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辽宁中医杂志2011年第38卷第7期
小鼠肝炎病毒温病湿热证模型的探讨
12
李华锋，林培政
（1. 广州医学院第二附属医院中医科，广东广州510260；2. 广州中医药大学温病学教研室，广东广州510405）摘要：目的：研究拟以MHV －A59和大肠杆菌作为生物致病因子，建立两种小鼠温病湿热证动物模型，通过对比探
讨小鼠肝炎病毒温病湿热证模型可行性。方法：动物随机分为3组：正常组、模型组（肥甘饮食+湿热外环境+MHV －A59
TNF －α水平及肝组织病理切片，造模）、肠菌组（肥甘饮食+湿热外环境+大肠杆菌造模），检测小鼠血清TG 、观察动物症
两种温病湿热证模型组小鼠血清TG 及TNF －α水平明显升高（P ＜0．01），两组造模动物状及体征。结果：与正常组比较，
均不同程度出现了发热、疲倦、纳呆、腹泻、体重减少、毛发无泽等症状。结论：以MHV －A59作为生物致病因子，结合肥甘
可以作为温病湿热证动物模型之一，也是一种新的病证结合模型。饮食及湿热外环境因素构建的动物模型，
关键词：温病湿热证；动物模型；MHV －A59；TG ；TNF －α中图分类号：R －332文献标识码：A 文章编号：1000－1719（2011）07－1318－04
To Approach Mouse Models of Damp －heat Syndrome of Seasonal
Febrile Disease Infected by MHV －A 59
LI Hua-feng 1，LIN Pei-zheng 2
（1．Department of TCM ，Second Affiliated Hospital ，Guangzhou Medical College ，Guangzhou 510260，Guangdong ，China ；2．Department of Seasonal Febrile Disease ，Guangzhou University of Chinese Medicine ，Guangzhou 510405，Guangdong ，China ）Abstract ：Objective ：Through contrast mouse models of Damp －heat syndrome of seasonal febrile disease infected by MHV －A59and Bacillus coli．To establish Mouse Models of Damp －heat Syndrome of Seasonal Febrile Disease Infected by MHV －A59．Methods ：four －weeks －old male mouse of BALB /cwas divided into three groups randomly ，control group ，model group （richly fatty and sweet diet +humid heat environment +infecting by MHV －A59），Bacillus coli group （richly fatty and sweet diet +humid heat environment +infecting by Bacillus coli ）．The TG and TNF －αlevel in serum of mouse were detected by biochemistry and ELISA．In experiment we observed the symptom and sign of mouse．Results ：The level of TG and TNF －αin serum of two model group
languor ，Diarrhea ，weight obviously risen up compared to control group （P ＜0. 01）．The mouse of two model group show up fever ，
lose ，poor appetite etc．Conclusion ：we duplicated a new mouse model of damp －heat syndrome of seasonal febrile disease by richly
humid heat environment ，MHV －A59．The model possessed characteristics of the illness and syndrome．fatty and sweet diet ，
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收稿日期：2010－11－10
基金项目：国家自然科学基金广东省自然科学基金联合项目
（U0632009）
作者简介：李华锋（1978－），男，湖北荆门人，讲师，博士，研究方向：岭
南温病的临床与实验。
通讯作者：林培政（1951－），男，教授，研究方向：岭南温病的临床与实
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辽宁中医杂志2011年第38卷第7期
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Key words ：Damp －heat syndrome of seasonal febrile disease ，Mouse Models ，MHV －A59，TG ，TNF －α
温病湿热证模型是研究湿热型温病的热点与重
点，现有温病湿热证动物模型造模方法，遵循了中医证必须根据中医理论模拟传统病因候动物模型的研制，
“太阴内伤，的基本要求，以湿饮停聚，客邪再至，内外
相引，故病湿热”为理论基础，既考虑了环境、饮食因
“内、，素来模拟外湿”又通过感染致病生物因子复合符合湿热类温病的发病学特点。造成外感湿热病邪，
“饮食+环境+生物致病因子”笔者认为，以的模型已
基本被同行接受。但生物感染因子集中在大肠杆菌、鼠沙门氏杆菌和内毒素，而将病毒感染纳入复合因素之一还未见报道。对于更多生物致病因子的探讨，不但有助于丰富温病湿热证的内涵，还是对病证结合模型的一种探讨。小鼠肝炎病毒A59株（mouse hepatitis virus ，MHV －A59）作为研究人类冠状病毒的良好替代品，目前的研究已经很深入。本课题拟用MHV －A59为生物致病因子建立温病湿热证模型，并从肿瘤坏死因子α（TNF －α）与甘油三酯（TG ）水平等，结合动物的体征与症状评估动物模型。1实验材料1．1动物
4周龄左右，清洁级BALB /c 雄性小鼠，体重（13
ʃ 2）g （由南方医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：NomL．0029399）。1．2
饲料
普通饲料由南方医科大学动物实验中心提供；肥甘饲料由广东省医学实验动物中心加工（配方：80%基础饲料+8%蜂蜜+12%猪油）。
分组及干预措施：小鼠18只，随机分为为3组，每组6只。
正常对照组（简称正常组，以下同）：正常饲料、自由饮水及自然环境饲养15天。MHV －A59温病湿热证模型组（简称模型组，以下同）（肥甘饮食+湿热外环境+MHV －A59造模）：小鼠先予以肥甘饮食、自由饮水和自然环境饲养；至第10天上午8：00予以腹腔
－5．5
），注射MHV －A590．5mL （浓度为10在病毒感染
第3天，第5天上午（9：00－12：00）放入气后第1天，
；其余候模拟舱［温度（32ʃ 0．5）ħ ，湿度（60ʃ 5）%］
肥甘饲料及自由饮水饲养。最后一时间在自然环境、
次出气候模拟舱时造模完毕。大肠杆菌温病湿热证模
型组（简称肠菌组，以下同）（肥甘饮食+湿热外环境+大肠杆菌造模）：小鼠先予以肥甘饮食、自由饮水和自然环境饲养；至第10天上午8：00予以0．4mL /10g
9
大肠杆菌（浓度为10/mL ）灌胃1次，第12天上午8：00重复感染1次。在大肠杆菌感染后第1天，第3天，第5天上午（9：00－12：00）放入气候模拟舱［温度
（32ʃ 0．5）ħ ，；其余时间在自然环湿度（60ʃ 5）%］境、肥甘饲料及自由饮水饲养。最后一次出气候模拟舱时造模完毕。2．4样本检测
2．4．1取材及样本预处理平时观察动物症状与体征，动物造模完毕，在气候模拟舱内测肛温（ħ ）、体重（g ），再将动物摘眼球取血，血液静置30min 后，于4ħ 、1500rpm 离心15min ，取上清液保存于4ħ ，待测。剖取小鼠肝脏右叶，面积约1cm ˑ 1cm ，用多聚甲醛中固定，放入4ħ 保存待测。
2．4．2血清TNF －α检测ELISA 法，步骤如下：试剂盒先平衡至室温（20 25ħ ）。取出所需反应板。
10μL 血清加入10微升（μL ）标准品（standards ）、
于相应反应板中孔；每孔加入40μL anti mouse TNF －a Biotin 和40μL Anti mouse TNF －a POD ，轻轻混匀30s ，封住板孔，室温温育45min ；洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350μL 洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次；每孔加入100μL 显色液，轻轻混匀10s ，室温温育20min ；每孔加入100μL 终止液（stop solution ）；轻轻混匀30s ；30min 内在450nm 处读取OD 值；以OD 值为纵坐标，也标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线；根据血清样品的OD 值可在标准曲线上查出其浓度（pg /mL ）。
2．4．3血清TG 水平磷酸甘油氧化法本指标在南方医科大学附属珠江医院检测。2．4．4肝脏病理切片HE 染色法，步骤如下：取材组4μm 切片；切片用二织块，经固定后，常规石蜡包埋，甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I ）5min →二甲苯（Ⅱ）5min →100%乙醇2min →95%的乙醇1min →80%乙醇1min →75%乙醇1min →蒸馏水洗2min ；苏木素染色5min ，自来水冲洗；盐酸乙醇分化30s （提插数下）；自来水浸泡15min 或温水（约50ħ ）5min ；置伊红液2min ；常规脱水，透明，封片：95%乙醇（I ）min →95%乙醇（Ⅱ）1min →100%乙醇（I ）1min →100%乙醇
1．3试剂及病毒、细胞、菌种
MHV －A59毒株，L929细胞株，大肠杆菌（南方医
TNF －α原装试剂盒（由科大学微生物实验室惠赠），
达辉生物有限公司代购）。TG 检测试剂（南方医科大
学附属珠江医院提供）。1．4
主要仪器
酶标仪（美国Bio －tek 公司出产的Powerwave HT 型），烤箱（德国MMM 公司的Venticall 型），摇床（北京市六一仪器厂，型号：WD9405B ），湿盒（广州威佳科
技有限公司，型号：10P ），水浴锅（常州澳华仪器有限
AESROST 全自动生化分析仪，公司，型号：HH －2），
CENTRIFOGE －TDL －160冷冻离心机，气候模拟舱（南方医科大学提供）。TANITAKD －160电子称，数字肛温计（上海华辰医用仪表有限公司）。2实验方法
2．1MHV －A59病毒液的制备
MHV －A59病毒液用生理盐水配制成10－5．5浓度备用（浓度来自预实验）。2．2大肠杆菌的制备
采用营养琼脂斜面培养24h ，生理盐水洗脱，麦氏
9
管比浊法测得该菌的应用浓度为10/mL ，由于小鼠的
［1］
鼠尾静脉注射的成功率相对较低，结合文献，造模第1天予以0．4mL /10g灌胃1次，第3天予以相同剂量重复感染1次。2．3
实验分组及造模方法
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（Ⅱ）1min →二甲苯石碳酸（3：1）1min →二甲苯（I ）1min →二甲苯（Ⅱ）1min →中性树脂封固；切片在200倍的光镜下读片。3实验结果3．1
统计方法
用SPSS 11．5软件分析结果，数据均以均数ʃ 标
珋ʃ s ），准差表示（x 若数据满足正态性和方差齐性，则采组间用q 检验，两组间采用t 检用单因素方差分析，
P ＜0．05为显著性差异，P ＜0．01为非常显著性差验，
异。
3．2结果
3．2．1两种温病湿热证模型血清TG 、TNF －α水平见表1。
表1组别正常组模型组肠菌组＜0．01。
珋TNF －α水平变化（x ʃ s ）两种温病湿热证模型血清TG 、
n 666
TG （mmol /L）1．84ʃ 0．565．04ʃ 2．24
△
辽宁中医杂志2011年第38卷第7期
图1模型组肝脏病理切片（HE ˑ 200
）
TNF －α（pg /mL）147．16ʃ 4．76188．10ʃ 10．09△△171．01ʃ 10．71△△★★
6．25ʃ 1．99△
注：与正常组比较△P ＜0．05，△△P ＜0．01；与模型组比较★★P
从表1及可以看出，与正常组比较，两组模型小鼠
TG 显著性增高（P ＜0．01或P ＜0．血清肿TNF －α、
05）。模型组血清TNF －α较肠菌组升高更显著（P ＜
0．01）实验结果显示：两种模型小鼠血清中TNF －α、TG 水平明显升高。
3．2．2两种温病湿热证模型肛温、体重的变化
表2
组别正常组模型组肠菌组
n 666
珋ʃ s ）两种温病湿热证模型肛温、体重的变化（x
肛温（ħ ）
造模前34．7ʃ 0．434．7ʃ 0．634．8ʃ 0．3
造模后34．8ʃ 0．437．4ʃ 0．9△△37．2ʃ 0．8△△
造模前12．9ʃ 1．611．6ʃ 1．510．9ʃ 2．0
体重（g ）
造模后15．4ʃ 1．3△9．8ʃ 1．3△△12．6ʃ 1．2
图2
肠菌组肝脏病理切片（HE ˑ 200）
见表2。
注：造模前后比较采用Paired －samples T Test ，与造模前比较△P ＜0．05，△△P ＜0．01。
从表2可以看出，造模前后比较，正常动物的体重增加（P ＜0．05），肛温变化不明显；模型组动物体重明显减轻（P ＜0．01），肛温明显升高（P ＜0．01）；肠菌组动物肛温明显升高（P ＜0．01），体重变化不明显。实验结时显示：两组温病湿热证模型均出现了发热（肛温升高），模型组小鼠体重减轻明显。3．2．3表3
表3组别
两种温病湿热证模型小鼠症状、体征及肝脏病理变化的对比
症状及体征
肛温
活动
饮食正常
大便正常
体重
毛发
肝脏病理肝细胞形态正常散状坏死（见图1）纤肝细胞点状坏死、维增生（见图2）
两种温病湿热证模型小鼠症状、体征对比见
正常组正常正常模型组肠菌组
正常正常
明显出现肢体瘫减少，部分动黏滞，粪明显毛发蓬松，肝细胞变性、点状或升高痪和追尾征物不进食明显动物蜷缩一升高团
饮食减少
便油黑减轻无光泽大便稀溏
稍有毛发无减轻光泽
4讨论
4．1两组温病湿热证模型症状、体征与肝脏病理分析
本研究在复制温病湿热证动物模型方面，采用“肥甘饮食+湿热外环境+生物致病因子”的模式，对
结合病毒于生物致病因子第一次引进了MHV －A59，
感染的特殊性，选择了4周龄左右的雄性BALB /c 小鼠，对比大肠杆菌作为生物致病因子的温病湿热证模型，充分体现温病湿热证包涵“病”的多样性，也是对
MHV －A59病证结合模型的一种补充。本研究发现，
温病湿热证模型小鼠出现了发热（肛温升高）、体重减
四肢瘫痪、饮食减少、活动减少、大便黏滞、毛发稀轻，
疏无泽等症状。大肠杆菌温病湿热证动物模型出现了发热、饮食减少、活动减少、大便稀溏等症状。MHV －A59温病湿热证动物模型小鼠体重减轻明显和肢体瘫痪，这与该病毒感染的特点有关。肝脏病理切片显示肝细胞出现变性与坏死，这与MHV －A59的嗜肝性有关。大肠杆菌温病湿热证模型动物腹泻症状明显与大肠杆菌的特性有关。以上两种温病湿热证模型的动物均出现了发热（肛温升高）、纳呆（饮食减少）、倦怠（活
大便黏滞或稀糖、毛发无泽的症状，与文献动减少）、［3］
报道基本一致，符合温病湿热证的发病特征。临床
“太阴内伤”，上由于运化无力，水液代谢失常，出现了
，倦怠、大便黏滞症状，加上“外邪客致”即湿热纳呆、
病邪侵袭人体，造成发热症状。
4．2温病湿热证与血清TNF －α水平变化
TNF 是一类能引起肿瘤组织发生出血坏死的细胞因子，其细胞来源极为广泛，包括各种免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞、表皮细胞、角质细胞、平滑肌细胞、星型细胞、成骨细胞等；按TNF 来源和分子结构不同，
从表3可以看出，两组模型动物均出现了发热、活
动减少、饮食减少、大便黏滞或稀溏、毛发无泽的症状
。
辽宁中医杂志2011年第38卷第7期
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造成脾之运化水湿功能失司，湿聚成痰，而造成损伤，
血脂升高。两种模型小鼠的TG 水平变化无差别，提，“内湿”示了模型在本阶段的形成可能主要与肥甘饮食、湿热外环境有关，与生物致病因子的关系相对较“太阴内小，因为，温病湿热证的典型发病特点是先有
，“内湿”伤，湿饮停聚”这样造成了形成，血脂升高，再“客邪外至”，即生物致病因子感染。才有
4．4动物模型的评价
“肥甘饮食+湿热外环境+生物致病因子”是复制温病湿热证模型较为理想的路线，生物致病因子主导着模型“病”的特性，饮食和环境因素主导着模型“证”特性。MHV －A59是鼠类冠状病毒，可作为研究人类冠状病毒的良好替代品。MHV －A59具有嗜肝性与嗜神经组织性，一般用来复制神经脱髓鞘疾病与爆发型肝炎模型，由于国内对MHV －A59在细胞模型的建立及小鼠感染品种与剂量有了一定的研究基础，本课题采用MHV －A59株建立温病湿热证模型。本
存在血脂紊乱与肿瘤坏研究的两种温病湿热证模型，
死因子水平升高，根据“湿脂相关”理论，血脂可能为
“湿邪”的代谢产物，模型因肥甘厚味，损伤脾胃，水液内湿形成，湿聚成痰，痰浊为血中之膏脂，而代谢失常，
致血脂紊乱。而血清TNF －α水平增高是导致发热与炎症反应的原因之一，与文献中报道的温病湿热证的本质一致。结合模型动物的体征与症状，本研究基本也复制了MHV －复制了温病湿热证动物模型。同时，A59感染的小鼠模型，且模型具有“湿热”特性，是一种新的病证结合模型。本研究扩大了温病湿热证模型的内涵，对于以往温病湿热证模型的研究是一种补充。
“证”充分体现了中医学的广泛内涵。
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TNF 分为TNF －α和TNF －β两种类型，两者氨基酸
序列仅有28%同源性，但两者结合相同的受体，具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、致热作用，促进炎症反应，
［3－4］
。有研究发现温病湿热证与血浆ETX 引起恶液质
［5］
水平及血清TNF －α水平密切相关。吴研等发现湿
TNF －α、热环境能使新西兰白兔体温升高，血浆ETX 、
IL －1浓度升高。周燕萍等［6］发现湿热证模型组血浆
ETX 含量均较正常对照组显著增高，湿热证模型组TNF －α，IL －1β含量均较正常对照组显著增高。本研究提示，模型组与肠菌组血清TNF －α水平明显增高，这与上述文献报道一致。模型组比肠菌组有显著的升高，可能是因为MHV －A59作为生物致病因子所致的湿热症模型炎症反应更加剧烈。4．3温病湿热证与血脂紊乱4．3．1
对于“高血脂为血中之痰
［7］t
这一理论已被临床和实验研究所证实。吴智兵浊”
血脂与痰的关系
认为脂类代谢异常，其病在血液，根在脾胃，乃脾胃失不能分清泌浊，膏脂、痰浊瘀滞血中为痰。有研究健，
［8］
表明，高脂血症与中医的痰湿有十分密切的关系，其中TG 、总胆固醇（TC ）及低密度脂蛋白（LDL －C ）在痰
湿中尤为明显。刘松林等对痰邪致病机理的研究认
TG 、LDL 升高为痰浊的物质基础，为，血中的TC 、使用化痰健脾中药可使其降低，痰湿体质亦表现出上述情
况。可见，血脂可为痰的物质基础之一。4．3．2“湿脂相关”理论湿邪与痰饮都是津液代谢失调的病理产物，乃有形之阴邪。痰饮的生成与湿邪，《临证指南医案·卷五》：“一切诸痰初有较大的关系
”起皆由湿而生。说明湿邪可以通过变化而成痰饮。湿邪是痰饮生成的主要来源之一，湿病日久，湿邪往往
停聚浓缩而成痰饮，阻塞于某一部位。有学者认，血脂异常的形成，一是外源性，由于外感湿热，嗜酒过度，过食肥甘致脾胃受伤，脾气壅滞，气机升降为
失常，二是内源性，一则由于脾不散精，气化失司，精微不布，正常的精微形成浊脂，二则脾不布津，津聚为湿，湿聚为痰，痰浊成脂。可见不论是外源性或内源性脂类异常，均是造成了脾胃运输与转化功能障碍而发病。因此从理论分析，湿、痰、血脂这三者有着密切的关系，三者与脾胃损伤密切相关，在某一阶段可能是同源异流，不能决然分开，正如有学者认为，嗜食肥甘可助湿生痰，甘味其性缓，因此脾胃为痰湿困遏，脾失健运，脾之清气不能化浊而为脂浊、痰湿相混之证。笔者参
［12］
与的前期研究发现，采用复合因素制成的温病湿热TG 、LDL －C 含量均明显升高，证大鼠模型血清中TC 、而HDL －C 显著下降，说明模型组大鼠存在着血脂代谢紊乱，且清热化湿法能改善这种紊乱。因此将血脂作为湿邪的代谢产物之一，或者作为湿邪的客观标准之一既有理论支持，又有现代医学的证实。
4．3．3温病湿热证与血清TG 水平通过理论分析“湿”与实验探讨，我们认为湿热证中性致病因子的物，“血中异常膏脂”质基础与血脂代谢异常有相关性可“湿邪”能为生化物质基础之一。本研究结果显示，两
种模型小鼠血清TG 水平的升高，与笔者前期的研究一致
［13］
［11］
［10］
［9］
。因此，两种温病湿热证动物模型存在着脾胃
·1318·
辽宁中医杂志2011年第38卷第7期
小鼠肝炎病毒温病湿热证模型的探讨
12
李华锋，林培政
（1. 广州医学院第二附属医院中医科，广东广州510260；2. 广州中医药大学温病学教研室，广东广州510405）摘要：目的：研究拟以MHV －A59和大肠杆菌作为生物致病因子，建立两种小鼠温病湿热证动物模型，通过对比探
讨小鼠肝炎病毒温病湿热证模型可行性。方法：动物随机分为3组：正常组、模型组（肥甘饮食+湿热外环境+MHV －A59
TNF －α水平及肝组织病理切片，造模）、肠菌组（肥甘饮食+湿热外环境+大肠杆菌造模），检测小鼠血清TG 、观察动物症
两种温病湿热证模型组小鼠血清TG 及TNF －α水平明显升高（P ＜0．01），两组造模动物状及体征。结果：与正常组比较，
均不同程度出现了发热、疲倦、纳呆、腹泻、体重减少、毛发无泽等症状。结论：以MHV －A59作为生物致病因子，结合肥甘
可以作为温病湿热证动物模型之一，也是一种新的病证结合模型。饮食及湿热外环境因素构建的动物模型，
关键词：温病湿热证；动物模型；MHV －A59；TG ；TNF －α中图分类号：R －332文献标识码：A 文章编号：1000－1719（2011）07－1318－04
To Approach Mouse Models of Damp －heat Syndrome of Seasonal
Febrile Disease Infected by MHV －A 59
LI Hua-feng 1，LIN Pei-zheng 2
（1．Department of TCM ，Second Affiliated Hospital ，Guangzhou Medical College ，Guangzhou 510260，Guangdong ，China ；2．Department of Seasonal Febrile Disease ，Guangzhou University of Chinese Medicine ，Guangzhou 510405，Guangdong ，China ）Abstract ：Objective ：Through contrast mouse models of Damp －heat syndrome of seasonal febrile disease infected by MHV －A59and Bacillus coli．To establish Mouse Models of Damp －heat Syndrome of Seasonal Febrile Disease Infected by MHV －A59．Methods ：four －weeks －old male mouse of BALB /cwas divided into three groups randomly ，control group ，model group （richly fatty and sweet diet +humid heat environment +infecting by MHV －A59），Bacillus coli group （richly fatty and sweet diet +humid heat environment +infecting by Bacillus coli ）．The TG and TNF －αlevel in serum of mouse were detected by biochemistry and ELISA．In experiment we observed the symptom and sign of mouse．Results ：The level of TG and TNF －αin serum of two model group
languor ，Diarrhea ，weight obviously risen up compared to control group （P ＜0. 01）．The mouse of two model group show up fever ，
lose ，poor appetite etc．Conclusion ：we duplicated a new mouse model of damp －heat syndrome of seasonal febrile disease by richly
humid heat environment ，MHV －A59．The model possessed characteristics of the illness and syndrome．fatty and sweet diet ，
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收稿日期：2010－11－10
基金项目：国家自然科学基金广东省自然科学基金联合项目
（U0632009）
作者简介：李华锋（1978－），男，湖北荆门人，讲师，博士，研究方向：岭
南温病的临床与实验。
通讯作者：林培政（1951－），男，教授，研究方向：岭南温病的临床与实
验。
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辽宁中医杂志2011年第38卷第7期
·1319·
Key words ：Damp －heat syndrome of seasonal febrile disease ，Mouse Models ，MHV －A59，TG ，TNF －α
温病湿热证模型是研究湿热型温病的热点与重
点，现有温病湿热证动物模型造模方法，遵循了中医证必须根据中医理论模拟传统病因候动物模型的研制，
“太阴内伤，的基本要求，以湿饮停聚，客邪再至，内外
相引，故病湿热”为理论基础，既考虑了环境、饮食因
“内、，素来模拟外湿”又通过感染致病生物因子复合符合湿热类温病的发病学特点。造成外感湿热病邪，
“饮食+环境+生物致病因子”笔者认为，以的模型已
基本被同行接受。但生物感染因子集中在大肠杆菌、鼠沙门氏杆菌和内毒素，而将病毒感染纳入复合因素之一还未见报道。对于更多生物致病因子的探讨，不但有助于丰富温病湿热证的内涵，还是对病证结合模型的一种探讨。小鼠肝炎病毒A59株（mouse hepatitis virus ，MHV －A59）作为研究人类冠状病毒的良好替代品，目前的研究已经很深入。本课题拟用MHV －A59为生物致病因子建立温病湿热证模型，并从肿瘤坏死因子α（TNF －α）与甘油三酯（TG ）水平等，结合动物的体征与症状评估动物模型。1实验材料1．1动物
4周龄左右，清洁级BALB /c 雄性小鼠，体重（13
ʃ 2）g （由南方医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：NomL．0029399）。1．2
饲料
普通饲料由南方医科大学动物实验中心提供；肥甘饲料由广东省医学实验动物中心加工（配方：80%基础饲料+8%蜂蜜+12%猪油）。
分组及干预措施：小鼠18只，随机分为为3组，每组6只。
正常对照组（简称正常组，以下同）：正常饲料、自由饮水及自然环境饲养15天。MHV －A59温病湿热证模型组（简称模型组，以下同）（肥甘饮食+湿热外环境+MHV －A59造模）：小鼠先予以肥甘饮食、自由饮水和自然环境饲养；至第10天上午8：00予以腹腔
－5．5
），注射MHV －A590．5mL （浓度为10在病毒感染
第3天，第5天上午（9：00－12：00）放入气后第1天，
；其余候模拟舱［温度（32ʃ 0．5）ħ ，湿度（60ʃ 5）%］
肥甘饲料及自由饮水饲养。最后一时间在自然环境、
次出气候模拟舱时造模完毕。大肠杆菌温病湿热证模
型组（简称肠菌组，以下同）（肥甘饮食+湿热外环境+大肠杆菌造模）：小鼠先予以肥甘饮食、自由饮水和自然环境饲养；至第10天上午8：00予以0．4mL /10g
9
大肠杆菌（浓度为10/mL ）灌胃1次，第12天上午8：00重复感染1次。在大肠杆菌感染后第1天，第3天，第5天上午（9：00－12：00）放入气候模拟舱［温度
（32ʃ 0．5）ħ ，；其余时间在自然环湿度（60ʃ 5）%］境、肥甘饲料及自由饮水饲养。最后一次出气候模拟舱时造模完毕。2．4样本检测
2．4．1取材及样本预处理平时观察动物症状与体征，动物造模完毕，在气候模拟舱内测肛温（ħ ）、体重（g ），再将动物摘眼球取血，血液静置30min 后，于4ħ 、1500rpm 离心15min ，取上清液保存于4ħ ，待测。剖取小鼠肝脏右叶，面积约1cm ˑ 1cm ，用多聚甲醛中固定，放入4ħ 保存待测。
2．4．2血清TNF －α检测ELISA 法，步骤如下：试剂盒先平衡至室温（20 25ħ ）。取出所需反应板。
10μL 血清加入10微升（μL ）标准品（standards ）、
于相应反应板中孔；每孔加入40μL anti mouse TNF －a Biotin 和40μL Anti mouse TNF －a POD ，轻轻混匀30s ，封住板孔，室温温育45min ；洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350μL 洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次；每孔加入100μL 显色液，轻轻混匀10s ，室温温育20min ；每孔加入100μL 终止液（stop solution ）；轻轻混匀30s ；30min 内在450nm 处读取OD 值；以OD 值为纵坐标，也标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线；根据血清样品的OD 值可在标准曲线上查出其浓度（pg /mL ）。
2．4．3血清TG 水平磷酸甘油氧化法本指标在南方医科大学附属珠江医院检测。2．4．4肝脏病理切片HE 染色法，步骤如下：取材组4μm 切片；切片用二织块，经固定后，常规石蜡包埋，甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I ）5min →二甲苯（Ⅱ）5min →100%乙醇2min →95%的乙醇1min →80%乙醇1min →75%乙醇1min →蒸馏水洗2min ；苏木素染色5min ，自来水冲洗；盐酸乙醇分化30s （提插数下）；自来水浸泡15min 或温水（约50ħ ）5min ；置伊红液2min ；常规脱水，透明，封片：95%乙醇（I ）min →95%乙醇（Ⅱ）1min →100%乙醇（I ）1min →100%乙醇
1．3试剂及病毒、细胞、菌种
MHV －A59毒株，L929细胞株，大肠杆菌（南方医
TNF －α原装试剂盒（由科大学微生物实验室惠赠），
达辉生物有限公司代购）。TG 检测试剂（南方医科大
学附属珠江医院提供）。1．4
主要仪器
酶标仪（美国Bio －tek 公司出产的Powerwave HT 型），烤箱（德国MMM 公司的Venticall 型），摇床（北京市六一仪器厂，型号：WD9405B ），湿盒（广州威佳科
技有限公司，型号：10P ），水浴锅（常州澳华仪器有限
AESROST 全自动生化分析仪，公司，型号：HH －2），
CENTRIFOGE －TDL －160冷冻离心机，气候模拟舱（南方医科大学提供）。TANITAKD －160电子称，数字肛温计（上海华辰医用仪表有限公司）。2实验方法
2．1MHV －A59病毒液的制备
MHV －A59病毒液用生理盐水配制成10－5．5浓度备用（浓度来自预实验）。2．2大肠杆菌的制备
采用营养琼脂斜面培养24h ，生理盐水洗脱，麦氏
9
管比浊法测得该菌的应用浓度为10/mL ，由于小鼠的
［1］
鼠尾静脉注射的成功率相对较低，结合文献，造模第1天予以0．4mL /10g灌胃1次，第3天予以相同剂量重复感染1次。2．3
实验分组及造模方法
·1320·
（Ⅱ）1min →二甲苯石碳酸（3：1）1min →二甲苯（I ）1min →二甲苯（Ⅱ）1min →中性树脂封固；切片在200倍的光镜下读片。3实验结果3．1
统计方法
用SPSS 11．5软件分析结果，数据均以均数ʃ 标
珋ʃ s ），准差表示（x 若数据满足正态性和方差齐性，则采组间用q 检验，两组间采用t 检用单因素方差分析，
P ＜0．05为显著性差异，P ＜0．01为非常显著性差验，
异。
3．2结果
3．2．1两种温病湿热证模型血清TG 、TNF －α水平见表1。
表1组别正常组模型组肠菌组＜0．01。
珋TNF －α水平变化（x ʃ s ）两种温病湿热证模型血清TG 、
n 666
TG （mmol /L）1．84ʃ 0．565．04ʃ 2．24
△
辽宁中医杂志2011年第38卷第7期
图1模型组肝脏病理切片（HE ˑ 200
）
TNF －α（pg /mL）147．16ʃ 4．76188．10ʃ 10．09△△171．01ʃ 10．71△△★★
6．25ʃ 1．99△
注：与正常组比较△P ＜0．05，△△P ＜0．01；与模型组比较★★P
从表1及可以看出，与正常组比较，两组模型小鼠
TG 显著性增高（P ＜0．01或P ＜0．血清肿TNF －α、
05）。模型组血清TNF －α较肠菌组升高更显著（P ＜
0．01）实验结果显示：两种模型小鼠血清中TNF －α、TG 水平明显升高。
3．2．2两种温病湿热证模型肛温、体重的变化
表2
组别正常组模型组肠菌组
n 666
珋ʃ s ）两种温病湿热证模型肛温、体重的变化（x
肛温（ħ ）
造模前34．7ʃ 0．434．7ʃ 0．634．8ʃ 0．3
造模后34．8ʃ 0．437．4ʃ 0．9△△37．2ʃ 0．8△△
造模前12．9ʃ 1．611．6ʃ 1．510．9ʃ 2．0
体重（g ）
造模后15．4ʃ 1．3△9．8ʃ 1．3△△12．6ʃ 1．2
图2
肠菌组肝脏病理切片（HE ˑ 200）
见表2。
注：造模前后比较采用Paired －samples T Test ，与造模前比较△P ＜0．05，△△P ＜0．01。
从表2可以看出，造模前后比较，正常动物的体重增加（P ＜0．05），肛温变化不明显；模型组动物体重明显减轻（P ＜0．01），肛温明显升高（P ＜0．01）；肠菌组动物肛温明显升高（P ＜0．01），体重变化不明显。实验结时显示：两组温病湿热证模型均出现了发热（肛温升高），模型组小鼠体重减轻明显。3．2．3表3
表3组别
两种温病湿热证模型小鼠症状、体征及肝脏病理变化的对比
症状及体征
肛温
活动
饮食正常
大便正常
体重
毛发
肝脏病理肝细胞形态正常散状坏死（见图1）纤肝细胞点状坏死、维增生（见图2）
两种温病湿热证模型小鼠症状、体征对比见
正常组正常正常模型组肠菌组
正常正常
明显出现肢体瘫减少，部分动黏滞，粪明显毛发蓬松，肝细胞变性、点状或升高痪和追尾征物不进食明显动物蜷缩一升高团
饮食减少
便油黑减轻无光泽大便稀溏
稍有毛发无减轻光泽
4讨论
4．1两组温病湿热证模型症状、体征与肝脏病理分析
本研究在复制温病湿热证动物模型方面，采用“肥甘饮食+湿热外环境+生物致病因子”的模式，对
结合病毒于生物致病因子第一次引进了MHV －A59，
感染的特殊性，选择了4周龄左右的雄性BALB /c 小鼠，对比大肠杆菌作为生物致病因子的温病湿热证模型，充分体现温病湿热证包涵“病”的多样性，也是对
MHV －A59病证结合模型的一种补充。本研究发现，
温病湿热证模型小鼠出现了发热（肛温升高）、体重减
四肢瘫痪、饮食减少、活动减少、大便黏滞、毛发稀轻，
疏无泽等症状。大肠杆菌温病湿热证动物模型出现了发热、饮食减少、活动减少、大便稀溏等症状。MHV －A59温病湿热证动物模型小鼠体重减轻明显和肢体瘫痪，这与该病毒感染的特点有关。肝脏病理切片显示肝细胞出现变性与坏死，这与MHV －A59的嗜肝性有关。大肠杆菌温病湿热证模型动物腹泻症状明显与大肠杆菌的特性有关。以上两种温病湿热证模型的动物均出现了发热（肛温升高）、纳呆（饮食减少）、倦怠（活
大便黏滞或稀糖、毛发无泽的症状，与文献动减少）、［3］
报道基本一致，符合温病湿热证的发病特征。临床
“太阴内伤”，上由于运化无力，水液代谢失常，出现了
，倦怠、大便黏滞症状，加上“外邪客致”即湿热纳呆、
病邪侵袭人体，造成发热症状。
4．2温病湿热证与血清TNF －α水平变化
TNF 是一类能引起肿瘤组织发生出血坏死的细胞因子，其细胞来源极为广泛，包括各种免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞、表皮细胞、角质细胞、平滑肌细胞、星型细胞、成骨细胞等；按TNF 来源和分子结构不同，
从表3可以看出，两组模型动物均出现了发热、活
动减少、饮食减少、大便黏滞或稀溏、毛发无泽的症状
。
辽宁中医杂志2011年第38卷第7期
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造成脾之运化水湿功能失司，湿聚成痰，而造成损伤，
血脂升高。两种模型小鼠的TG 水平变化无差别，提，“内湿”示了模型在本阶段的形成可能主要与肥甘饮食、湿热外环境有关，与生物致病因子的关系相对较“太阴内小，因为，温病湿热证的典型发病特点是先有
，“内湿”伤，湿饮停聚”这样造成了形成，血脂升高，再“客邪外至”，即生物致病因子感染。才有
4．4动物模型的评价
“肥甘饮食+湿热外环境+生物致病因子”是复制温病湿热证模型较为理想的路线，生物致病因子主导着模型“病”的特性，饮食和环境因素主导着模型“证”特性。MHV －A59是鼠类冠状病毒，可作为研究人类冠状病毒的良好替代品。MHV －A59具有嗜肝性与嗜神经组织性，一般用来复制神经脱髓鞘疾病与爆发型肝炎模型，由于国内对MHV －A59在细胞模型的建立及小鼠感染品种与剂量有了一定的研究基础，本课题采用MHV －A59株建立温病湿热证模型。本
存在血脂紊乱与肿瘤坏研究的两种温病湿热证模型，
死因子水平升高，根据“湿脂相关”理论，血脂可能为
“湿邪”的代谢产物，模型因肥甘厚味，损伤脾胃，水液内湿形成，湿聚成痰，痰浊为血中之膏脂，而代谢失常，
致血脂紊乱。而血清TNF －α水平增高是导致发热与炎症反应的原因之一，与文献中报道的温病湿热证的本质一致。结合模型动物的体征与症状，本研究基本也复制了MHV －复制了温病湿热证动物模型。同时，A59感染的小鼠模型，且模型具有“湿热”特性，是一种新的病证结合模型。本研究扩大了温病湿热证模型的内涵，对于以往温病湿热证模型的研究是一种补充。
“证”充分体现了中医学的广泛内涵。
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TNF 分为TNF －α和TNF －β两种类型，两者氨基酸
序列仅有28%同源性，但两者结合相同的受体，具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、致热作用，促进炎症反应，
［3－4］
。有研究发现温病湿热证与血浆ETX 引起恶液质
［5］
水平及血清TNF －α水平密切相关。吴研等发现湿
TNF －α、热环境能使新西兰白兔体温升高，血浆ETX 、
IL －1浓度升高。周燕萍等［6］发现湿热证模型组血浆
ETX 含量均较正常对照组显著增高，湿热证模型组TNF －α，IL －1β含量均较正常对照组显著增高。本研究提示，模型组与肠菌组血清TNF －α水平明显增高，这与上述文献报道一致。模型组比肠菌组有显著的升高，可能是因为MHV －A59作为生物致病因子所致的湿热症模型炎症反应更加剧烈。4．3温病湿热证与血脂紊乱4．3．1
对于“高血脂为血中之痰
［7］t
这一理论已被临床和实验研究所证实。吴智兵浊”
血脂与痰的关系
认为脂类代谢异常，其病在血液，根在脾胃，乃脾胃失不能分清泌浊，膏脂、痰浊瘀滞血中为痰。有研究健，
［8］
表明，高脂血症与中医的痰湿有十分密切的关系，其中TG 、总胆固醇（TC ）及低密度脂蛋白（LDL －C ）在痰
湿中尤为明显。刘松林等对痰邪致病机理的研究认
TG 、LDL 升高为痰浊的物质基础，为，血中的TC 、使用化痰健脾中药可使其降低，痰湿体质亦表现出上述情
况。可见，血脂可为痰的物质基础之一。4．3．2“湿脂相关”理论湿邪与痰饮都是津液代谢失调的病理产物，乃有形之阴邪。痰饮的生成与湿邪，《临证指南医案·卷五》：“一切诸痰初有较大的关系
”起皆由湿而生。说明湿邪可以通过变化而成痰饮。湿邪是痰饮生成的主要来源之一，湿病日久，湿邪往往
停聚浓缩而成痰饮，阻塞于某一部位。有学者认，血脂异常的形成，一是外源性，由于外感湿热，嗜酒过度，过食肥甘致脾胃受伤，脾气壅滞，气机升降为
失常，二是内源性，一则由于脾不散精，气化失司，精微不布，正常的精微形成浊脂，二则脾不布津，津聚为湿，湿聚为痰，痰浊成脂。可见不论是外源性或内源性脂类异常，均是造成了脾胃运输与转化功能障碍而发病。因此从理论分析，湿、痰、血脂这三者有着密切的关系，三者与脾胃损伤密切相关，在某一阶段可能是同源异流，不能决然分开，正如有学者认为，嗜食肥甘可助湿生痰，甘味其性缓，因此脾胃为痰湿困遏，脾失健运，脾之清气不能化浊而为脂浊、痰湿相混之证。笔者参
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与的前期研究发现，采用复合因素制成的温病湿热TG 、LDL －C 含量均明显升高，证大鼠模型血清中TC 、而HDL －C 显著下降，说明模型组大鼠存在着血脂代谢紊乱，且清热化湿法能改善这种紊乱。因此将血脂作为湿邪的代谢产物之一，或者作为湿邪的客观标准之一既有理论支持，又有现代医学的证实。
4．3．3温病湿热证与血清TG 水平通过理论分析“湿”与实验探讨，我们认为湿热证中性致病因子的物，“血中异常膏脂”质基础与血脂代谢异常有相关性可“湿邪”能为生化物质基础之一。本研究结果显示，两
种模型小鼠血清TG 水平的升高，与笔者前期的研究一致
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。因此，两种温病湿热证动物模型存在着脾胃