平均回收率达99.86%，时，

与对硝基苯酚阿魏酸酯分光光度计法及HPLC 法测定阿魏酸酯酶酶活进行了比较，结果表明去淀粉麦麸分光光度计法测定阿魏酸酯酶酶活具有稳定性好，相对偏差较小的优点且简便可行。关键词：阿魏酸酯酶，酶活测定，去淀粉麦麸，对硝基苯酚阿魏酸酯，分光光度法，影响因素

1

1，2，*

Study on the determination of ferulic acid esterase enzyme activity

with spectrophotometer method and its impact factors

2，*

LIU Yuan －yuan 1，XU Ze －ping 1，

(1.Shandong Polytechnic University ，Jinan 250353，China ;

2.Shandong chambroad Co. ，Ltd. ，Technology Center ，Binzhou 256500，China )

Abstract :The UV －Vis spectrophotometer methods to determination the ferulic acid esterase enzyme activity was studied using destarchedwheat bran (DSWB ) and 4－nitrophenyl ferulate as the substrates respectively . The enzyme activity was calculated by measuring the quantities of ferulic acid released and the quantities of p －nitrophenol released . The factors influencing the enzyme activity determination were also investigated . The method for the determination the ferulic acid esterase enzyme activity using DWB substrate was validated with the average recovery of 99.86%and RSD was 0.65%. It was compared with the method of 4－nitrophenyl ferulate spectrophotometer and the method of HPLC . The results showed that the DSWB spectrophotometer method had advantages of a good stability ，smaller relative deviation ，simple and feasible .

Key words :Ferulic acid esterase ; enzyme activity determination ; Destarchedwheat bran (DSWB ) ; 4－Nitrophenyl ferulate ; Spectrophotometer method ; impact factor 中图分类号：TS207.3

文献标识码：B

文章编号：1002－0306（2013）13－0284－05

糖或羟基肉桂酸之间的酯健。当其作用于天然纤维

素材料时，可以水解阿魏酸与半纤维素之间的酯键，从而破坏细胞壁的骨架结构，使得纤维素原料结构

［4］

疏松，这样各种胞壁降解酶类更容易接近底物而加阿魏酸酯酶可用于阿魏酸的速降解细胞壁。因此，生产，纸浆和纸的加工及促进饲料的吸收利用。这些酶不仅有能力解构植物生物量也能合成结构新颖

［5］

并可用于保健和工业领域的生物活性成分。阿魏酸酯酶活性的检测主要是通过检测阿魏酸的释放量

［1］

来确定酶活力，也有利用人工合成的底物，根据与

阿魏酸酯酶（E.C.3.1.1.73），又称肉桂酸酯酶或肉桂酸水解酶，是一种胞外羧酸酯酶括阿魏酸的一些衍生物）酸分离出来

［3］

［2］

［1］

，其催化的主

阿魏酸酯+H 2O =阿魏酸+多糖（包要反应是：多糖

。它能水解阿魏酸甲酯、

低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏

。植物细胞壁的降解过程中，阿魏酸酯

酶主要降解细胞壁多糖或果胶中的阿拉伯糖或半乳

收稿日期：2012－12－11

*通讯联系人

作者简介：刘元元(1987－) ，女，硕士研究生，研究方向:发酵工程。

檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾

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阿魏酸成酯物质固定的摩尔比，测定与其结合的物

［6－7］

。质的释放量来进行阿魏酸定量进而计算出酶活

［8］

GC 法［9］，阿魏酸的含量测定多采用HPLC 法、结果

准确、精密度高，但费用较高、费时，不适合快速分析

阿魏酸，溶于适量乙醇，定容至100mL ，得1.00mg /mL 的

反式阿魏酸标准溶液。从阿魏酸标准溶液中分别取0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mL 溶液依次用乙醇定容至100mL ，7、9、11、13μg /mL 的反式阿得浓度依次为5、魏酸标准溶液。以乙醇为空白，在320nm 下测定溶液的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，以反式阿魏酸的浓度（μg /mL ）为横坐标制作标准曲线，并计算

［15］

线性回归方程。1.2.1.2

对硝基苯酚标准曲线制作以DMSO ：2.5%

Triton X－100=1ʒ9 （v /v ）的混合液为溶剂，将对硝基

0.3、0.4、0.5、0.6mmol /L 浓度的溶液。苯酚配制成0.2、

混匀后于410nm 波长处测定吸光度，分别以对硝基苯酚浓度和所测得的吸光度为横坐标和纵坐标制作

［16］

标准曲线。1.2.21.2.2.1

酶活测定

去淀粉麦麸为底物测定阿魏酸酯酶酶活（去

淀粉麦麸UV －Vis 法）取待测酶液10mL 于试管放入55ħ 水浴中预热5min ，加入0.33g 底物，摇中，

恒温反应15min ，边反应边混匀，沸水灭酶，终止匀，

20min ），反应。反应液离心（4000r /min ，取上清液稀

取该溶液1mL 加入4mL 乙醇，摇匀，释至适当倍数，

20min ），离心（4000r /min ，于320nm 下测定吸光度并计算反式阿魏酸产量，按式（1）计算阿魏酸酯酶的

活力。

酶活定义：在反应条件下，每分钟降解底物生成1μmoL 阿魏酸所需要的酶量为一个酶活单位。酶活（μmol /mL ）=（m ˑ V ˑ W ）/（M ˑ t ）式（1）式中：m －从曲线上查得的标准阿魏酸的微克数（μg /mL ）；V －反应液总体积（mL ）；W －酶的稀释倍数，从原酶溶液稀释到待测酶溶液过程中历次稀释的倍数之积；M －阿魏酸分子量（194.19）；t －反应时间（min ）。1.2.2.2

阿魏酸对硝基苯酯为底物测定阿魏酸酯酶

100μL 10.5mmol /L 酶活（对硝基苯酚UV－Vis 法）

800μL 含有2.5%阿魏酸对硝基苯酯的DMSO 溶液，

（V /V ）Triton X －100的0.1mol /L 磷酸钠缓冲溶液

（pH6.5）和100μL 待测酶液，在55ħ 反应30min 后于410nm 波长下测定阿魏酸对硝基苯酯释放对硝基苯酚的吸光度，计算对硝基苯酚的浓度，进而计算阿魏酸酯酶的酶活。

酶活定义：在反应条件下，每分钟降解1μmol 对硝基苯酚阿魏酸酯所需的酶量为一个酶活单位。1.2.31.2.3.1

酶活测定影响因素的研究

不同底物对酶活的影响用0.1mg /mL 阿魏0.1mg /mL 阿魏酸甲酯、去淀粉麦麸、酸乙酯、

10.5mmol /L 阿魏酸对硝基苯酯作为底物，在55ħ 反应30min ，比较不同底物对酶活的影响。为考察底物

在不加酶的情况下，分别用本身对酶活测定的影响，

UV－Vis法和HPLC 法相同的方法处理去淀粉麦麸，

观察是否有酶活表现。1.2.3.2

温度对酶活影响

在30 70ħ 范围内（间隔

5ħ ），分别以去淀粉麦麸和阿魏酸对硝基苯酯为底

410nm 下测定不同温度下的酶活，物，于320、分析不

大量样品。薄层扫描法也是常用的阿魏酸含量测定

［10］

方法之一，该法快速，但灵敏度不够理想。此外，

［11］

还有高效毛细管电泳法，该方法的特点是简单、高

样品用量小、易自动化操作，但费用也较效快速、

大

［12］

。本研究根据阿魏酸在极性溶液如甲醇、乙醇、

水中于320nm 左右有一最大吸收峰，将提取液直接

或用不同极性溶剂萃取阿魏酸后，利用紫外可见光分光光度计（UV－Vis 法）进行定量测定进而计算阿魏酸酯酶的活性。由于测定结果易受样品中其他组分，如多糖、蛋白质、淀粉等的干扰，造成测定结果的

［12］

准确性、灵敏度降低，因此，本研究还对阳性偏高，

测定阿魏酸酯酶活性可能造成影响的因素进行了研

并与人工合成的对硝基苯酚阿魏酸酯为底物测究，

定酶活的方法及HPLC 测定法进行比较。

1

1.1

GR

材料与方法

材料与仪器

反式阿魏酸标准品

美国Sigma 公司；阿魏酸

Alfa 东京仁成工业株式会社；阿魏酸甲酯

Aesar ；对硝基苯酚、Triton 无水对甲苯磺酸、吡啶、

X－100、1，3－二环己基碳化二二甲基亚砜（DMSO ）、二甲基甲酰胺（DMF ）均为上海天呈AR 亚胺（DCC ）、试剂；氯仿、三氟乙酸、阿魏酸乙酯、无水乙醇、冰醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等均为国产分析纯；麦麸

市售。

［13］

去淀粉麦麸的制备：称取适量麦麸，过50目筛去杂，按1ʒ30 （v /v ）加水，煮沸2h ，冷却至室温，抽滤，

去离子水淘洗4 5 遍，按1ʒ10 （v /v ）加水混匀，加入中温淀粉酶（25u /mL ）和中性蛋白酶（1/1000（w /v ）），调pH6.5，55ħ 水浴搅拌反应4h ，抽滤，漂洗4 6 次，挤

50ħ 下干燥，粉碎，备用。压脱水，

［14］

对硝基苯酚阿魏酸酯的合成：9.04g （0.11mol ）

0.4g 无水对甲苯磺酸、35mL 干燥吡啶对硝基苯酚、

依次加入三口烧瓶，搅拌使之溶解，冷却至0ħ ，加入

DCC 11.22g （溶于10mL DMF ），保持温度0 3ħ ，滴加7.6g 阿魏酸（溶于20mL 干燥吡啶），于室温反应24h ，0 5ħ 放置过夜，加入10mL 冰醋酸搅拌1h ，过20mL DMF 洗涤，滤饼用20mL 干燥吡啶、合并滤滤，

搅拌产生沉淀，过滤，滤饼经液和洗液于50g 碎冰中，

水洗后干燥得粗品。粗品用氯仿重结晶得白色固体

阿魏酸对硝基苯酯。经HPLC 测定，其含量为98.0%。

LC－20ATHPLC 光分光光度计锅

日本岛津；UV1700紫外可见

苏州岛津；HH 型电子数显恒温水浴

江苏金坛市中大仪器；DL－5低速大容量冷冻离心机上海安亭科学仪器；1000μL 移液枪芬兰百得Genex 。

1.2

1.2.1

实验方法

标准曲线制作

阿魏酸标准曲线制作

精密称取0.1000g 反式

1.2.1.1

同温度对酶活的影响。每个稀释倍数重复3次。

1.2.3.3

去淀粉麦麸粒径的影响称取适量麦麸，过

50目筛去杂，再分别进一步粉碎至80目和125目，再按1.1中去淀粉分麦麸的制备方法处理。于320nm 下分别测定50、80和125目不同粒径去淀粉麦麸为底物时的吸光度并计算酶活。

1.2.3.4去淀粉麦麸处理方法的影响酶法处理：按1.1中去淀粉分麦麸的制备方法处理。酸碱法处理：称取适量麦麸，过50目筛去杂，按1ʒ30 （v /v ）加水，煮沸2h ，冷却至室温，抽滤，去离子水淘洗4 5 遍，按1ʒ10 （v /v ）加入2%（w /v ）的NaOH 溶液，室温下处理2h ，抽滤，漂洗至中性，按1ʒ10 （v /v ）加入2%（v /v ）的HCl 溶液，室温下处理2h ，抽滤，漂洗4 6 次，挤压50ħ 下干燥，脱水，粉碎。于320nm 下分别测定酶法和酸碱法处理的去淀粉麦麸为底物时的吸光度并计算酶活。

（n =3），当以阿魏酸乙酯为底物时，测定的吸光度值比灭活后的酶液的吸光度低，因此阿魏酸乙酯不适于在此方法中作为底物使用。

在不加酶的情况下，用测定酶活相同的方法处发现有微弱的酶活表现，分别为理去淀粉麦麸，

（0.0202ʃ 0.0011）U /mL （n =5）（去淀粉麦麸UV －Vis ）和（0.0004ʃ 0.0776）U /mL （n =5）（HPLC ）。其中UV －Vis 法测定的酶活仅为加酶情况下的0.0116%，可忽略不计

。

1.3去淀粉麦麸UV 法的方法学验证

根据分光光度计的准确度范围（吸光度0.2 0.8

3200、6400倍，之间），分别将酶液稀释2400、再测定酶活力。

1.3.1精密度试验

3种稀释度的酶液分别取10mL

放入20mL 试管内，按酶活测定方法测定酶活。每个

图1不同底物测定酶活大小

Fig.1the determination of the ferulic acid esterase enzyme activity 注：1. 去淀粉麦麸；2. 阿魏酸对硝基苯酯；

3. 阿魏酸甲酯；4. 不加酶时去淀粉麦麸为底物。

2.2.2

温度对酶活测定的影响温度对酶活测定的

影响见图2。由图2可见，以去淀粉麦麸和阿魏酸对

稀释度重复取5次。

1.3.2准确性试验3种稀释度的酶液，每个稀释度分别稀释5次，各取稀释液10mL 放入20mL 试管，按酶活测定方法测定酶活。

1.3.3加样回收率试验称取反式阿魏酸0.100g 溶于100mL 无水乙醇，配制成1mg /mL 的阿魏酸溶液，60、70、80、再用无水乙醇配制成浓度分别为50、

90μg /mL 的阿魏酸溶液。将酶液稀释到2400倍，使1mL 不同浓度的酶液与底物反应后，取1mL 反应液、

1mL 无水乙醇混合均匀后，阿魏酸溶液、测定吸光度，计算酶活。

最适温度均为55ħ

。硝基苯酯为底物时，

2

2.1

结果与讨论

线性关系考察

2.1.1

阿魏酸标准曲线以阿魏酸浓度（μg /mL ）为

横坐标，所测定的吸光度值（A ）为纵坐标作标准曲线

（见图1），R 2=计算得回归方程y =0.0868x +0.0003，0.9993。该曲线表明，在阿魏酸浓度为0 15μg /mL 范围内，阿魏酸浓度与吸光度有良好的线性关系。2.1.2对硝基苯酚标准曲线以对硝基苯酚浓度（mmol /L ）为横坐标，所测的吸光度值（A ）为纵坐标

R 2=计算得回归方程y =1.586x－0.068，作标准曲线，

0.998。该曲线表明，阿魏酸浓度为0 0.6mmol /L 范

围内，对硝基苯酚浓度与吸光度有良好的线性关系。

图2温度对酶活测定结果的影响

Fig.2The influence of temperature on the results of enzyme activity determination 注：a. 去淀粉麦麸；b. 对硝基苯酚阿魏酸酯。

酶的催化作用受温度的影响很大，提高温度可以增加酶促反应的速度，但酶的化学本质是蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，当反应速度达到最大值以后，随着温度的升反应速度反而逐渐下降，甚至停止反应。反应高，

速度达到最大值时的温度即为酶作用的最适温度。高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间长短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的

［17］

方向移动。2.2.3

80、去淀粉麦麸粒径对酶活的影响以50、

125目3种不同粒径的去淀粉麦麸作底物时，所测定所测得的吸的酶活平均值基本接近。随粒径减小，

2.2

2.2.1

酶活测定影响因素

底物对酶活的影响

底物对酶活的影响见图

1。测定阿魏酸酯酶酶活所选4种底物中，以去淀粉麦麸作底物时所测酶活最高为（173.652ʃ 0.998）U /mL （n =3），以阿魏酸对硝基苯酯为底物时所测酶活仅次于去淀粉麦麸，为（135.183ʃ 3.531）U /mL （n =3），所得酶活虽然较高，但离散度较大，没有去淀粉麦麸为底物时测定的酶活稳定。以阿魏酸甲酯作底物时，所测定的酶活为（22.933ʃ 3.6112）U /mL

光度值的离散度逐渐增大，说明所溶出的其他物质的干扰作用加大，结果的稳定性变差，因此无需对50目粒径的去淀粉麦麸做进一步的粉碎。

2.2.4去淀粉麦麸处理方法的影响用淀粉酶和蛋蛋白等对白酶处理去淀粉麦麸的目的是去除淀粉、

测定结果的干扰作用。用碱处理后再用酸处理同样可以达到去淀粉和蛋白等杂质的作用。2种不同方法处理后测定酶的结果表明，酶法处理所测得的酶活略高于酸碱法处理的结果，但二者之间的差异不显著（p ＞0.05）。

苯酯UV－Vis 法测定的酶活为HPLC 法测定所得结果的5倍左右，不同方法测定阿魏酸酯酶酶活具有一定的对应关系。其中去淀粉麦麸UV －Vis 法与HPLC 法具有显著的相关性（R 2=0.9997）。Q Yue ［18］

等报道在以阿魏酸甲酯为底物时，分别用UV－Vis 法和HPLC 测得的阿魏酸酯酶酶活结果具有高度相

2

关性（R ＞0.98）同样也是UV－Vis 法的测定值高于HPLC 法。所不同的是Q Yue 等所使用的测定波长为340nm ，且在335nm 下测定的结果不具有连贯性。说明测定波长也有一定的影响。

表2去淀粉麦麸UV 法的准确性（n =5）

2.3

2.3.1

去淀粉麦麸UV－Vis法的方法学研究

测定方法的精密度

3200、分别对稀释2400、

6400倍的酶液进行酶活测定，并计算标准偏差（STDEV ）和相对标准偏差（RSD ）。结果见表1。随酶液稀释倍数的增加，所测定的酶活逐渐降低。各稀释倍数的5个平行样之间的RSD 值小于4%，说明该测定方法具有一定的精密度。

Table 2The accuracy test of DSWB spectrophotometer method （n =5）

样本数12345平均值STDEV RSD （%）

2400300.513320.467314.766313.340321.179317.446.862.16

稀释倍数3200210.062223.365205.882205.501181.177211.208.373.96

6400154.981168.664175.505176.075163.533170.945.983.50

表1

去淀粉麦麸UV 法的精密度（n =5）Table 1The precision test of

稀释倍数3200200.181194.100203.981208.542191.059199.577.123.57

DSWB spectrophotometer method （n =5）

样本数12345平均值STDEV RSD （%）2.3.2

2400348.924349.684325.237334.006319.041335.3812.333.68

6400161.822166.953177.785163.818163.533164.032.141.30

表3去淀粉麦麸UV－Vis法的平均加样回收率（n =5）Table 3The average recovery of the added index test

DSWB spectrophotometer method （n =5）

序号

酶液吸光度（A ）阿魏酸浓度（μg /mL）加阿魏酸吸光度（A ）理论吸光度（A ）实测吸光度（A ）回收率（%）平均回收率（%）相对标准偏差RSD （%）

150

260

370

480

590

0.5970.5970.5970.5970.5970.1450.1740.2030.2320.2610.7420.7710.8000.8290.8580.7420.7700.8010.8270.852100.0399.91100.1899.8199.40

99.860.65

测定方法的准确性按一定稀释倍数对待测

酶液分别稀释5次，再测定不同稀释倍数酶液的酶并计算标准偏差（STDEV ）和相对标准偏差活，

（RSD ）。结果见表2。结果表明，各个稀释酶液的样品所测定的酶活之间的RSD 值小于4%，说明该方法具有一定的准确性。

3结论

2.3.3

样品稀释2400倍后测定的

平均加样回收率结果见表3。5个样品的平均加样

平均加样回收率

分光光度法测定阿魏酸酯酶酶活是较有应用前

主要是利用游离阿魏酸或其酯类衍景的分析方法，

［19－20］

。生物具有不同吸收光谱的特征建立的分析方法

该方法需要检测的吸光度变化范围很小，技术上还

RSD 值为0.65%，回收率为99.86%，说明该方法具有

较高的可信度。

2.4不同酶活测定方法测定酶活的比较

将待测酶液稀释2400倍后，分别采用HPLC 法和不同底物的UV－Vis法对同一样品进行测定，所得结果见表4。去淀粉麦麸UV－Vis 法测定的酶活为HPLC 法测定所得结果的7倍左右，以阿魏酸对硝基

没有被多数人所采纳。近年发展起来一种不成熟，

较好的方法是通过测定人工合成的底物4－硝基苯酚阿魏酸酯（4－NPF）释放出的4－硝基苯酚的量来计算

［21］

阿魏酸酯酶的活性。该方法简单易行，底物也较但合成该底物的物质成本较高且毒性较容易获得，

Table 4测定方法

表4UV 法与HPLC 法测定的酶活比较（n =5）

The experiment results comparison between the UV－Vismethod and the HPLC method （n =5）

2400269.612ʃ 0.86734.949ʃ 2.960185.176ʃ 3.033

不同稀释倍数下的酶活（U /mL）

3200

168.168ʃ 3.99826.448ʃ 2.953132.269ʃ 1.027

6400173.134ʃ 1.09623.670ʃ 0.917114.905ʃ 2.030

去淀粉麦麸UV－Vis法

HPLC 法阿魏酸对硝基苯酯UV－Vis法

大，缓冲液中的溶解度低，稳定性较差。

本研究采用紫外分光光度计以去淀粉麦麸为底

进而计算阿魏酸酯物直接测定游离阿魏酸的含量，

酶活性的方法是在前人方法的基础上加以改良得

［22］

来。本研究的结果表明，在阿魏酸酯酶对底物作用之后，溶液的吸光度有较大的变化，很容易被测定出来，且方法学验证结果表明，分光光度法具有一定的准确性和精密度，其RSD 都在4%以内，尤其是具

RSD 0.65%，有很好的加样回收率99.86%，说明紫外分光光度法用于测定阿魏酸酯酶活性具有一定的可

行性。

去淀粉麦麸UV 法测定阿魏酸酯酶活性所得酶活测定结果高于HPLC 法测定的结果，但与HPLC 法可用于大量样品酶活所得结果具有很好的相关性，的初步测定。

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