中国消毒学杂志2011年第28卷第3期·309·文章编号:1001-7658(2011)03-0309-04 【论著】
细菌生物膜培养及评估方法
刘芝兰,李 宇,刘 颋,邱 凯
(3M中国有限公司,上海 200233)
提要 目的 研究生物膜的不同生成模型和检测方法,用于清洗去除的评估。方法 采用生物膜反应器方法培养生物膜,用扫描电镜和激光共聚焦显微镜及细菌定量检测方法,对生物膜的形成和清除效果进行监测。结果 用生物膜反应器方法来培养标准的绿脓杆菌生物膜,通过结晶紫染色法、扫描电镜观测法以及活菌计数法,都证明载体上绿脓杆菌生物膜生长成熟,黏附力较强。用激光共聚焦显微镜法观察到,经过多酶清洗液清洗作用,样片上绿脓杆菌生物膜细菌胞外多糖出现分解,结构出现松散;继续清洗后,生物膜随清洗液不断消失,继而被彻底清除。结论 此系列生物膜培养方法,过程监测及菌落计数的量化方法,能有效衡量清洗剂生物膜清洗去除效果。
关键词 生物膜;清洗;清除效果;检测
中图分类号:R187 文献标识码:A
RESEARCHONTHEBACTERIABIOFILMCULTIVATIONANDEVALUATIONMETHODSLIUZhi-lan,LIYu,LIUTing,QIUKai
(3MResearchCenterofChina,Shanghai 200233,China)
Abstract Objective Tostudythedifferentbiofilmcultivationandprocessdetectionmethod,inordertoevaluateclean-ingeffect.Methods Biofilmreactorwasusedtocultivatebiofilm.Scanningelectronmicroscopy,confocallaserscanningmicroscopeandtotalplantcountmethodwereusedtodetectthebiofilmformationandremovalresult.Results Thestand-ardPseudomonasaeruginosabiofilmcultivatedbyreactorisprovedgrowthmatureandstronglyattachedonthecarrier.Thetestmethodisincludedcrystalvioletdyeing,scanningelectronmicroscopyandtotalplantcountmethods.Underconfocallaserscanningmicroscopedetection,wecouldseethatextracellularpolysaccharidesofP.aeruginosabiofilmwerebrokedown,thestructurewasloosed,andthebiofilmwasdisappearedstepbystep.Conclusion Thesebiofilmcultivation,processdetectionandtotalplantcountmethodscouldbeeffectivelyevaluatecleaner'sbiofilmremovalability.
Keywords biofilm;cleaning;removalefficacy;detection
生物膜是细菌为了适应生存环境而形成的与浮
游细胞相对应的生存形式,属于细菌在特殊环境下
的生存状态。细菌生物膜的形成过程是细菌与材料
表面接触附着,在材料表面形成菌落,菌落生长包埋
于胞外脂多糖基质中〔1〕但都存在生物膜生长牢度不足、判断生物膜形成时主观性较大、评判结果差异较大以及计数准确性不高等缺点。本研究在生物膜反应器培养方法的基础〔4〕上,建立一套生物膜的培养、计数、清洗的实验方法,在实验室对本方法体系进行了验证和评估。
1 材料与方法
1.1 试验材料
主要仪器设备有生物膜反应器、恒温摇床,由上
海精宏公司生产;超声波清洗机,由科导超声波仪器
有限公司生产;涡流振荡器、蠕动泵和扫描电镜,为
日本进口产品;聚焦激光扫描显微镜(ZEISS)。
实验菌株为铜绿假单胞杆菌(ATCC15442),
购自国家菌种保藏中心。
1.2 试验方法
1.2.1 试管生物膜培养法 用接种环从长满绿脓,生物膜一旦形成即具有较强的黏附力,很难清除。一般的抗生素和消毒剂很难穿透生物膜的胞外脂多糖基质层,造成杀灭和清〔2,3〕洗困难,为医院感染埋下隐患。为了研究生物膜的形成规律和清除方法,很多学者建立了生物膜各种培养方法和检测方法。常用的培养方法主要有用以定量检测微孔板法、试管法、置片法、平板膜片法、管路法、刚果红琼脂培养法、噻唑蓝比色法等,这些方法都能在一定程度上模拟生物膜的形成过程,〔作者简介〕 刘芝兰(1979-),女,山东人,博士,主要从事消毒灭
菌产品开发。
·310·ChineseJournalofDisinfection 2011;28(3)杆菌的斜面取菌苔接种到带有玻璃珠的生理盐水
67中,震荡混匀,使含菌量达到10cfu/ml～10cfu/ml。
再将生理盐水菌悬液从原液按20%体积分数为梯
度稀释至20%,共5组浓度菌悬液分装到无菌试管
内,置于孵箱内作静态培养。
1.2.2 玻片生物膜培养法 用15mm×15mm的盖
玻片,经脱脂处理后,再用磷酸盐缓冲液清洗干净,
自然凉干灭菌备用。将处理好的普通盖玻片放入六
孔板中,加入5ml0.3%TSB培养液,同时接种0.2
ml绿脓杆菌悬液混匀。将六孔板置于28℃温度条
件下培养24h,可连续培养1周,培养期间每隔24h
更换培养液,也可置于恒温摇床上进行振荡,模拟一
定的剪切效果。
1.2.3 生物膜反应器培养法 选取特定材质的生
物膜培养片(玻片、金属片或塑料片等),置于超声
波清洗机中清洗干净,再用去离子水冲洗,保持无
菌。将备好的生物膜培养片仔细安装在反应杆上,
旋紧固定螺丝,于主反应器中倒入500mlTSB溶
液。装配整套反应容器,用铝薄封闭多余的连接口,
于121℃压力蒸汽灭菌器内灭菌20min,冷却备用。
将主反应器平放在磁力搅拌器上,无菌接种1
ml含菌量为10cfu/ml绿脓杆菌菌悬液,使反应器
56内的菌液浓度达到10～10cfu/ml。打开磁力搅拌
器,以125rmp/min速度,在常温下震荡培养24h。
在储液罐中添加20L灭菌TSB溶液,打开蠕动泵,
控制流速在11.7ml/min,流动培养24h。在无菌条
件下,取下生物膜培养片,放入装有10ml生理盐水
试管中,超声震荡10min,进行活菌计数培养。生物
膜反应器及配套装置如图1所示。8成熟,如果着色较浅,说明生物膜基本没有形成或牢度不够。1.3.2 超声波活菌计数法实验方法 采用超声的方法来进行菌落计数,将生物膜培养片放入带盖子的玻璃瓶中,每个玻璃瓶中放入20ml无菌生理盐水,经一定功率超声一定时间后,取1ml样液进行培养计数。1.3.3 扫描电镜观测生物膜分析法 将生物膜样片经过乙醇梯度逐级脱水干燥处理,用导电胶固定在电镜上喷金,在扫描电镜下观测并拍照。1.3.4 激光共聚焦显微镜生物膜分析方法 选取培养好的生物膜样片,在激光共聚焦显微镜下观察到生物膜在不同时间点随清洗液流过时的形态。通过激光共聚显微镜可在第一时间直接观察到新鲜、完全水合的生物膜状态,利用特殊软件可作三维图象分析。1.4 生物膜去除清洗方法将恒温水浴调节至设定的温度(40℃),准备24根干净的20ml试管并依次编号。将7个待测样品按要求稀释,分别向对应编号的试管中加入10ml稀释液,将盛有稀释样品的试管放到稳定的水浴中保温10min,从计时开始以1min为间隔,依次向试管中加入长有绿脓生物膜的培养片,浸渍并且清洗30min。同样以1min为间隔,依次将试管中清洗完的生物膜培养片取出,用无菌的生理盐水润洗,并放入盛有20ml无菌生理盐水的瓶子中,对瓶中的样品定量分析菌膜的残留。2 结果
2.1 生物膜培养试验结果
2.1.1 结晶紫染色结果 在使用试管法和玻片法
培养生物膜时,结晶紫法可以快速直接的定性观测
到生物膜的存在情况。结果表明,所培养的样片上
结晶紫着色较深,显示绿脓杆菌生物膜形成比较成
熟(见扉页图2b)。经过不同的清洗剂清洗,管壁
上和样片上结晶紫基本不着色或着色较浅,指出生
物膜去除情况(见扉页图2ab)。
2.1.2 扫描电镜分析结果 扫描电镜观察结果表
明,生物膜中的绿脓杆菌通过胞外多糖相互连接,浓
密的粘液样物质紧紧的包裹着大量的绿脓杆菌,聚
集成团块状(图3)。经过超声计数,每片生物膜生
长片上的细菌量为10cfu/ml。
2.1.3 细菌计数法观察结果 采用超声方法将生
物膜从培养片上完全脱离下来。超声时间的长短对
细菌计数结果有明显影响。超声时间过短,会导致
,7 图1 生物膜反应器及配套装置1.3 生物膜鉴定分析方法1.3.1 结晶紫染色定性分析法 利用生物膜内物质可与某些染料结合的特点,通过染色的方法对生物膜进行定性或定量分析。结晶紫染色分析法是将结晶紫溶液浸润生物膜后,静止5min后用流动水冲洗试管壁或者玻片,然后定性的观测生物膜的生。
中国消毒学杂志2011年第28卷第3期·311·亡。经对不同超声震荡时间活菌计数结果显示,以
产生震荡5～10min,对生长在PC材质培养片上的
生物膜脱落混匀最好(图4)。
2.1.4 激光共聚焦显微镜观察结果 经过CLSM
动态观察发现,培养生长成的生物膜显示出多层结
构(图5a)。生物膜经过多酶清洗液清洗作用,其胞
外多糖出现分解,结构出现松散(图5b);继续清洗
后,生物膜随清洗液不断消失(图5c);继而被彻底
清除(图5d)
。2.2 生物膜清洗试验结果结果证明,生物膜反应器培养的生物膜片,经过标准清洗流程,不同方法表现出清洗结果不同。首先用不同的样品分别静止浸泡生物膜片30min,然后用无菌水轻轻冲洗,以去掉浮游菌;以水清洗的样品做为对照。活菌计数结果显示,以多酶清洗剂浸泡法清洗效果最好,对样片上生物膜清除率可达到90%以上(图6)
。
图3 绿脓杆菌生物膜电镜图片(SEM3000×和SEM5000×
) 图6 不同清洗液样品的生物膜去除率
3 讨论
近年来,对铜绿假单胞菌生物膜的研究已成为
对致病菌深入研究中的重点,研究进展最快。但
在如何培养标准的生物膜及去除生物膜的定量评价
方面,国内外学者虽然已做了大量的研究工作,但结
果各有不同。国内外学者先后研究过不同材质载体
〔6-11〕培养生物膜方法,试管法、微孔板法、置片法、
管路法和旋碟法等。通过这些方法培养的生物膜,
观察分析基因水平转移对生物膜生成的影响,铜绿
假单胞菌在生物膜状态下β-内酰胺酶及其褐藻胶
图4
超声时间与活菌计数的落数对应值〔5〕合成相关基因的表达差异,培养材质、培养时间、培
养温度、培养基加入方式、流速等诸多因素的影响。
生物膜的检测技术近年来也得到了长足的发
展,不同学者用菌体计数法来评估生物膜清除效果、
生物膜定量分析。
本研究采用生物膜反应器方法来培养标准的绿
脓杆菌生物膜,通过结晶紫染色法、扫描电镜观测法
以及活菌计数法,都证明得到的结果比较满意,载体
上绿脓杆菌生物膜生长成熟,黏附力较强。本研究
还观察了模拟医疗器械的清洗流程,观察对生物膜
清除效果。用激光共聚焦显微镜来检测清洗过程中
生物膜的形态变化,用活菌计数法评价不同清洗液
对生物膜的去除效果。此套方法经过多个样品的多〔12,13〕
图5 多酶清洗液作用于生物膜的动态过程次平行实验验证,证明其效果可靠、准确和结果稳
定,可进一步在实践中验证研究和完善。)
·314·ChineseJournalofDisinfection 2011;28(3)3 讨论
医院感染防控工作中,消毒剂的使用是重要的
一环,2002年版《消毒技术规范》中规定金黄色葡
萄球菌(ATCC6538)作为化脓性球菌的代表,用于
衡量消毒剂的杀灭能力。金黄色葡萄球菌通过获得
耐甲氧西林的抗生素抗性成为MRSA,通过质粒可
在细菌间传递。MRSA同时可能还获得针对消毒剂
抗性的基因,因此,通过MIC/MBC实验可以比较医
院感染MRSA与标准菌株对各种医院常用消毒剂
的抗力,评估消毒剂控制医院感染的作用。
本研究结果显示,以MIC为判定标准,所试验
的5种消毒剂对9株医院感染MRSA的MIC值分
别大于或等于标准菌株;以MBC为判定标准,除3
株对醋酸氯己定的MBC值大于标准菌株,其余皆小
于或等于标准菌株。结果提示,分别以MIC和MBC
为评价标准可得出不同的结论,有文献认为,由于消
毒剂效果评价依据是杀菌效果,因此以MBC值评估
消毒剂抗性比比MIC更合理。
葡萄球菌属对消毒剂的抗性机制,近几年研究
较多的有关质粒基因,抗消毒剂质粒是qac基因家
族。葡萄球菌属较易获得qacA或qacB基因而耐消
〔7,8〕毒剂,qac基因家族表达多种化合物外排泵,可
将季铵类化合物、双胍类化合物等排出菌体〔9〕〔6〕〔5〕对醋酸氯己定的抗力超过标准菌株,由此可见,在MRSA中可能存在其他抗性机制主导对消毒剂的抗力。参考文献〔1〕 徐燕,吴晓松,谈智,等.铜绿假单胞菌抗药基因检测及其对消毒剂抗性研究[J].中国消毒学杂志,2007,24(5):401.〔2〕 徐燕,吴晓松,谈智,等.鲍曼不动杆菌抗药基因检测及其对消毒剂抗性研究[J].中国消毒学杂志,2008,25(4):341.〔3〕 王晓蕾,吴晓松,谈智,等.三种革兰阴性杆菌抗消毒剂基因检测及其对碘伏的抗性研究[J].中国消毒学杂志,2009,26(1):8.〔4〕 糜祖煌,黄支密,秦玲.鲍氏不动杆菌耐药性和氨基糖苷类修饰酶、β-内酰胺酶基因研究[J].中华医院感染学杂志,2004,14(9):968.〔5〕 卫生部卫生法制与监督司.消毒技术规范[S].北京:中华人民共和国卫生部,2002.〔6〕 王晓蕾,戎毅,谈智,等.两种医院感染致病菌对聚醇醚碘和聚维酮碘的抗性比较[J].现代预防医学,2009,36(8):1530.〔7〕 蔡培泉,王春新,黄支密,等.阴沟肠杆菌耐药性、氯己定-磺胺耐药基因学研究[J].中华医院感染学杂志,2006,16(8):841.〔8〕 葛忆琳,朱仁义,陈越火,等.临床分离的金黄色葡萄球菌对消毒剂抗力及其抗药基因研究[J].中国消毒学杂志,2010,27(6):658.〔9〕 MitchellBA,BrownMH,S.QacAMultidrugeffluxpumpfromStaphylococcusaureus:comparativeanalysisofresistancetodiami-
dines,biguanidines,andguanylhydrazones[J].AntimicrobA-
gentsChemother,1998,42(2):475.
(收稿日期:2010-10-12)。本研究中9株医院感染MRSA未检出qacA/B基因,但仍然有多株MIC超过标准菌株,MBC中亦有三株
(上接第311页)
参考文献
〔1〕 CostertonJW,StewartPS,GreenbergEP.Bacterialbiofilms:a
commoncauseofpersistentinfections[J].Science,1999,284:
13182.
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tyissues[J].CurrentopinioninInfectiousDiseases,2005,18
(3):320.
〔3〕 邱侠,沈瑾,邢书霞,等.人工生物膜的制备及其清洗消毒特
性的初步研究[J].中国消毒学杂志,2010,27(3):244.
〔4〕 ASTME2562-07:StandardTestMethodforQuantificationof
PseudomonasaeruginosaBiofilmGrownwithHighShearandCon-
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〔5〕 黄晓敏,柯野,郑秋桦,等.铜绿假单胞菌生物膜对大蓟乙醇
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中国消毒学杂志2011年第28卷第3期·309·文章编号:1001-7658(2011)03-0309-04 【论著】
细菌生物膜培养及评估方法
刘芝兰,李 宇,刘 颋,邱 凯
(3M中国有限公司,上海 200233)
提要 目的 研究生物膜的不同生成模型和检测方法,用于清洗去除的评估。方法 采用生物膜反应器方法培养生物膜,用扫描电镜和激光共聚焦显微镜及细菌定量检测方法,对生物膜的形成和清除效果进行监测。结果 用生物膜反应器方法来培养标准的绿脓杆菌生物膜,通过结晶紫染色法、扫描电镜观测法以及活菌计数法,都证明载体上绿脓杆菌生物膜生长成熟,黏附力较强。用激光共聚焦显微镜法观察到,经过多酶清洗液清洗作用,样片上绿脓杆菌生物膜细菌胞外多糖出现分解,结构出现松散;继续清洗后,生物膜随清洗液不断消失,继而被彻底清除。结论 此系列生物膜培养方法,过程监测及菌落计数的量化方法,能有效衡量清洗剂生物膜清洗去除效果。
关键词 生物膜;清洗;清除效果;检测
中图分类号:R187 文献标识码:A
RESEARCHONTHEBACTERIABIOFILMCULTIVATIONANDEVALUATIONMETHODSLIUZhi-lan,LIYu,LIUTing,QIUKai
(3MResearchCenterofChina,Shanghai 200233,China)
Abstract Objective Tostudythedifferentbiofilmcultivationandprocessdetectionmethod,inordertoevaluateclean-ingeffect.Methods Biofilmreactorwasusedtocultivatebiofilm.Scanningelectronmicroscopy,confocallaserscanningmicroscopeandtotalplantcountmethodwereusedtodetectthebiofilmformationandremovalresult.Results Thestand-ardPseudomonasaeruginosabiofilmcultivatedbyreactorisprovedgrowthmatureandstronglyattachedonthecarrier.Thetestmethodisincludedcrystalvioletdyeing,scanningelectronmicroscopyandtotalplantcountmethods.Underconfocallaserscanningmicroscopedetection,wecouldseethatextracellularpolysaccharidesofP.aeruginosabiofilmwerebrokedown,thestructurewasloosed,andthebiofilmwasdisappearedstepbystep.Conclusion Thesebiofilmcultivation,processdetectionandtotalplantcountmethodscouldbeeffectivelyevaluatecleaner'sbiofilmremovalability.
Keywords biofilm;cleaning;removalefficacy;detection
生物膜是细菌为了适应生存环境而形成的与浮
游细胞相对应的生存形式,属于细菌在特殊环境下
的生存状态。细菌生物膜的形成过程是细菌与材料
表面接触附着,在材料表面形成菌落,菌落生长包埋
于胞外脂多糖基质中〔1〕但都存在生物膜生长牢度不足、判断生物膜形成时主观性较大、评判结果差异较大以及计数准确性不高等缺点。本研究在生物膜反应器培养方法的基础〔4〕上,建立一套生物膜的培养、计数、清洗的实验方法,在实验室对本方法体系进行了验证和评估。
1 材料与方法
1.1 试验材料
主要仪器设备有生物膜反应器、恒温摇床,由上
海精宏公司生产;超声波清洗机,由科导超声波仪器
有限公司生产;涡流振荡器、蠕动泵和扫描电镜,为
日本进口产品;聚焦激光扫描显微镜(ZEISS)。
实验菌株为铜绿假单胞杆菌(ATCC15442),
购自国家菌种保藏中心。
1.2 试验方法
1.2.1 试管生物膜培养法 用接种环从长满绿脓,生物膜一旦形成即具有较强的黏附力,很难清除。一般的抗生素和消毒剂很难穿透生物膜的胞外脂多糖基质层,造成杀灭和清〔2,3〕洗困难,为医院感染埋下隐患。为了研究生物膜的形成规律和清除方法,很多学者建立了生物膜各种培养方法和检测方法。常用的培养方法主要有用以定量检测微孔板法、试管法、置片法、平板膜片法、管路法、刚果红琼脂培养法、噻唑蓝比色法等,这些方法都能在一定程度上模拟生物膜的形成过程,〔作者简介〕 刘芝兰(1979-),女,山东人,博士,主要从事消毒灭
菌产品开发。
·310·ChineseJournalofDisinfection 2011;28(3)杆菌的斜面取菌苔接种到带有玻璃珠的生理盐水
67中,震荡混匀,使含菌量达到10cfu/ml～10cfu/ml。
再将生理盐水菌悬液从原液按20%体积分数为梯
度稀释至20%,共5组浓度菌悬液分装到无菌试管
内,置于孵箱内作静态培养。
1.2.2 玻片生物膜培养法 用15mm×15mm的盖
玻片,经脱脂处理后,再用磷酸盐缓冲液清洗干净,
自然凉干灭菌备用。将处理好的普通盖玻片放入六
孔板中,加入5ml0.3%TSB培养液,同时接种0.2
ml绿脓杆菌悬液混匀。将六孔板置于28℃温度条
件下培养24h,可连续培养1周,培养期间每隔24h
更换培养液,也可置于恒温摇床上进行振荡,模拟一
定的剪切效果。
1.2.3 生物膜反应器培养法 选取特定材质的生
物膜培养片(玻片、金属片或塑料片等),置于超声
波清洗机中清洗干净,再用去离子水冲洗,保持无
菌。将备好的生物膜培养片仔细安装在反应杆上,
旋紧固定螺丝,于主反应器中倒入500mlTSB溶
液。装配整套反应容器,用铝薄封闭多余的连接口,
于121℃压力蒸汽灭菌器内灭菌20min,冷却备用。
将主反应器平放在磁力搅拌器上,无菌接种1
ml含菌量为10cfu/ml绿脓杆菌菌悬液,使反应器
56内的菌液浓度达到10～10cfu/ml。打开磁力搅拌
器,以125rmp/min速度,在常温下震荡培养24h。
在储液罐中添加20L灭菌TSB溶液,打开蠕动泵,
控制流速在11.7ml/min,流动培养24h。在无菌条
件下,取下生物膜培养片,放入装有10ml生理盐水
试管中,超声震荡10min,进行活菌计数培养。生物
膜反应器及配套装置如图1所示。8成熟,如果着色较浅,说明生物膜基本没有形成或牢度不够。1.3.2 超声波活菌计数法实验方法 采用超声的方法来进行菌落计数,将生物膜培养片放入带盖子的玻璃瓶中,每个玻璃瓶中放入20ml无菌生理盐水,经一定功率超声一定时间后,取1ml样液进行培养计数。1.3.3 扫描电镜观测生物膜分析法 将生物膜样片经过乙醇梯度逐级脱水干燥处理,用导电胶固定在电镜上喷金,在扫描电镜下观测并拍照。1.3.4 激光共聚焦显微镜生物膜分析方法 选取培养好的生物膜样片,在激光共聚焦显微镜下观察到生物膜在不同时间点随清洗液流过时的形态。通过激光共聚显微镜可在第一时间直接观察到新鲜、完全水合的生物膜状态,利用特殊软件可作三维图象分析。1.4 生物膜去除清洗方法将恒温水浴调节至设定的温度(40℃),准备24根干净的20ml试管并依次编号。将7个待测样品按要求稀释,分别向对应编号的试管中加入10ml稀释液,将盛有稀释样品的试管放到稳定的水浴中保温10min,从计时开始以1min为间隔,依次向试管中加入长有绿脓生物膜的培养片,浸渍并且清洗30min。同样以1min为间隔,依次将试管中清洗完的生物膜培养片取出,用无菌的生理盐水润洗,并放入盛有20ml无菌生理盐水的瓶子中,对瓶中的样品定量分析菌膜的残留。2 结果
2.1 生物膜培养试验结果
2.1.1 结晶紫染色结果 在使用试管法和玻片法
培养生物膜时,结晶紫法可以快速直接的定性观测
到生物膜的存在情况。结果表明,所培养的样片上
结晶紫着色较深,显示绿脓杆菌生物膜形成比较成
熟(见扉页图2b)。经过不同的清洗剂清洗,管壁
上和样片上结晶紫基本不着色或着色较浅,指出生
物膜去除情况(见扉页图2ab)。
2.1.2 扫描电镜分析结果 扫描电镜观察结果表
明,生物膜中的绿脓杆菌通过胞外多糖相互连接,浓
密的粘液样物质紧紧的包裹着大量的绿脓杆菌,聚
集成团块状(图3)。经过超声计数,每片生物膜生
长片上的细菌量为10cfu/ml。
2.1.3 细菌计数法观察结果 采用超声方法将生
物膜从培养片上完全脱离下来。超声时间的长短对
细菌计数结果有明显影响。超声时间过短,会导致
,7 图1 生物膜反应器及配套装置1.3 生物膜鉴定分析方法1.3.1 结晶紫染色定性分析法 利用生物膜内物质可与某些染料结合的特点,通过染色的方法对生物膜进行定性或定量分析。结晶紫染色分析法是将结晶紫溶液浸润生物膜后,静止5min后用流动水冲洗试管壁或者玻片,然后定性的观测生物膜的生。
中国消毒学杂志2011年第28卷第3期·311·亡。经对不同超声震荡时间活菌计数结果显示,以
产生震荡5～10min,对生长在PC材质培养片上的
生物膜脱落混匀最好(图4)。
2.1.4 激光共聚焦显微镜观察结果 经过CLSM
动态观察发现,培养生长成的生物膜显示出多层结
构(图5a)。生物膜经过多酶清洗液清洗作用,其胞
外多糖出现分解,结构出现松散(图5b);继续清洗
后,生物膜随清洗液不断消失(图5c);继而被彻底
清除(图5d)
。2.2 生物膜清洗试验结果结果证明,生物膜反应器培养的生物膜片,经过标准清洗流程,不同方法表现出清洗结果不同。首先用不同的样品分别静止浸泡生物膜片30min,然后用无菌水轻轻冲洗,以去掉浮游菌;以水清洗的样品做为对照。活菌计数结果显示,以多酶清洗剂浸泡法清洗效果最好,对样片上生物膜清除率可达到90%以上(图6)
。
图3 绿脓杆菌生物膜电镜图片(SEM3000×和SEM5000×
) 图6 不同清洗液样品的生物膜去除率
3 讨论
近年来,对铜绿假单胞菌生物膜的研究已成为
对致病菌深入研究中的重点,研究进展最快。但
在如何培养标准的生物膜及去除生物膜的定量评价
方面,国内外学者虽然已做了大量的研究工作,但结
果各有不同。国内外学者先后研究过不同材质载体
〔6-11〕培养生物膜方法,试管法、微孔板法、置片法、
管路法和旋碟法等。通过这些方法培养的生物膜,
观察分析基因水平转移对生物膜生成的影响,铜绿
假单胞菌在生物膜状态下β-内酰胺酶及其褐藻胶
图4
超声时间与活菌计数的落数对应值〔5〕合成相关基因的表达差异,培养材质、培养时间、培
养温度、培养基加入方式、流速等诸多因素的影响。
生物膜的检测技术近年来也得到了长足的发
展,不同学者用菌体计数法来评估生物膜清除效果、
生物膜定量分析。
本研究采用生物膜反应器方法来培养标准的绿
脓杆菌生物膜,通过结晶紫染色法、扫描电镜观测法
以及活菌计数法,都证明得到的结果比较满意,载体
上绿脓杆菌生物膜生长成熟,黏附力较强。本研究
还观察了模拟医疗器械的清洗流程,观察对生物膜
清除效果。用激光共聚焦显微镜来检测清洗过程中
生物膜的形态变化,用活菌计数法评价不同清洗液
对生物膜的去除效果。此套方法经过多个样品的多〔12,13〕
图5 多酶清洗液作用于生物膜的动态过程次平行实验验证,证明其效果可靠、准确和结果稳
定,可进一步在实践中验证研究和完善。)
·314·ChineseJournalofDisinfection 2011;28(3)3 讨论
医院感染防控工作中,消毒剂的使用是重要的
一环,2002年版《消毒技术规范》中规定金黄色葡
萄球菌(ATCC6538)作为化脓性球菌的代表,用于
衡量消毒剂的杀灭能力。金黄色葡萄球菌通过获得
耐甲氧西林的抗生素抗性成为MRSA,通过质粒可
在细菌间传递。MRSA同时可能还获得针对消毒剂
抗性的基因,因此,通过MIC/MBC实验可以比较医
院感染MRSA与标准菌株对各种医院常用消毒剂
的抗力,评估消毒剂控制医院感染的作用。
本研究结果显示,以MIC为判定标准,所试验
的5种消毒剂对9株医院感染MRSA的MIC值分
别大于或等于标准菌株;以MBC为判定标准,除3
株对醋酸氯己定的MBC值大于标准菌株,其余皆小
于或等于标准菌株。结果提示,分别以MIC和MBC
为评价标准可得出不同的结论,有文献认为,由于消
毒剂效果评价依据是杀菌效果,因此以MBC值评估
消毒剂抗性比比MIC更合理。
葡萄球菌属对消毒剂的抗性机制,近几年研究
较多的有关质粒基因,抗消毒剂质粒是qac基因家
族。葡萄球菌属较易获得qacA或qacB基因而耐消
〔7,8〕毒剂,qac基因家族表达多种化合物外排泵,可
将季铵类化合物、双胍类化合物等排出菌体〔9〕〔6〕〔5〕对醋酸氯己定的抗力超过标准菌株,由此可见,在MRSA中可能存在其他抗性机制主导对消毒剂的抗力。参考文献〔1〕 徐燕,吴晓松,谈智,等.铜绿假单胞菌抗药基因检测及其对消毒剂抗性研究[J].中国消毒学杂志,2007,24(5):401.〔2〕 徐燕,吴晓松,谈智,等.鲍曼不动杆菌抗药基因检测及其对消毒剂抗性研究[J].中国消毒学杂志,2008,25(4):341.〔3〕 王晓蕾,吴晓松,谈智,等.三种革兰阴性杆菌抗消毒剂基因检测及其对碘伏的抗性研究[J].中国消毒学杂志,2009,26(1):8.〔4〕 糜祖煌,黄支密,秦玲.鲍氏不动杆菌耐药性和氨基糖苷类修饰酶、β-内酰胺酶基因研究[J].中华医院感染学杂志,2004,14(9):968.〔5〕 卫生部卫生法制与监督司.消毒技术规范[S].北京:中华人民共和国卫生部,2002.〔6〕 王晓蕾,戎毅,谈智,等.两种医院感染致病菌对聚醇醚碘和聚维酮碘的抗性比较[J].现代预防医学,2009,36(8):1530.〔7〕 蔡培泉,王春新,黄支密,等.阴沟肠杆菌耐药性、氯己定-磺胺耐药基因学研究[J].中华医院感染学杂志,2006,16(8):841.〔8〕 葛忆琳,朱仁义,陈越火,等.临床分离的金黄色葡萄球菌对消毒剂抗力及其抗药基因研究[J].中国消毒学杂志,2010,27(6):658.〔9〕 MitchellBA,BrownMH,S.QacAMultidrugeffluxpumpfromStaphylococcusaureus:comparativeanalysisofresistancetodiami-
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(收稿日期:2010-10-12)。本研究中9株医院感染MRSA未检出qacA/B基因,但仍然有多株MIC超过标准菌株,MBC中亦有三株
(上接第311页)
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