分子标记技术及其在真菌中的应用
摘要 对RFLP、AFLP、SSR、SNP这些常用的DNA 分子标记技术的原理、特点以及其在真菌中的应用进行了综述。
关键词 分子标记；RFLP； AFLP；SSR；SNP；真菌
遗传标记(Genetic marker) 是研究生物遗传变异规律及其物质基础的重要手段。它具有2个基本特征,即可遗传性和可识别性。因此,生物中任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。随着遗传学的不断发展,遗传标记的种类和数量也不断增加。目前,应用较为广泛的遗传标记有形态标记(Morphologi2cal maker) 、细胞标记
(Cytological maker) 、生化标记(Biochemical maker) 和分子标记(Molecular maker) [1] 。
形态标记指植物的外部形态特征(矮秆、紫鞘、卷叶等) ；细胞标记主要是染色体的核型(染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等) 和带型(C 带、N 带、G带等) ；生化标记主要包括同工酶和等位酶标记。这3 种标记都是基因表达的结果,是对基因的间接反映,标记数目有限,多态性较差,易受环境条件的影响。而分子标记是直接在DNA 分子上检测生物间的差异,是在DNA 水平上遗传变异的直接反映。 1 分子标记及其特点
分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。分子
标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）、DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）、原位杂交（in situ hybridization）等；第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）、扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）、简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）、序标位（Sequence tagged sites, 简称STS标记）、序列特征化扩增区域
（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等；第三类是一些新型的分子标记，如：单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）、表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利[2]。因此,DNA
分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。
1. 1 第一代分子标记
1.1.1 RFLP 标记技术。1980 年Botesin 提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP)开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术[3] 。 RFLP指限制性内切酶酶解不同个体基因组后，含有同源序列的酶切片段长度的差异。限制性内切酶能识别序列上有特定碱基组成的识别位点，并在识别位点切开，使很长的分子降解成长短不一的片段，片段的数目和长度反映了限制性内切酶切点的分布，对于特定的DNA限制性内切酶组合，所降解的片段的数目和长度是特异的，因此可以作为某一基因组的特有“指纹”(fingerprinting)。这种特异的指纹图谱具有高度的特异性 。碱基序列不同或发生插入、缺失、易位、碱基替换、基因重叠、碱基修饰等变异都能引起指纹图谱的变化，因此指纹图谱可用于个体遗传变异的鉴定。
RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。但是,在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区[4]。
1.1.2 RFLP在真菌中的应用
RFLP因其能展示大量的遗传标记，最初用于人类遗传病的诊断，近年
来在真菌分类鉴定和系统分析中也已广泛应用。Forster[5]等利用RFLP 技术对疫霉属(Phytophthora)真菌的6个种的线粒体DNA 进行了多态性分析，发现这项技术不仅可以区别种，甚至可以区别来自不同地理环境和寄主的种以下的分类单元亚群。通过对线粒体DNA 限制性片段多态性分析，Croft[6]等人对曲霉属(Aspergillus)的两个种
A．iaponicus与A．aculeatus的分子特征与表型特片之间的关系作了分析，经过研究，他们将A．japonicus与A．aculeatus的菌株分成7个不同的线粒体DNA的酶切片段群，并由此证明线粒体DNA的RFLP的分析在对黑曲霉的野生型分离株的特征界定上是一个非常有用的分析工具。Fliegerova[7]等应用RFLP技术，成功的区分开厌氧真菌
Anaeromyces属中的不同菌株， 因所用菌株数量偏少，作者在讨论中指出，尚需要更多不同来源、不同地域的菌株方能证实该结论。
1. 2 第二代分子标记
1. 2 .1 AFLP 标记技术。扩增片段长度多态技术(AFLP) ,又名限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragment
amplification ,SRFA) ,于1993 年由荷兰KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等发明[8]。AFLP 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术,它将基因组DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补) 连接起来,并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA 片段,从而形成指纹图谱的分子标记技术。AFLP 指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。它兼具RAPD 与RFLP 的优点,有较高的稳定性,用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点,
并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上,各染色体上AFLP 标记的数目与染色体长度呈正相关( r = 0. 501) ,而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关( r = 0. 826) 。因此,通过少量效率高的引物组合,可获得覆盖整个基因组的AFLP 标记[9] 。
1. 2 .2 AFLP在真菌中的应用
目前,AFLP 作为一种高效的指纹技术,已在遗传育种研究中发挥它的优势。Azuml[10]等使用9对引物，对Saccharomyces sensu stricto的 工业、实验室及典型菌株进行AFLP定性分析得到了此酵母的表型图谱，并将S．cerevisiae群簇分为三个亚群。1998 年Patehara[11]等用这种方法分析黑胫茎点霉( Leptophaerla rnaculara)，获得了基因对基因假说的进一步证据。Miguel [12]等报道了AFLP用于酵母菌遗传多样性的分析。Terashima [13]等应用AFLP技术对日本的Lentlanula edobes(香菇)的培养菌株进行了遗传多样性和菌株分型研究。评估了日本 L．edobes主要培养菌株之间的AFLP变化范围，评价了AFLP作为遗传标记在菌株分型上的实用性，并揭示了它们之间的遗传相关性。
1. 2 .3 SSR 标记技术。在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星
DNA(Minisatellite DNA) ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA(Microsatellite DNA) [14] 。小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。
Moore 等于1991 年结合PCR 技术创立了SSR(Simple
sequence repeat ,简单重复序列) 标记技术。SSR 也称微卫星DNA ,是一类由几个(多为1～5 个) 碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即(CA) n和(TG) n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同,导致了SSR 长度的高度变异性,这一变异性正是SSR 标记产生的基础。SSR 标记的基本原理:根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分子标记。
1. 2 .3 SSR在真菌中的应用
Lieckfeldt[15] 等于1993年第一次报道了用SSR作为单引物对酵母基因组的扩增。目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域[16] 。此外,SSR 标记不仅能够鉴定纯合体和杂合体,而且结果更加可靠,方法简单,省时省力。
1. 3 第三代分子标记
1. 3. 1 SNP 标记技术。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被称为第三代DNA 分子标记,是指同一位点的
不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入[17] ,更常见的是单个核苷酸的替换,且常发生在嘌呤碱基(A 与G) 和嘧啶碱基(C 与T) 之间。SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异,被认为是应用前景最好的遗传标记。
1. 3. 2 SNP在真菌中的应用
目前,已有236多个标记定位于真菌,在人类染色体上也已发展出2 000个SNP 标记。在这些SNP 标记中大约有30 %包含限制性位点的多态性。检测SNP 的最佳方法是DNA 芯片技术,最新报道的微芯片电泳(Microchip electrophoresis) ,可以高速度地检测临床样品的SNP ,它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高10 和50倍 。SNP 与第1 代的RFLP 及第2 代的SSR 标记的不同有两个方面:其一,SNP 不再以DNA 片段的长度变化作为检测手段,而直接以序列变异作为标记;其二,SNP 标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳,代之以最新的DNA 芯片技术。
2 结语
DNA分子标记技术在植物病原真菌鉴定上的应用给植物病原鉴定带来了一次革命，它突破了形态学或同工酶等作为分类依据的传统观念 这一技术从遗传本质，从遗传学角度分析真菌种群进化关系，从而使病原真菌鉴定不再受发育阶段和环境条件的影响，因而更加准确、快速。目前，因DNA分子鉴定技术鉴定植物病原真菌的工作仍停留在实验室水平上，虽然有许多方法已证明是鉴定真菌的理想方法，但较高的技术和昂贵的设备仍然是短时间内进行推广的主要障碍。PCR技术
的出现．虽然为分子技术的推广提供了可能性，但又需要很高的费用 由于分子鉴定技术有其它方法不可比拟的优势，所以随着DNA分子鉴定技术的不断成熟，它必然将成为植物病原真菌鉴定的重要方法，而在植物病理学研究和生产实践中广泛使用。因此，把已成型的实验室DNA分子鉴定技术转化为能在实际生产中应用的经济、快速和准确的实用技术，将成为未来一段时期内人们研究的热点。
参考文献
[1] : 郑成木，植物分子标记原理与方法，湖南科学技术出版社，
2002，1～5
[2] : 贾继增，分子标记种质资源坚定与分子标记育种，中国农业科
学，1996，29（4）：1～10
[3] : 朱玉贤,李毅. 现代分子生物学,高等教育出版社,2002
[4] : 周延清,DNA分子标记技术在植物研究中的应用,化学工业出版
社,2005 :56 - 57
[5] : Forster H．Oudemans P and Coffy M D M itochondrial and
nuclear DNA diversity within six species of Phytophthora
[J]． Experimental Mycology， 1990(14)：18—31
[6] : Croft J H ，Kevel F et a1．M olecular and phenotypic
characterization of mitochondrial DNA polymerphisms
[J]．Antomie Van Leeuwenhoek，1997，72(4)：337—347
[7] : Filegemva K，Paioutova S．Mrazek J，et a1． Aeta Veterinaria
Bmo．2002．71：441～444
[8] : VELAPPAM N,SONDRASS J L ,HAKOVIRTA J R. Rapid
identification of path genoic bacteria by single enzyme amplified fragment length polymorphism
analysis[J ].Diagnostic Microbiology and Infections Disease ,2001 , 77 ～ 83
[9] : 熊立仲,王石平,刘克德,等。 微卫星和AFLP 标记在水稻分子
标记连锁图上的分布， 植物学报,1998 ,40(7) :605 ～ 614
[10] : Azumi M，Yamamoto N．AFLP analysis oftype strains and
laboratory and industrial strains of Saccharomyces senJu stricto and its application to phonetic
clustering[J]．Yeast，200l，l8：l145一ll54
[11] : ptttchara PP．Oslborn TC．W illam PH et al . Genetic
analysis and identification of arnplified fragment length polymorpIism market linded to the gene of
Leptophaerla naculara ， phynopatho ,1998，88，1068～ 1072
[12] : Barros L M D，rainier i S，Henschke P A，et a1．AFLP
fingerprinting for analysis of yeast genetic
variation[J] ．International Jourasl of ，systematic Bacterriology，l999，49：915—924
[13] : Terashima K，Matsumoto T, Hasebe K，et al．Genetic
diversity and straintyping in cultivated strains of
Lentinula edode (the shii—take mushroom)in Japan by AFLP analysis[J]．Mycologcal Research，2OO2，lO6(1)：34—39
[14] :黎裕,贾继增,王天宇；分子标记的种类及其发展[J ]， 生物
技术通报,1999 ,15(4) :19 ～ 22
[15] : Lieckfeldt E, Meyer W, et al .Rapid identification and
differentiation of yeqats by DNA and PCR
fingerprinting.J Basic Microbiol.1993,33;413～416
[16] : 罗文永,胡骏,李小方， 微卫星序列及其应用，遗传，
2003:615～619
[17] : CHO RJ ,MINDRINOSM,RICHARDS D R,et al. Genome2wide
mapping with biallelic markers in Arabidopsis
thaliana[J ]，Nature Genetics ,1999 ,23 :203 ～ 207
分子标记技术及其在真菌中的应用
摘要 对RFLP、AFLP、SSR、SNP这些常用的DNA 分子标记技术的原理、特点以及其在真菌中的应用进行了综述。
关键词 分子标记；RFLP； AFLP；SSR；SNP；真菌
遗传标记(Genetic marker) 是研究生物遗传变异规律及其物质基础的重要手段。它具有2个基本特征,即可遗传性和可识别性。因此,生物中任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。随着遗传学的不断发展,遗传标记的种类和数量也不断增加。目前,应用较为广泛的遗传标记有形态标记(Morphologi2cal maker) 、细胞标记
(Cytological maker) 、生化标记(Biochemical maker) 和分子标记(Molecular maker) [1] 。
形态标记指植物的外部形态特征(矮秆、紫鞘、卷叶等) ；细胞标记主要是染色体的核型(染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等) 和带型(C 带、N 带、G带等) ；生化标记主要包括同工酶和等位酶标记。这3 种标记都是基因表达的结果,是对基因的间接反映,标记数目有限,多态性较差,易受环境条件的影响。而分子标记是直接在DNA 分子上检测生物间的差异,是在DNA 水平上遗传变异的直接反映。 1 分子标记及其特点
分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。分子
标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）、DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）、原位杂交（in situ hybridization）等；第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）、扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）、简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）、序标位（Sequence tagged sites, 简称STS标记）、序列特征化扩增区域
（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等；第三类是一些新型的分子标记，如：单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）、表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利[2]。因此,DNA
分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。
1. 1 第一代分子标记
1.1.1 RFLP 标记技术。1980 年Botesin 提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP)开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术[3] 。 RFLP指限制性内切酶酶解不同个体基因组后，含有同源序列的酶切片段长度的差异。限制性内切酶能识别序列上有特定碱基组成的识别位点，并在识别位点切开，使很长的分子降解成长短不一的片段，片段的数目和长度反映了限制性内切酶切点的分布，对于特定的DNA限制性内切酶组合，所降解的片段的数目和长度是特异的，因此可以作为某一基因组的特有“指纹”(fingerprinting)。这种特异的指纹图谱具有高度的特异性 。碱基序列不同或发生插入、缺失、易位、碱基替换、基因重叠、碱基修饰等变异都能引起指纹图谱的变化，因此指纹图谱可用于个体遗传变异的鉴定。
RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。但是,在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区[4]。
1.1.2 RFLP在真菌中的应用
RFLP因其能展示大量的遗传标记，最初用于人类遗传病的诊断，近年
来在真菌分类鉴定和系统分析中也已广泛应用。Forster[5]等利用RFLP 技术对疫霉属(Phytophthora)真菌的6个种的线粒体DNA 进行了多态性分析，发现这项技术不仅可以区别种，甚至可以区别来自不同地理环境和寄主的种以下的分类单元亚群。通过对线粒体DNA 限制性片段多态性分析，Croft[6]等人对曲霉属(Aspergillus)的两个种
A．iaponicus与A．aculeatus的分子特征与表型特片之间的关系作了分析，经过研究，他们将A．japonicus与A．aculeatus的菌株分成7个不同的线粒体DNA的酶切片段群，并由此证明线粒体DNA的RFLP的分析在对黑曲霉的野生型分离株的特征界定上是一个非常有用的分析工具。Fliegerova[7]等应用RFLP技术，成功的区分开厌氧真菌
Anaeromyces属中的不同菌株， 因所用菌株数量偏少，作者在讨论中指出，尚需要更多不同来源、不同地域的菌株方能证实该结论。
1. 2 第二代分子标记
1. 2 .1 AFLP 标记技术。扩增片段长度多态技术(AFLP) ,又名限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragment
amplification ,SRFA) ,于1993 年由荷兰KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等发明[8]。AFLP 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术,它将基因组DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补) 连接起来,并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA 片段,从而形成指纹图谱的分子标记技术。AFLP 指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。它兼具RAPD 与RFLP 的优点,有较高的稳定性,用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点,
并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上,各染色体上AFLP 标记的数目与染色体长度呈正相关( r = 0. 501) ,而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关( r = 0. 826) 。因此,通过少量效率高的引物组合,可获得覆盖整个基因组的AFLP 标记[9] 。
1. 2 .2 AFLP在真菌中的应用
目前,AFLP 作为一种高效的指纹技术,已在遗传育种研究中发挥它的优势。Azuml[10]等使用9对引物，对Saccharomyces sensu stricto的 工业、实验室及典型菌株进行AFLP定性分析得到了此酵母的表型图谱，并将S．cerevisiae群簇分为三个亚群。1998 年Patehara[11]等用这种方法分析黑胫茎点霉( Leptophaerla rnaculara)，获得了基因对基因假说的进一步证据。Miguel [12]等报道了AFLP用于酵母菌遗传多样性的分析。Terashima [13]等应用AFLP技术对日本的Lentlanula edobes(香菇)的培养菌株进行了遗传多样性和菌株分型研究。评估了日本 L．edobes主要培养菌株之间的AFLP变化范围，评价了AFLP作为遗传标记在菌株分型上的实用性，并揭示了它们之间的遗传相关性。
1. 2 .3 SSR 标记技术。在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星
DNA(Minisatellite DNA) ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA(Microsatellite DNA) [14] 。小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。
Moore 等于1991 年结合PCR 技术创立了SSR(Simple
sequence repeat ,简单重复序列) 标记技术。SSR 也称微卫星DNA ,是一类由几个(多为1～5 个) 碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即(CA) n和(TG) n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同,导致了SSR 长度的高度变异性,这一变异性正是SSR 标记产生的基础。SSR 标记的基本原理:根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分子标记。
1. 2 .3 SSR在真菌中的应用
Lieckfeldt[15] 等于1993年第一次报道了用SSR作为单引物对酵母基因组的扩增。目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域[16] 。此外,SSR 标记不仅能够鉴定纯合体和杂合体,而且结果更加可靠,方法简单,省时省力。
1. 3 第三代分子标记
1. 3. 1 SNP 标记技术。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被称为第三代DNA 分子标记,是指同一位点的
不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入[17] ,更常见的是单个核苷酸的替换,且常发生在嘌呤碱基(A 与G) 和嘧啶碱基(C 与T) 之间。SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异,被认为是应用前景最好的遗传标记。
1. 3. 2 SNP在真菌中的应用
目前,已有236多个标记定位于真菌,在人类染色体上也已发展出2 000个SNP 标记。在这些SNP 标记中大约有30 %包含限制性位点的多态性。检测SNP 的最佳方法是DNA 芯片技术,最新报道的微芯片电泳(Microchip electrophoresis) ,可以高速度地检测临床样品的SNP ,它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高10 和50倍 。SNP 与第1 代的RFLP 及第2 代的SSR 标记的不同有两个方面:其一,SNP 不再以DNA 片段的长度变化作为检测手段,而直接以序列变异作为标记;其二,SNP 标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳,代之以最新的DNA 芯片技术。
2 结语
DNA分子标记技术在植物病原真菌鉴定上的应用给植物病原鉴定带来了一次革命，它突破了形态学或同工酶等作为分类依据的传统观念 这一技术从遗传本质，从遗传学角度分析真菌种群进化关系，从而使病原真菌鉴定不再受发育阶段和环境条件的影响，因而更加准确、快速。目前，因DNA分子鉴定技术鉴定植物病原真菌的工作仍停留在实验室水平上，虽然有许多方法已证明是鉴定真菌的理想方法，但较高的技术和昂贵的设备仍然是短时间内进行推广的主要障碍。PCR技术
的出现．虽然为分子技术的推广提供了可能性，但又需要很高的费用 由于分子鉴定技术有其它方法不可比拟的优势，所以随着DNA分子鉴定技术的不断成熟，它必然将成为植物病原真菌鉴定的重要方法，而在植物病理学研究和生产实践中广泛使用。因此，把已成型的实验室DNA分子鉴定技术转化为能在实际生产中应用的经济、快速和准确的实用技术，将成为未来一段时期内人们研究的热点。
参考文献
[1] : 郑成木，植物分子标记原理与方法，湖南科学技术出版社，
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[2] : 贾继增，分子标记种质资源坚定与分子标记育种，中国农业科
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[9] : 熊立仲,王石平,刘克德,等。 微卫星和AFLP 标记在水稻分子
标记连锁图上的分布， 植物学报,1998 ,40(7) :605 ～ 614
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laboratory and industrial strains of Saccharomyces senJu stricto and its application to phonetic
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analysis and identification of arnplified fragment length polymorpIism market linded to the gene of
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Lentinula edode (the shii—take mushroom)in Japan by AFLP analysis[J]．Mycologcal Research，2OO2，lO6(1)：34—39
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技术通报,1999 ,15(4) :19 ～ 22
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