538 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2015, 46(5) · · 中国医药工业杂志
药学管理与信息
再谈仿制药研发中杂质研究思路之我见
Re-discussion on the Studies of Related Substances in Generic Drugs
谢沐风
(上海市食品药品检验所，上海 201203)
XIE Mufeng
(Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201203)
摘要：本文阐述了仿制药研发中如何根据原研制剂杂质谱剖析测得结果，来科学合理地制订仿制原料药与仿制制剂中杂质控制策略，并从临床用药的宏观角度和具体杂质研究的微观思路上阐明杂质研究中应把握的“度”，为仿制药杂质的理性研究提供一些借鉴。
关键词：仿制药研发；杂质研究；控制策略
中图分类号：R95 文献标志码：C 文章编号：1001-8255(2015) 05-0538-09DOI ：10.16522/j.cnki.cjph.2015.05.024
自2013年11月在本刊发表“仿制药研发中有关物质研究思路之我见”后[1]，收到大量同仁来电来函交流。积累1年多心得，撰写此续篇，希冀能将某些观点阐述得更为清楚明了，进而为我国仿制药研发中杂质研究思路与控制策略提供1种更为客观理性的认知，为将有限的资源用到研发关键之处提供一些参考。1 从宏观上解读杂质
1.1 杂质与药物不良反应的关系
很多同仁都认为杂质与药物的不良反应息息相关，认为杂质越小或越少、临床不良反应发生几率也就越小或越少，进而在进行杂质研究与控制时，力求面面俱到、尽善尽美。殊不知，引起药物不良反应的原因是多方面的，并不仅仅是药物中的杂质。人用药品注册技术要求国际协调会(ICH ) 于2002年9月12日颁布了《疗效--M4E (R1) 人用药品注册的通用技术文档：模块2的临床回顾和临床概述与模块5：临床研究报告》[2]，其中阐述道：关于
收稿日期：2015-01-10
作者简介：谢沐风(1972-)，男，副主任药师，从事药品品质评价与研发。
Tel ：021-38839900×26832E-mail ：[email protected]
药物的不良反应，常见的有关因素包括剂量、单位剂量、总剂量、给药方案、疗程、人口统计学特征(如年龄、性别、种族)、联合用药、其他基础特征(如肾功能状态)、效能特性和药物浓度等。可见，药物不良反应主要与主成分的不合理使用以及患者个人体质差异相关。不同给药方式下杂质与药物不良反应间的关系解读如下。1.1.1 口服给药
口服给药是1种较为安全的给药方式。但若用法用量不当、超出安全用药浓度上限时，将对人体带来伤害、产生不良反应[3](如治疗窗狭窄药物常发生此情形)。目前我国此类药物的主要问题是：部分仿制药质量与原研药存在较大差距，主要是在患者体内生物利用度的差异[4]；生物利用度又与体外溶出行为密切相关。国家食品药品监督管理总局(SFDA ) 自2008年起开展“国家药品评价性抽验”工作至今，已发现国内已上市的部分口服固体制剂体外多条溶出曲线与原研制剂有显著性差异[5]。1.1.2 静脉滴注给药
有同仁认为，静脉滴注给药方式已无生物利用度问题，此时不良反应与杂质密切相关，故应着重关注。笔者认为这种认知是偏颇的。此种给药方式
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使得药物直接进入封闭的血液循环系统中，当外来物质(包括葡萄糖注射液、氯化钠注射液、药物主成分、少量杂质、辅料和微量颗粒等)“一股脑儿地侵入”时，其中呈现出的不良反应强弱与患者的秉承制剂质量标准仅关注降解杂质的原则[8]，在前些年的国外药典和进口质量标准中很多制剂品种并无有关物质检查项，这也是合理的：经研究当“原料药制成0天制剂”和“0天制剂在加速试验6身体机能以及主成分的自身毒性及用法用量息息相关。此种给药方式带来的不良反应即便是小概率事件，但其发生率远高于肌肉注射和口服给药方式。故世界卫生组织(WHO ) 早在多年前就已制订了用药要遵循“能不用就不用，能少用就不多用；能口服不肌注，能肌注不输液”的原则。然而过去的10多年间，我国临床用药大量使用静脉滴注给药方式[6]，使得临床不良反应发生率增高；并在2006～2007年间集中爆发了几起影响恶劣的药害事件，引起各方关注[7]。部分专家将其归咎为仅是杂质所为，其实，此类制剂的质量安全性风险不仅仅在于杂质，还与微生物、热原或细菌内毒素、不溶性微粒和可见异物等密切相关。1.2 杂质与药物质量控制的关系
为最大限度地确保临床安全性，ICH 在Q3 A和B 指导原则中设定了评估杂质的“三条限”，即报告限、鉴定限和质控限。报告限：小于该限度的杂质，无关注价值，故无需积分。鉴定限：笼统法(主成分自身对照法或面积归一化法) 测定结果不大于该限度的杂质，仅需报告测定结果，无需研究、也无需鉴定结构，不会对临床带来安全性问题 ；超过该限度的杂质，则需厘清化学结构。质控限(qualification threshold，也称“界定限”) ：准确法(杂质对照品法或主成分+校正因子法) 测定结果不大于限度时，无需深入研究，该限度下的杂质不会对临床带来安全性问题。对于货架期内含量超出质控限的杂质应进行动物毒理研究，确定临床使用时的安全限，且药品中的该杂质含量应在效期内不大于该限，并将该限订入质量标准。这“三条限”为仿制药研发中杂质控制策略提供了科学合理的参考。同时，人们还力图通过杂质控制来保证生产过程的可控性、批内或批间品质的均一性、辅证主成分在货架期内的稳定性等来满足评价药物质量的需求。1.3 发达国家向非发达国家施放的“烟雾弹”1.3.1 第一枚烟雾弹——杂质
个月、长期试验6个月或货架期内”，这2个环节中杂质都无变化，在制剂的质量标准中便无需制订有关物质检查项。但近些年，这些标准中开始制订并收载大量杂质。乍看起来甚是高标准、严要求，但笔者认为这是在施放“烟雾弹”，目的是引仿制者误入歧途。
解读如下案例：某一普通口服片剂进口质量标准(规格为0.125～1.0 mg ) 中收载了12个已知杂质，并采用了极为复杂的色谱系统进行测定，还引入校正因子逐一准确计算，制定了每一杂质限度。秉承上述原则，该药物是不可能在效期内有12个降解杂质产生的。果然，经对数批货架期内原研制剂样品予以检测，绝大部分杂质均未检出(报告限以下)，仅有1～2个杂质含量在报告限以上、鉴定限以下。可令人遗憾的是，很多同仁唯进口质量标准或国外药典马首是瞻，花费大量资源设法获得那12个杂质，最终经研究，在仿制原料药和仿制制剂中均是未检出。
笔者推荐该品种的研发思路如下。①测定3批原研制剂，经剖析杂质谱，无含量不断增加的杂质；②测定3批规模化生产的仿制原料药与仿制制剂样品，无制剂鉴定限以上杂质，且无含量不断增加的杂质；③根据以上研究结果，最终质量标准中无需制订有关物质检查项。甚至可以采取更为大胆的做法——由于主成分规格很小，且每日最多口服3片，故杂质与残留溶剂均无需研究，只需在申报材料中阐明“经推算这些物质的每日最高摄入量均小于每日临床安全摄入限度”即可。
还有一进口外用涂抹皮肤的乳膏剂质量标准，制订了8个已知杂质。本人认为这些均是原研企业对仿制者施放的烟雾弹，以阻碍仿制进程、迷惑研发方向。
据笔者所知，目前全世界绝大多数原料药已由发展中国家生产后出口至欧美国家，欧美国家将这些杂质含量极低的原料药经特殊处理后(例如重结
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晶后制成目标晶型、粒度分布、颗粒形状、比表面能等特性) 制成制剂，再销往全世界获取高额利润，其质量毋庸置疑[9]。至于国外药典原料药项下罗列的众多杂质，且毫无保留地给出了结构式，还可购得(价格不菲)，更是见仁见智。1.3.2 第二枚烟雾弹——溶出度试验
各剂型皆有关键性评价指标，这在ICH Q6文件(规范：新原料药和新药制剂的测试方法和认可标准：化学物质) 和WHO 药品标准专家委员会第43次技术报告一书中均有阐述[10,11]。发达国家针对这些关键性评价指标，一者隐含(仅在严格保密的、企业内控质量标准中才有)，二者即便公开、也大多为宽松的试验参数与限度范围。如对于口服固体制剂，最为核心的是溶出度试验[12]。笔者曾接触过上百个原研制剂多条溶出曲线测定结果，发现相当一部分国外药典和进口质量标准中的试验参数都极为宽松、不具区分力(如15 min 已溶出85％以上或未采用关键溶出介质)。盖因该试验太重要，故发达国家在制订ICH Q系列质量管理文件时都未有专门论述，唯《日本溶出曲线数据库》收载的实验条件较具区分力。
因生物等效性(BE ) 试验仅采用年轻男性作为受试者有其局限性，日本自20世纪90年代起就十分重视体外溶出度试验。在无法采用各种人群大标本试验的前提下，只能通过对体外溶出度试验的严格要求来促使仿制制剂内在品质趋近原研制剂[5,13]。为此，日本在《仿制药生物等效性试验指导原则》中制订了详尽的溶出度试验研究比对要求[14][谢沐风. 日本仿制药生物利用度指导原则. 药品技术审评论坛, 2008年第3期(总第21期)]。同时，日本官方已建立起700多个品种的原研制剂4条溶出曲线数据库，并予以公开，该项工作还在不断进行中。
而欧美的公开资料中大多宣称：体内生物利用度试验才具有最终决定性，不太强调体外溶出度试验。但通过解读他们公开文献中的溶出度试验参数，发现多数不具区分力、甚至干脆不公开。如英国药典收载的制剂很少，有些难溶性口服固体制剂竟没有溶出度试验，甚至没有1个缓控释制剂品种有释放度试验[15]。如按此种不具区分力的实验条件去
研制仿制制剂，则多半会出现“部分仿制药对于部分患者安全无效”的结果。因此，只有依靠科学客观的评价手段，才能做出与原研制剂内在品质无限趋近的高品质仿制药来。
1.3.3 第三枚烟雾弹——潜在基因毒性杂质
其实，只要观测仿制原料药的起始物、副产物、试剂、配位体、催化剂等是否具备文献报道的“基因毒性杂质官能团”[16]，并针对规模化生产的仿制原料药3批样品中检出的鉴定限(0.10％) 以上特有杂质(即原研制剂中不存在)，如具备这些结构式(见图1)，再进行相应研究。
今后一定还会有其他“烟雾弹”发射过来，如近期兴起的“金属杂质研究”等。1.3.4 应对策略
⑴针对进口质量标准：相关药品检验机构进行复核时，应要求企业提供详尽的检测法验证资料，着重审阅质量标准中的各项试验参数是如何建立的，关注其逻辑推导过程，是经怎样的研究与试验结果确定的。如未尽详细，应要求对方持续提供。如溶出度试验，为何申报中制订了100 r/min高转速和该溶出介质？是否研究过50和75 r/min溶出行为，以及其他介质的溶出情况后综合考虑确定？是否有故意放宽、让自我产品永远合格的嫌疑？又比如有关物质，为何订入这么多杂质和如此低的限度，制订的依据是否充分等。
⑵针对公开的各国药典与文献资料：切忌照搬照抄、盲目迷信。我国药品审评中心(CDE ) 早在2003年就已提出“仿产品不是仿标准”的指导思想[17]，就是希冀同仁在具体研制时能独立思考、冷静分析。该宗旨中的“标准”不仅仅指国内质量标准，也包括国外标准及文献。
总之，无论如何都应获取至少3批原研制剂，深度剖析其关键质量特性参数后再来指导仿制药的开发，以及制订质量标准等事宜[15]，这才是研发的根本出发点(FDA 仿制药办公室. “质量源于设计”理念应用于仿制药申报[M ]. 北京大学药物信息与工程研究中心译, 2012)。 2 从微观上予以研究
以上阐述并非强调不研究杂质，而是希望在进
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A
N -羟基苯胺N -hydroxyaryls N -酰化氨基苯N -acylated aminorryls
氮杂芳基N -氧化物aza-aryl N -oxides 芳香胺和烷基取代的芳酰胺aminoaryls and alkylated aminoaryls
芳香族化合物
H
2
NH 2
醛aldehydes
N -亚甲基醇N -methylols N -亚硝基胺N -nitrosamines 硝基化合物nitro compounds 氨基甲酸类carbamates
H halogen N A A
N
N 环氧丙烷epoxides 氮丙啶类aziridines 环丙酯propiolactones β-卤代烷肼和偶氮化合物
N or S mustards hydrazines and azo compounds
烷烃和环烷烃类化合物
halogen
卤代烯烃halo-alkenes
halogen
迈克尔加成反应受体膦酸酯或磺酸酯Michael-reactive alkyl esters of phosphonates
acceptors or sulfonates
烷烃和环烷烃卤代物
primary halides
含杂原子化合物
A=烷烃基、芳香基或H ；X=卤素(F 、Cl 、Br 、I )；EGW=吸电子取代基，如氰基、羰基或酯基等
图1 建议进行基因毒性杂质分析的结构单元
行仿制药研制时能够把握好“度”。下面以既有质量标准存在的前提下，详述六类仿制药研发思路。2.1 杂质谱的测定与研究对象
该理念的提出富有针对性，即通过测得原研制剂杂质谱来客观合理地控制仿制原料药和仿制制剂中杂质被允许存在的程度。逻辑树如下：
原研制剂杂质谱→仿制原料药杂质谱→仿制制剂杂质谱
需强调的是，无需测得原研原料药杂质谱(实际上也难以获得样品)，一者与临床无关，二者其往往与仿制原料药合成路径殊途同归。如此，国外药典收载的原料药质量标准项下大量已知杂质也就无需全部获得并逐一研究，最多仅研究其中主成分降解产生的杂质(以下简称“降解杂质”)，因这些降解杂质在仿制品中也往往存在。2.2 杂质谱测定法：色谱条件建立过程
既然要进行以上3种来源样品的杂质谱比较，就应在同一色谱条件下予以测定，才具可比性。由于是六类仿制药，故色谱条件的建立往往可参考和借鉴既有制剂或原料药质量标准中的色谱条件(以下简称“既有标准”)。建立过程如下。
2.2.1 用既有标准中罗列的所有已知杂质来验证色谱条件的系统适用性
很多同仁认为这一步很重要，所以为了验证各已知杂质的彼此分离度以及与主成分峰的分离度，花巨资购买来或自制出所有杂质对照品。但笔者认为该步验证必要性并不强，因这些已知杂质大多仅与原研原料药的合成路径相关，而与仿制品无关，在原研制剂和仿制品中很多均是未检出(报告限以下)。笔者建议的应对方案如下。
①由于既有标准已具备相当的权威性，故可认为已具备良好的耐受性，无需再获取罗列的所有杂
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质予以验证，直接沿用既有标准色谱条件，即可认为能分离检测出既有标准中的所有杂质。虽说制剂质量标准仅针对降解杂质，但通常该色谱条件的建立也要确保原料药中的合成杂质不干扰降解杂质的测定[18]。因此，这些标准本身就已具备较强的检测能力。
②对既有标准的色谱条件进行微调，通常是减少流动相中有机相比例或延长梯度洗脱时间，使所有色谱峰保留时间延长。此法通常更有利于各物质间的分离。此时，也无需再取对照品验证。
③厘清既有标准中与主成分最难分离的1～2个杂质[19]，随后仅验证该杂质峰与主成分峰的分离即可。至于其他杂质间能否有效分离，只要在检测各样品杂质谱时均未检出，即无需再深入研究。即便检出，只要这些杂质不是需针对性准确测定的降解杂质，也无需再深入研究，因峰重合更提高了对仿制药的质控要求。
以上3种做法研究者可根据品种具体情形酌情遴选。
2.2.2 所建立的色谱条件应能分离检测出仿制原料药中的目标杂质
采用“2.2.1”项下所建立的色谱条件验证：①分离检测仿制原料药合成步骤各中间体和起始物等与主成分峰的分离度，因为这些物质最易残留于产品中[18]；验证时所配制的系统适用性试验溶液应是主成分浓度为100％、各杂质浓度约1.0％[19]。②采用原料药精制前的粗品予以验证。③采用存在于仿制品中的针对性目标杂质予以验证。经过上述步骤所建立的色谱条件通常应为：采用普通粒径25 cm 长色谱柱、流速1.0 ml/min前提下，主成分峰保留时间不小于15 min ，测定3～4倍保留时间至60～90 min结束；只要溶液稳定性良好[20]，测定时应尽可能采用自动进样设备、以充分利用下班后时间来提高检测效能。同时，无需担心由于保留时间长、部分含量较低的杂质峰难以积分出，此时只要将积分参数中的斜率设置得小些、峰宽设置得大些便不会有漏检(最小峰面积按报告限设置)。2.2.3 研究勿苛求完美
很多研发人员力求检测出仿制品中可能存在的
所有潜在杂质，其实大可不必。关于研究逻辑思路与着眼点，在ICH Q3A和B 指导原则中早已阐明：秉承“逆向分析”思路——即从检测规模化生产的3批仿制原料药和仿制制剂样品入手，获得报告限以上杂质谱；随后与“正向分析”结合(通常仅选取合成中间体和起始物料，因为这些杂质最易残留于规模化生产的终产品中)，如2种分析所得杂质相对应，研究结束；如存在未对应杂质，仅针对原料药鉴定限以上的杂质才考虑厘清来源、适度研究。
关于是否存在“漏检杂质”，可采用以下3法予以验证。①对于包裹于主成分峰的含量较大或不增加杂质，一般可通过二极管阵列检测器(DAD ) 探明。②对于“逸出”于所建色谱条件以外的含量较大或不增加杂质，则可通过至少两法测定主成分含量、观测结果是否“殊途同归”的办法予以探明，或是在连续测定中在其后样品中被检出。③对于含量不断增加的杂质，自会在稳定性考核(加速和长期) 试验中“主成分含量下降量与总杂质增加量间相辅相成性(以下简称相辅相成性)”上体现出来，此时再着手亦不迟。实际工作中，出现以上3种情形的概率均不大。
总之，我们应客观理性地认知到“任何检测法都不是万能”的，即便有漏检杂质，只要这些杂质含量在制剂鉴定限或质控限以下，临床应用时引起不良反应的可能性就不大。2.3 检测各样品杂质谱
采用“2.2”项下建立的色谱条件分别测定以下各样品。
2.3.1 原研制剂杂质谱
一者可通过测定至少3批不同货架期时间点的样品(应有1批临近效期)；二者可采用1批样品，对其进行至少6个月加速试验测得(加速试验的时长根据效期相应制订)。无需采用强破坏试验，因实际情况根本不存在。随后厘清“不断增加的降解杂质”和“不增加杂质”。2.3.2 测得仿制原料药杂质谱
一般通过测定至少3批规模化生产样品和加速试验6个月或长期试验N 个月样品获得，厘清“不
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断增加的降解杂质”和“不增加杂质”。2.3.3 测得仿制制剂杂质谱
同“2.3.2”项下操作。
这里需强调的是，测定以上各样品杂质谱时，均应严格按照ICH 设定的原料药报告限(0.05％) 予以积分(考虑到杂质谱的可比连贯性，制剂积分时也建议依照该限)。但遗憾的是，有部分研究人员积分时将最小峰面积设定得很小，导致小于报告限的大量杂质被积分出，随后为了研究、又将Y 轴设置得也很小、视野放得很大进行观测。
对于仿制品中含量大于原料药鉴定限的杂质建议厘清化学结构与来源。
2.4 对仿制原料药或仿制制剂中杂质谱的控制要求2.4.1 针对仿制制剂与原研制剂共有的降解杂质
要求此类杂质在仿制制剂中的降解速度不得大于原研制剂，由此效期才能不短于原研制剂(一般此类杂质临近效期时含量会超出制剂质控限)。以往可通过缩短仿制制剂效期使降解杂质符合质量标准限度，但现今各国纷纷提高了仿制药研发要求，其中一点就是“效期不得短于原研制剂”[21]。
降解速度的表达建议采用作图法，即以时间(月份) 为横坐标，杂质含量为纵坐标，线性回归计算得斜率，仿制制剂斜率不大于原研制剂即可，由此便可推断出未来目标时间点仿制制剂中的降解杂质符合限度要求。因此，在以原研制剂为对比的前提下，仿制制剂进行6个月加速试验也完全可考虑递交“暂定效期长于2年”的申请，只是此时建议长期试验增加或直接采用中间试验[30 ℃、相对湿度(RH ) 65％]予以考察[8]。
此类杂质在质量标准中通常需采用准确法测定。2.4.2 针对仿制制剂与原研制剂共有的、含量不增加的杂质
此类杂质通常为原料药中合成工艺杂质、起始物等。具体要求如下。
①当原研制剂中该杂质含量大于制剂鉴定限时，仿制制剂中该杂质含量应不大于原研制剂。
②当原研制剂中该杂质含量小于制剂鉴定限时，仿制制剂中该杂质含量可大于原研制剂，但必须仍不大于制剂鉴定限[8,22]。
此类杂质检测时采用笼统法即可。如用准确法测定，对应限度可相应改为制剂质控限。2.4.3 针对仿制品中的特有杂质[23]
由于CDE 对杂质要求较为严格，故建议厘清来源、鉴定结构，并确认不具备潜在基因毒性杂质官能团。一类为含量不变化杂质，来源同“2.4.2”项。此时，笼统法测定结果不大于制剂鉴定限，或准确法测定结果不大于制剂质控限，即可不必再做深入研究。另一类为含量不断增加的新增降解杂质，依然是效期内满足以上要求即可[22]。一旦笼统法测定结果超过鉴定限，就需准确测定：获得杂质对照品、确证其结构、测得纯度值，计算校正因子等。2.4.4 杂质总量
参照既有标准拟定。此时，仿制制剂只要符合既有标准、实际含量即便高于原研制剂亦无妨。因该限度值是由原研企业或国外药典规定，已经临床充分论证。
2.4.5 仿制制剂与原研制剂的质量对比
业内普遍存在“杂质种类或量一致、甚至杂质量少于原研制剂，仿制药质量就与原研药一致、甚至超越”的思维模式，其实，杂质含量只要在规定限度下就没有可比性。3 对研发热点的概念解读
3.1 客观理解强破坏试验和影响因素试验[10]
探求药物内在稳定性的手段由弱到强依次为：①长期试验(包括中间试验)；②加速试验；③影响因素试验；④强破坏试验。通常情况下药物是不可能遭遇到③和④情形的。之所以进行，是期望通过较为激烈的外界刺激来洞悉药物易受何条件影响、发生降解或质变，从而在药物生产、包装、贮藏、运输等环节规避该条件，以保证药物在效期内的质量稳定性。针对①和②试验，既要洞悉药物随时间推移时关键指标是否有变化，还要关注若发生变化，是否呈现相辅相成性。若非，说明有较大杂质漏检，建立的有关物质检测法需进一步完善，此时才考虑通过③和④手段去寻找那些“丢失的杂质”。若是，即便有漏检杂质，含量也应在制剂鉴定限以下。因此，上述③和④产生的杂质在实际样品中一般不会存在，也就无需研究这些降解杂质，仅验证分离度
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即可，以保证样品遭遇不可知极端条件时，即便产生杂质也能被检出。
很多同仁针对该实验所产生的杂质做了大量研究，但最终结论几乎没有推翻已建立色谱条件的。其实，只要保证主成分峰保留时间在15 min后，且适度破坏(使杂质产生5％～15％)，该实验则可顺利完成。至于需验证“破坏后的物料平衡”，该专业认知与要求至今未在任何国家级指导原则上发布。笔者认为，持有该观点的同仁是与“①和②试验中的相辅相成性”混淆了，故不应强求[24]。3.2 举足轻重的加速试验
由于长期试验较为耗时，故一般采用加速试验。该实验在验证辅料相容性、成品采用何种包装更经济实用等众多方面均极为实用。为减小误差、更准确测定主成分含量变化情况以窥探是否有降解，强烈建议含量测定法中的溶液浓度设定得低一些，一者有利于与相邻杂质峰的分离，再者主成分峰形变、峰面积变小，更能提高测定精密度、提升准确性。
3.3 主成分与辅料的相容性研究
该试验目的是探求主成分易受何辅料影响导致降解，但绝非试验结果不理想就剔除该辅料，因所采用的试验条件可能与实际情况不符，只是“大胆假设、小心求证”，只有当尝试用该处方进行加速试验后，若发生杂质超标、不符合规定或不满足控制策略时，才考虑更改制剂工艺或是摒弃该辅料。3.4 方法学验证
方法学验证分为两部分内容：①测定法各参数的逻辑推导过程与对试验结果的分析论述，即测定法各参数是如何确定的？②确定后的方法学验证，这只是验证方法执行时的适用性。前者是验证的核心内容，后者仅在极个别情形时才会出现问题。而如今很多研发者未能充分理解以上含义，对于第一部分内容，在申报材料中轻描淡写或照抄既有标准；而对后一部分内容做了大量工作。
如溶出度试验方法学验证分为3部分：第一部分为各参数的确立过程，应论证装置、转速、溶出介质、溶出体积、取样时间点、溶出限度等参数的逻辑推导过程；第二部分为样品处理方式的验证，
如自动取样装置是否对样品测定有干扰、过滤是否会导致主成分损失、过滤多少体积滤膜才至饱和等；第三部分为测定法的验证，如采用UV 法测定时辅料是否有干扰，以及通常所需进行的那些验证内容(如线性、精密度等)。这其中最为核心的是第一部分，如采用了不科学的100 r/min高转速，那所有试验与验证就没有意义。
一般而言，分析方法的建立包括分离检测条件的筛选与优化以及方法验证两方面[24]。其中，方法验证是在检测方法确定后开展的，其目的是证明采用的方法适用于相应检测要求。检测方法的筛选优化研究不能代替方法的验证工作，尽管二者的部分研究内容有交叉。所谓“交叉”，笔者以有关物质测定方法学验证中前一部分的“供试品溶液浓度应如何确定”与后一部分“最低检出限、最低定量限”的关联性来诠释[19]，列表如下(表1)。
可知，最低检出限和最低定量限的真正作用是用来推导供试品溶液浓度的设定，因此试验结束后应给出“相当于供试品溶液浓度的X ％”。如此，在今后检测中可确保即便最低检出限有所升高，也能保证至少有1 000～2 000倍的落差(报告限要求)，从而对杂质检测的灵敏度不会带来任何影响。3.5 归一化法的妙用
当供试品溶液稀释100倍呈线性时(误差在2％以内)，杂质含量采用主成分自身对照法和归一化法的测定结果便无显著性差异，此时建议质量标准中仍采用前者，但研发中的大量样品测定和今后企业的内控标准均可采用后者。4 讨论
4.1 相辅相成性的数值多少为宜
关于加速和长期试验中“主成分含量下降量与总杂质增加量间的相辅相成性”多少为宜，笔者查阅了大量文献，均未明确指明，ICH 指导原则中只提出实验者酌情确定。笔者依据经验和试验误差，建议“以不超过该品种规格所对应的制剂鉴定限3倍”为宜，如主成分每日最高给药量0.01～2 g ，对应鉴定限为0.2％，则建议不超过±0.6％。之所以是鉴定限、而非质控限，盖因很多杂质的测定均可采用笼统法。
“瘦”
545中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2015, 46(5) · ·
表1 制剂有关物质测定时供试品浓度确立推导逻辑树
各溶液最大进样量或点样量供试品溶液
1.0％自身对照液
报告限最低定量限各溶液
备注
随着浓度增加，峰面积不再(呈线性)增加，或峰形极端恶化或薄层斑
点严重拖尾甚至断腰
-通常选用该浓度
制剂通常为0.1％(原料药通常为0.05％)一般为最低检出限的3～5倍，且不得大于报告限
无需按S /N =3推算，采用直接测定法即可
浓度/µg·ml-1500(50 000倍)200(20 000倍)2(200倍)0.2(20倍)0.05(5倍)0.01(1倍)
相当于供试品溶液/％
-1001.00.1-0.005
注：1) 浓度均为举例浓度，括号内为相应倍数
4.2 ICH 指导原则中对原料药和制剂杂质控制的“2.4.3”项下仿制品中特有杂质的控制策略是按照ICH Q3指导原则制订的，该指导原则对原料药要求过于严格。通览各国药典和进口的原料药质量标准，其中不乏有“未鉴定杂质按笼统法测定、结果不得过0.1％(有效数字较0.10％少保留一位，如此实测值0.14％也可以) 或0.2％”的设定案例。因此，笔者强烈建议：秉承临床使用制剂、而非原料药的原则，针对仿制品中特有杂质，无论原料药还是制剂，均以制剂限度予以要求，便可极大程度地减少在原料药开发上的资金投入与时间成本。此处，也恳请CDE 老师们思忖定夺，从而引导众人更为客观理性地把握好杂质研究与控制的“度”。参考文献：
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“厚此薄彼”性
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546 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2015, 46(5) · · 中国医药工业杂志
无菌检查隔离器的应用
Application of Sterility Testing Isolator
吴文蕾，程锦生，郑金旺
(上海东富龙爱瑞思科技有限公司，上海 201108)
WU Wenlei, CHENG Jinsheng, ZHENG Jinwang
(Tofflon Science and Technology Co., Ltd., Shanghai 201108)
摘要：在即将颁布的中国药典2015年版中，首次提到了无菌检查隔离器。本文以美国药典为参考，结合了国内的技术条件，详述了无菌检查隔离器的相关验证要求。在这样的法规背景下，无菌检查隔离器越来越受到制药企业的关注，而无菌检查隔离器在可控、先进、低能耗的QC 无菌检查实验室中的应用也将成为趋势。文中首先介绍了与无菌检查和无菌检查隔离器相关的国内外法规，并且从隔离器对无菌检查中“假阳性”发生概率的控制及对实验室能耗的降低等特点说明了隔离器的优势。同时，阐述了隔离器的汽化过氧化氢灭菌及其验证，测试排产等实际应用；比较了硬墙和软墙隔离器的优缺点。
关键词：无菌检查；隔离器；汽化过氧化氢；假阳性
中图分类号：R95 文献标志码：C 文章编号：1001-8255(2015) 05-0546-06DOI ：10.16522/j.cnki.cjph.2015.05.025
从1980年代中期，无菌检查隔离器(也称实验室隔离器，sterility testing isolator ) 首先在欧洲发展起来。此设备能为微生物测试提供一个最可靠的环境，较好地防止微生物污染待测试物品，避免产生假阳性，现已在全球制药行业得到广泛应用。
随着中国药典和GMP 要求的不断发展完善，无菌检查隔离器日益受到国内制药企业的关注。本文介绍了无菌检查隔离器的相关法规要求、发展技
收稿日期：2015-04-03
作者简介：吴文蕾(1982-)，女，硕士，从事隔离器在无菌制剂生产中的应用、验证等研究。
Tel ：[1**********]
E-mail ：[email protected]
术背景及设备特点等。
1 无菌检查隔离器的法规与技术背景1.1 与无菌检查隔离器相关的法规
中国药典2010年版附录Ⅺ H 无菌检查法中规定，“无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行”。而2014年中国药典对微生物实验室的增补征求意见《附录ⅩⅧG 药品微生物实验室质量管理指导原则》中说明，“无菌检查应在B 级背景下的A 级单向流洁净区域或D 级背景下的隔离器中进行”。但中国药典2015年版通则微生物内容第3次公开征求意见的通知中《1101无菌检查法》中取消了第
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538 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2015, 46(5) · · 中国医药工业杂志
药学管理与信息
再谈仿制药研发中杂质研究思路之我见
Re-discussion on the Studies of Related Substances in Generic Drugs
谢沐风
(上海市食品药品检验所，上海 201203)
XIE Mufeng
(Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201203)
摘要：本文阐述了仿制药研发中如何根据原研制剂杂质谱剖析测得结果，来科学合理地制订仿制原料药与仿制制剂中杂质控制策略，并从临床用药的宏观角度和具体杂质研究的微观思路上阐明杂质研究中应把握的“度”，为仿制药杂质的理性研究提供一些借鉴。
关键词：仿制药研发；杂质研究；控制策略
中图分类号：R95 文献标志码：C 文章编号：1001-8255(2015) 05-0538-09DOI ：10.16522/j.cnki.cjph.2015.05.024
自2013年11月在本刊发表“仿制药研发中有关物质研究思路之我见”后[1]，收到大量同仁来电来函交流。积累1年多心得，撰写此续篇，希冀能将某些观点阐述得更为清楚明了，进而为我国仿制药研发中杂质研究思路与控制策略提供1种更为客观理性的认知，为将有限的资源用到研发关键之处提供一些参考。1 从宏观上解读杂质
1.1 杂质与药物不良反应的关系
很多同仁都认为杂质与药物的不良反应息息相关，认为杂质越小或越少、临床不良反应发生几率也就越小或越少，进而在进行杂质研究与控制时，力求面面俱到、尽善尽美。殊不知，引起药物不良反应的原因是多方面的，并不仅仅是药物中的杂质。人用药品注册技术要求国际协调会(ICH ) 于2002年9月12日颁布了《疗效--M4E (R1) 人用药品注册的通用技术文档：模块2的临床回顾和临床概述与模块5：临床研究报告》[2]，其中阐述道：关于
收稿日期：2015-01-10
作者简介：谢沐风(1972-)，男，副主任药师，从事药品品质评价与研发。
Tel ：021-38839900×26832E-mail ：[email protected]
药物的不良反应，常见的有关因素包括剂量、单位剂量、总剂量、给药方案、疗程、人口统计学特征(如年龄、性别、种族)、联合用药、其他基础特征(如肾功能状态)、效能特性和药物浓度等。可见，药物不良反应主要与主成分的不合理使用以及患者个人体质差异相关。不同给药方式下杂质与药物不良反应间的关系解读如下。1.1.1 口服给药
口服给药是1种较为安全的给药方式。但若用法用量不当、超出安全用药浓度上限时，将对人体带来伤害、产生不良反应[3](如治疗窗狭窄药物常发生此情形)。目前我国此类药物的主要问题是：部分仿制药质量与原研药存在较大差距，主要是在患者体内生物利用度的差异[4]；生物利用度又与体外溶出行为密切相关。国家食品药品监督管理总局(SFDA ) 自2008年起开展“国家药品评价性抽验”工作至今，已发现国内已上市的部分口服固体制剂体外多条溶出曲线与原研制剂有显著性差异[5]。1.1.2 静脉滴注给药
有同仁认为，静脉滴注给药方式已无生物利用度问题，此时不良反应与杂质密切相关，故应着重关注。笔者认为这种认知是偏颇的。此种给药方式
539中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2015, 46(5) · ·
使得药物直接进入封闭的血液循环系统中，当外来物质(包括葡萄糖注射液、氯化钠注射液、药物主成分、少量杂质、辅料和微量颗粒等)“一股脑儿地侵入”时，其中呈现出的不良反应强弱与患者的秉承制剂质量标准仅关注降解杂质的原则[8]，在前些年的国外药典和进口质量标准中很多制剂品种并无有关物质检查项，这也是合理的：经研究当“原料药制成0天制剂”和“0天制剂在加速试验6身体机能以及主成分的自身毒性及用法用量息息相关。此种给药方式带来的不良反应即便是小概率事件，但其发生率远高于肌肉注射和口服给药方式。故世界卫生组织(WHO ) 早在多年前就已制订了用药要遵循“能不用就不用，能少用就不多用；能口服不肌注，能肌注不输液”的原则。然而过去的10多年间，我国临床用药大量使用静脉滴注给药方式[6]，使得临床不良反应发生率增高；并在2006～2007年间集中爆发了几起影响恶劣的药害事件，引起各方关注[7]。部分专家将其归咎为仅是杂质所为，其实，此类制剂的质量安全性风险不仅仅在于杂质，还与微生物、热原或细菌内毒素、不溶性微粒和可见异物等密切相关。1.2 杂质与药物质量控制的关系
为最大限度地确保临床安全性，ICH 在Q3 A和B 指导原则中设定了评估杂质的“三条限”，即报告限、鉴定限和质控限。报告限：小于该限度的杂质，无关注价值，故无需积分。鉴定限：笼统法(主成分自身对照法或面积归一化法) 测定结果不大于该限度的杂质，仅需报告测定结果，无需研究、也无需鉴定结构，不会对临床带来安全性问题 ；超过该限度的杂质，则需厘清化学结构。质控限(qualification threshold，也称“界定限”) ：准确法(杂质对照品法或主成分+校正因子法) 测定结果不大于限度时，无需深入研究，该限度下的杂质不会对临床带来安全性问题。对于货架期内含量超出质控限的杂质应进行动物毒理研究，确定临床使用时的安全限，且药品中的该杂质含量应在效期内不大于该限，并将该限订入质量标准。这“三条限”为仿制药研发中杂质控制策略提供了科学合理的参考。同时，人们还力图通过杂质控制来保证生产过程的可控性、批内或批间品质的均一性、辅证主成分在货架期内的稳定性等来满足评价药物质量的需求。1.3 发达国家向非发达国家施放的“烟雾弹”1.3.1 第一枚烟雾弹——杂质
个月、长期试验6个月或货架期内”，这2个环节中杂质都无变化，在制剂的质量标准中便无需制订有关物质检查项。但近些年，这些标准中开始制订并收载大量杂质。乍看起来甚是高标准、严要求，但笔者认为这是在施放“烟雾弹”，目的是引仿制者误入歧途。
解读如下案例：某一普通口服片剂进口质量标准(规格为0.125～1.0 mg ) 中收载了12个已知杂质，并采用了极为复杂的色谱系统进行测定，还引入校正因子逐一准确计算，制定了每一杂质限度。秉承上述原则，该药物是不可能在效期内有12个降解杂质产生的。果然，经对数批货架期内原研制剂样品予以检测，绝大部分杂质均未检出(报告限以下)，仅有1～2个杂质含量在报告限以上、鉴定限以下。可令人遗憾的是，很多同仁唯进口质量标准或国外药典马首是瞻，花费大量资源设法获得那12个杂质，最终经研究，在仿制原料药和仿制制剂中均是未检出。
笔者推荐该品种的研发思路如下。①测定3批原研制剂，经剖析杂质谱，无含量不断增加的杂质；②测定3批规模化生产的仿制原料药与仿制制剂样品，无制剂鉴定限以上杂质，且无含量不断增加的杂质；③根据以上研究结果，最终质量标准中无需制订有关物质检查项。甚至可以采取更为大胆的做法——由于主成分规格很小，且每日最多口服3片，故杂质与残留溶剂均无需研究，只需在申报材料中阐明“经推算这些物质的每日最高摄入量均小于每日临床安全摄入限度”即可。
还有一进口外用涂抹皮肤的乳膏剂质量标准，制订了8个已知杂质。本人认为这些均是原研企业对仿制者施放的烟雾弹，以阻碍仿制进程、迷惑研发方向。
据笔者所知，目前全世界绝大多数原料药已由发展中国家生产后出口至欧美国家，欧美国家将这些杂质含量极低的原料药经特殊处理后(例如重结
540 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2015, 46(5) · · 中国医药工业杂志
晶后制成目标晶型、粒度分布、颗粒形状、比表面能等特性) 制成制剂，再销往全世界获取高额利润，其质量毋庸置疑[9]。至于国外药典原料药项下罗列的众多杂质，且毫无保留地给出了结构式，还可购得(价格不菲)，更是见仁见智。1.3.2 第二枚烟雾弹——溶出度试验
各剂型皆有关键性评价指标，这在ICH Q6文件(规范：新原料药和新药制剂的测试方法和认可标准：化学物质) 和WHO 药品标准专家委员会第43次技术报告一书中均有阐述[10,11]。发达国家针对这些关键性评价指标，一者隐含(仅在严格保密的、企业内控质量标准中才有)，二者即便公开、也大多为宽松的试验参数与限度范围。如对于口服固体制剂，最为核心的是溶出度试验[12]。笔者曾接触过上百个原研制剂多条溶出曲线测定结果，发现相当一部分国外药典和进口质量标准中的试验参数都极为宽松、不具区分力(如15 min 已溶出85％以上或未采用关键溶出介质)。盖因该试验太重要，故发达国家在制订ICH Q系列质量管理文件时都未有专门论述，唯《日本溶出曲线数据库》收载的实验条件较具区分力。
因生物等效性(BE ) 试验仅采用年轻男性作为受试者有其局限性，日本自20世纪90年代起就十分重视体外溶出度试验。在无法采用各种人群大标本试验的前提下，只能通过对体外溶出度试验的严格要求来促使仿制制剂内在品质趋近原研制剂[5,13]。为此，日本在《仿制药生物等效性试验指导原则》中制订了详尽的溶出度试验研究比对要求[14][谢沐风. 日本仿制药生物利用度指导原则. 药品技术审评论坛, 2008年第3期(总第21期)]。同时，日本官方已建立起700多个品种的原研制剂4条溶出曲线数据库，并予以公开，该项工作还在不断进行中。
而欧美的公开资料中大多宣称：体内生物利用度试验才具有最终决定性，不太强调体外溶出度试验。但通过解读他们公开文献中的溶出度试验参数，发现多数不具区分力、甚至干脆不公开。如英国药典收载的制剂很少，有些难溶性口服固体制剂竟没有溶出度试验，甚至没有1个缓控释制剂品种有释放度试验[15]。如按此种不具区分力的实验条件去
研制仿制制剂，则多半会出现“部分仿制药对于部分患者安全无效”的结果。因此，只有依靠科学客观的评价手段，才能做出与原研制剂内在品质无限趋近的高品质仿制药来。
1.3.3 第三枚烟雾弹——潜在基因毒性杂质
其实，只要观测仿制原料药的起始物、副产物、试剂、配位体、催化剂等是否具备文献报道的“基因毒性杂质官能团”[16]，并针对规模化生产的仿制原料药3批样品中检出的鉴定限(0.10％) 以上特有杂质(即原研制剂中不存在)，如具备这些结构式(见图1)，再进行相应研究。
今后一定还会有其他“烟雾弹”发射过来，如近期兴起的“金属杂质研究”等。1.3.4 应对策略
⑴针对进口质量标准：相关药品检验机构进行复核时，应要求企业提供详尽的检测法验证资料，着重审阅质量标准中的各项试验参数是如何建立的，关注其逻辑推导过程，是经怎样的研究与试验结果确定的。如未尽详细，应要求对方持续提供。如溶出度试验，为何申报中制订了100 r/min高转速和该溶出介质？是否研究过50和75 r/min溶出行为，以及其他介质的溶出情况后综合考虑确定？是否有故意放宽、让自我产品永远合格的嫌疑？又比如有关物质，为何订入这么多杂质和如此低的限度，制订的依据是否充分等。
⑵针对公开的各国药典与文献资料：切忌照搬照抄、盲目迷信。我国药品审评中心(CDE ) 早在2003年就已提出“仿产品不是仿标准”的指导思想[17]，就是希冀同仁在具体研制时能独立思考、冷静分析。该宗旨中的“标准”不仅仅指国内质量标准，也包括国外标准及文献。
总之，无论如何都应获取至少3批原研制剂，深度剖析其关键质量特性参数后再来指导仿制药的开发，以及制订质量标准等事宜[15]，这才是研发的根本出发点(FDA 仿制药办公室. “质量源于设计”理念应用于仿制药申报[M ]. 北京大学药物信息与工程研究中心译, 2012)。 2 从微观上予以研究
以上阐述并非强调不研究杂质，而是希望在进
541中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2015, 46(5) · ·
A
N -羟基苯胺N -hydroxyaryls N -酰化氨基苯N -acylated aminorryls
氮杂芳基N -氧化物aza-aryl N -oxides 芳香胺和烷基取代的芳酰胺aminoaryls and alkylated aminoaryls
芳香族化合物
H
2
NH 2
醛aldehydes
N -亚甲基醇N -methylols N -亚硝基胺N -nitrosamines 硝基化合物nitro compounds 氨基甲酸类carbamates
H halogen N A A
N
N 环氧丙烷epoxides 氮丙啶类aziridines 环丙酯propiolactones β-卤代烷肼和偶氮化合物
N or S mustards hydrazines and azo compounds
烷烃和环烷烃类化合物
halogen
卤代烯烃halo-alkenes
halogen
迈克尔加成反应受体膦酸酯或磺酸酯Michael-reactive alkyl esters of phosphonates
acceptors or sulfonates
烷烃和环烷烃卤代物
primary halides
含杂原子化合物
A=烷烃基、芳香基或H ；X=卤素(F 、Cl 、Br 、I )；EGW=吸电子取代基，如氰基、羰基或酯基等
图1 建议进行基因毒性杂质分析的结构单元
行仿制药研制时能够把握好“度”。下面以既有质量标准存在的前提下，详述六类仿制药研发思路。2.1 杂质谱的测定与研究对象
该理念的提出富有针对性，即通过测得原研制剂杂质谱来客观合理地控制仿制原料药和仿制制剂中杂质被允许存在的程度。逻辑树如下：
原研制剂杂质谱→仿制原料药杂质谱→仿制制剂杂质谱
需强调的是，无需测得原研原料药杂质谱(实际上也难以获得样品)，一者与临床无关，二者其往往与仿制原料药合成路径殊途同归。如此，国外药典收载的原料药质量标准项下大量已知杂质也就无需全部获得并逐一研究，最多仅研究其中主成分降解产生的杂质(以下简称“降解杂质”)，因这些降解杂质在仿制品中也往往存在。2.2 杂质谱测定法：色谱条件建立过程
既然要进行以上3种来源样品的杂质谱比较，就应在同一色谱条件下予以测定，才具可比性。由于是六类仿制药，故色谱条件的建立往往可参考和借鉴既有制剂或原料药质量标准中的色谱条件(以下简称“既有标准”)。建立过程如下。
2.2.1 用既有标准中罗列的所有已知杂质来验证色谱条件的系统适用性
很多同仁认为这一步很重要，所以为了验证各已知杂质的彼此分离度以及与主成分峰的分离度，花巨资购买来或自制出所有杂质对照品。但笔者认为该步验证必要性并不强，因这些已知杂质大多仅与原研原料药的合成路径相关，而与仿制品无关，在原研制剂和仿制品中很多均是未检出(报告限以下)。笔者建议的应对方案如下。
①由于既有标准已具备相当的权威性，故可认为已具备良好的耐受性，无需再获取罗列的所有杂
542 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2015, 46(5) · · 中国医药工业杂志
质予以验证，直接沿用既有标准色谱条件，即可认为能分离检测出既有标准中的所有杂质。虽说制剂质量标准仅针对降解杂质，但通常该色谱条件的建立也要确保原料药中的合成杂质不干扰降解杂质的测定[18]。因此，这些标准本身就已具备较强的检测能力。
②对既有标准的色谱条件进行微调，通常是减少流动相中有机相比例或延长梯度洗脱时间，使所有色谱峰保留时间延长。此法通常更有利于各物质间的分离。此时，也无需再取对照品验证。
③厘清既有标准中与主成分最难分离的1～2个杂质[19]，随后仅验证该杂质峰与主成分峰的分离即可。至于其他杂质间能否有效分离，只要在检测各样品杂质谱时均未检出，即无需再深入研究。即便检出，只要这些杂质不是需针对性准确测定的降解杂质，也无需再深入研究，因峰重合更提高了对仿制药的质控要求。
以上3种做法研究者可根据品种具体情形酌情遴选。
2.2.2 所建立的色谱条件应能分离检测出仿制原料药中的目标杂质
采用“2.2.1”项下所建立的色谱条件验证：①分离检测仿制原料药合成步骤各中间体和起始物等与主成分峰的分离度，因为这些物质最易残留于产品中[18]；验证时所配制的系统适用性试验溶液应是主成分浓度为100％、各杂质浓度约1.0％[19]。②采用原料药精制前的粗品予以验证。③采用存在于仿制品中的针对性目标杂质予以验证。经过上述步骤所建立的色谱条件通常应为：采用普通粒径25 cm 长色谱柱、流速1.0 ml/min前提下，主成分峰保留时间不小于15 min ，测定3～4倍保留时间至60～90 min结束；只要溶液稳定性良好[20]，测定时应尽可能采用自动进样设备、以充分利用下班后时间来提高检测效能。同时，无需担心由于保留时间长、部分含量较低的杂质峰难以积分出，此时只要将积分参数中的斜率设置得小些、峰宽设置得大些便不会有漏检(最小峰面积按报告限设置)。2.2.3 研究勿苛求完美
很多研发人员力求检测出仿制品中可能存在的
所有潜在杂质，其实大可不必。关于研究逻辑思路与着眼点，在ICH Q3A和B 指导原则中早已阐明：秉承“逆向分析”思路——即从检测规模化生产的3批仿制原料药和仿制制剂样品入手，获得报告限以上杂质谱；随后与“正向分析”结合(通常仅选取合成中间体和起始物料，因为这些杂质最易残留于规模化生产的终产品中)，如2种分析所得杂质相对应，研究结束；如存在未对应杂质，仅针对原料药鉴定限以上的杂质才考虑厘清来源、适度研究。
关于是否存在“漏检杂质”，可采用以下3法予以验证。①对于包裹于主成分峰的含量较大或不增加杂质，一般可通过二极管阵列检测器(DAD ) 探明。②对于“逸出”于所建色谱条件以外的含量较大或不增加杂质，则可通过至少两法测定主成分含量、观测结果是否“殊途同归”的办法予以探明，或是在连续测定中在其后样品中被检出。③对于含量不断增加的杂质，自会在稳定性考核(加速和长期) 试验中“主成分含量下降量与总杂质增加量间相辅相成性(以下简称相辅相成性)”上体现出来，此时再着手亦不迟。实际工作中，出现以上3种情形的概率均不大。
总之，我们应客观理性地认知到“任何检测法都不是万能”的，即便有漏检杂质，只要这些杂质含量在制剂鉴定限或质控限以下，临床应用时引起不良反应的可能性就不大。2.3 检测各样品杂质谱
采用“2.2”项下建立的色谱条件分别测定以下各样品。
2.3.1 原研制剂杂质谱
一者可通过测定至少3批不同货架期时间点的样品(应有1批临近效期)；二者可采用1批样品，对其进行至少6个月加速试验测得(加速试验的时长根据效期相应制订)。无需采用强破坏试验，因实际情况根本不存在。随后厘清“不断增加的降解杂质”和“不增加杂质”。2.3.2 测得仿制原料药杂质谱
一般通过测定至少3批规模化生产样品和加速试验6个月或长期试验N 个月样品获得，厘清“不
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断增加的降解杂质”和“不增加杂质”。2.3.3 测得仿制制剂杂质谱
同“2.3.2”项下操作。
这里需强调的是，测定以上各样品杂质谱时，均应严格按照ICH 设定的原料药报告限(0.05％) 予以积分(考虑到杂质谱的可比连贯性，制剂积分时也建议依照该限)。但遗憾的是，有部分研究人员积分时将最小峰面积设定得很小，导致小于报告限的大量杂质被积分出，随后为了研究、又将Y 轴设置得也很小、视野放得很大进行观测。
对于仿制品中含量大于原料药鉴定限的杂质建议厘清化学结构与来源。
2.4 对仿制原料药或仿制制剂中杂质谱的控制要求2.4.1 针对仿制制剂与原研制剂共有的降解杂质
要求此类杂质在仿制制剂中的降解速度不得大于原研制剂，由此效期才能不短于原研制剂(一般此类杂质临近效期时含量会超出制剂质控限)。以往可通过缩短仿制制剂效期使降解杂质符合质量标准限度，但现今各国纷纷提高了仿制药研发要求，其中一点就是“效期不得短于原研制剂”[21]。
降解速度的表达建议采用作图法，即以时间(月份) 为横坐标，杂质含量为纵坐标，线性回归计算得斜率，仿制制剂斜率不大于原研制剂即可，由此便可推断出未来目标时间点仿制制剂中的降解杂质符合限度要求。因此，在以原研制剂为对比的前提下，仿制制剂进行6个月加速试验也完全可考虑递交“暂定效期长于2年”的申请，只是此时建议长期试验增加或直接采用中间试验[30 ℃、相对湿度(RH ) 65％]予以考察[8]。
此类杂质在质量标准中通常需采用准确法测定。2.4.2 针对仿制制剂与原研制剂共有的、含量不增加的杂质
此类杂质通常为原料药中合成工艺杂质、起始物等。具体要求如下。
①当原研制剂中该杂质含量大于制剂鉴定限时，仿制制剂中该杂质含量应不大于原研制剂。
②当原研制剂中该杂质含量小于制剂鉴定限时，仿制制剂中该杂质含量可大于原研制剂，但必须仍不大于制剂鉴定限[8,22]。
此类杂质检测时采用笼统法即可。如用准确法测定，对应限度可相应改为制剂质控限。2.4.3 针对仿制品中的特有杂质[23]
由于CDE 对杂质要求较为严格，故建议厘清来源、鉴定结构，并确认不具备潜在基因毒性杂质官能团。一类为含量不变化杂质，来源同“2.4.2”项。此时，笼统法测定结果不大于制剂鉴定限，或准确法测定结果不大于制剂质控限，即可不必再做深入研究。另一类为含量不断增加的新增降解杂质，依然是效期内满足以上要求即可[22]。一旦笼统法测定结果超过鉴定限，就需准确测定：获得杂质对照品、确证其结构、测得纯度值，计算校正因子等。2.4.4 杂质总量
参照既有标准拟定。此时，仿制制剂只要符合既有标准、实际含量即便高于原研制剂亦无妨。因该限度值是由原研企业或国外药典规定，已经临床充分论证。
2.4.5 仿制制剂与原研制剂的质量对比
业内普遍存在“杂质种类或量一致、甚至杂质量少于原研制剂，仿制药质量就与原研药一致、甚至超越”的思维模式，其实，杂质含量只要在规定限度下就没有可比性。3 对研发热点的概念解读
3.1 客观理解强破坏试验和影响因素试验[10]
探求药物内在稳定性的手段由弱到强依次为：①长期试验(包括中间试验)；②加速试验；③影响因素试验；④强破坏试验。通常情况下药物是不可能遭遇到③和④情形的。之所以进行，是期望通过较为激烈的外界刺激来洞悉药物易受何条件影响、发生降解或质变，从而在药物生产、包装、贮藏、运输等环节规避该条件，以保证药物在效期内的质量稳定性。针对①和②试验，既要洞悉药物随时间推移时关键指标是否有变化，还要关注若发生变化，是否呈现相辅相成性。若非，说明有较大杂质漏检，建立的有关物质检测法需进一步完善，此时才考虑通过③和④手段去寻找那些“丢失的杂质”。若是，即便有漏检杂质，含量也应在制剂鉴定限以下。因此，上述③和④产生的杂质在实际样品中一般不会存在，也就无需研究这些降解杂质，仅验证分离度
544 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2015, 46(5) · · 中国医药工业杂志
即可，以保证样品遭遇不可知极端条件时，即便产生杂质也能被检出。
很多同仁针对该实验所产生的杂质做了大量研究，但最终结论几乎没有推翻已建立色谱条件的。其实，只要保证主成分峰保留时间在15 min后，且适度破坏(使杂质产生5％～15％)，该实验则可顺利完成。至于需验证“破坏后的物料平衡”，该专业认知与要求至今未在任何国家级指导原则上发布。笔者认为，持有该观点的同仁是与“①和②试验中的相辅相成性”混淆了，故不应强求[24]。3.2 举足轻重的加速试验
由于长期试验较为耗时，故一般采用加速试验。该实验在验证辅料相容性、成品采用何种包装更经济实用等众多方面均极为实用。为减小误差、更准确测定主成分含量变化情况以窥探是否有降解，强烈建议含量测定法中的溶液浓度设定得低一些，一者有利于与相邻杂质峰的分离，再者主成分峰形变、峰面积变小，更能提高测定精密度、提升准确性。
3.3 主成分与辅料的相容性研究
该试验目的是探求主成分易受何辅料影响导致降解，但绝非试验结果不理想就剔除该辅料，因所采用的试验条件可能与实际情况不符，只是“大胆假设、小心求证”，只有当尝试用该处方进行加速试验后，若发生杂质超标、不符合规定或不满足控制策略时，才考虑更改制剂工艺或是摒弃该辅料。3.4 方法学验证
方法学验证分为两部分内容：①测定法各参数的逻辑推导过程与对试验结果的分析论述，即测定法各参数是如何确定的？②确定后的方法学验证，这只是验证方法执行时的适用性。前者是验证的核心内容，后者仅在极个别情形时才会出现问题。而如今很多研发者未能充分理解以上含义，对于第一部分内容，在申报材料中轻描淡写或照抄既有标准；而对后一部分内容做了大量工作。
如溶出度试验方法学验证分为3部分：第一部分为各参数的确立过程，应论证装置、转速、溶出介质、溶出体积、取样时间点、溶出限度等参数的逻辑推导过程；第二部分为样品处理方式的验证，
如自动取样装置是否对样品测定有干扰、过滤是否会导致主成分损失、过滤多少体积滤膜才至饱和等；第三部分为测定法的验证，如采用UV 法测定时辅料是否有干扰，以及通常所需进行的那些验证内容(如线性、精密度等)。这其中最为核心的是第一部分，如采用了不科学的100 r/min高转速，那所有试验与验证就没有意义。
一般而言，分析方法的建立包括分离检测条件的筛选与优化以及方法验证两方面[24]。其中，方法验证是在检测方法确定后开展的，其目的是证明采用的方法适用于相应检测要求。检测方法的筛选优化研究不能代替方法的验证工作，尽管二者的部分研究内容有交叉。所谓“交叉”，笔者以有关物质测定方法学验证中前一部分的“供试品溶液浓度应如何确定”与后一部分“最低检出限、最低定量限”的关联性来诠释[19]，列表如下(表1)。
可知，最低检出限和最低定量限的真正作用是用来推导供试品溶液浓度的设定，因此试验结束后应给出“相当于供试品溶液浓度的X ％”。如此，在今后检测中可确保即便最低检出限有所升高，也能保证至少有1 000～2 000倍的落差(报告限要求)，从而对杂质检测的灵敏度不会带来任何影响。3.5 归一化法的妙用
当供试品溶液稀释100倍呈线性时(误差在2％以内)，杂质含量采用主成分自身对照法和归一化法的测定结果便无显著性差异，此时建议质量标准中仍采用前者，但研发中的大量样品测定和今后企业的内控标准均可采用后者。4 讨论
4.1 相辅相成性的数值多少为宜
关于加速和长期试验中“主成分含量下降量与总杂质增加量间的相辅相成性”多少为宜，笔者查阅了大量文献，均未明确指明，ICH 指导原则中只提出实验者酌情确定。笔者依据经验和试验误差，建议“以不超过该品种规格所对应的制剂鉴定限3倍”为宜，如主成分每日最高给药量0.01～2 g ，对应鉴定限为0.2％，则建议不超过±0.6％。之所以是鉴定限、而非质控限，盖因很多杂质的测定均可采用笼统法。
“瘦”
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表1 制剂有关物质测定时供试品浓度确立推导逻辑树
各溶液最大进样量或点样量供试品溶液
1.0％自身对照液
报告限最低定量限各溶液
备注
随着浓度增加，峰面积不再(呈线性)增加，或峰形极端恶化或薄层斑
点严重拖尾甚至断腰
-通常选用该浓度
制剂通常为0.1％(原料药通常为0.05％)一般为最低检出限的3～5倍，且不得大于报告限
无需按S /N =3推算，采用直接测定法即可
浓度/µg·ml-1500(50 000倍)200(20 000倍)2(200倍)0.2(20倍)0.05(5倍)0.01(1倍)
相当于供试品溶液/％
-1001.00.1-0.005
注：1) 浓度均为举例浓度，括号内为相应倍数
4.2 ICH 指导原则中对原料药和制剂杂质控制的“2.4.3”项下仿制品中特有杂质的控制策略是按照ICH Q3指导原则制订的，该指导原则对原料药要求过于严格。通览各国药典和进口的原料药质量标准，其中不乏有“未鉴定杂质按笼统法测定、结果不得过0.1％(有效数字较0.10％少保留一位，如此实测值0.14％也可以) 或0.2％”的设定案例。因此，笔者强烈建议：秉承临床使用制剂、而非原料药的原则，针对仿制品中特有杂质，无论原料药还是制剂，均以制剂限度予以要求，便可极大程度地减少在原料药开发上的资金投入与时间成本。此处，也恳请CDE 老师们思忖定夺，从而引导众人更为客观理性地把握好杂质研究与控制的“度”。参考文献：
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“厚此薄彼”性
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无菌检查隔离器的应用
Application of Sterility Testing Isolator
吴文蕾，程锦生，郑金旺
(上海东富龙爱瑞思科技有限公司，上海 201108)
WU Wenlei, CHENG Jinsheng, ZHENG Jinwang
(Tofflon Science and Technology Co., Ltd., Shanghai 201108)
摘要：在即将颁布的中国药典2015年版中，首次提到了无菌检查隔离器。本文以美国药典为参考，结合了国内的技术条件，详述了无菌检查隔离器的相关验证要求。在这样的法规背景下，无菌检查隔离器越来越受到制药企业的关注，而无菌检查隔离器在可控、先进、低能耗的QC 无菌检查实验室中的应用也将成为趋势。文中首先介绍了与无菌检查和无菌检查隔离器相关的国内外法规，并且从隔离器对无菌检查中“假阳性”发生概率的控制及对实验室能耗的降低等特点说明了隔离器的优势。同时，阐述了隔离器的汽化过氧化氢灭菌及其验证，测试排产等实际应用；比较了硬墙和软墙隔离器的优缺点。
关键词：无菌检查；隔离器；汽化过氧化氢；假阳性
中图分类号：R95 文献标志码：C 文章编号：1001-8255(2015) 05-0546-06DOI ：10.16522/j.cnki.cjph.2015.05.025
从1980年代中期，无菌检查隔离器(也称实验室隔离器，sterility testing isolator ) 首先在欧洲发展起来。此设备能为微生物测试提供一个最可靠的环境，较好地防止微生物污染待测试物品，避免产生假阳性，现已在全球制药行业得到广泛应用。
随着中国药典和GMP 要求的不断发展完善，无菌检查隔离器日益受到国内制药企业的关注。本文介绍了无菌检查隔离器的相关法规要求、发展技
收稿日期：2015-04-03
作者简介：吴文蕾(1982-)，女，硕士，从事隔离器在无菌制剂生产中的应用、验证等研究。
Tel ：[1**********]
E-mail ：[email protected]
术背景及设备特点等。
1 无菌检查隔离器的法规与技术背景1.1 与无菌检查隔离器相关的法规
中国药典2010年版附录Ⅺ H 无菌检查法中规定，“无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行”。而2014年中国药典对微生物实验室的增补征求意见《附录ⅩⅧG 药品微生物实验室质量管理指导原则》中说明，“无菌检查应在B 级背景下的A 级单向流洁净区域或D 级背景下的隔离器中进行”。但中国药典2015年版通则微生物内容第3次公开征求意见的通知中《1101无菌检查法》中取消了第
ffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffff
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