广东农业科学2011年第13期
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黄曲霉毒素检测方法研究进展
韩
珍，赵文红，钱
敏，白卫东
（仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广州510225）
摘
要：曲霉毒素是剧毒性物质，多在食品中发现，对人类危害极大。对黄曲霉毒素的毒性、检验标准、检测方法进行了探讨，
分析讨论了黄曲霉毒素的各种检测方法如层析法、色谱法、免疫法的优缺点，并对未来黄曲霉毒素的检测方法进行了展望。
关键词：黄曲霉毒素；层析法；色谱法；免疫法中图分类号：R155.5
文献标识码：A
文章编号：1004-874X（2011）13-0093-04
黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一种剧毒和强致癌物质，是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物，可分为B1、B2、G1、G2、M1、M2等。其形成过程为：初始阶段以乙酰CoA作为起始单位，丙二酸单酰CoA作为延长单位，在聚酮化合物合成酶(pksA)催化作用下形成黄曲霉毒素的聚酮骨架。黄曲霉毒素生物合成的过程至少经过18步化学反应，许多中间产物都具有一定的毒性[1-2]。黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，即含有一个双呋喃环（基本毒性结构）和一个氧杂萘邻酮(即香豆素，与致癌有关)。M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物，M1和M2主要存在于牛奶中。
B1为黄曲霉毒素中毒性及致癌性最强的物质，是间接致癌物，进入人体内经氧化代谢酶(如CYP3A4等)活化后形成的活性中间代谢产物与DNA大分子结合，导致细胞遗传特性改变，进而发挥其致癌致突变效应；同时又可被另一类代谢酶(如GST)代谢解毒，使终致癌物结构发生改变而不能攻击DNA，实现机体的自身保护作用。从物种
收稿日期：2010-12-10
基金项目：广东省科技计划项目（2009A020700005）
作者简介：韩珍（1987-），女，在读硕士生，E-mail：hanzhen2005
上来说，黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果(特别是花生和核桃中)中。一般黄曲霉毒素的裂解温度为280℃,黄曲霉毒素B1的裂解温度为268℃。紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。
1993年，黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为一类致癌物，是世界公认的三大强致癌物质之一，是一种剧毒物质[3-4]。因此，世界各国都对食品中的黄曲霉毒素的含量做出了严格的规定。玉米黄曲霉素污染最为严重，我国是第二大玉米生产国，欧美相关标准均严于我国国标[5]，2000年以来我国出口花生和玉米连续多次由于黄曲霉毒素含量超标而被欧盟额外实施特检甚至拒绝进口。因此，无论是黄曲霉毒素毒性的严重性还是国际贸易的紧迫性，都说明选择一种合适的黄曲霉毒素的检测方法就是一个亟待解决的重要问题。
1黄曲霉毒素的危害及国内外标准
黄曲霉菌适宜生长和产毒条件为：温度10～45℃，最适温度为30℃，湿度为85％。以花生为例，黄曲霉毒素适宜的产毒温度为24～30℃，黄曲霉菌(菌丝)在侵染花生后24～36h就能达到最快的生长速度，6～8d即可产生黄曲霉毒素污染。AFT是世界共认的致癌物质，其中B1是目前已知的最强致癌物，被WHO列为1A类致癌物。研究表
通讯作者：白卫东（1967-），男，教授，E-mail：whitebai2002@yahoo.
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族最爱的饼干、聚会时必不可少的点心，都可在其中加入有机硒。通过摄入这样的食品补充人体每人所需的微量元素，防治疾病的发生，还可起到一定的保健作用。综上所述，有机硒在焙烤食品中的作用非常大，而且发展前景非常可观。
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明，一粒严重污染(100μg)的花生(0.5g/粒)混入10000粒(约5kg)花生中，黄曲霉毒素污染的平均水平为20μg/kg[6]。王君等[7]对重庆、福建、广东、广西、湖北、江苏、上海、浙江等地区采集的市售玉米、花生、大米、核桃、松子等284份样品测定其AFT含量，结果表明，大米、核桃、松子的污染情况较轻，全部符合国家限量标准；玉米中黄曲霉毒素的检出率为70.27%，平均含量为36.51μg/kg，最高为1098.36μg/kg，并有14.86%的玉米样品中黄曲霉毒素
色、蓝紫色、绿色和蓝色荧光。此法的优点是操作简便，费用低，缺点是操作繁琐，对操作人员的身体有害，灵敏度差。
目前AFTB1的测定方法很多，但因条件限制，国内一般食品、粮油通用的检测方法为薄层层析法。现行薄层层析法提取与净化效果不够理想，使提取液中杂质较多进而在展开时影响斑点的荧光强度，或减少了样液的杂质但提取后测定结果偏低，同时展开时分离效果不好，王宏亮[12]针对以上问题对GB5009．22—85所规定的方法进行了改进。即提取与净化过程中，在用氯仿抽提前加入25％的醋酸铅溶液5mL（沉淀蛋白质）和4％的NaCI溶液5mL（防乳化现象且加速蛋白形成），再用氯仿振动抽提。于薄层板点样后展开时先用氯仿与丙酮(90∶10)的混合液正向展开，然后用无水乙醚进行反向展开（提高分离效果）。确认方法可采用加滴稀盐酸（取代传统滴加价格昂贵的剧毒性药剂三氟乙酸）使之生成相同荧光的衍生物，Rf值为黄曲霉毒34素Bl的Rf值的1/10。测得其回收率为76.9％，最低检出限量为5×10-9。改进后方法中，黄曲霉毒素B1形成的斑点易观察，操作简便。James[13]改进了薄层色谱法检测棉籽饭中的黄曲霉毒素B1，该方法利用乙醚—甲醇—水（96∶3∶1）作为溶剂体系，来提高黄曲霉毒素在薄层色谱板上的分离效果，这种方法对棉籽饭中5μg/kg的黄曲霉毒素B1很敏感。
（2）金标免疫层析法（GICA）。胶体金免疫层析法是20世纪80年代发展起来的一种将胶体金免疫技术和色谱层析技术相结合的固相膜免疫分析方法，具有快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便、无需任何仪器设备等优点，结果判断直观可靠、容易被基层单位人员掌握，现已广泛应用于临床诊断及药物检测等领域。
其原理是使样品中的黄曲霉毒素B1首先与胶体金颗粒表面的抗AFB1单克隆抗体反应，如果样品中AFB1的含量超过限值，胶体金的抗体位点将不再有剩余，当胶体金颗粒层析经过检测线时，胶体金颗粒将不会停留在该线的所在位置，继续上行时与质控线上喷涂的羊抗鼠IgG反应，呈现出胶体金的红色条带。如果样品中不含AFB1或AFB1含量低于限值，胶体金表面的抗体将与检测线上的化合物反应呈现出红色条带，质控线也呈现红色条带。
赵晓联等[14]应用金标免疫层析法研制的金标免疫试纸条对食品中黄曲霉毒素B1的检测，确立了该方法的各项技术指标。结果表明：该方法的最低检测限为2.5ng/mL；金标免疫试纸条在4℃环境下可稳定10个月以上；与类似毒素AFB2、AFG2的交叉反应率分别是7.14％、6.25％；检测时间小于15min；GICA与ELISA方法的符合率达90％以上。该方法简便、快速，有较高的灵敏度，重复性好，特异性强，能定性或半定量检测食品中的黄曲霉毒素B1含量。邓省亮[15]也应用胶体金免疫层析技术，建立了一种快速检测食品中黄曲霉毒素B1的方法。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体并喷于玻璃纤维上，黄曲霉毒素B1偶联抗原和二抗鼠抗驴分别结合于硝酸纤维膜上，依次将样本垫、胶金垫、硝
B1含量超出国家限量标准。花生中黄曲霉毒素的检出率为24.24%，平均含量为80.27μg/kg，最高为437.09μg/kg，且有3.03%的花生样品中黄曲霉毒素含量超出国家及国际食品法典限量标准。WHO规定的标准与我国和美国的标准是一致的,欧盟的标准则更严格一些。
2检测程序及方法
黄曲霉毒素的检测主要是层析法、色谱法、免疫法
等，这些方法各有优缺点，随着特异性抗体技术的发展，免疫法正在迅速发展，也成为此种毒素检测的趋势。目前，酶联免疫吸附法已用于黄曲霉毒素的检测，利用电化学免疫传感器进行测定也是一种新兴起的方法。
2.1前处理
2.1.1纯化技术路戈等[8]将花生样品粉碎，称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确加入100.0mL甲醇—水（55∶45）溶液和30.0mL石油醚，150r/min振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中，分层后放出下层甲醇—水溶液于100mL烧杯内，取20.0mL（相当于4.0g样品）置于另一个125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）。放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层合并于蒸发皿中。65℃水浴通风挥干，用2.0mLMeOH-PBS(20∶80，V/V)分3次(0.8、0.7、0.5mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g样品。杨焱等[9]将20g粉碎过筛样品于250mL具塞锥形瓶中，用滴管加6mL水使样品湿润，准确加入60mL氯仿，振荡30min，过滤后取滤液12mL于蒸发皿中，65℃水浴挥干，再用苯—乙脯溶液转移至刻度试管中，定容至1mL。
相对于固相萃取而言，免疫亲和色谱（IAC）能够提供净化更为彻底的样品处理液。李佩暖等[10]加氯化钠于花生样品中，再加入甲醇—水（70∶30,V/V），高速均质30min过滤，取滤液按1∶4的比例与水混合，于漩涡混合器上混匀，以玻璃纤维滤纸过滤。取10mL滤液通过免疫亲和柱，先用20mL水洗涤，流速约2滴/s，直至完全通过；用
1mL甲醇淋洗免疫亲和柱，速度约为1滴/s。张浩等[11]所用方法与此法类似。
2.2分析方法
2.2.1色谱法（1）薄层层析法(TLC)。TLC法是对样品进行提取、柱层析、洗脱、薄层分离的过程。薄层析板在365nm紫外光下观察，AFBl、AFB2、AFG1和AFG2分别显蓝紫
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酸纤维膜和吸水纸组装切割成胶体金试纸条并装入检测卡中。测试结果表明黄曲霉毒素B1快速检测试纸条的灵敏度为5ng/mL，检测时间为10min，批内和批间重复性为100％，假阳性率和假阴性率均为0。使用简单方便，非常适合现场快速检测黄曲霉毒素B1。
（3）高效液相色谱法（HPLC）。HPLC方法主要为反相色谱法，该方法已非常成熟。用此方法检测黄曲霉毒素一般要经过样品纯化、衍生，最后经HPLC荧光检测器检测，大多数研究中采用的色谱条件为：C18柱，流动相为甲醇、水，有的采用乙腈、异丙醇。宋欢用高效液相色谱一荧光检测法检测饲料中的黄曲毒素B1。采用C18色谱柱，甲醇∶水(3∶7)为流动相，荧光检测器检测，激发波长365nm，发射波长455nm，效果比较好。冯建蕾等[17]对发酵玉米粉用甲醇—水(8∶2，V/V)提取，经免疫亲合柱(IAC)分离纯化、在线光化学衍生器柱后衍生化后，反相HPLC荧光检测器测定黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量，得出该方法具有准确度高、重现性好、检测限低、效率高等优点。
[16]
而得到一组特征质谱图。由于特定分子在确定的质谱分析条件下，具有特征的碎裂和离子化规律，并呈良好的重现性，因此，质谱分析可为未知组分的分析提供丰富的结构信息，是最有效的定性分析手段之一。质谱分析对样品纯度要求较高，其样品预处理过程十分繁复。
张浩等[23]研究了液相色谱—质谱联用技术检测花生中的黄曲霉毒素。用80%甲醇溶液提取花生中的黄曲霉毒素，经免疫小柱净化，以甲醇—乙酸水为流动相，在C18柱上对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2进行分离，采用质谱正离子模式对黄曲霉毒素进行检测。结果表明，本方法可同时检测花生中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，检测限分别为
0.15、0.09、0.25、0.5μg/kg,回收率为78%～110%。检测出口欧盟的花生及其制品中的黄曲霉毒素时,使用该法也可完全满足要求。
2.2.3免疫法（1）酶联免疫吸附法（ELISA）。该法是利
用固相酶联免疫吸附原理，将黄曲霉毒素B1（AFB1）特异性抗体包被于聚苯乙烯微量反应板的孔穴中，再加入样品提取液(未知抗原)及酶标AFB1抗原(已知抗原)使两者与抗体之间进行免疫竞争反应，然后加酶底物显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标AFTB1抗原结合的量,即样品中
HPLC常与其他分离方法联用以期获得更准确的测定结果。柳洁等对市售大米、面粉、食用油样品首先用直接竞争ELISA方法初筛测定，阳性样品再用免疫亲和柱净化、荧光检测器测定的HPLC方法验证和准确定量。测定结果显示，两种方法具有很好的符合性（r=0.9968)，建立了一种简便、快速、高效的ELISA法初筛检测结合HPLC法验证和定量测定粮油食品中AFB1的检测方法。张鹏等采用免疫亲和柱净化、在线电化学衍生化高效液相色谱法测定了花生中的黄曲霉毒AFB1，AFB2，AFG1和AFG2。以体积分数为80％的甲醇提取样品中的
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[18]
AFB1多则被抗体结合的酶标AFB1抗原少，颜色浅，反之则深。该法适用于食品、饲料、粮油、酒类、常用药材等产品。
任志秋[24]利用黄曲霉测定仪法测定AFB1，得到了理想的结果。此法测AFB1具有操作简便、灵敏度高、特异性好、测量结果准确、回收率高的特点，是一个值得推广的检测方法。路戈等[8]用抗AFB1的单克隆抗体AFB1-2H8，建立了检测食品(玉米、花生、小麦、大米、植物油)中AFB1的ELISA间接竞争法。该法最低检出浓度为0.01μg/kg，敏感范围为0.2～50μg/kg。为降低本方法的检测误差，龚燕等[25]针对盐分、酸碱性、金属离子、乳化现象对检测结果的影响，用ELISA法检测5类食品(酱油、醋、面粉、大米、食用油)中的AFB1含量，对5类食品中AFB1的前处理进行了方法学研究。其前处理方法为：在乳化液中无机盐类电解质破坏乳化层，降低因乳化现象导致的测定结果假阳性。醋由于酸度很大加氯化物效果不明显，需进行调酸处理；用甲醇水提取的面粉若出现假阳性结果，可能是面粉中加入的添加剂成分多，如漂白剂、品质改良剂、化学膨松剂及营养强化剂等，这些添加剂中所含Fe3+、
AFT，经免疫亲和柱净化洗脱后，以KobraCeil装置在线衍生，反相HPLC分离定量。4种毒素的分离在13min内完成，检出限均达到0.1μg/kg。李佐卿等[20]采用单克隆抗体免疫亲和技术作为直接从样品中分离提纯黄曲酶毒素的特效手段，提取液挥发干后，经衍生用HPLC荧光检测器测定。为使测定方法定量准确，精密度高而且操作方便，朱最丽[21]用一种快速方便的MycoSepTM净化柱和高效液相色谱法对谷物中的黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2进行测定。样品经乙腈—水(体积比84∶16)提取，提取液通过MycoSepTM226净化柱净化、浓缩，三氟乙酸(TFA)柱前衍生，Cl8色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。对添加两个浓度黄曲霉毒素的玉米样品进行加标回收试验发现，4种毒素的回收率均在90.44％～101.23％之间，Bl、Gl、B2、G2的最低检测限分别为2.0、1.0、0.5、0.5
Ca2+、Mg2+等金属离子均影响结果，此时应用三氯甲烷法提取样品来消除此干扰。结果表明，改进后的前处理使检测灵敏度达0.1μg/kg，在0.1～10μg/kg之间呈良好线性关系。
（2）微柱法。微柱法是将试样提取液经过滤、稀释后，通过黄曲霉毒素B1免疫亲和柱。黄曲霉毒素B1免疫亲和柱是由偶联有黄曲霉毒素B1抗体的免疫亲和微球填充而成的，而此抗体对黄曲霉毒素B1具有专一性，样液中黄曲霉毒素B1被黄曲霉毒素B1免疫亲和微球上的抗体捕获，杂质随洗涤液流出微柱，再以甲醇将黄曲霉毒素B1洗脱，
ng/kg，大大提高了最低检测浓度。AliciaMaroto等[22]研究了HPLC方法检测黄曲霉毒素B1的不确定度。将这些不确定因素分为两组：（1）模型的可变性，中间精密度和样品异质性；（2）方法的一致性。结果表明，黄曲霉毒素相对标准的不确定度是16.3%。
2.2.2联用方法液相色谱—质谱联用法（LC-MS）。LC-MS法是一种新的检测方法。质谱分析先将待测化合物的分子离子化(M→M+)，再在电场和磁场作用下，将所得不同质荷比的离子(包括分子离子和碎片离子)分离，从
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洗脱液通过荧光光度法根据黄曲霉毒素B1检测工作曲线测定黄曲霉毒素B1的含量[26]。
李明生[27]研究了微柱法测定小麦中黄曲霉毒素B1的含量，结果表明微柱法虽然所需仪器简单，操作容易，比薄层法省时，便于普及，但此法所测结果只能作为参考，不能做正式依据，因为所得数据除误差大之外，还可能有假阳性。
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广东农业科学2011年第13期
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黄曲霉毒素检测方法研究进展
韩
珍，赵文红，钱
敏，白卫东
（仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广州510225）
摘
要：曲霉毒素是剧毒性物质，多在食品中发现，对人类危害极大。对黄曲霉毒素的毒性、检验标准、检测方法进行了探讨，
分析讨论了黄曲霉毒素的各种检测方法如层析法、色谱法、免疫法的优缺点，并对未来黄曲霉毒素的检测方法进行了展望。
关键词：黄曲霉毒素；层析法；色谱法；免疫法中图分类号：R155.5
文献标识码：A
文章编号：1004-874X（2011）13-0093-04
黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一种剧毒和强致癌物质，是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物，可分为B1、B2、G1、G2、M1、M2等。其形成过程为：初始阶段以乙酰CoA作为起始单位，丙二酸单酰CoA作为延长单位，在聚酮化合物合成酶(pksA)催化作用下形成黄曲霉毒素的聚酮骨架。黄曲霉毒素生物合成的过程至少经过18步化学反应，许多中间产物都具有一定的毒性[1-2]。黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，即含有一个双呋喃环（基本毒性结构）和一个氧杂萘邻酮(即香豆素，与致癌有关)。M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物，M1和M2主要存在于牛奶中。
B1为黄曲霉毒素中毒性及致癌性最强的物质，是间接致癌物，进入人体内经氧化代谢酶(如CYP3A4等)活化后形成的活性中间代谢产物与DNA大分子结合，导致细胞遗传特性改变，进而发挥其致癌致突变效应；同时又可被另一类代谢酶(如GST)代谢解毒，使终致癌物结构发生改变而不能攻击DNA，实现机体的自身保护作用。从物种
收稿日期：2010-12-10
基金项目：广东省科技计划项目（2009A020700005）
作者简介：韩珍（1987-），女，在读硕士生，E-mail：hanzhen2005
上来说，黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果(特别是花生和核桃中)中。一般黄曲霉毒素的裂解温度为280℃,黄曲霉毒素B1的裂解温度为268℃。紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。
1993年，黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为一类致癌物，是世界公认的三大强致癌物质之一，是一种剧毒物质[3-4]。因此，世界各国都对食品中的黄曲霉毒素的含量做出了严格的规定。玉米黄曲霉素污染最为严重，我国是第二大玉米生产国，欧美相关标准均严于我国国标[5]，2000年以来我国出口花生和玉米连续多次由于黄曲霉毒素含量超标而被欧盟额外实施特检甚至拒绝进口。因此，无论是黄曲霉毒素毒性的严重性还是国际贸易的紧迫性，都说明选择一种合适的黄曲霉毒素的检测方法就是一个亟待解决的重要问题。
1黄曲霉毒素的危害及国内外标准
黄曲霉菌适宜生长和产毒条件为：温度10～45℃，最适温度为30℃，湿度为85％。以花生为例，黄曲霉毒素适宜的产毒温度为24～30℃，黄曲霉菌(菌丝)在侵染花生后24～36h就能达到最快的生长速度，6～8d即可产生黄曲霉毒素污染。AFT是世界共认的致癌物质，其中B1是目前已知的最强致癌物，被WHO列为1A类致癌物。研究表
通讯作者：白卫东（1967-），男，教授，E-mail：whitebai2002@yahoo.
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族最爱的饼干、聚会时必不可少的点心，都可在其中加入有机硒。通过摄入这样的食品补充人体每人所需的微量元素，防治疾病的发生，还可起到一定的保健作用。综上所述，有机硒在焙烤食品中的作用非常大，而且发展前景非常可观。
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明，一粒严重污染(100μg)的花生(0.5g/粒)混入10000粒(约5kg)花生中，黄曲霉毒素污染的平均水平为20μg/kg[6]。王君等[7]对重庆、福建、广东、广西、湖北、江苏、上海、浙江等地区采集的市售玉米、花生、大米、核桃、松子等284份样品测定其AFT含量，结果表明，大米、核桃、松子的污染情况较轻，全部符合国家限量标准；玉米中黄曲霉毒素的检出率为70.27%，平均含量为36.51μg/kg，最高为1098.36μg/kg，并有14.86%的玉米样品中黄曲霉毒素
色、蓝紫色、绿色和蓝色荧光。此法的优点是操作简便，费用低，缺点是操作繁琐，对操作人员的身体有害，灵敏度差。
目前AFTB1的测定方法很多，但因条件限制，国内一般食品、粮油通用的检测方法为薄层层析法。现行薄层层析法提取与净化效果不够理想，使提取液中杂质较多进而在展开时影响斑点的荧光强度，或减少了样液的杂质但提取后测定结果偏低，同时展开时分离效果不好，王宏亮[12]针对以上问题对GB5009．22—85所规定的方法进行了改进。即提取与净化过程中，在用氯仿抽提前加入25％的醋酸铅溶液5mL（沉淀蛋白质）和4％的NaCI溶液5mL（防乳化现象且加速蛋白形成），再用氯仿振动抽提。于薄层板点样后展开时先用氯仿与丙酮(90∶10)的混合液正向展开，然后用无水乙醚进行反向展开（提高分离效果）。确认方法可采用加滴稀盐酸（取代传统滴加价格昂贵的剧毒性药剂三氟乙酸）使之生成相同荧光的衍生物，Rf值为黄曲霉毒34素Bl的Rf值的1/10。测得其回收率为76.9％，最低检出限量为5×10-9。改进后方法中，黄曲霉毒素B1形成的斑点易观察，操作简便。James[13]改进了薄层色谱法检测棉籽饭中的黄曲霉毒素B1，该方法利用乙醚—甲醇—水（96∶3∶1）作为溶剂体系，来提高黄曲霉毒素在薄层色谱板上的分离效果，这种方法对棉籽饭中5μg/kg的黄曲霉毒素B1很敏感。
（2）金标免疫层析法（GICA）。胶体金免疫层析法是20世纪80年代发展起来的一种将胶体金免疫技术和色谱层析技术相结合的固相膜免疫分析方法，具有快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便、无需任何仪器设备等优点，结果判断直观可靠、容易被基层单位人员掌握，现已广泛应用于临床诊断及药物检测等领域。
其原理是使样品中的黄曲霉毒素B1首先与胶体金颗粒表面的抗AFB1单克隆抗体反应，如果样品中AFB1的含量超过限值，胶体金的抗体位点将不再有剩余，当胶体金颗粒层析经过检测线时，胶体金颗粒将不会停留在该线的所在位置，继续上行时与质控线上喷涂的羊抗鼠IgG反应，呈现出胶体金的红色条带。如果样品中不含AFB1或AFB1含量低于限值，胶体金表面的抗体将与检测线上的化合物反应呈现出红色条带，质控线也呈现红色条带。
赵晓联等[14]应用金标免疫层析法研制的金标免疫试纸条对食品中黄曲霉毒素B1的检测，确立了该方法的各项技术指标。结果表明：该方法的最低检测限为2.5ng/mL；金标免疫试纸条在4℃环境下可稳定10个月以上；与类似毒素AFB2、AFG2的交叉反应率分别是7.14％、6.25％；检测时间小于15min；GICA与ELISA方法的符合率达90％以上。该方法简便、快速，有较高的灵敏度，重复性好，特异性强，能定性或半定量检测食品中的黄曲霉毒素B1含量。邓省亮[15]也应用胶体金免疫层析技术，建立了一种快速检测食品中黄曲霉毒素B1的方法。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体并喷于玻璃纤维上，黄曲霉毒素B1偶联抗原和二抗鼠抗驴分别结合于硝酸纤维膜上，依次将样本垫、胶金垫、硝
B1含量超出国家限量标准。花生中黄曲霉毒素的检出率为24.24%，平均含量为80.27μg/kg，最高为437.09μg/kg，且有3.03%的花生样品中黄曲霉毒素含量超出国家及国际食品法典限量标准。WHO规定的标准与我国和美国的标准是一致的,欧盟的标准则更严格一些。
2检测程序及方法
黄曲霉毒素的检测主要是层析法、色谱法、免疫法
等，这些方法各有优缺点，随着特异性抗体技术的发展，免疫法正在迅速发展，也成为此种毒素检测的趋势。目前，酶联免疫吸附法已用于黄曲霉毒素的检测，利用电化学免疫传感器进行测定也是一种新兴起的方法。
2.1前处理
2.1.1纯化技术路戈等[8]将花生样品粉碎，称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确加入100.0mL甲醇—水（55∶45）溶液和30.0mL石油醚，150r/min振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中，分层后放出下层甲醇—水溶液于100mL烧杯内，取20.0mL（相当于4.0g样品）置于另一个125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）。放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层合并于蒸发皿中。65℃水浴通风挥干，用2.0mLMeOH-PBS(20∶80，V/V)分3次(0.8、0.7、0.5mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g样品。杨焱等[9]将20g粉碎过筛样品于250mL具塞锥形瓶中，用滴管加6mL水使样品湿润，准确加入60mL氯仿，振荡30min，过滤后取滤液12mL于蒸发皿中，65℃水浴挥干，再用苯—乙脯溶液转移至刻度试管中，定容至1mL。
相对于固相萃取而言，免疫亲和色谱（IAC）能够提供净化更为彻底的样品处理液。李佩暖等[10]加氯化钠于花生样品中，再加入甲醇—水（70∶30,V/V），高速均质30min过滤，取滤液按1∶4的比例与水混合，于漩涡混合器上混匀，以玻璃纤维滤纸过滤。取10mL滤液通过免疫亲和柱，先用20mL水洗涤，流速约2滴/s，直至完全通过；用
1mL甲醇淋洗免疫亲和柱，速度约为1滴/s。张浩等[11]所用方法与此法类似。
2.2分析方法
2.2.1色谱法（1）薄层层析法(TLC)。TLC法是对样品进行提取、柱层析、洗脱、薄层分离的过程。薄层析板在365nm紫外光下观察，AFBl、AFB2、AFG1和AFG2分别显蓝紫
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酸纤维膜和吸水纸组装切割成胶体金试纸条并装入检测卡中。测试结果表明黄曲霉毒素B1快速检测试纸条的灵敏度为5ng/mL，检测时间为10min，批内和批间重复性为100％，假阳性率和假阴性率均为0。使用简单方便，非常适合现场快速检测黄曲霉毒素B1。
（3）高效液相色谱法（HPLC）。HPLC方法主要为反相色谱法，该方法已非常成熟。用此方法检测黄曲霉毒素一般要经过样品纯化、衍生，最后经HPLC荧光检测器检测，大多数研究中采用的色谱条件为：C18柱，流动相为甲醇、水，有的采用乙腈、异丙醇。宋欢用高效液相色谱一荧光检测法检测饲料中的黄曲毒素B1。采用C18色谱柱，甲醇∶水(3∶7)为流动相，荧光检测器检测，激发波长365nm，发射波长455nm，效果比较好。冯建蕾等[17]对发酵玉米粉用甲醇—水(8∶2，V/V)提取，经免疫亲合柱(IAC)分离纯化、在线光化学衍生器柱后衍生化后，反相HPLC荧光检测器测定黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量，得出该方法具有准确度高、重现性好、检测限低、效率高等优点。
[16]
而得到一组特征质谱图。由于特定分子在确定的质谱分析条件下，具有特征的碎裂和离子化规律，并呈良好的重现性，因此，质谱分析可为未知组分的分析提供丰富的结构信息，是最有效的定性分析手段之一。质谱分析对样品纯度要求较高，其样品预处理过程十分繁复。
张浩等[23]研究了液相色谱—质谱联用技术检测花生中的黄曲霉毒素。用80%甲醇溶液提取花生中的黄曲霉毒素，经免疫小柱净化，以甲醇—乙酸水为流动相，在C18柱上对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2进行分离，采用质谱正离子模式对黄曲霉毒素进行检测。结果表明，本方法可同时检测花生中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，检测限分别为
0.15、0.09、0.25、0.5μg/kg,回收率为78%～110%。检测出口欧盟的花生及其制品中的黄曲霉毒素时,使用该法也可完全满足要求。
2.2.3免疫法（1）酶联免疫吸附法（ELISA）。该法是利
用固相酶联免疫吸附原理，将黄曲霉毒素B1（AFB1）特异性抗体包被于聚苯乙烯微量反应板的孔穴中，再加入样品提取液(未知抗原)及酶标AFB1抗原(已知抗原)使两者与抗体之间进行免疫竞争反应，然后加酶底物显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标AFTB1抗原结合的量,即样品中
HPLC常与其他分离方法联用以期获得更准确的测定结果。柳洁等对市售大米、面粉、食用油样品首先用直接竞争ELISA方法初筛测定，阳性样品再用免疫亲和柱净化、荧光检测器测定的HPLC方法验证和准确定量。测定结果显示，两种方法具有很好的符合性（r=0.9968)，建立了一种简便、快速、高效的ELISA法初筛检测结合HPLC法验证和定量测定粮油食品中AFB1的检测方法。张鹏等采用免疫亲和柱净化、在线电化学衍生化高效液相色谱法测定了花生中的黄曲霉毒AFB1，AFB2，AFG1和AFG2。以体积分数为80％的甲醇提取样品中的
[19]
[18]
AFB1多则被抗体结合的酶标AFB1抗原少，颜色浅，反之则深。该法适用于食品、饲料、粮油、酒类、常用药材等产品。
任志秋[24]利用黄曲霉测定仪法测定AFB1，得到了理想的结果。此法测AFB1具有操作简便、灵敏度高、特异性好、测量结果准确、回收率高的特点，是一个值得推广的检测方法。路戈等[8]用抗AFB1的单克隆抗体AFB1-2H8，建立了检测食品(玉米、花生、小麦、大米、植物油)中AFB1的ELISA间接竞争法。该法最低检出浓度为0.01μg/kg，敏感范围为0.2～50μg/kg。为降低本方法的检测误差，龚燕等[25]针对盐分、酸碱性、金属离子、乳化现象对检测结果的影响，用ELISA法检测5类食品(酱油、醋、面粉、大米、食用油)中的AFB1含量，对5类食品中AFB1的前处理进行了方法学研究。其前处理方法为：在乳化液中无机盐类电解质破坏乳化层，降低因乳化现象导致的测定结果假阳性。醋由于酸度很大加氯化物效果不明显，需进行调酸处理；用甲醇水提取的面粉若出现假阳性结果，可能是面粉中加入的添加剂成分多，如漂白剂、品质改良剂、化学膨松剂及营养强化剂等，这些添加剂中所含Fe3+、
AFT，经免疫亲和柱净化洗脱后，以KobraCeil装置在线衍生，反相HPLC分离定量。4种毒素的分离在13min内完成，检出限均达到0.1μg/kg。李佐卿等[20]采用单克隆抗体免疫亲和技术作为直接从样品中分离提纯黄曲酶毒素的特效手段，提取液挥发干后，经衍生用HPLC荧光检测器测定。为使测定方法定量准确，精密度高而且操作方便，朱最丽[21]用一种快速方便的MycoSepTM净化柱和高效液相色谱法对谷物中的黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2进行测定。样品经乙腈—水(体积比84∶16)提取，提取液通过MycoSepTM226净化柱净化、浓缩，三氟乙酸(TFA)柱前衍生，Cl8色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。对添加两个浓度黄曲霉毒素的玉米样品进行加标回收试验发现，4种毒素的回收率均在90.44％～101.23％之间，Bl、Gl、B2、G2的最低检测限分别为2.0、1.0、0.5、0.5
Ca2+、Mg2+等金属离子均影响结果，此时应用三氯甲烷法提取样品来消除此干扰。结果表明，改进后的前处理使检测灵敏度达0.1μg/kg，在0.1～10μg/kg之间呈良好线性关系。
（2）微柱法。微柱法是将试样提取液经过滤、稀释后，通过黄曲霉毒素B1免疫亲和柱。黄曲霉毒素B1免疫亲和柱是由偶联有黄曲霉毒素B1抗体的免疫亲和微球填充而成的，而此抗体对黄曲霉毒素B1具有专一性，样液中黄曲霉毒素B1被黄曲霉毒素B1免疫亲和微球上的抗体捕获，杂质随洗涤液流出微柱，再以甲醇将黄曲霉毒素B1洗脱，
ng/kg，大大提高了最低检测浓度。AliciaMaroto等[22]研究了HPLC方法检测黄曲霉毒素B1的不确定度。将这些不确定因素分为两组：（1）模型的可变性，中间精密度和样品异质性；（2）方法的一致性。结果表明，黄曲霉毒素相对标准的不确定度是16.3%。
2.2.2联用方法液相色谱—质谱联用法（LC-MS）。LC-MS法是一种新的检测方法。质谱分析先将待测化合物的分子离子化(M→M+)，再在电场和磁场作用下，将所得不同质荷比的离子(包括分子离子和碎片离子)分离，从
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洗脱液通过荧光光度法根据黄曲霉毒素B1检测工作曲线测定黄曲霉毒素B1的含量[26]。
李明生[27]研究了微柱法测定小麦中黄曲霉毒素B1的含量，结果表明微柱法虽然所需仪器简单，操作容易，比薄层法省时，便于普及，但此法所测结果只能作为参考，不能做正式依据，因为所得数据除误差大之外，还可能有假阳性。
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商家为获得最大限度的利益，漠视食品法规，使得市场上存在黄曲霉毒素超标问题，为全民食品安全带来极大隐患。此外，黄曲霉毒素的检测技术越来越多元化，但如何研发和选定一种快速准确的检测方法显得尤为重要。因此，一方面可以从防范黄曲霉毒素污染的源头出发来减少其对人类的危害；另一方面可从检测技术出发，利用现代技术着力研发AFT特异性抗体，改进酶联免疫法，使其设备简单，操作方便，可进行现场快速检测来严格检测控制食品中黄曲霉毒素的含量或者研发一种兼并金标免疫法和酶联免疫法优点的方法，既可批量准确测定又可进行快速现场检测。
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