Vol. 342013年3月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 高等学校化学学报 746~750No. 3
doi:10. 7503/cjcu20120179
人工细胞外基质对血管内皮细胞生存的影响
(1.天津大学化工学院, 天津300071; 2. 南开大学生命科学学院, 生物活性材料研究教育部重点实验室, 天津300072) 于美华1, 杜凤移2, 饶 霞1, 姚芳莲1, 杨 军2
摘要 通过物理吸附方法, 利用胶原㊁ 聚赖氨酸和融合蛋白VEGF⁃Fc 对聚苯乙烯培养板表面进行改性, 以研究细胞外基质材料对血管内皮细胞的影响. 结果表明, 3种蛋白显著提高了聚苯乙烯表面的亲水性. 内皮细胞的黏附㊁ 增殖㊁ 细胞骨架蛋白染色和血管性血友病因子(vWF)免疫染色实验结果表明, 胶原㊁ 聚赖氨酸和VEGF⁃Fc 基质均能有效提高血管内皮细胞的黏附, 其中胶原可与VEGF 协同作用促进内皮细胞分化表型的表达; VEGF⁃Fc 基质兼具了VEGF 的生物学活性, 可促进内皮细胞的黏附和增殖以及vWF 功能性蛋白的表达. 本研究为诱导材料表面内皮化和血管新生的生物活性材料的设计开发提供了新思路.
关键词 聚苯乙烯; 融合蛋白; 组织工程; 物理吸附; 血管新生
中图分类号 O631 文献标志码 A
黏附㊁ 形态㊁ 增殖㊁ 迁移和功能表达等[1,2]. 因此, 模拟体内具有生物活性的细胞外基质的生物材料的设计与制备已成为目前组织工程和再生医学领域研究的热点之一. 目前, 人工细胞外基质的构建一方面为了提高细胞黏附能力和生物相容性, 另一方面为了模拟体内微环境使其具有蛋白敏感性和生长因子活性[3~5]. 血管内皮细胞是血管结构的重要组成细胞, 其在血管表面形成一层物理屏障, 并在调节
凝血⁃ 纤溶系统的平衡中起关键作用. 细胞外基质
的选择将直接影响血管内皮细胞的黏附㊁ 增殖㊁ 迁
移以及细胞功能的实现, 进而影响细胞外基质诱导
血管再生的性能[6,7]. 本文针对作为常规细胞培养板的疏水材料代表聚苯乙烯, 以及常用促进细胞黏
附的细胞外基质材料胶原㊁ 聚赖氨酸和本实验室构
建的VEGF⁃Fc 融合蛋白, 拟通过物理修饰方法构
建胶原基质㊁ 聚赖氨酸基质以及含生长因子活性的
融合蛋白VEGF⁃Fc 基质(Scheme1), 考察不同基质
表面血管内皮细胞的黏附㊁ 增殖㊁ 细胞形态变化以
及细胞功能, 为模拟血管内皮细胞体内微环境和诱
导血管新生生物材料的研究提供了理论基础. Scheme 1 Schematic of the interactions between different matrix materials and cells (A)Interaction between collagen and integrin; (B) electrostatic in⁃ teraction between polylysine and cells; (C ) interaction between VEGF⁃Fc and its receptors; (D ) hydrophobic interaction between polystyrene and cells. 天然/人工细胞外基质为细胞的生存及活动提供了适宜的场所, 并通过信号转导系统影响细胞的
1 实验部分
1. 1 试剂与仪器IWAKI 1820⁃024 型聚苯乙烯平板(日本Asahi Glass 公司); 聚赖氨酸㊁ 噻唑蓝(MTT)和二甲基亚矾
收稿日期:2012⁃08⁃02.
基金项目:国家自然科学基金(批准号:31070855, 51073119), 国家 九七三” 计划项目(批准号:2011CB606202) 和天津市自然科学基金重点资助项目(批准号:10JCYBJC10400) 资助.
联系人简介:杨 军, 女, 博士, 教授, 博士生导师, 主要从事细胞及组织工程㊁ 生物材料研究.
E⁃mail: yangjun106@nankai. edu. cn
No. 3 于美华等:人工细胞外基质对血管内皮细胞生存的影响747(DMSO)(美国Sigma 试剂公司); vWF 抗体(美国Cell signaling 公司); 融合蛋白VEGF⁃Fc 由本实验室1014酶联免疫试剂盒(美国R&D公司); 人脐静脉血管内皮细胞和内皮细胞培养基(美国Scien Cell 公司); 胎牛血清(BSA,民海生物公司). MCO175型CO 2恒温细胞培养箱(日本三洋公司); CKX41型免疫荧光显微镜及显微照相系统(日构建, GenScript 公司鉴定表达, Fc 功能域由东京工业大学赤池教授惠赠; Ⅰ 型胶原和VEGF 的opy⁃
1. 2 不同细胞外基质的制备与细胞培养本Olympus 公司); Thermo MK3酶标仪(芬兰Thermo Fish 公司).
分别配制0. 1mg /mL 胶原[溶剂为1%(体积分数) 冰醋酸]㊁0. 1mg /mL 聚赖氨酸和0. 2μg /mL 融合蛋白VEGF⁃Fc 溶液[溶剂为0. 01mol /L 磷酸盐缓冲液(PBS)],并用0. 22μm 滤膜过滤除菌. 将胶原㊁ 聚赖氨酸和融合蛋白VEGF⁃Fc 溶液分别加至96孔(100μL /孔) 和24孔(500μL /孔) 聚苯乙烯平板, 于4℃ 孵育过夜, 弃去包被液, 用蒸馏水洗涤3次, 备用. 为了充分说明细胞外基质对内皮细胞黏附的影响, 分别以0. 1μg /mL BSA 和0. 2μg /mL 免疫球蛋白G(IgG)修饰的聚苯乙烯平板作为对照组, 其修饰方法如前所述.
将人脐带血管内皮细胞(HUVECs)在含有5%(体积分数) 胎牛血清㊁ 100IU /mL 抗生素和1%(体积分数) 内皮细胞培养填充物的内皮细胞培养基中培养至3~6代用于实验. 以1×10 5细胞/mL 的密度将细胞分别接种于经预处理的96孔培养板(100μL) 和24孔培养板(1mL), 置于37℃ ㊁ 含5%(体积
1. 3 静态接触角的测定分数) CO 2㊁ 湿度为95%的细胞培养箱中培养, 并用于细胞的黏附㊁ 增殖和染色实验.
测试前将所有样品于65℃ 鼓风干燥10h. 在25℃ 下, 用Harke⁃Spca 型接触角测量仪测定不同细
1. 4 细胞黏附与增殖实验胞外基质表面的静态接触角. 每种细胞外基质取2个样品, 每个样品测3次.
利用MTT 法检测血管内皮细胞在不同细胞外基质上的黏附和增殖情况[8]. 将血管内皮细胞分别在不同细胞外基质上培养24, 48和72h 后进行细胞活性检测, 考察细胞的增殖情况. 以初始加入的细
1. 5 免疫荧光染色胞量为100%作为对照, 每组实验设3组平行实验.
将血管内皮细胞在不同细胞外基质上培养特定时间后, 弃去上清液, 用PBS 清洗3遍, 以4%(体积分数) 的多聚甲醛在室温下固定10min, 用0. 2%(体积分数)Triton X⁃100 透化处理5min, 以10g /L 牛血清白蛋白(BSA)于37℃ 封闭2h. 加入异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(体积比1∶ 10), 于37℃ 避光孵育30min, 进行细胞骨架染色. 加入兔来源的vWF 抗体(体积比1∶ 100), 于4℃ 避光孵育过夜, 再加入异硫氰酸荧光素标记的兔抗(体积比1∶ 200), 在室温下孵育2h, 进行细胞功能因子染色. 最后, 用PI(体积比1∶ 100) 标记细胞核10min, 以上每步操作后均用PBS 清洗3遍, 最后用10%(体
1. 6 统计学分析积分数) 的缓冲甘油封片, 置于免疫荧光显微镜下观察.
采用GraphPad Prism Version 4. 0统计学软件进行两因素方差数据分析(P *
2. 1 人工细胞外基质的亲水性
46. 0° 和46. 1°( 如图1所示), 说明3种蛋白均已固定在聚苯乙烯表面, 并提高了材料表面的亲水性. 在聚苯乙烯表面固定胶原㊁ 聚赖氨酸和融合蛋白VEGF⁃Fc 后, 其接触角由78. 9° 分别降至58. 3°, 已有文献[9,10]报道利用Fc 功能域的疏水作用, 将Fc 融合蛋白结合到疏水材料表面, 并将与其融合的生物活性蛋白功能域暴露在材料表面, 进而提高疏水材料的亲水性㊁ 生物相容性和细胞响应性. 因此, 我们推测融合蛋白VEGF⁃Fc 是利用Fc 功能域的疏水作用固定在聚苯乙烯表面, 并将VEGF 功能域暴露在材料表面, 从而形成具有VEGF 活性的细胞外基质.
748高等学校化学学报 Vol. 34
Fig. 1 Static contact angles of artificial
extracellular
matrixes Fig. 2 HUVECs adhered on artificial extracellular matrixes
2. 2 人工细胞外基质表面血管内皮细胞的黏附
由图2可见, 与聚苯乙烯基质相比, 血管内皮细胞在胶原㊁ 聚赖氨酸和融合蛋白VEGF⁃Fc 修饰的聚苯乙烯基质表面的黏附率均显著提高, 而在对照组IgG 和BSA 修饰的表面的黏附率很低. 由于Fc 是IgG 的主要组成部分, 可推断融合蛋白VEGF⁃Fc 基质材料主要通过其VEGF 功能域而不是Fc 功能域介导细胞黏附. 该结论与文献[11]报道的固定化VEGF 与其受体相互作用可以介导细胞黏附的结论一致[Scheme1(C)].此结论也验证了2. 1节中的推断, 即融合蛋白VEGF⁃Fc 利用Fc 功能域的疏水作用固定在聚苯乙烯表面, 将VEGF 功能域暴露在基质表面, 构建成具有VEGF 生物活性的细胞外基质. 胶原基质促进内皮细胞黏附主要通过胶原蛋白中含有的RGD 短肽与血管内皮细胞表面的整合蛋白相互作用介导细胞黏附[12][Scheme1(A)].而聚阳离子聚赖氨酸基质则主要通过正负电荷作用诱导细胞膜结构在短时间内发生重组, 产生细胞黏附蛋白介导细胞黏附[13][Scheme1(B)].而聚苯乙烯基质材料表面不具有细胞识别位点, 不利于细胞黏附. 血管内皮细胞只有在基质材料表面黏附后才能进一步迁移㊁ 增殖㊁ 分化及保持细胞功能因子的表达, 且不同的细胞黏附机制将影响一系列细胞活性的表
2. 3 人工细胞外基质表面血管内皮细胞的增殖活性
为了考察构建的细胞外基质对血管内皮细胞增殖情况的影响, 在对照组培养基中加入0. 5ng /mL 商品化可溶性VEGF, 在VEGF⁃Fc 基质化实验组的培养基中则不添加. 通过MTT 方法分别在3, 24, 48和72h 检测细胞的存活率, 结果(图3) 表明, 血管内皮细胞在融合蛋白VEGF⁃Fc 基质上保持持续的增殖活性, 而在聚赖氨酸和胶原基质上培养48h 后, 细胞存活率保持不变, 细胞的增殖活性降低. 以上结果表明, VEGF⁃Fc 基质实现了VEGF 的固定, 提
高了VEGF 的稳定性, 促进了血管内皮细胞的增
殖; 并在一定程度上减弱了胞吞作用引起的VEGF
消耗, 其分子机制有待进一步研究. 由图3还可见,
与聚赖氨酸基质材料相比, 内皮细胞在胶原基质材
料上呈现更高的细胞增殖活性. 这一方面是由于胶
原的RGD 序列与细胞表面的整合蛋白结合后使细
另一方面由于聚阳离子聚赖氨酸通过静电作用介导胞内信号通路打开, 提高了细胞的增殖能力[15,16];
2. 4 人工细胞外基质对血管内皮细胞细胞形态的影响Fig. 3 Proliferative activity of HUVECs cultured on artificial extracellular matrixes 达[14][Scheme1(D)].细胞黏附, 在短时间内引起细胞膜结构变化的同时对血管内皮细胞造成一定的伤害[17,18].
通过光学显微镜观察了血管内皮细胞的形态. 由图4可见, 在胶原和VEGF⁃Fc 基质表面, 内皮细胞一直呈现良好的细胞伸展状态; 而在聚赖氨酸和聚苯乙烯基质表面上培养30h 时内皮细胞收缩, 部分呈圆形的细胞形态, 表明2种基质不能有效保持血管内皮细胞的生物活性, 而胶原和融合蛋白VEGF⁃Fc 基质通过与细胞表面受体相互作用调节血管内皮细胞形态. 细胞骨架的重要组成部分肌动蛋白的免疫荧光染色结果表明, 在胶原基质上培养10h 后血管内皮细胞伸展, 丝状伪足形成, 细胞内形
No. 3 于美华等:人工细胞外基质对血管内皮细胞生存的影响749成大量的应力纤维; 培养30h 后细胞体积明显变大, 丝状伪足和应力纤维逐渐消失. 而在VEGF⁃Fc 基质上, 血管内皮细胞始终具有丰富的丝状伪足, 细胞内形成应力纤维, 并可见细胞周围黏着斑. 这说明胶原和VEGF⁃Fc 基质均能有效诱导应力纤维产生, 进一步影响细胞迁移和伸展能力. 据文献[19]报道, 应力纤维的产生直接影响血管内皮细胞的迁移能力㊁ 细胞形状的改变以及细胞功能的实现
. Fig. 4 Morphologies of HUVECs cultured on artificial extracellular matrixes observed by phase contrast
(B 1 B 4, D 1 D 4) after culturing for 10h (A 1 A 4, B 1 B 4) and 30h (C 1 C 4, D 1 D 4)
gen; A 3, B 3, C 3, D 3:polylysine; A 4, B 4, C 4, D 4:
VEGF⁃Fc. microscope (A 1 A 4, C 1 C 4) and F⁃actin expression of HUVECs observed by fluorescence microscope Solid arrows directed stress fiber; hollow arrows directed filopodia. A 1, B 1, C 1, D 1:Polystyrene; A 2, B 2, C 2, D 2:colla⁃
2. 5 人工细胞外基质表面血管内皮细胞vWF 的表达
原㊁ 聚赖氨酸和融合蛋白VEGF⁃Fc 基质对HUVEC 分化功能的影响(图5). 在1h 正常培养条件下, 各基质表面血管内皮细胞的vWF 表达量无明显差异; 培养48h 后, 与其它2种人工细胞外基质相比, 融合蛋白VEGF⁃Fc 基质上培养的血管内皮细胞内仍具有较高的vWF 表达量. 因此, 具有VEGF 活性的融合蛋白VEGF⁃Fc 基质更利于血管内皮细胞内分泌细胞器WPB(Weibel⁃Palade body) 的形成, 从而调vWF 为内皮细胞特异分泌的功能性糖蛋白[20], 实验中通过对vWF 进行免疫荧光染色考察了胶
Fig. 5 Expression of vWF in HUVECs cultured on artificial extracellular matrixes
for 1h (A 1 A 4) and 48h (B 1 B 4) A 1, B 1:Polystyrene; A 2, B 2:collagen; A 3, B 3:polylysine; A 4, B 4:VEGF⁃Fc.
750高等学校化学学报 Vol. 34 节炎症㊁ 血管新生以及伤口愈合等多种与生物材料相关的机体反应.
参 考 文 献
[1] Hynes R. O. , Science , 2009, 326(5957),1216 1219 [2] Patterson J. , Martino M. M. , Hubbell J. A. , Materials Today , 2010, 13(1/2), 14 22
[4] Sengupta D. , Heilshorn S. C. , Tissue Eng. Part B Rev. , 2010, 16(3),285 293 [5] Discher D. E. , Mooney D. J. , Zandstra P. W. , Science , 2009, 324, 1673 1677 [3] Nagaoka M. , Jiang H. L. , Hoshiba T. , Akaike T. , Cho C. S. , Ann. Biomed Eng . , 2010, 38(3),683 693 [6] Wang J. , Wang W. , Liu Y. , Zhu X. C. , Yuan Z. , Tang S. M. , Liu M. , Tang H. , Chem. J. Chinese Universities , 2008, 29(11),
[7] Tian L. , George S. C. , J. Cardiovase. Trans. Res. , 2011, 4, 685 698 [8] Tirziu D. , Simons M. , Vascular Pharmacology , 2009, 50, 1 7 [9] Mosmann T. , J. Immunol Methods , 1983, 65, 55 63 2317 2320( 王珺, 王蔚, 刘媛, 朱晓翠, 袁直, 汤石明, 刘民, 汤华. 高等学校化学学报, 2008, 29(11),2317 2320) [10] Ogiwara K. , Nagaoka M. , Cho C. S. , Akaike T. , Biotechnol. Lett. , 2005, 27(20),1633 1637 [11] Azuma K. , Nagaola M. , Cho C. S. , Akaike T. , Biomaterials , 2010, 31(5),802 809 [12] Taguchi T. , Kishida A. , Akashi M. , Maruyama I. , J. Bioactive Compatible Polym. , 2000, 15, 309 320 [13] Rainaldi G. , Calcabrini A. , Santini M. T. , J. Mater. Sci. Mater. Med. , 1998, 9(12),755 760
丁珊, 闵翔, 焦延鹏, 周长忍, 李红. 高等学校化学学报, 2011, 32(12),2891 2895) [14] Tang M. J. , Ding S. , Min X. , Jiao Y. P. , Zhou C. R. , Li H. , Chem. J. Chinese Universities , 2011, 32(12),2891 2895( 唐敏健,
[15] Stupack D. G. , Cheresh D. A. , Curr. Top. Dev. Biol. , 2004, 64, 207 238
鸿, 沈家骢. 高等学校化学学报, 2004, 25(4),749 752) [16] Ma Z. W. , Gao C. Y. , Gong Y. H. , Shen J. C. . Chem. J. Chinese Universities , 2004, 25(4),749 752( 马祖伟, 高长有, 龚逸
[17] Vaara M. , Vaara T. , Antimicrob Agents Chemother , 1983, 24(1),114 122 [18] Fischer D. , Ahlemeyer B. , Krieglstein J. , Kissel T. , Biomaterials , 2003, 24(7),1121 1131
Cell , 2009, 101(9),525 539 [19] Sulpice E. , Ding S. , Muscatelli⁃Groux B. , Beatrice M. G. , Mathieu B. , Zhong C. H. , Jean P. , Gerard T. , Tatyana M. R. , Biol.
[20] Zhang Z. , Li W. . Hereditas , 2009, 31(9),882 888( 张喆, 李巍. 遗传, 2009, 31(9),882 888)
Effects of Artificial Extracellular Matrixes on the Survival of Vascular Endothelial Cells
(1. School of Chemical Engineering , Tianjin University , Tianjin 300072, China ; 2. Key Laboratory of Bioactive Materials , Ministry of Education , School of Life Science , Nankai University , Tianjin 300071, China ) YU Mei⁃Hua 1, DU Feng⁃Yi 2, RAO Xia 1, YAO Fang⁃Lian 1, YANG Jun 2*
Abstract In order to study the impact of extracellular matrix material on endothelial cells, collagen, poly⁃ lysine and fusion protein VEGF⁃Fc were immobilized on the polystyrene cell culture plate by physical adsor⁃ bing, respectively. The three proteins significantly improved the hydrophilic of the polystyrene surface. Mean⁃ while, the cell adhesion, proliferation and the expressions of the cytoskeletal protein and von Willebrand factor (vWF)were investigated. The results showed that these matrixes effectively improved the adhesion of Human extra VEGF in the culture medium could also maintain and prolong the bioactivities of cell proliferation and work provided suitable environment for HUVECs. Those results will provide a theoretical basis on achieving the endothelialization and improving the angiogenesis of implanted materials. Keywords Polystyrene; Fusion protein; Tissue engineering; Physical adsorption; Vascularization
(Ed. :H , J , N , K ) umbilical vein endothelial cells(HUVECs).And HUVECs cultured on fusion protein VEGF⁃Fc matrix without vWF expression. Furthermore, HUVECs cultured on collagen and fusion protein matrixes expressed abundant stress fibers and filopodia. Thereby, the collagen and fusion protein VEGF⁃Fc matrixes constructed in this
Vol. 342013年3月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 高等学校化学学报 746~750No. 3
doi:10. 7503/cjcu20120179
人工细胞外基质对血管内皮细胞生存的影响
(1.天津大学化工学院, 天津300071; 2. 南开大学生命科学学院, 生物活性材料研究教育部重点实验室, 天津300072) 于美华1, 杜凤移2, 饶 霞1, 姚芳莲1, 杨 军2
摘要 通过物理吸附方法, 利用胶原㊁ 聚赖氨酸和融合蛋白VEGF⁃Fc 对聚苯乙烯培养板表面进行改性, 以研究细胞外基质材料对血管内皮细胞的影响. 结果表明, 3种蛋白显著提高了聚苯乙烯表面的亲水性. 内皮细胞的黏附㊁ 增殖㊁ 细胞骨架蛋白染色和血管性血友病因子(vWF)免疫染色实验结果表明, 胶原㊁ 聚赖氨酸和VEGF⁃Fc 基质均能有效提高血管内皮细胞的黏附, 其中胶原可与VEGF 协同作用促进内皮细胞分化表型的表达; VEGF⁃Fc 基质兼具了VEGF 的生物学活性, 可促进内皮细胞的黏附和增殖以及vWF 功能性蛋白的表达. 本研究为诱导材料表面内皮化和血管新生的生物活性材料的设计开发提供了新思路.
关键词 聚苯乙烯; 融合蛋白; 组织工程; 物理吸附; 血管新生
中图分类号 O631 文献标志码 A
黏附㊁ 形态㊁ 增殖㊁ 迁移和功能表达等[1,2]. 因此, 模拟体内具有生物活性的细胞外基质的生物材料的设计与制备已成为目前组织工程和再生医学领域研究的热点之一. 目前, 人工细胞外基质的构建一方面为了提高细胞黏附能力和生物相容性, 另一方面为了模拟体内微环境使其具有蛋白敏感性和生长因子活性[3~5]. 血管内皮细胞是血管结构的重要组成细胞, 其在血管表面形成一层物理屏障, 并在调节
凝血⁃ 纤溶系统的平衡中起关键作用. 细胞外基质
的选择将直接影响血管内皮细胞的黏附㊁ 增殖㊁ 迁
移以及细胞功能的实现, 进而影响细胞外基质诱导
血管再生的性能[6,7]. 本文针对作为常规细胞培养板的疏水材料代表聚苯乙烯, 以及常用促进细胞黏
附的细胞外基质材料胶原㊁ 聚赖氨酸和本实验室构
建的VEGF⁃Fc 融合蛋白, 拟通过物理修饰方法构
建胶原基质㊁ 聚赖氨酸基质以及含生长因子活性的
融合蛋白VEGF⁃Fc 基质(Scheme1), 考察不同基质
表面血管内皮细胞的黏附㊁ 增殖㊁ 细胞形态变化以
及细胞功能, 为模拟血管内皮细胞体内微环境和诱
导血管新生生物材料的研究提供了理论基础. Scheme 1 Schematic of the interactions between different matrix materials and cells (A)Interaction between collagen and integrin; (B) electrostatic in⁃ teraction between polylysine and cells; (C ) interaction between VEGF⁃Fc and its receptors; (D ) hydrophobic interaction between polystyrene and cells. 天然/人工细胞外基质为细胞的生存及活动提供了适宜的场所, 并通过信号转导系统影响细胞的
1 实验部分
1. 1 试剂与仪器IWAKI 1820⁃024 型聚苯乙烯平板(日本Asahi Glass 公司); 聚赖氨酸㊁ 噻唑蓝(MTT)和二甲基亚矾
收稿日期:2012⁃08⁃02.
基金项目:国家自然科学基金(批准号:31070855, 51073119), 国家 九七三” 计划项目(批准号:2011CB606202) 和天津市自然科学基金重点资助项目(批准号:10JCYBJC10400) 资助.
联系人简介:杨 军, 女, 博士, 教授, 博士生导师, 主要从事细胞及组织工程㊁ 生物材料研究.
E⁃mail: yangjun106@nankai. edu. cn
No. 3 于美华等:人工细胞外基质对血管内皮细胞生存的影响747(DMSO)(美国Sigma 试剂公司); vWF 抗体(美国Cell signaling 公司); 融合蛋白VEGF⁃Fc 由本实验室1014酶联免疫试剂盒(美国R&D公司); 人脐静脉血管内皮细胞和内皮细胞培养基(美国Scien Cell 公司); 胎牛血清(BSA,民海生物公司). MCO175型CO 2恒温细胞培养箱(日本三洋公司); CKX41型免疫荧光显微镜及显微照相系统(日构建, GenScript 公司鉴定表达, Fc 功能域由东京工业大学赤池教授惠赠; Ⅰ 型胶原和VEGF 的opy⁃
1. 2 不同细胞外基质的制备与细胞培养本Olympus 公司); Thermo MK3酶标仪(芬兰Thermo Fish 公司).
分别配制0. 1mg /mL 胶原[溶剂为1%(体积分数) 冰醋酸]㊁0. 1mg /mL 聚赖氨酸和0. 2μg /mL 融合蛋白VEGF⁃Fc 溶液[溶剂为0. 01mol /L 磷酸盐缓冲液(PBS)],并用0. 22μm 滤膜过滤除菌. 将胶原㊁ 聚赖氨酸和融合蛋白VEGF⁃Fc 溶液分别加至96孔(100μL /孔) 和24孔(500μL /孔) 聚苯乙烯平板, 于4℃ 孵育过夜, 弃去包被液, 用蒸馏水洗涤3次, 备用. 为了充分说明细胞外基质对内皮细胞黏附的影响, 分别以0. 1μg /mL BSA 和0. 2μg /mL 免疫球蛋白G(IgG)修饰的聚苯乙烯平板作为对照组, 其修饰方法如前所述.
将人脐带血管内皮细胞(HUVECs)在含有5%(体积分数) 胎牛血清㊁ 100IU /mL 抗生素和1%(体积分数) 内皮细胞培养填充物的内皮细胞培养基中培养至3~6代用于实验. 以1×10 5细胞/mL 的密度将细胞分别接种于经预处理的96孔培养板(100μL) 和24孔培养板(1mL), 置于37℃ ㊁ 含5%(体积
1. 3 静态接触角的测定分数) CO 2㊁ 湿度为95%的细胞培养箱中培养, 并用于细胞的黏附㊁ 增殖和染色实验.
测试前将所有样品于65℃ 鼓风干燥10h. 在25℃ 下, 用Harke⁃Spca 型接触角测量仪测定不同细
1. 4 细胞黏附与增殖实验胞外基质表面的静态接触角. 每种细胞外基质取2个样品, 每个样品测3次.
利用MTT 法检测血管内皮细胞在不同细胞外基质上的黏附和增殖情况[8]. 将血管内皮细胞分别在不同细胞外基质上培养24, 48和72h 后进行细胞活性检测, 考察细胞的增殖情况. 以初始加入的细
1. 5 免疫荧光染色胞量为100%作为对照, 每组实验设3组平行实验.
将血管内皮细胞在不同细胞外基质上培养特定时间后, 弃去上清液, 用PBS 清洗3遍, 以4%(体积分数) 的多聚甲醛在室温下固定10min, 用0. 2%(体积分数)Triton X⁃100 透化处理5min, 以10g /L 牛血清白蛋白(BSA)于37℃ 封闭2h. 加入异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(体积比1∶ 10), 于37℃ 避光孵育30min, 进行细胞骨架染色. 加入兔来源的vWF 抗体(体积比1∶ 100), 于4℃ 避光孵育过夜, 再加入异硫氰酸荧光素标记的兔抗(体积比1∶ 200), 在室温下孵育2h, 进行细胞功能因子染色. 最后, 用PI(体积比1∶ 100) 标记细胞核10min, 以上每步操作后均用PBS 清洗3遍, 最后用10%(体
1. 6 统计学分析积分数) 的缓冲甘油封片, 置于免疫荧光显微镜下观察.
采用GraphPad Prism Version 4. 0统计学软件进行两因素方差数据分析(P *
2. 1 人工细胞外基质的亲水性
46. 0° 和46. 1°( 如图1所示), 说明3种蛋白均已固定在聚苯乙烯表面, 并提高了材料表面的亲水性. 在聚苯乙烯表面固定胶原㊁ 聚赖氨酸和融合蛋白VEGF⁃Fc 后, 其接触角由78. 9° 分别降至58. 3°, 已有文献[9,10]报道利用Fc 功能域的疏水作用, 将Fc 融合蛋白结合到疏水材料表面, 并将与其融合的生物活性蛋白功能域暴露在材料表面, 进而提高疏水材料的亲水性㊁ 生物相容性和细胞响应性. 因此, 我们推测融合蛋白VEGF⁃Fc 是利用Fc 功能域的疏水作用固定在聚苯乙烯表面, 并将VEGF 功能域暴露在材料表面, 从而形成具有VEGF 活性的细胞外基质.
748高等学校化学学报 Vol. 34
Fig. 1 Static contact angles of artificial
extracellular
matrixes Fig. 2 HUVECs adhered on artificial extracellular matrixes
2. 2 人工细胞外基质表面血管内皮细胞的黏附
由图2可见, 与聚苯乙烯基质相比, 血管内皮细胞在胶原㊁ 聚赖氨酸和融合蛋白VEGF⁃Fc 修饰的聚苯乙烯基质表面的黏附率均显著提高, 而在对照组IgG 和BSA 修饰的表面的黏附率很低. 由于Fc 是IgG 的主要组成部分, 可推断融合蛋白VEGF⁃Fc 基质材料主要通过其VEGF 功能域而不是Fc 功能域介导细胞黏附. 该结论与文献[11]报道的固定化VEGF 与其受体相互作用可以介导细胞黏附的结论一致[Scheme1(C)].此结论也验证了2. 1节中的推断, 即融合蛋白VEGF⁃Fc 利用Fc 功能域的疏水作用固定在聚苯乙烯表面, 将VEGF 功能域暴露在基质表面, 构建成具有VEGF 生物活性的细胞外基质. 胶原基质促进内皮细胞黏附主要通过胶原蛋白中含有的RGD 短肽与血管内皮细胞表面的整合蛋白相互作用介导细胞黏附[12][Scheme1(A)].而聚阳离子聚赖氨酸基质则主要通过正负电荷作用诱导细胞膜结构在短时间内发生重组, 产生细胞黏附蛋白介导细胞黏附[13][Scheme1(B)].而聚苯乙烯基质材料表面不具有细胞识别位点, 不利于细胞黏附. 血管内皮细胞只有在基质材料表面黏附后才能进一步迁移㊁ 增殖㊁ 分化及保持细胞功能因子的表达, 且不同的细胞黏附机制将影响一系列细胞活性的表
2. 3 人工细胞外基质表面血管内皮细胞的增殖活性
为了考察构建的细胞外基质对血管内皮细胞增殖情况的影响, 在对照组培养基中加入0. 5ng /mL 商品化可溶性VEGF, 在VEGF⁃Fc 基质化实验组的培养基中则不添加. 通过MTT 方法分别在3, 24, 48和72h 检测细胞的存活率, 结果(图3) 表明, 血管内皮细胞在融合蛋白VEGF⁃Fc 基质上保持持续的增殖活性, 而在聚赖氨酸和胶原基质上培养48h 后, 细胞存活率保持不变, 细胞的增殖活性降低. 以上结果表明, VEGF⁃Fc 基质实现了VEGF 的固定, 提
高了VEGF 的稳定性, 促进了血管内皮细胞的增
殖; 并在一定程度上减弱了胞吞作用引起的VEGF
消耗, 其分子机制有待进一步研究. 由图3还可见,
与聚赖氨酸基质材料相比, 内皮细胞在胶原基质材
料上呈现更高的细胞增殖活性. 这一方面是由于胶
原的RGD 序列与细胞表面的整合蛋白结合后使细
另一方面由于聚阳离子聚赖氨酸通过静电作用介导胞内信号通路打开, 提高了细胞的增殖能力[15,16];
2. 4 人工细胞外基质对血管内皮细胞细胞形态的影响Fig. 3 Proliferative activity of HUVECs cultured on artificial extracellular matrixes 达[14][Scheme1(D)].细胞黏附, 在短时间内引起细胞膜结构变化的同时对血管内皮细胞造成一定的伤害[17,18].
通过光学显微镜观察了血管内皮细胞的形态. 由图4可见, 在胶原和VEGF⁃Fc 基质表面, 内皮细胞一直呈现良好的细胞伸展状态; 而在聚赖氨酸和聚苯乙烯基质表面上培养30h 时内皮细胞收缩, 部分呈圆形的细胞形态, 表明2种基质不能有效保持血管内皮细胞的生物活性, 而胶原和融合蛋白VEGF⁃Fc 基质通过与细胞表面受体相互作用调节血管内皮细胞形态. 细胞骨架的重要组成部分肌动蛋白的免疫荧光染色结果表明, 在胶原基质上培养10h 后血管内皮细胞伸展, 丝状伪足形成, 细胞内形
No. 3 于美华等:人工细胞外基质对血管内皮细胞生存的影响749成大量的应力纤维; 培养30h 后细胞体积明显变大, 丝状伪足和应力纤维逐渐消失. 而在VEGF⁃Fc 基质上, 血管内皮细胞始终具有丰富的丝状伪足, 细胞内形成应力纤维, 并可见细胞周围黏着斑. 这说明胶原和VEGF⁃Fc 基质均能有效诱导应力纤维产生, 进一步影响细胞迁移和伸展能力. 据文献[19]报道, 应力纤维的产生直接影响血管内皮细胞的迁移能力㊁ 细胞形状的改变以及细胞功能的实现
. Fig. 4 Morphologies of HUVECs cultured on artificial extracellular matrixes observed by phase contrast
(B 1 B 4, D 1 D 4) after culturing for 10h (A 1 A 4, B 1 B 4) and 30h (C 1 C 4, D 1 D 4)
gen; A 3, B 3, C 3, D 3:polylysine; A 4, B 4, C 4, D 4:
VEGF⁃Fc. microscope (A 1 A 4, C 1 C 4) and F⁃actin expression of HUVECs observed by fluorescence microscope Solid arrows directed stress fiber; hollow arrows directed filopodia. A 1, B 1, C 1, D 1:Polystyrene; A 2, B 2, C 2, D 2:colla⁃
2. 5 人工细胞外基质表面血管内皮细胞vWF 的表达
原㊁ 聚赖氨酸和融合蛋白VEGF⁃Fc 基质对HUVEC 分化功能的影响(图5). 在1h 正常培养条件下, 各基质表面血管内皮细胞的vWF 表达量无明显差异; 培养48h 后, 与其它2种人工细胞外基质相比, 融合蛋白VEGF⁃Fc 基质上培养的血管内皮细胞内仍具有较高的vWF 表达量. 因此, 具有VEGF 活性的融合蛋白VEGF⁃Fc 基质更利于血管内皮细胞内分泌细胞器WPB(Weibel⁃Palade body) 的形成, 从而调vWF 为内皮细胞特异分泌的功能性糖蛋白[20], 实验中通过对vWF 进行免疫荧光染色考察了胶
Fig. 5 Expression of vWF in HUVECs cultured on artificial extracellular matrixes
for 1h (A 1 A 4) and 48h (B 1 B 4) A 1, B 1:Polystyrene; A 2, B 2:collagen; A 3, B 3:polylysine; A 4, B 4:VEGF⁃Fc.
750高等学校化学学报 Vol. 34 节炎症㊁ 血管新生以及伤口愈合等多种与生物材料相关的机体反应.
参 考 文 献
[1] Hynes R. O. , Science , 2009, 326(5957),1216 1219 [2] Patterson J. , Martino M. M. , Hubbell J. A. , Materials Today , 2010, 13(1/2), 14 22
[4] Sengupta D. , Heilshorn S. C. , Tissue Eng. Part B Rev. , 2010, 16(3),285 293 [5] Discher D. E. , Mooney D. J. , Zandstra P. W. , Science , 2009, 324, 1673 1677 [3] Nagaoka M. , Jiang H. L. , Hoshiba T. , Akaike T. , Cho C. S. , Ann. Biomed Eng . , 2010, 38(3),683 693 [6] Wang J. , Wang W. , Liu Y. , Zhu X. C. , Yuan Z. , Tang S. M. , Liu M. , Tang H. , Chem. J. Chinese Universities , 2008, 29(11),
[7] Tian L. , George S. C. , J. Cardiovase. Trans. Res. , 2011, 4, 685 698 [8] Tirziu D. , Simons M. , Vascular Pharmacology , 2009, 50, 1 7 [9] Mosmann T. , J. Immunol Methods , 1983, 65, 55 63 2317 2320( 王珺, 王蔚, 刘媛, 朱晓翠, 袁直, 汤石明, 刘民, 汤华. 高等学校化学学报, 2008, 29(11),2317 2320) [10] Ogiwara K. , Nagaoka M. , Cho C. S. , Akaike T. , Biotechnol. Lett. , 2005, 27(20),1633 1637 [11] Azuma K. , Nagaola M. , Cho C. S. , Akaike T. , Biomaterials , 2010, 31(5),802 809 [12] Taguchi T. , Kishida A. , Akashi M. , Maruyama I. , J. Bioactive Compatible Polym. , 2000, 15, 309 320 [13] Rainaldi G. , Calcabrini A. , Santini M. T. , J. Mater. Sci. Mater. Med. , 1998, 9(12),755 760
丁珊, 闵翔, 焦延鹏, 周长忍, 李红. 高等学校化学学报, 2011, 32(12),2891 2895) [14] Tang M. J. , Ding S. , Min X. , Jiao Y. P. , Zhou C. R. , Li H. , Chem. J. Chinese Universities , 2011, 32(12),2891 2895( 唐敏健,
[15] Stupack D. G. , Cheresh D. A. , Curr. Top. Dev. Biol. , 2004, 64, 207 238
鸿, 沈家骢. 高等学校化学学报, 2004, 25(4),749 752) [16] Ma Z. W. , Gao C. Y. , Gong Y. H. , Shen J. C. . Chem. J. Chinese Universities , 2004, 25(4),749 752( 马祖伟, 高长有, 龚逸
[17] Vaara M. , Vaara T. , Antimicrob Agents Chemother , 1983, 24(1),114 122 [18] Fischer D. , Ahlemeyer B. , Krieglstein J. , Kissel T. , Biomaterials , 2003, 24(7),1121 1131
Cell , 2009, 101(9),525 539 [19] Sulpice E. , Ding S. , Muscatelli⁃Groux B. , Beatrice M. G. , Mathieu B. , Zhong C. H. , Jean P. , Gerard T. , Tatyana M. R. , Biol.
[20] Zhang Z. , Li W. . Hereditas , 2009, 31(9),882 888( 张喆, 李巍. 遗传, 2009, 31(9),882 888)
Effects of Artificial Extracellular Matrixes on the Survival of Vascular Endothelial Cells
(1. School of Chemical Engineering , Tianjin University , Tianjin 300072, China ; 2. Key Laboratory of Bioactive Materials , Ministry of Education , School of Life Science , Nankai University , Tianjin 300071, China ) YU Mei⁃Hua 1, DU Feng⁃Yi 2, RAO Xia 1, YAO Fang⁃Lian 1, YANG Jun 2*
Abstract In order to study the impact of extracellular matrix material on endothelial cells, collagen, poly⁃ lysine and fusion protein VEGF⁃Fc were immobilized on the polystyrene cell culture plate by physical adsor⁃ bing, respectively. The three proteins significantly improved the hydrophilic of the polystyrene surface. Mean⁃ while, the cell adhesion, proliferation and the expressions of the cytoskeletal protein and von Willebrand factor (vWF)were investigated. The results showed that these matrixes effectively improved the adhesion of Human extra VEGF in the culture medium could also maintain and prolong the bioactivities of cell proliferation and work provided suitable environment for HUVECs. Those results will provide a theoretical basis on achieving the endothelialization and improving the angiogenesis of implanted materials. Keywords Polystyrene; Fusion protein; Tissue engineering; Physical adsorption; Vascularization
(Ed. :H , J , N , K ) umbilical vein endothelial cells(HUVECs).And HUVECs cultured on fusion protein VEGF⁃Fc matrix without vWF expression. Furthermore, HUVECs cultured on collagen and fusion protein matrixes expressed abundant stress fibers and filopodia. Thereby, the collagen and fusion protein VEGF⁃Fc matrixes constructed in this