实验一 细菌感受态的制备和质粒的转化
实验目的
通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA 转化的最基本操作，以及如何
提高转化效率的思路。本实验综合因素较多，难度较大，是分子生物学中的一个
很关键的实验手段。
实验原理
转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA ，而导致其原来的遗传性状发生
改变，这种遗传性状包括遗传型和表型的改变。
感受态是受体菌能接受外源DNA 能力的一种生理状态。用CaCl 2处理细菌，
改变细胞膜的结构，使质粒DNA 能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性
培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形
成菌落。
本实验采用质粒pUC118转化大肠杆菌DH-5 ，通过氨苄青霉素抗性筛选转
化子。
图1-1 质粒pUC118/pUC119图谱
实验材料和试剂
（一）实验材料
大肠杆菌DH-5α
质粒pUC118（ampicillin ，Amp R ）
（二）培养基和试剂
1. LB 液体培养基(%)
胰蛋白胨（Tryptone ） 0. 5
酵母浸出粉（Yeast extract） 1. 0
NaCl 0. 5
pH 7. 2～7. 4（用2mol/L NaOH 调节）
（分装：20ml/250ml三角瓶，每组2瓶。3ml/试管，每组2管。0.07Mpa
高压灭菌30分钟）。
2. LB 固体培养基
LB 液体培养基加入1. 6%的琼脂粉即可。
（分装：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克琼脂粉，每组1瓶。0.07Mpa
高压灭菌30分钟）。
3. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin, ，Amp ），配制成100mg/ml备用。
4. 0. 1mol/L CaCl2溶液
(配制方法：称取1.1克无水CaCl 2，溶于90ml 蒸馏水中，定容至100ml ，
装于250ml 三角瓶中，0.07Mpa 高压灭菌30分钟，4℃保存。）
（三）器材
接种针 10ml 移液管 50ml 塑料离心管 5ml 移液管
90mm 培养皿 1ml 移液管
1.5ml Eppendorf管 200μl 吸头
三角爬 15×150试管
冰块 试管铝帽
牛皮纸 纱布盖
线绳 硫酸纸
（四）仪器
净化工作台 摇床机
恒温水浴锅 离心机
培养箱
实验步骤
以下均需无菌操作
（一）感受态细胞的制备
1. 大肠杆菌DH-5α 冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB 固体培养基平板上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）。
2. 从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜（约16小时）。
3. 取0.3ml 菌液接种于20ml LB 液体培养基的250ml 三角瓶中，37℃振荡培养2～3小时，待OD 600值达到0. 3～0. 4时，取下三角瓶，立即置冰浴10～15 分钟。
4. 将细菌转移到一个灭菌的50ml 离心管中，4℃ 3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。
5. 加入20ml 用冰预冷的0. 1mol/L CaCl2溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀，置冰浴中30分钟。
6. 4℃ 3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。
7. 再加入2ml 用冰预冷的0. 1mol/L CaCl2溶液，小心重新悬浮菌体（操作要轻）。在4℃冰箱中放置12～24小时，即可应用于DNA 转化。
（二）细菌的转化
1. 取大肠杆菌DH-5α新鲜感受态细胞100μl 于1.5ml Eppendorf管中，加入50～100ng 质粒pUC118 DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。
2. 42℃热休克120秒，不要摇动Eppendorf 管。
3. 加入LB 液体培养基900μl ，37℃保温60分钟。
4. 取100μl 转化液涂布在含氨苄青霉素（Amp ）100 μg/ml的LB 固体平板上，37℃倒置培养16～24小时。
5．观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。
【提示】
实验操作中注意的问题
1. DNA 与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低，转化效率极差。
2. Eppendorf 管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染。
3. 42℃热处理时很关键，转移速度要快，但温度要准确。
4. 涂布转化液时，要避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
【思考题】
1．制备感受态细胞的关键是什么？
2．如果DNA 转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。
3．如何提高转化效率？
实验一 细菌感受态的制备和质粒的转化
实验目的
通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA 转化的最基本操作，以及如何
提高转化效率的思路。本实验综合因素较多，难度较大，是分子生物学中的一个
很关键的实验手段。
实验原理
转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA ，而导致其原来的遗传性状发生
改变，这种遗传性状包括遗传型和表型的改变。
感受态是受体菌能接受外源DNA 能力的一种生理状态。用CaCl 2处理细菌，
改变细胞膜的结构，使质粒DNA 能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性
培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形
成菌落。
本实验采用质粒pUC118转化大肠杆菌DH-5 ，通过氨苄青霉素抗性筛选转
化子。
图1-1 质粒pUC118/pUC119图谱
实验材料和试剂
（一）实验材料
大肠杆菌DH-5α
质粒pUC118（ampicillin ，Amp R ）
（二）培养基和试剂
1. LB 液体培养基(%)
胰蛋白胨（Tryptone ） 0. 5
酵母浸出粉（Yeast extract） 1. 0
NaCl 0. 5
pH 7. 2～7. 4（用2mol/L NaOH 调节）
（分装：20ml/250ml三角瓶，每组2瓶。3ml/试管，每组2管。0.07Mpa
高压灭菌30分钟）。
2. LB 固体培养基
LB 液体培养基加入1. 6%的琼脂粉即可。
（分装：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克琼脂粉，每组1瓶。0.07Mpa
高压灭菌30分钟）。
3. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin, ，Amp ），配制成100mg/ml备用。
4. 0. 1mol/L CaCl2溶液
(配制方法：称取1.1克无水CaCl 2，溶于90ml 蒸馏水中，定容至100ml ，
装于250ml 三角瓶中，0.07Mpa 高压灭菌30分钟，4℃保存。）
（三）器材
接种针 10ml 移液管 50ml 塑料离心管 5ml 移液管
90mm 培养皿 1ml 移液管
1.5ml Eppendorf管 200μl 吸头
三角爬 15×150试管
冰块 试管铝帽
牛皮纸 纱布盖
线绳 硫酸纸
（四）仪器
净化工作台 摇床机
恒温水浴锅 离心机
培养箱
实验步骤
以下均需无菌操作
（一）感受态细胞的制备
1. 大肠杆菌DH-5α 冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB 固体培养基平板上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）。
2. 从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜（约16小时）。
3. 取0.3ml 菌液接种于20ml LB 液体培养基的250ml 三角瓶中，37℃振荡培养2～3小时，待OD 600值达到0. 3～0. 4时，取下三角瓶，立即置冰浴10～15 分钟。
4. 将细菌转移到一个灭菌的50ml 离心管中，4℃ 3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。
5. 加入20ml 用冰预冷的0. 1mol/L CaCl2溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀，置冰浴中30分钟。
6. 4℃ 3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。
7. 再加入2ml 用冰预冷的0. 1mol/L CaCl2溶液，小心重新悬浮菌体（操作要轻）。在4℃冰箱中放置12～24小时，即可应用于DNA 转化。
（二）细菌的转化
1. 取大肠杆菌DH-5α新鲜感受态细胞100μl 于1.5ml Eppendorf管中，加入50～100ng 质粒pUC118 DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。
2. 42℃热休克120秒，不要摇动Eppendorf 管。
3. 加入LB 液体培养基900μl ，37℃保温60分钟。
4. 取100μl 转化液涂布在含氨苄青霉素（Amp ）100 μg/ml的LB 固体平板上，37℃倒置培养16～24小时。
5．观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。
【提示】
实验操作中注意的问题
1. DNA 与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低，转化效率极差。
2. Eppendorf 管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染。
3. 42℃热处理时很关键，转移速度要快，但温度要准确。
4. 涂布转化液时，要避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
【思考题】
1．制备感受态细胞的关键是什么？
2．如果DNA 转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。
3．如何提高转化效率？