读《中国传统发酵食品中ENTEROLSIN 及 HELVETICIN
J 基因多样性及抑菌活性研究》笔记
一．主题
本研究主要通过使用不依赖于培养的宏基因组方法对六种中国传统发酵食品中的 ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J基因的多样性进行研究，在 NCBI 数据库中检索已知的 ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J 氨基酸序列，用 CLUSTALW 进行氨基酸序列比对找出保守区域，然后用 CODEHOP 进行引物设计，用 PCR 的方法在六种发酵食品样品中扩增基因 ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J，得到的PCR 产物纯化后连接到 p GM-T 载体上构建成克隆文库并进行系统发育分析。通过 Genome walking 的方法获得挑选基因的全基因序列，通过大肠杆菌表达体系重组表达的细菌素进行重组表达，并对表达产物进行活性检验，最终建立起细菌素重组表达的完整通路。
二．方法要点
1.宏基因组学方法
宏基因组学：是一种新的微生物研究方法，它以自然环境中全部微生物群体基因组为研究对象，通过基因筛选和序列分析等手段，来
研究环境微生物的功能活性、多样性、种群结构、进化关系，以及它们与环境之间的关系。
2.氨基酸序列比对方法
CLUSTALW：是一种渐进的多序列对比方法，先将多个序列两两比对构建距离矩阵，反应序列之间两两关系；然后根据距离矩阵计算产生系统进化指导树，对关系密切的序列进行加权；然后从最紧密的两条序列开始，逐步引入临近的序列并不断重新构建比对，直到所有序列都被加入为止。
3.大肠杆菌表达系统选择
重组细菌素 DIVEREIN V41 在大肠杆菌(Origami)和AD494(DE3)表达系统中成功表达，且具有较高的活性及纯化产量。
4.引物设计方法
根据 NCBI上已经公布的 ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J 氨基酸序列进行简并引物的设计，通过 ClustalW2 对序列进行比对分析，然后将比对结果提交到 CODEHOP服务器进行运算，检索出多条简并引物。
5.系统发育树建方法
根据测序结果，应用CLUSTAL W2 对序列进行多序列比对，并采用 MEGA (version 4.0)的 neighbor-joining 算法，分别绘制 ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J 的系统发育树。此法对于16SrDNA序列的进化树建具有更准确速度更快的优点。
三．结果
1.用宏基因组的方法以及用 ICODEHOP 新设计的简并引物，研究ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J在中国传统发酵食品中的多样性，并用 N-J 法构建了ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J 基因的系统发育树。
2.用 Genome walking 方法获得豆腐样品中 DFE5 的全基因序列，乳扇中的 RS9的全基因序列，羊乳饼中的 GCE11 的全基因序列， 酒酿中的 RW21 的全基因序列。
3.成功构建一下四种工程菌 BL21(DE3)(pET28a-DFE5)，BL21(DE3)(pET28a-RS9)，BL21(DE3)(pET28a-GCE11)， BL21(DE3)(pET28a-RW21)。
4.通过使用诱导剂 IPTG 诱导表达载体 pET28a-DFE5，pET28a-RS9pET28a-GCE11，pET28a-RW21 在大肠杆菌 BL21(DE3)中表达。
5.采用三层平板法实验对细菌素BL21(DE3)(pET28a-DFE5)，BL21(DE3)(pET28a-RS9)，BL21(DE3)，(pET28a-GCE11)，BL21(DE3)(pET28a-RW21)的抑菌活性及抑菌谱进行了鉴定重组。
四．阅读收获
1. 宏基因组技术的内容
1.1 DNA的提取
原位裂解法：用机械、超声等手段将样品预处理，直接置于裂解缓冲液中提取纯化。
特点：操作简单，提取率高，但切下的DNA片段比较小，多是平端不利于建库。
异位裂解法：是用物理方法将微生物细胞从样品中分离出来，再用密度梯度离心、低熔点琼脂糖裂解DNA等的方法提取样品的DNA。 特点:能提取到高纯度的大片段DNA，但操作繁琐，成本较高，会丢失一些DNA，所以DNA产率比第一种方法低。
1.2 构建宏基因组文库
常用的DNA克隆的载体：质粒、黏粒和细菌人工染色体等。 常用的宿主是：大肠杆菌，恶臭假单胞杆菌。不同研究目标应该选择不同的宿主菌株，因为不同的微生物种类会产生不同的活性物 质。
1.3 宏基因组文库的筛选
方法一：基于目标克隆的代谢活性的功能驱动筛选，该方法筛选工作量大，效率低；
方法二：基于不同物质的不同结构有不同吸收峰的化合物结构筛选，此方法工作量大，费用高；
方法三：基于不同功能的基因序列来筛选具有目标序列克隆子的序列驱动筛选，该方法无法筛选基因文库中的未知基因；
方法四：基于底物诱导基因表达的底物诱导筛选，该方法对筛选抗体基因和生物活性物质十分有效。
五．分析与思考
1.本研究通过使用宏基因组的方法对中国传统发酵食品中的
ENTEROLSIN 和 HELVETICIN 基因多样性进行研究富有创新性。宏基因组技术是将样品中的总 DNA 提取出来后，利用适宜的载体克隆到宿主细胞中以构建成宏基因组文库，再筛选出新的活性物质，整个过程不依赖于微生物纯培养。同样，筛选细菌素时，利用宏基因组技术直接将样品中的总DNA 提取出来后，通过简并引物进行 PCR 扩增，再利用适宜的载体克隆到宿主细胞中以构建成宏基因组文库，通过序列分析来寻找新的活性物质，并对新的细菌素进行基因重组表达。此方法的应用大大提高了细菌素筛选的效率及基因表达稳定性。建立的从细菌素基因获得到活性蛋白表达的研究通路，为应用分子生物学、基因组筛选到细菌素基因之后获得活性蛋白并进一步进行活性鉴定打下了坚实基础。
2.结果不仅展示了在 PCR 方法的基础上，从发酵食品样品中获得新的细菌素序列的可行性，同时也证实了从中国传统发酵食品中挖掘新细菌素的潜能。
3.读文献后的启发
经过对此文的拜读，我了解到：虽然宏基因组技术的应用还不是特别成熟广泛，但它不仅丰富和拓展了我对微生物世界多样性的认识，更重要的是改变了我思考问题的思路和见解。
由于宏基因组学技术是从自然界直接获取遗传信息，以环境样品中的基因组DNA为靶目标，获得任何序列或功能的基因，同时可以发现新物种。这样一来，我就可以跳出传统培养微生物发酵样品的模式，而是，把已发酵产品中基因组DNA作为靶目标，获得能够发酵蛋白质
的基因。
利用宏基因组技术可以开发天然产物新资源，从环境微生物的总基因组着手，开发环境中的天然产物新资源，克服传统分离培养的局限性，那么，我就可以最大限度地开发利用不可培养微生物的代谢产物。如:酶，维生素，功能性肽等用于更深一步的研究。
还有就是，之前我在考虑自己课题所用菌的时候，只是单单局限在一种菌枯草芽孢杆菌，读过此论文之后，我联想到读过的一篇文献中出现过“铜绿假单胞菌产蛋白酶能力明显强于枯草芽孢杆菌，前者对照样的蛋白酶产量是后者对照样蛋白酶产量的6倍多。”我之前之所以没有选铜绿假单胞菌，是因为铜绿假单胞杆菌是条件致病菌。现在我改变了自己的想法，想通过基因技术改造并筛选出非致病且高产蛋白酶的菌株，或者利用基因组的方法提取产蛋白酶基因进而获得活性蛋白酶。现在我面临的问题就是此想法的可行性，我相信有问题才会有答案，至于此想法的可行性问题急需要进一步认真摸索研究。
注：记录本笔记前也简单了解了以下文献：
[1]张彩凤，王婷婷等.宏基因组学技术及其应用概述[J].生物学教学2013,(3).
[2] Yu n- Zhu X ia o & Si-Yang Zhao. Food Omics Validation: Towards Understanding Key Features for Gut Microbiota, Probiotics and Human Health[J].Food Anal Methods 2014,(4).
[3]Real-Time PCR Quantification of Protease-Producing Bacteria in Traditional Chinese Fish Sauce[J].Food Anal Methods 2014.
[4]高 岳．应用宏基因组技术从微生物中获得活性物质的研究进展江苏农业科学[J].2014,42(1):5-8.
读《中国传统发酵食品中ENTEROLSIN 及 HELVETICIN
J 基因多样性及抑菌活性研究》笔记
一．主题
本研究主要通过使用不依赖于培养的宏基因组方法对六种中国传统发酵食品中的 ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J基因的多样性进行研究，在 NCBI 数据库中检索已知的 ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J 氨基酸序列，用 CLUSTALW 进行氨基酸序列比对找出保守区域，然后用 CODEHOP 进行引物设计，用 PCR 的方法在六种发酵食品样品中扩增基因 ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J，得到的PCR 产物纯化后连接到 p GM-T 载体上构建成克隆文库并进行系统发育分析。通过 Genome walking 的方法获得挑选基因的全基因序列，通过大肠杆菌表达体系重组表达的细菌素进行重组表达，并对表达产物进行活性检验，最终建立起细菌素重组表达的完整通路。
二．方法要点
1.宏基因组学方法
宏基因组学：是一种新的微生物研究方法，它以自然环境中全部微生物群体基因组为研究对象，通过基因筛选和序列分析等手段，来
研究环境微生物的功能活性、多样性、种群结构、进化关系，以及它们与环境之间的关系。
2.氨基酸序列比对方法
CLUSTALW：是一种渐进的多序列对比方法，先将多个序列两两比对构建距离矩阵，反应序列之间两两关系；然后根据距离矩阵计算产生系统进化指导树，对关系密切的序列进行加权；然后从最紧密的两条序列开始，逐步引入临近的序列并不断重新构建比对，直到所有序列都被加入为止。
3.大肠杆菌表达系统选择
重组细菌素 DIVEREIN V41 在大肠杆菌(Origami)和AD494(DE3)表达系统中成功表达，且具有较高的活性及纯化产量。
4.引物设计方法
根据 NCBI上已经公布的 ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J 氨基酸序列进行简并引物的设计，通过 ClustalW2 对序列进行比对分析，然后将比对结果提交到 CODEHOP服务器进行运算，检索出多条简并引物。
5.系统发育树建方法
根据测序结果，应用CLUSTAL W2 对序列进行多序列比对，并采用 MEGA (version 4.0)的 neighbor-joining 算法，分别绘制 ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J 的系统发育树。此法对于16SrDNA序列的进化树建具有更准确速度更快的优点。
三．结果
1.用宏基因组的方法以及用 ICODEHOP 新设计的简并引物，研究ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J在中国传统发酵食品中的多样性，并用 N-J 法构建了ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J 基因的系统发育树。
2.用 Genome walking 方法获得豆腐样品中 DFE5 的全基因序列，乳扇中的 RS9的全基因序列，羊乳饼中的 GCE11 的全基因序列， 酒酿中的 RW21 的全基因序列。
3.成功构建一下四种工程菌 BL21(DE3)(pET28a-DFE5)，BL21(DE3)(pET28a-RS9)，BL21(DE3)(pET28a-GCE11)， BL21(DE3)(pET28a-RW21)。
4.通过使用诱导剂 IPTG 诱导表达载体 pET28a-DFE5，pET28a-RS9pET28a-GCE11，pET28a-RW21 在大肠杆菌 BL21(DE3)中表达。
5.采用三层平板法实验对细菌素BL21(DE3)(pET28a-DFE5)，BL21(DE3)(pET28a-RS9)，BL21(DE3)，(pET28a-GCE11)，BL21(DE3)(pET28a-RW21)的抑菌活性及抑菌谱进行了鉴定重组。
四．阅读收获
1. 宏基因组技术的内容
1.1 DNA的提取
原位裂解法：用机械、超声等手段将样品预处理，直接置于裂解缓冲液中提取纯化。
特点：操作简单，提取率高，但切下的DNA片段比较小，多是平端不利于建库。
异位裂解法：是用物理方法将微生物细胞从样品中分离出来，再用密度梯度离心、低熔点琼脂糖裂解DNA等的方法提取样品的DNA。 特点:能提取到高纯度的大片段DNA，但操作繁琐，成本较高，会丢失一些DNA，所以DNA产率比第一种方法低。
1.2 构建宏基因组文库
常用的DNA克隆的载体：质粒、黏粒和细菌人工染色体等。 常用的宿主是：大肠杆菌，恶臭假单胞杆菌。不同研究目标应该选择不同的宿主菌株，因为不同的微生物种类会产生不同的活性物 质。
1.3 宏基因组文库的筛选
方法一：基于目标克隆的代谢活性的功能驱动筛选，该方法筛选工作量大，效率低；
方法二：基于不同物质的不同结构有不同吸收峰的化合物结构筛选，此方法工作量大，费用高；
方法三：基于不同功能的基因序列来筛选具有目标序列克隆子的序列驱动筛选，该方法无法筛选基因文库中的未知基因；
方法四：基于底物诱导基因表达的底物诱导筛选，该方法对筛选抗体基因和生物活性物质十分有效。
五．分析与思考
1.本研究通过使用宏基因组的方法对中国传统发酵食品中的
ENTEROLSIN 和 HELVETICIN 基因多样性进行研究富有创新性。宏基因组技术是将样品中的总 DNA 提取出来后，利用适宜的载体克隆到宿主细胞中以构建成宏基因组文库，再筛选出新的活性物质，整个过程不依赖于微生物纯培养。同样，筛选细菌素时，利用宏基因组技术直接将样品中的总DNA 提取出来后，通过简并引物进行 PCR 扩增，再利用适宜的载体克隆到宿主细胞中以构建成宏基因组文库，通过序列分析来寻找新的活性物质，并对新的细菌素进行基因重组表达。此方法的应用大大提高了细菌素筛选的效率及基因表达稳定性。建立的从细菌素基因获得到活性蛋白表达的研究通路，为应用分子生物学、基因组筛选到细菌素基因之后获得活性蛋白并进一步进行活性鉴定打下了坚实基础。
2.结果不仅展示了在 PCR 方法的基础上，从发酵食品样品中获得新的细菌素序列的可行性，同时也证实了从中国传统发酵食品中挖掘新细菌素的潜能。
3.读文献后的启发
经过对此文的拜读，我了解到：虽然宏基因组技术的应用还不是特别成熟广泛，但它不仅丰富和拓展了我对微生物世界多样性的认识，更重要的是改变了我思考问题的思路和见解。
由于宏基因组学技术是从自然界直接获取遗传信息，以环境样品中的基因组DNA为靶目标，获得任何序列或功能的基因，同时可以发现新物种。这样一来，我就可以跳出传统培养微生物发酵样品的模式，而是，把已发酵产品中基因组DNA作为靶目标，获得能够发酵蛋白质
的基因。
利用宏基因组技术可以开发天然产物新资源，从环境微生物的总基因组着手，开发环境中的天然产物新资源，克服传统分离培养的局限性，那么，我就可以最大限度地开发利用不可培养微生物的代谢产物。如:酶，维生素，功能性肽等用于更深一步的研究。
还有就是，之前我在考虑自己课题所用菌的时候，只是单单局限在一种菌枯草芽孢杆菌，读过此论文之后，我联想到读过的一篇文献中出现过“铜绿假单胞菌产蛋白酶能力明显强于枯草芽孢杆菌，前者对照样的蛋白酶产量是后者对照样蛋白酶产量的6倍多。”我之前之所以没有选铜绿假单胞菌，是因为铜绿假单胞杆菌是条件致病菌。现在我改变了自己的想法，想通过基因技术改造并筛选出非致病且高产蛋白酶的菌株，或者利用基因组的方法提取产蛋白酶基因进而获得活性蛋白酶。现在我面临的问题就是此想法的可行性，我相信有问题才会有答案，至于此想法的可行性问题急需要进一步认真摸索研究。
注：记录本笔记前也简单了解了以下文献：
[1]张彩凤，王婷婷等.宏基因组学技术及其应用概述[J].生物学教学2013,(3).
[2] Yu n- Zhu X ia o & Si-Yang Zhao. Food Omics Validation: Towards Understanding Key Features for Gut Microbiota, Probiotics and Human Health[J].Food Anal Methods 2014,(4).
[3]Real-Time PCR Quantification of Protease-Producing Bacteria in Traditional Chinese Fish Sauce[J].Food Anal Methods 2014.
[4]高 岳．应用宏基因组技术从微生物中获得活性物质的研究进展江苏农业科学[J].2014,42(1):5-8.