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菌种长期保存方法的新尝试
林君荣!李慧霞
辽东学院医学院!辽宁丹东#"#$%%&’
摘要(目的(寻找一种能长期保存菌种的方法!以便更好地为科研)教学以及临床诊断提供标准菌株*方法(将需保存的菌
种纯化后!用接种环取一定量分别置于装有保护剂牛奶的菌种管)合成菌种保养液小试管和接种到高层半固体琼脂中!经真
试管加盖橡皮塞后+&在连续.年的实验期内合成保养液保存空熔封菌种管)%,保存和进行培养后置+-,冰箱保存*结果(
菌种的效果最佳!且各菌生化反应)形态结构)染色特性等均与标准菌株相符*结论(合成保养液保存菌种时间长方法简便!适用各种微生物菌种的保存*
关键词(菌种/长期保存/培养基/保养液中图分类号(.1文献标识码(#%%$+%#%-"&%%3’%#+%%41+%#02文章编号(
菌种的保存是微生物学研究的一项重要的基础工作*因每一类型微生物都具有不同的特性!在进行微生物学的基础研究)应用研究)以及病原微生物致病性研究时必须依靠微生物菌种来重复实验结果*要使菌种长期保存!并遗传性质
不变!
必须选择适宜的培养基和更好更稳定的保存方法!我室以往采用真空冷冻干燥法和半固体培养基保存法!但多年
来的实践经验表明!以上方法各有不足之处!冷冻真空干燥法效果最佳!但设备要求高!制备程序复杂!半固体培养基缺点为多数菌种存活时间不长!而且不适于营养要求高的细
菌*笔者自&%%&5%4开始!
应用合成保养液保存法)高层半固体培养基保存法和真空冷冻干燥法进行比较性研究!结果如下*#材料与方法
#6#材料#6#6#合成菌种保养液的配制
硫酸铵%647!硫酸镁%6%%4硫酸铜7!硫酸锌%6%%#6%%#7!氯化钙6%%%4钠盐7!
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用蒸馏水浸泡过夜!
晾干后干烤灭菌备用*#6#64#%种供试菌种伤寒沙门氏菌!福氏志贺菌!普通变形杆菌!大肠埃希菌!
金黄色葡萄球菌!溶血性链球菌!肺炎链球菌!脑膜炎奈瑟菌!
白喉棒状杆菌!铜绿假单胞菌!以上菌种为北京药品生物制品鉴定所提供的标准菌株*#6#63冷冻干燥机真空泵#6&方法#6&6#合成菌种保养液保存法
将菌种分离纯化!用接种环刮取菌苔".C4环’
置上述合成保养液小试管中!盖紧管塞将其放入+&%,冰柜保存*每
年取出一支复苏转移至适宜培养基中观察其生长情况!并做
生化反应无明显变化!
再继续保存!已保存.年*#6&6&高层半固体琼脂保存法
将要保存菌种分离纯化后!挑取菌落接种到高层半固体作者简介(林君荣"#83-C’
女!辽宁丹东人!实验师*琼脂中!.1,培养#&D取出置室温过夜!次日以无菌操作换上无菌橡皮塞!置-,冰箱保存!
每.个月转种一次!多数已保存.年*#6&6.冷冻干燥保存法
将欲保存菌种分别接种到对该菌最适宜斜面或平板上!经.1,#3已脱脂牛奶中D培养后用接种刮取三白金耳放在上述#约以9:!轻轻混匀!$%亿为宜!
然后用无菌长颈滴管吸取菌悬液滴入菌种管球部!每管4滴!向管颈部塞入无菌脱脂棉少许!放入低温冰柜+-%,速冻-%取出直接放入冷冻机中真空抽干9>?!$C#%然后在真空条件下溶封菌种管!抽样检查菌种真空度D!
*已保存#4年*&结果我们使用冷冻干燥法保存的菌种到目前为止已达#4年!应用合成保养液保存法的时间不长!仅仅.年!经检测以上两种方法保存的#%种受试菌种生化反应)形态结构)染色特性等与标准菌株相符!存活率达88;*高层半固体琼脂保存法!一般细菌已存活.年!但营养要求高的细菌"如溶血性链球
菌)肺炎链球菌)脑膜炎奈瑟菌)白喉棒状杆菌’只能存活3C8个月!需要每.个月传代一次*.讨论细菌依靠各种营养物质合成菌细胞本身的成分及其代
谢产物!
并提供新陈代谢中的能量!同时也依靠营养物质维持酶的活性或参与酶的组成*培养基的研制就必须考虑到细
菌所需要的各种营养物质如碳源)
氮源)无机盐和生长因子!以维持细菌长期在半休眠状态期下的营养*所以良好的培养
基是细菌长期保存必不可少的条件*@.A
冷冻真空干燥保存法
保存时间最长!
效果最佳!但所需要的专用仪器一般实验室难以配备!
而且过程复杂操作难度大!需要较长时间才能完成*
高层半固体琼脂保存菌种方法简便易行但不适于特殊菌种的长期保存*合成保养液保存菌种的时间虽不如冷冻真空
干燥保存法保存的时间长!
但操作比较简单!比高层半固体琼脂保存法保存时间长!且不易变性*从.种保存方法比较结果分析以及实际工作总结!对常用菌的保存!合成菌种保养
液保存法优于其它两种方法!
克服以往多次传代造成菌种容易污染和变异的弊病*为此!根据细菌特性选择不同的保存
方式以满足科研)
教学实验标本的供给!是非常重要的*延长保存菌种的存活期必须注意以下几点(E保存菌种的培养物应选择生长期幼龄的培养物!且培养物应制成浓菌
液保存!
以保证细菌的存活率*F高层半固体培养基保存菌种最好选择不含或含糖量低的培养基!可减少或避免因代谢产物产生而造成的细菌死亡*G保存温度的高低可影响菌种的存活率!反复冰融易使细菌死亡*
参考文献(
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李洪敏!刘军!林明贵!等6介绍一种长期保存菌种的合成保养液@A6微生物学通报!&%%&!&8".@&A陈秀H英6菌种保存方法比较’(#%4C#%3@HA6中国卫生检验杂志!&%%&!#&"@.A郭&’积(&燕.#
主编6微生物检验技术@IA6北京(人民卫生出版社!&%%&!##
"收稿日期(&%%4+#&+#1’
菌种长期保存方法的新尝试
作者：
作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
林君荣， 李慧霞
辽东学院医学院,辽宁,丹东,118002黑龙江医药科学
HEILONGJIANG MEDICINE AND PHARMACY2006，29(1)1次
1.李洪敏.刘军.林明贵 介绍一种长期保存菌种的合成保养液[期刊论文]-微生物学通报 2002(03)2.陈秀英 菌种保存方法比较[期刊论文]-中国卫生检验杂志 2002(02)3.郭积燕 微生物检验技术 2002
1.期刊论文 蒋小皖.张春元.倪秀璋 霍乱菌种长期保存存活率分析 -江苏预防医学2001,12(3)
霍乱是由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病,该古老的疾病,在中外历史上曾对人类健康造成极大的危害.该病病原霍乱弧菌长期动态的深入研究对该病防治有重要意义.菌种的长期保存是进行研究的基本条件之一.本省自1961年发现El Tor霍乱弧菌至今,坚持了霍乱菌种的冷冻干燥(冻干)保存,但是从未对冻干菌种的存活率进行检查.分析长期保存霍乱菌种的存活率,探讨如何改善菌种的保存,这是一件十分有意义的工作.
2.学位论文 刘衍芬 DVS乳酸菌种菌株传代和保存与遗传稳定性分析 2005
乳酸菌已由过去的单纯应用于食品领域发展至现在已广泛应用于人畜的防病治病及保健等许多方面，因而乳酸菌制品的分离和保存就显得极为重要。较常用的乳酸菌有双歧杆菌、乳杆菌、链球菌等。正常条件下，乳酸菌较难分离和长期保存。直投式酸奶发酵剂(DVS)中的乳酸菌菌株只能在分离之后稳定传代3次左右，如果长期传代则发酵性能变得不稳定，使发酵乳产品质量下降。有关乳酸菌菌株在传代和保存过程中的遗传稳定性分析在国内外均未见报道。本研究从DNA水平、表型特征、全细胞蛋白质变化及发酵特性等生物学特性方面对从直投式酸奶发酵剂中分离出来的3株乳酸菌菌株传代和保存过程中的遗传稳定性进行分析，为建立乳酸菌传代和保存方法及开发DVS菌种提供实验依据。
实验结果表明：在PY改良培养基当中，乳球菌和杆菌1可稳定传代15次，RAPD结果、表型特征、全细胞蛋白质和发酵特性无明显变化；而杆菌2可稳定传代10次。4℃保存过程中，乳球菌RAPD结果、表型特征、全细胞蛋白质和发酵特性均无明显变化，可连续保存至30d；杆菌1和杆菌2可连续保存至15d。以PY改良培养基加入15％甘油为保护剂于-80℃冷冻保存过程中，乳球菌可保存30d，表型特征、全细胞蛋白质和发酵特性无明显变化；杆菌1、杆菌2可保存15d。冻干保存前后3个DVS菌株均无明显变化，提示冻干法是乳酸菌菌株长期保存的最佳方法之一。
本研究建立了适合DVS菌株传代和保存的方法，同时也为建立一套完整、科学的检验微生物传代和保存过程中遗传稳定性分析方法提供了实验依据。
3.期刊论文 张俊达.孙厚华 常见医学真菌菌种低温真空冷冻干燥长期保存后存活情况研究 -中国麻风皮肤病杂志2006,22(3)
本文观察了在低温真空冷冻干燥长期保存的真菌菌种存活情况,结果皮肤癣菌存活率为91.6%,大部分菌种存活至20年;酵母样菌存活率为83.5%,最长存活22年;深部真菌存活率为83.4%,除个别菌种外多数菌种均存活22年;腐生菌存活率为75%,其中曲霉菌属保存至22年全部存活.本实验结果显示绝大部分真菌菌种用冷干法保存,可存活13～22年.
4.期刊论文 杨根华.王雪媛.陈海如.生越明 长期保存丝核菌菌种的一种方法 -菌物系统2002,21(1)
Cultures of Rhizoctonia spp. maintained on agar media at 15℃ should be transferred every 4-5 months to ensure viability. Thisprocedure could consume an excessive amount of time, and isolates that are transferred frequently may undergo genetic changesresulting in reduction in virulence. Therefore, methods for long-term storage (>6 months) are required.
5.学位论文 刘廷利 重庆地区烟草黑胫病菌致病性分化及小种鉴定 2007
烟草黑胫病(tobaccoblackshank)在我国分布范围很广，除黑龙江省尚未发现之外，其余各植烟省区，包括台湾在内，均有发生。烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasitica)可以危害烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等所有的栽培烟草，破坏力极强。
本研究从重庆主产烟区采集典型烟草黑胫病样品，带回实验室分离、纯化、鉴定。对确定为烟草黑胫病菌的菌株进行了致病性分化的研究及生理小种鉴定；并利用各烟区致病性表现较强的菌株组成的混合菌对重庆10个主栽烟草品种进行了抗病性测定。期望为生产上的烟草抗病品种的定向培育及合理布局提供前提条件和科学依据。主要试验结果如下：
1.菌株的采集从2005年7月到2006年10月从重庆武隆、万州、巫山、彭水、涪陵、石柱、酉阳等地区的共采集烟草黑胫病样品123份，分离纯化得到烟草黑胫病菌菌株52个，其中武隆2个、万州2个、巫山7个、彭水12个、涪陵12个、石柱9个、酉阳8个。
2.生理小种鉴定随机选择40个菌株注射接种4个鉴别寄主后第10天观察，NC1071对供试的40个菌株表现为抗病，病情指数皆为0；N.nesophilal对40个菌株也表现为抗病，病情指数0-20；L8对40个菌株皆表现为感病，病情指数75-100；小黄金1025皆表现为感病反应，病情指数77.78-100。40个菌株在TTC固体培养基和液体培养基上皆呈现红色反应。由鉴别寄主抗性反应和TTC颜色反应可以鉴定40个菌株皆为1号生理小种。
3.致病性分化选择具代表性的24个菌株用游动孢子悬浮液灌根接种红花大金元、MSK326、云烟202三个烟草品种，结果表明，24个菌株在单个烟草品种上、三个品种的组合上、地区之间皆存在明显的致病性分化。在红花大金元上，表现为强致病力的菌株14个，中致病力菌株6个，弱致病力菌株4个；在MSK326上，表现为强致病力的菌株3个，中致病力菌株11个，弱致病力菌株10个；在云烟202上，表现为强致病力的菌株2个，中致病力菌株6个，弱致病力菌株16个。24个菌株在三个品种的组合上，表现为强致病力菌株有2个，中等致病力菌株有16个，弱致病力菌株有6个。从各烟区菌株的平均病情指数来看，各烟区存在明显的致病性分化，其中武隆烟区菌株的致病性最强，平均病情指数为57.41，而万州烟区的菌株致病性相对较弱，平均病情指数为18.50。
4.重庆主栽品种对烟草黑胫病菌的抗病性测定本研究中选用了重庆各烟区近年来最常使用的10个品种。利用各烟区中致病力表现较强的七个菌株(FJ2-1、PL3-1、SL1-5、WH1-1、WL1-8、WX1-7和YL1-2)组成混合菌对这10个主栽品种的进行抗性测定。结果表明，供试的10个烟草品种对烟草黑胫病菌的抗性差异明显，其中，无高抗品种；抗病品种有4个，分别为NC82、云烟201、云烟203、贵烟4号；中抗品种有2个，分别为MSK326、MS云烟85；感病品种有2个，分别为MS云烟87、云烟202；高感品种有2个、分别为颚烟4号、红花大金元。 5.菌种保存
分别用四种不同菌种保存方法对PL2-5、SS1-8、YL1-2三个菌株进行了菌种的保存方法比较，并定期对供试保存菌种的进行检测。结果表明，蒸馏水常温保存和液体石蜡常温保存二种方法皆较好，适用于长期保存菌种；用燕麦培养基斜面常温保存菌种，适用于短期保存菌种；另外燕麦培养基斜面4℃冰箱保存不适宜用于烟草黑胫病菌的保存。
6.期刊论文 马学斌.马骢.郭建巍.蒋学兵.陈昌国.郝秀红.刘敏.王海东.MA Xue-bin.MA Cong.GUO Jian-wei.JIANG Xue-bing.CHEN Chang-guo.HAO Xiu-hong.LIU Min.WANG Hai-dong 海洋细菌长期保存方法研究 -海军总医院学报2009,22(3)
目的 比较几种不同的方法长期保存海洋细菌的效果.方法 应用10%脱脂乳、35%甘油肉汤、灭菌滤纸片和鉴定卡分别在-80℃保存海洋细菌,选取保存1、2、5、8年的细菌分别复苏检测其存活率.结果 10%脱脂乳和35%的甘油肉汤对各种菌种的保存效果比较好,保存2年时复苏率为100%,保存8年时间复苏率为98.3%.滤纸片和鉴定卡对海洋细菌的长期保存效果不如脱脂乳和甘油肉汤法.结论 10%脱脂乳和35%甘油肉汤对海洋细菌的长期保存效果较好,可以用于海洋细菌的长期保存.
7.会议论文 李洪敏.徐明.王涛.安慧茹.刘真.赵玉梅 建立长期保存结核分支杆菌的方法 2003
为寻找结核分枝杆菌长期保存的方法,本文研制了合成保养液,并进行了对比实验,结果表明,该长期菌种培养基随着时间的延长,越来越显示出它的优势.
8.学位论文 马金龙 短梗霉多糖发酵研究 2005
本文遵照从菌种初级选育→摇瓶发酵→放大培养的程序路线:首先,将长期保存的菌种进行复壮和筛选;之后,重点放在摇瓶发酵中,包括几个方面:1、通过改变培养基离子浓度、渗透压和添加表面活性剂,来改变细胞膜透性,促进细胞内外物质交换,增加底物利用率.2、在培养基组成方面,通过正交实验,确定培养基的最适合配比:蔗糖(50.0g/L)、KHPO(5.0g/L)、(NH)SO(0.6g/L)、酵母膏(3.0g/L)、
CaCO(0.5g/L),MgSO.7HO(0.4g/L),NaCl(1.0g/L),吐温-80(0.3﹪V)可使多糖转化率达到70﹪,发酵液颜色接近乳黄色.3、发酵条件考察初始pH、装液量、接种量等方面,确定了最适发酵条件.最后,通过采用BiostatB 5L发酵罐进行放大培养,发酵培养基为摇瓶所确定的最适配比,通过研究确定通气率为1.5vvm,搅拌速度为500rpm,培养温度为28℃±1.5℃,初始pH值为6.5,使得多糖转化率超过60﹪,发酵液颜色为浅乳黄色.通过上述研究,为今后选用低色素菌株进行工业化生产做铺垫,对进一步研究短梗霉产多糖机制有一定的帮助.
9.期刊论文 段双科.李宁.吴兴元.杨英 小麦赤霉病菌种保存及致病性研究 -西北农业学报2003,12(4)
在小麦赤霉病抗性鉴定工作中,常因禾谷镰刀菌于室内连续多代移植培养导致菌株的致病性衰弱,而影响年度间鉴定结果的准确性和一致性.对此,笔者尝试"一次制种,多年应用",将小麦赤霉病菌制备成小米粒菌体,置 4℃冰箱环境中长期保存.对保存年限不同的4个菌株进行室内培养和大田接种以测定其活力和致病性.结果表明,小麦赤霉菌小米粒菌体在4 ℃冰箱环境中可长期保存,7 a之久仍有活力,且其田间致病性没有发生衰退.该菌种制作保存方法简单、经济、可靠,适用于小麦种质材料抗赤霉病鉴定选择工作.
10.期刊论文 叶峰山.张瑞芳.周霞.崔雪萍.李连青.李小平.陈莎丽 3种淋球菌菌种保存方法比较 -山西医药杂志2009,38(8)
目前,淋球菌保存一般采用传统的冷冻真空干燥法,此法虽然可靠,但操作繁琐费时,需要贵重仪器--冰冻干燥机和真空泵等,成本较高.如何简单而又可靠地长期保存淋球菌,一直是广大科研工作者关心的课题,为此我们经过实验,比较几种淋球菌菌种保存方法,现报告如下.
1.朱志宁.赵燕.黄惠.任晓明 两种方法保存嗜酸乳杆菌效果的比较研究[期刊论文]-动物医学进展 2008(11)
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_hljyykx200601025.aspx
授权使用：复旦大学图书馆(fddxlwxsjc)，授权号：b6329722-3e6f-4bee-a5f8-9e190167a666
下载时间：2010年10月24日
6&%%3!6&8OZ6#=KLMNOPHLQOPIKRLSLOKQORT=Q0IQSUVWXYZ:J41J
菌种长期保存方法的新尝试
林君荣!李慧霞
辽东学院医学院!辽宁丹东#"#$%%&’
摘要(目的(寻找一种能长期保存菌种的方法!以便更好地为科研)教学以及临床诊断提供标准菌株*方法(将需保存的菌
种纯化后!用接种环取一定量分别置于装有保护剂牛奶的菌种管)合成菌种保养液小试管和接种到高层半固体琼脂中!经真
试管加盖橡皮塞后+&在连续.年的实验期内合成保养液保存空熔封菌种管)%,保存和进行培养后置+-,冰箱保存*结果(
菌种的效果最佳!且各菌生化反应)形态结构)染色特性等均与标准菌株相符*结论(合成保养液保存菌种时间长方法简便!适用各种微生物菌种的保存*
关键词(菌种/长期保存/培养基/保养液中图分类号(.1文献标识码(#%%$+%#%-"&%%3’%#+%%41+%#02文章编号(
菌种的保存是微生物学研究的一项重要的基础工作*因每一类型微生物都具有不同的特性!在进行微生物学的基础研究)应用研究)以及病原微生物致病性研究时必须依靠微生物菌种来重复实验结果*要使菌种长期保存!并遗传性质
不变!
必须选择适宜的培养基和更好更稳定的保存方法!我室以往采用真空冷冻干燥法和半固体培养基保存法!但多年
来的实践经验表明!以上方法各有不足之处!冷冻真空干燥法效果最佳!但设备要求高!制备程序复杂!半固体培养基缺点为多数菌种存活时间不长!而且不适于营养要求高的细
菌*笔者自&%%&5%4开始!
应用合成保养液保存法)高层半固体培养基保存法和真空冷冻干燥法进行比较性研究!结果如下*#材料与方法
#6#材料#6#6#合成菌种保养液的配制
硫酸铵%647!硫酸镁%6%%4硫酸铜7!硫酸锌%6%%#6%%#7!氯化钙6%%%4钠盐7!
%%麸氨酸+%枸橼酸钠7!64%6#7!盐酸吡咯醇7!
%6%%#7!磷酸氢二钠&647!
磷酸二氢钾#6%7!蛋白胨#6%!葡萄糖#6%加蒸馏水8溶解后加7#%;肉汤#%%9:!调7!%%9:
于小试管中!$磅&%9>?高压灭菌备用@#A*#6#6&高层半固体琼脂
成分为蛋白胨#;)氯化钠%64;)琼脂粉%6.;!
6&!在小试管中制成&B.以上高层半固体琼脂!#4磅&%备用9>?灭菌
*无菌橡皮塞@&A
*#6#6.保护剂牛奶准备收取原牛奶煮沸!冷却后去掉奶皮!离心吸取下层奶液!用脱脂棉过滤!如此反复&C.次!脱尽脂肪!$磅#%9>?灭
菌!保存于冰箱备用*#6#6-菌种管的处理先经清洁液浸泡)清水冲洗)肥皂水煮沸!自来水冲洗后
用蒸馏水浸泡过夜!
晾干后干烤灭菌备用*#6#64#%种供试菌种伤寒沙门氏菌!福氏志贺菌!普通变形杆菌!大肠埃希菌!
金黄色葡萄球菌!溶血性链球菌!肺炎链球菌!脑膜炎奈瑟菌!
白喉棒状杆菌!铜绿假单胞菌!以上菌种为北京药品生物制品鉴定所提供的标准菌株*#6#63冷冻干燥机真空泵#6&方法#6&6#合成菌种保养液保存法
将菌种分离纯化!用接种环刮取菌苔".C4环’
置上述合成保养液小试管中!盖紧管塞将其放入+&%,冰柜保存*每
年取出一支复苏转移至适宜培养基中观察其生长情况!并做
生化反应无明显变化!
再继续保存!已保存.年*#6&6&高层半固体琼脂保存法
将要保存菌种分离纯化后!挑取菌落接种到高层半固体作者简介(林君荣"#83-C’
女!辽宁丹东人!实验师*琼脂中!.1,培养#&D取出置室温过夜!次日以无菌操作换上无菌橡皮塞!置-,冰箱保存!
每.个月转种一次!多数已保存.年*#6&6.冷冻干燥保存法
将欲保存菌种分别接种到对该菌最适宜斜面或平板上!经.1,#3已脱脂牛奶中D培养后用接种刮取三白金耳放在上述#约以9:!轻轻混匀!$%亿为宜!
然后用无菌长颈滴管吸取菌悬液滴入菌种管球部!每管4滴!向管颈部塞入无菌脱脂棉少许!放入低温冰柜+-%,速冻-%取出直接放入冷冻机中真空抽干9>?!$C#%然后在真空条件下溶封菌种管!抽样检查菌种真空度D!
*已保存#4年*&结果我们使用冷冻干燥法保存的菌种到目前为止已达#4年!应用合成保养液保存法的时间不长!仅仅.年!经检测以上两种方法保存的#%种受试菌种生化反应)形态结构)染色特性等与标准菌株相符!存活率达88;*高层半固体琼脂保存法!一般细菌已存活.年!但营养要求高的细菌"如溶血性链球
菌)肺炎链球菌)脑膜炎奈瑟菌)白喉棒状杆菌’只能存活3C8个月!需要每.个月传代一次*.讨论细菌依靠各种营养物质合成菌细胞本身的成分及其代
谢产物!
并提供新陈代谢中的能量!同时也依靠营养物质维持酶的活性或参与酶的组成*培养基的研制就必须考虑到细
菌所需要的各种营养物质如碳源)
氮源)无机盐和生长因子!以维持细菌长期在半休眠状态期下的营养*所以良好的培养
基是细菌长期保存必不可少的条件*@.A
冷冻真空干燥保存法
保存时间最长!
效果最佳!但所需要的专用仪器一般实验室难以配备!
而且过程复杂操作难度大!需要较长时间才能完成*
高层半固体琼脂保存菌种方法简便易行但不适于特殊菌种的长期保存*合成保养液保存菌种的时间虽不如冷冻真空
干燥保存法保存的时间长!
但操作比较简单!比高层半固体琼脂保存法保存时间长!且不易变性*从.种保存方法比较结果分析以及实际工作总结!对常用菌的保存!合成菌种保养
液保存法优于其它两种方法!
克服以往多次传代造成菌种容易污染和变异的弊病*为此!根据细菌特性选择不同的保存
方式以满足科研)
教学实验标本的供给!是非常重要的*延长保存菌种的存活期必须注意以下几点(E保存菌种的培养物应选择生长期幼龄的培养物!且培养物应制成浓菌
液保存!
以保证细菌的存活率*F高层半固体培养基保存菌种最好选择不含或含糖量低的培养基!可减少或避免因代谢产物产生而造成的细菌死亡*G保存温度的高低可影响菌种的存活率!反复冰融易使细菌死亡*
参考文献(
@#A
李洪敏!刘军!林明贵!等6介绍一种长期保存菌种的合成保养液@A6微生物学通报!&%%&!&8".@&A陈秀H英6菌种保存方法比较’(#%4C#%3@HA6中国卫生检验杂志!&%%&!#&"@.A郭&’积(&燕.#
主编6微生物检验技术@IA6北京(人民卫生出版社!&%%&!##
"收稿日期(&%%4+#&+#1’
菌种长期保存方法的新尝试
作者：
作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
林君荣， 李慧霞
辽东学院医学院,辽宁,丹东,118002黑龙江医药科学
HEILONGJIANG MEDICINE AND PHARMACY2006，29(1)1次
1.李洪敏.刘军.林明贵 介绍一种长期保存菌种的合成保养液[期刊论文]-微生物学通报 2002(03)2.陈秀英 菌种保存方法比较[期刊论文]-中国卫生检验杂志 2002(02)3.郭积燕 微生物检验技术 2002
1.期刊论文 蒋小皖.张春元.倪秀璋 霍乱菌种长期保存存活率分析 -江苏预防医学2001,12(3)
霍乱是由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病,该古老的疾病,在中外历史上曾对人类健康造成极大的危害.该病病原霍乱弧菌长期动态的深入研究对该病防治有重要意义.菌种的长期保存是进行研究的基本条件之一.本省自1961年发现El Tor霍乱弧菌至今,坚持了霍乱菌种的冷冻干燥(冻干)保存,但是从未对冻干菌种的存活率进行检查.分析长期保存霍乱菌种的存活率,探讨如何改善菌种的保存,这是一件十分有意义的工作.
2.学位论文 刘衍芬 DVS乳酸菌种菌株传代和保存与遗传稳定性分析 2005
乳酸菌已由过去的单纯应用于食品领域发展至现在已广泛应用于人畜的防病治病及保健等许多方面，因而乳酸菌制品的分离和保存就显得极为重要。较常用的乳酸菌有双歧杆菌、乳杆菌、链球菌等。正常条件下，乳酸菌较难分离和长期保存。直投式酸奶发酵剂(DVS)中的乳酸菌菌株只能在分离之后稳定传代3次左右，如果长期传代则发酵性能变得不稳定，使发酵乳产品质量下降。有关乳酸菌菌株在传代和保存过程中的遗传稳定性分析在国内外均未见报道。本研究从DNA水平、表型特征、全细胞蛋白质变化及发酵特性等生物学特性方面对从直投式酸奶发酵剂中分离出来的3株乳酸菌菌株传代和保存过程中的遗传稳定性进行分析，为建立乳酸菌传代和保存方法及开发DVS菌种提供实验依据。
实验结果表明：在PY改良培养基当中，乳球菌和杆菌1可稳定传代15次，RAPD结果、表型特征、全细胞蛋白质和发酵特性无明显变化；而杆菌2可稳定传代10次。4℃保存过程中，乳球菌RAPD结果、表型特征、全细胞蛋白质和发酵特性均无明显变化，可连续保存至30d；杆菌1和杆菌2可连续保存至15d。以PY改良培养基加入15％甘油为保护剂于-80℃冷冻保存过程中，乳球菌可保存30d，表型特征、全细胞蛋白质和发酵特性无明显变化；杆菌1、杆菌2可保存15d。冻干保存前后3个DVS菌株均无明显变化，提示冻干法是乳酸菌菌株长期保存的最佳方法之一。
本研究建立了适合DVS菌株传代和保存的方法，同时也为建立一套完整、科学的检验微生物传代和保存过程中遗传稳定性分析方法提供了实验依据。
3.期刊论文 张俊达.孙厚华 常见医学真菌菌种低温真空冷冻干燥长期保存后存活情况研究 -中国麻风皮肤病杂志2006,22(3)
本文观察了在低温真空冷冻干燥长期保存的真菌菌种存活情况,结果皮肤癣菌存活率为91.6%,大部分菌种存活至20年;酵母样菌存活率为83.5%,最长存活22年;深部真菌存活率为83.4%,除个别菌种外多数菌种均存活22年;腐生菌存活率为75%,其中曲霉菌属保存至22年全部存活.本实验结果显示绝大部分真菌菌种用冷干法保存,可存活13～22年.
4.期刊论文 杨根华.王雪媛.陈海如.生越明 长期保存丝核菌菌种的一种方法 -菌物系统2002,21(1)
Cultures of Rhizoctonia spp. maintained on agar media at 15℃ should be transferred every 4-5 months to ensure viability. Thisprocedure could consume an excessive amount of time, and isolates that are transferred frequently may undergo genetic changesresulting in reduction in virulence. Therefore, methods for long-term storage (>6 months) are required.
5.学位论文 刘廷利 重庆地区烟草黑胫病菌致病性分化及小种鉴定 2007
烟草黑胫病(tobaccoblackshank)在我国分布范围很广，除黑龙江省尚未发现之外，其余各植烟省区，包括台湾在内，均有发生。烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasitica)可以危害烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等所有的栽培烟草，破坏力极强。
本研究从重庆主产烟区采集典型烟草黑胫病样品，带回实验室分离、纯化、鉴定。对确定为烟草黑胫病菌的菌株进行了致病性分化的研究及生理小种鉴定；并利用各烟区致病性表现较强的菌株组成的混合菌对重庆10个主栽烟草品种进行了抗病性测定。期望为生产上的烟草抗病品种的定向培育及合理布局提供前提条件和科学依据。主要试验结果如下：
1.菌株的采集从2005年7月到2006年10月从重庆武隆、万州、巫山、彭水、涪陵、石柱、酉阳等地区的共采集烟草黑胫病样品123份，分离纯化得到烟草黑胫病菌菌株52个，其中武隆2个、万州2个、巫山7个、彭水12个、涪陵12个、石柱9个、酉阳8个。
2.生理小种鉴定随机选择40个菌株注射接种4个鉴别寄主后第10天观察，NC1071对供试的40个菌株表现为抗病，病情指数皆为0；N.nesophilal对40个菌株也表现为抗病，病情指数0-20；L8对40个菌株皆表现为感病，病情指数75-100；小黄金1025皆表现为感病反应，病情指数77.78-100。40个菌株在TTC固体培养基和液体培养基上皆呈现红色反应。由鉴别寄主抗性反应和TTC颜色反应可以鉴定40个菌株皆为1号生理小种。
3.致病性分化选择具代表性的24个菌株用游动孢子悬浮液灌根接种红花大金元、MSK326、云烟202三个烟草品种，结果表明，24个菌株在单个烟草品种上、三个品种的组合上、地区之间皆存在明显的致病性分化。在红花大金元上，表现为强致病力的菌株14个，中致病力菌株6个，弱致病力菌株4个；在MSK326上，表现为强致病力的菌株3个，中致病力菌株11个，弱致病力菌株10个；在云烟202上，表现为强致病力的菌株2个，中致病力菌株6个，弱致病力菌株16个。24个菌株在三个品种的组合上，表现为强致病力菌株有2个，中等致病力菌株有16个，弱致病力菌株有6个。从各烟区菌株的平均病情指数来看，各烟区存在明显的致病性分化，其中武隆烟区菌株的致病性最强，平均病情指数为57.41，而万州烟区的菌株致病性相对较弱，平均病情指数为18.50。
4.重庆主栽品种对烟草黑胫病菌的抗病性测定本研究中选用了重庆各烟区近年来最常使用的10个品种。利用各烟区中致病力表现较强的七个菌株(FJ2-1、PL3-1、SL1-5、WH1-1、WL1-8、WX1-7和YL1-2)组成混合菌对这10个主栽品种的进行抗性测定。结果表明，供试的10个烟草品种对烟草黑胫病菌的抗性差异明显，其中，无高抗品种；抗病品种有4个，分别为NC82、云烟201、云烟203、贵烟4号；中抗品种有2个，分别为MSK326、MS云烟85；感病品种有2个，分别为MS云烟87、云烟202；高感品种有2个、分别为颚烟4号、红花大金元。 5.菌种保存
分别用四种不同菌种保存方法对PL2-5、SS1-8、YL1-2三个菌株进行了菌种的保存方法比较，并定期对供试保存菌种的进行检测。结果表明，蒸馏水常温保存和液体石蜡常温保存二种方法皆较好，适用于长期保存菌种；用燕麦培养基斜面常温保存菌种，适用于短期保存菌种；另外燕麦培养基斜面4℃冰箱保存不适宜用于烟草黑胫病菌的保存。
6.期刊论文 马学斌.马骢.郭建巍.蒋学兵.陈昌国.郝秀红.刘敏.王海东.MA Xue-bin.MA Cong.GUO Jian-wei.JIANG Xue-bing.CHEN Chang-guo.HAO Xiu-hong.LIU Min.WANG Hai-dong 海洋细菌长期保存方法研究 -海军总医院学报2009,22(3)
目的 比较几种不同的方法长期保存海洋细菌的效果.方法 应用10%脱脂乳、35%甘油肉汤、灭菌滤纸片和鉴定卡分别在-80℃保存海洋细菌,选取保存1、2、5、8年的细菌分别复苏检测其存活率.结果 10%脱脂乳和35%的甘油肉汤对各种菌种的保存效果比较好,保存2年时复苏率为100%,保存8年时间复苏率为98.3%.滤纸片和鉴定卡对海洋细菌的长期保存效果不如脱脂乳和甘油肉汤法.结论 10%脱脂乳和35%甘油肉汤对海洋细菌的长期保存效果较好,可以用于海洋细菌的长期保存.
7.会议论文 李洪敏.徐明.王涛.安慧茹.刘真.赵玉梅 建立长期保存结核分支杆菌的方法 2003
为寻找结核分枝杆菌长期保存的方法,本文研制了合成保养液,并进行了对比实验,结果表明,该长期菌种培养基随着时间的延长,越来越显示出它的优势.
8.学位论文 马金龙 短梗霉多糖发酵研究 2005
本文遵照从菌种初级选育→摇瓶发酵→放大培养的程序路线:首先,将长期保存的菌种进行复壮和筛选;之后,重点放在摇瓶发酵中,包括几个方面:1、通过改变培养基离子浓度、渗透压和添加表面活性剂,来改变细胞膜透性,促进细胞内外物质交换,增加底物利用率.2、在培养基组成方面,通过正交实验,确定培养基的最适合配比:蔗糖(50.0g/L)、KHPO(5.0g/L)、(NH)SO(0.6g/L)、酵母膏(3.0g/L)、
CaCO(0.5g/L),MgSO.7HO(0.4g/L),NaCl(1.0g/L),吐温-80(0.3﹪V)可使多糖转化率达到70﹪,发酵液颜色接近乳黄色.3、发酵条件考察初始pH、装液量、接种量等方面,确定了最适发酵条件.最后,通过采用BiostatB 5L发酵罐进行放大培养,发酵培养基为摇瓶所确定的最适配比,通过研究确定通气率为1.5vvm,搅拌速度为500rpm,培养温度为28℃±1.5℃,初始pH值为6.5,使得多糖转化率超过60﹪,发酵液颜色为浅乳黄色.通过上述研究,为今后选用低色素菌株进行工业化生产做铺垫,对进一步研究短梗霉产多糖机制有一定的帮助.
9.期刊论文 段双科.李宁.吴兴元.杨英 小麦赤霉病菌种保存及致病性研究 -西北农业学报2003,12(4)
在小麦赤霉病抗性鉴定工作中,常因禾谷镰刀菌于室内连续多代移植培养导致菌株的致病性衰弱,而影响年度间鉴定结果的准确性和一致性.对此,笔者尝试"一次制种,多年应用",将小麦赤霉病菌制备成小米粒菌体,置 4℃冰箱环境中长期保存.对保存年限不同的4个菌株进行室内培养和大田接种以测定其活力和致病性.结果表明,小麦赤霉菌小米粒菌体在4 ℃冰箱环境中可长期保存,7 a之久仍有活力,且其田间致病性没有发生衰退.该菌种制作保存方法简单、经济、可靠,适用于小麦种质材料抗赤霉病鉴定选择工作.
10.期刊论文 叶峰山.张瑞芳.周霞.崔雪萍.李连青.李小平.陈莎丽 3种淋球菌菌种保存方法比较 -山西医药杂志2009,38(8)
目前,淋球菌保存一般采用传统的冷冻真空干燥法,此法虽然可靠,但操作繁琐费时,需要贵重仪器--冰冻干燥机和真空泵等,成本较高.如何简单而又可靠地长期保存淋球菌,一直是广大科研工作者关心的课题,为此我们经过实验,比较几种淋球菌菌种保存方法,现报告如下.
1.朱志宁.赵燕.黄惠.任晓明 两种方法保存嗜酸乳杆菌效果的比较研究[期刊论文]-动物医学进展 2008(11)
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下载时间：2010年10月24日