专论与综述
中 国 酿 造
2009年第6期总第207期
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乳酸菌分类鉴定方法的研究进展
庞会利,谈重芳,蔡义民,秦广雍
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(1 郑州大学离子束生物工程省重点实验室,河南郑州450052;2 日本国立畜产草地研究所,日本枥木县329-2793)摘 要:对目前使用的乳酸菌表型特征鉴定和基因型特征鉴定方法的优缺点进行了综述。依据表型的常规生理生化特征进行乳酸菌的分类鉴定不仅费时,有时甚至难以完成。随着分子生物技术的发展和基因数据库的建立,将分子标记技术、新兴鉴定技术与常规方法结合使用,将使乳酸菌的分类、鉴定更为准确和便捷。关 键 词:乳酸菌;食品;酿造;鉴定
中图分类号:TS201 3 文献标识码:A 文章编号:0254-5071(2009)06-0001-04
Progressinresearchonlacticacidbacteriaidentificationmethods
PANGHuili,TANZhongfang,CAIYmiin,QINGuangyong
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1
2
1*
(1.ProvincialKeyLaboratoryofIonBeamBio-engineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China;
2.NationalInstituteofLivestockandGrasslandofJapan,Tochigi329-2793,Japan)
Abstract:ThispaperprovidesanoverviewofphenotypicandgenotypetechniquesthatarecurrentlyusedforidentificationofLAB,andthemerit
andshortcomingofallkindsofmethodsaresummerized.Theconventionalphenotypesbasedonthephysiologicalandbiochemicalcharacteristicsoflacticacidbacteriaidentificationnotonlytmie-consumingbutalsosometmiesdifficulttoworkou.tWiththedevelopmentofmoleculartechniquesandgeneticdatabase,usingacombinationofmolecularmarkers,emergingidentificationtechnologiesandconventionalmethodswillenabletheclas-sificationandidentificationoflacticacidbacteriamoreaccurateandconvenien.tKeywords:lacticacidbacteria;food;brewing;identification
乳酸菌是利用可发酵糖产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。乳酸菌是广义范畴的概念,是非正式、非规范的细菌分类学名称
[1]
用API50CHL体系分析了317株可能为乳酸菌的菌株,只有38%分离株被鉴定到种的水平。WIJTZEST等到种的水平。
虽然应用表型性状鉴定对部分乳酸菌是非常有用的,但对某些乳酸菌来说,即使表型性状很相似,也不意味着基因型亲源关系很近2DNA标记技术
传统的表型、生物化学方法鉴定微生物耗时耗力,培养条件的改变还可能导致结果发生改变,鉴定结果很不稳定。因此,人们希望能找到一种快速、稳定、灵敏的方法用于微生物的分类研究。从分子和基因水平来认识乳酸菌的遗传结构、组成和分类,许多新的分子标记技术被用来进行乳酸菌的分类和鉴定,如16SrDNA、16S~23SrRNA基因间隔区(IntergenicSpacerRegion,ISR)的序列分析和基于PCR技术的分子标记技术等,其中基于PCR技术的分子标记又可分为随机扩增多态性DNA(RandomlyAm-plifiedPolymorphicDNA,RAPD)、扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP)、限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymor-phism,RFLP)、重复基因外回文序列(RepetitiveExtragenic
[5]
[4]
利用
。当前,乳酸菌产品以其独特的生2种碳源发酵测试体系也未能将14种乳酸菌分离株鉴定
物学功能呈现出前所未有的商业开发利用价值,乳酸菌在酿造工业中有广泛的应用,如在白酒固态发酵酿造中,乳酸菌产生的乳酸可以与乙醇酯化生成乳酸乙酯,对于白酒的风味十分重要,用于葡萄酒及苹果酒酿造中的乳酸菌可以触发苹果酸、乳酸发酵等。所以优良菌株的筛选、生产菌种的保护越来越引起商家的重视。1经典方法(表型特征鉴定)
人类对乳酸菌的分类鉴定和利用已经有悠久的历史,并积累了丰富的经验和知识,形成了至今一直沿用的传统分类鉴定方法,包括形态特征、生理生化反应及血清学反应等,这些方法都是基于微生物表面受体的特异性,属于表型分类法。
一般情况下,表型鉴定是一种比较廉价的方法。GONZLEZCJ等
[2]
。
利用44种形态学和生理学特征从淡水
鱼及其生活环境中分离到249株乳酸菌进行鉴定,其中90%以上的分离株被鉴定到属的水平。目前已经有一些比较受欢迎的微生物鉴定体系,如API、BIOLOG和API50CHL等应用于微生物的鉴定。CORSETTIA等
收稿日期:2008-11-07
[3]
利
基金项目:国家 973 项目(2004CB719604 4);农业部核技术农业应用专项资助课题(200803034)
:1982-),,,博士研究生,;*,通讯作者。
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2009No.6SerialNo.207
ChinaBrewing
ForumandSummary
PalindromicSequences,REP)、肠细菌基因间重复共有序列(EnterobacterialRepetitiveIntergenicConsensusSequences,ERIC)等。
2 1rDNA/rRNA序列的分子标记
16SrDNA或rRNA序列既具有保守性,又具有高变性,是目前细菌分类和鉴定经常使用的一种检测方法。CHOIIK等
[6]
REP)、肠细菌基因间重复共有序列(EnterobacterialRepe-titiveIntergenicConsensusSequences,ERIC)、BOX序列以及(GTG)5序列。
重复序列PCR(repetitivesequence-basedPCR,Rep-PCR)技术可以迅速而准确地在亚种和菌株水平上鉴别微生物分离株。rep-PCR主要应用于细菌,其中乳酸菌方面主要集中在双歧杆菌球菌
[15]
[10]
利用16SrDNA测序和DNA杂交技术研究、芽孢杆菌
[11-12]
、乳杆菌
[13-14]
、肠
了泡菜中乳酸菌的菌群变化,在泡菜(5d)的发酵过程中随机分离了120株乳酸菌,结果发现在发酵的前中期,柠檬明串珠菌(L citreum)是优势种,然而在后期主要为清酒乳杆菌(L sake)或弯曲乳杆菌以及短乳杆菌。WATERJ等
[7]
等。
2 2 3随机扩增多态性DNA技术(RandomAmplifiedPoly-morphicDNA,RAPD)
RAPD作为一种分子标记,具有种属甚至种间特异性。该方法的重现率较低,RAPD技术很难将乳酸菌鉴定到种的水平。现在主要和其他方法一起使用,如ANTON-SSONM等[16]先将分离自奶酪的33株乳酸菌分为10个RAPD型(RAPDtypes),再用温度梯度凝胶电泳(Temper-atureGradientGelElectrophoresis)技术将这些细菌鉴定到种的水平。CUSICKSM等
[17]
依据16S~23SrRNA的ISR设计的引物鉴定干酪乳
[8]
杆菌,可以区分干酪乳杆菌或类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌以及玉米乳杆菌。SCARPELLINIM等属菌种的鉴定。
但无论是16SrDNA序列还是16S~23SrDNAISR序列分析方法,都是针对乳酸菌基因组的一部分序列进行分析,而不是在全基因组的水平上分析,具有一定的局限性,并且该方法比较耗时,当样本数量很多时,测序费用较高。2 2基于PCR的DNA标记技术
随着DNA标记技术的不断成熟,人们建立了一系列以DNA标记为基础的微生物鉴定和检测技术,根据菌株之间遗传距离所产生的DNA指纹差异来直接反映检测微生物菌株的DNA多态性来对其鉴定和分型。这些技术的最大优势就是可以忽略各种复杂的微生物生长条件,不需要预先培养就可以鉴定和检测。多数研究结果表明,DNA标记分型技术具有从种属到菌株各种水平的鉴别能力,为乳酸菌的快速分子鉴定和分型提供了借鉴2 2 1特异性扩增靶片段
通过设计特异性的引物在一定条件下通过聚合酶链式反应选择性的特异扩增特定的靶DNA片段,理论上讲可以在任何分类水平上对微生物菌株进行区别和鉴定。虽然特异性扩增靶DNA片段可以快速准确地在种和亚种甚至菌株水平鉴定乳酸菌,但是需要较复杂的引物设计策略,并鉴定引物的有效性后才能获得一系列有效的引物。因此这种方法只有在对检测和鉴定的菌株完全了解的情况下,才最为有效和实用。2 2 2基因组短重复序列标记
这类标记主要是指基因组中的分散保守重复DNA元件(InterspersedConservedRepetitiveDNAElements),依据它们在整个细菌基因组DNA中存在多个拷贝进行引物设计。现在已有3类重复性元件得到了确认,即重复基因外回Palimic,
[9]
对Carnobacte-
rium属的现有种的16S~23SrDNA间区分析,能够进行该
利用改进RAPD技术将有
些乳酸菌鉴定到种和菌株的水平。
2 3限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLength
Polymorphism)
RFLP是BOSTEIN在1980年首先提出并最早发展的分子标记技术。该技术是可以用于种内水平鉴定乳酸菌分离株的一种DNA指纹方法。徐艳文等
[18]
使用26S
rDNA-RFLP分析了分离自甘肃莫高葡萄酒厂的29株非酿酒酵母菌,被测菌株被分为10个类型。通过26SrDNAD1/D2区序列分析验证,证明此方法在葡萄酿酒酵母菌种多样性研究中有良好的应用价值。
2 4扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPoly-morphism)
AFLP是最早由荷兰科学家ZABEAU发明并由VOS发展起来的一种分子标记技术,具有比RAPD和RFLP技术更大的优越性。AFLP主要用于流行病学及食品源性病原体毒力指标的测定研究(如李斯特杆菌和沙门菌),也有利用这一技术对种族遗传学上关系密切的菌种(戊糖乳杆菌、植物乳杆菌和类植物乳杆菌)进行种水平的鉴定[19]。
2 5电泳核型标记技术(EK)
电泳核型标记技术是利用脉冲场凝胶电泳(PulsedFieldGelElectrophoresis,PFGE)将用稀有位点酶(rare-cu-ttingenzymes)对菌株完整的基因组DNA进行消化后的大片段DNA进行分离生的DNA片段。
[21]
[20]
。
。乳酸菌的核糖体分型技术是利
用限制性内切酶消化DNA后,再用rDNA探针来检测产
I和21
专论与综述
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株单核细胞增多性李斯特菌菌株基因组DNA进行酶切,用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法进行遗传多样性分析。结果表明,3株临床分离株(00181、00174和0194)分别存在于亚型A、B、D中;16个单核细胞增多性李斯特菌奶相关和环境分离株主要存在于4个亚型中,其中2个亚型(C、D)均为奶相关分离株(包括原料奶、均质奶(储奶罐)和成品奶分离株,而加工厂地面污水分离株为独立的一个亚型(A))。
2 6温度梯度凝胶电泳(TemperatureGradientGelElectro-phoresis,TGGE)/变性梯度凝胶电泳(Denaturinggra-dientgelelectrophoresis,DGGE)
TGGE技术的优点是可以从凝胶中切下谱带,然后通过测序分析来揭示群落成员系统发育的从属关系,进一步可以用类群特异探针同群落图谱杂交,检测出特异细菌种群的存在。
与TGGE技术相似的还有变性梯度凝胶电泳DGGE,是FISCHER和LERMAN于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。它的分辨精度比聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可以检测到一个核苷酸水平的差异。
MUYZER等
[22]
2 8扩增性rDNA限制性酶切片段分析(amplifiedriboso-malDNArestrictionanalysis,ARDRA)
ARDRA方法是1992年建立的,此方法不受菌株是否纯培养的限制,不受宿主的干扰,具备特异性强、效率高的特点,已广泛应用于微生物的分类、鉴定、分析及揭示微生物的多样性和系统发育关系的研究。
MICHELC等
[29]
使用该技术对不同来源的22种菌进
[30]
行分析,探讨了鱼及其生存环境中乳酸菌的多样性,探明了其中存在的乳酸菌。GIRAFFAG等
使用全基因序
列和ARDRA分析方法对干酪中的乳酸菌进行分析,为描述瑞士乳杆菌的微生物生态系提供了基础。RACHMANCN等
[31]
的实验证实当对16S~23SrDNA相近的乳酸菌使用
RFLP技术进行鉴定时可以很好地将香肠乳杆菌、消化乳杆菌、弯曲乳杆菌和植物乳杆菌区分开来。
3FtsZ(filamentoustemperature-sensitiveproteinZ)
FtsZ是一种广泛存在于细菌和古菌中的结构保守的蛋白质,在细胞分裂的过程中起关键的作用,是真核生物中微管蛋白的类似物。研究表明,FtsZ具有GTPase的活性,其N端的一段300多个氨基酸残基的肽段是GTP的结合位点和水解位点,且氨基酸序列比较保守,适用于细菌系统学研究。张斌等
[32]
发现DGGE只能对微生物群落中数量
大于1%的优势种群进行分析;梯度凝胶及电泳条件也很难适合所有微生物的DNA,不同菌的DNA扩增片段在电泳中可能走到相同的位置。
DGGE/TGGE带谱中每条带可能代表一个不同的微生物物种,电泳带谱中条带的数量反映环境微生物菌落中优势类群的数量
[23]
通过PCR扩增FtsZ基因的一
段800bp的核苷酸,构建了干酪乳杆菌-片球菌及相关乳酸菌的FtsZ蛋白系统发育树。将此系统树和16SrDNA系统树比较,发现二者的拓扑结构非常相似。在2个基因系统树中,片球菌与乳杆菌的种均显示较近的亲缘关系,而与其他球状的乳酸菌(如链球菌和肠球菌)的亲缘关系较远。研究还表明FtsZ蛋白序列分辨率>16SrDNA,更适用于乳酸菌种间的系统分类研究。4电子鼻(Electronicnose)
电子鼻是利用气体传感器阵列的响应曲线来识别气味的电子系统,可以在几小时、几天甚至数月的时间内连续、实时地监测特定位置的气味状况。电子鼻与普通的化学仪器(如色谱仪、光谱仪等)不同,得到的不是被测样品各种成分的定性和定量结果,而是给予样品中挥发成分的整体信息,也就是 指纹数据 。其不仅可以对不同样品的气味信息进行简单的比对分析,而且可以通过采集标样信息建立数据库,利用化学计量学的统计分析方法对未知样品进行定性和定量分析。
MARILLEYL等
[33]
。目前,DGGE和TGGE被广泛用于食
[24]
品和其他样品中的乳酸菌检测,是很有前景的直接鉴定方法。FAVIERCF等菌群的情况。
2 7DNA杂交和DNA探针技术
WEONHY等
[25]
应用DGGE技术通过观察2例新
生婴儿10个多月粪样菌群的动态变化来了解婴幼儿胃肠
研究表明,要在种的水平上鉴定新
的菌株,采用DNA杂交技术确定DNA的相似性是十分可取的。尽管这种方法在种的鉴定上具有一定的优势,但是耗时耗力,影响了该技术的推广应用。
WAYNES等
[26]
研究结果表明,DNA的相似性在70%
以上可以认为是同一个种;而JOHNSON等认为DNA的相似性在20%~60%可以认为是属的水平上相关的。DU-TOIT等利用DNA杂交技术从297株乳杆菌中成功筛选出了益生菌。LYHSU等MANEROG等
[28]
[27]
利用基于电子鼻技术的质谱分析
应用核糖体分型技术成功鉴系统对乳酸菌的挥发性化合物进行评估,得到的分类鉴定结果与用分子生物学方法得到的结果相同。这种方法可用于区分样品中的细菌群落,发现新的能够产生气定了真空包装食品中的296个乳酸菌分离株;GARCIA-应用基因组DNA探针成功鉴定了从酒
4
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ForumandSummary
5分子荧光光谱法(Molecularfluorescencespectroscopy)
荧光是受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。分子荧光光谱法又称为荧光光谱法或荧光分析法,是以物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析,以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析。
AMMORS等
[34]
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利用乳酸菌样品内所含物质的3种
激发光:250nm(氨基酸+核酸)、316nm(NADH)、380nm(NAD),数据的分析采用主成分分析法和因子判别式法,分别在种、类、种类水平上对所收集到的乳酸菌样品进行分离鉴定。内在的荧光可作为一种经济有效的手段来鉴定野生型乳酸菌。6总结与展望
表型、生物化学鉴定方法耗时耗力,而且培养条件的改变可能导致结果发生改变,很不稳定,且仍是表观的,很难反映生物的遗传本质
[35]
;分子标记技术快速、准确、
灵敏,但是通过对各个研究方法的比较,会发现不同方法检测到的乳酸菌种类多样性结果可能不完全一致,这说明各种方法都有一定的选择性和局限性。目前还没有一种技术能单独胜任对乳酸菌的鉴定,只有把各种方法结合起来进行比较研究,尤其是将传统方法和分子生物学方法、新兴的方法等结合起来使用,才会得到比较满意的结果,使乳酸菌的分类、鉴定更为准确、便捷。参考文献:
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[8],.D
专论与综述
中 国 酿 造
2009年第6期总第207期
5
中国酒曲微生物研究进展
荣瑞金
1,2
,李祖明
1*
,王德良,白志辉,李鸿玉,荣瑞芬,叶 磊
34111
(1 北京联合大学师范学院,北京100011;2 山西省杏花村汾酒集团有限责任公司汾青分厂,山西孝义032300;
3 中国食品发酵工业研究院,北京100027;4 中国科学院生态环境研究中心,北京100085)
摘 要:综述了中国酒曲微生物在分离与鉴定、组成、性能和育种方面的研究进展,并简单介绍了中国酒曲微生物在酿酒工业、乳酸和单细胞蛋白生产、功能保健食品与食品添加剂、酶制剂等领域的应用,最后展望了中国酒曲微生物研究的广阔前景。关 键 词:中国酒曲;微生物;研究进展
中图分类号:TS261 1 文献标识码:A 文章编号:0254-5071(2009)06-0005-04
ResearchprogressonmicroorganismsinChineseliquorQu
RONGRuijin,LIZuming,WANGDeliang,BAIZhihui,LIHongyu,RONGRuifen,YELei
1,2
1*
3
4
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1
(1.TeacherCollegeofBeijingUnionUniversity,Beijing100011,China;2.FenqingBranchFactoryofShanxiXinghuacunFenChiew(Group)Co.,Ltd,Xiaoyi032300,China;3.ChinaNationalResearchInstituteofFoodandFermentationIndustry,Beijing100027,China;4.ResearchCenterforEco-EnviromentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China)Abstract:Thespecificflavor,highqualityandrecoveryrateofChineseliquorwascloselyrelatedtothemicroorganismsinChineseliquorQu.The
researchprogressinisolationandidentification,composition,performanceandscreeningofthemicroorganismsinChineseliquorQuwassumma-rized,aswellastheapplicationofthemicroorganismsinChineseliquorQuinthefieldsofliquor-makingindustry,productionoflacticacidandsingle-cel-lprotein,functionalfoodandfoodadditives,enzymepreparation.AndthevastrangeofprospectsfortheresearchonmicroorganismsinChineseliquorQuwasforecasted.Keywords:ChineseliquorQu;microorganism;researchprogress
用曲酿酒是中国酒的特色,在世界酿酒史上独树一帜,是我国的一项伟大发明。日本著名酿酒专家板口谨一郎先生曾经评论: 中国发明酒曲酿酒,其影响之大,堪与中国四大发明相比 。传统的微生物工艺过程(如食
收稿日期:2009-02-06
基金项目:北京市属市管高校人才强教计划资助项目
[1]
品、饮料发酵和废物处理)几乎都是多种微生物共同作用的结果,如传统的制曲是多种微生物进入曲料竞争生存,能适应制曲环境的保存下来,并生长繁殖,积累了丰富的代谢产物和种类繁多的酶系的过程
[2]
。酒曲是中国酒酿
作者简介:荣瑞金(1962-),男,山西孝义人,主要从事白酒生产及技术管理工作;李祖明*,讲师,通讯作者。
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[35]孙志宏,孟 和,孙天松,等 分子标记技术用于乳酸菌分类鉴定研
究进展[J] 中国乳品工业,2006,34(5):35-38
专论与综述
中 国 酿 造
2009年第6期总第207期
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乳酸菌分类鉴定方法的研究进展
庞会利,谈重芳,蔡义民,秦广雍
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(1 郑州大学离子束生物工程省重点实验室,河南郑州450052;2 日本国立畜产草地研究所,日本枥木县329-2793)摘 要:对目前使用的乳酸菌表型特征鉴定和基因型特征鉴定方法的优缺点进行了综述。依据表型的常规生理生化特征进行乳酸菌的分类鉴定不仅费时,有时甚至难以完成。随着分子生物技术的发展和基因数据库的建立,将分子标记技术、新兴鉴定技术与常规方法结合使用,将使乳酸菌的分类、鉴定更为准确和便捷。关 键 词:乳酸菌;食品;酿造;鉴定
中图分类号:TS201 3 文献标识码:A 文章编号:0254-5071(2009)06-0001-04
Progressinresearchonlacticacidbacteriaidentificationmethods
PANGHuili,TANZhongfang,CAIYmiin,QINGuangyong
1
1
2
1*
(1.ProvincialKeyLaboratoryofIonBeamBio-engineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China;
2.NationalInstituteofLivestockandGrasslandofJapan,Tochigi329-2793,Japan)
Abstract:ThispaperprovidesanoverviewofphenotypicandgenotypetechniquesthatarecurrentlyusedforidentificationofLAB,andthemerit
andshortcomingofallkindsofmethodsaresummerized.Theconventionalphenotypesbasedonthephysiologicalandbiochemicalcharacteristicsoflacticacidbacteriaidentificationnotonlytmie-consumingbutalsosometmiesdifficulttoworkou.tWiththedevelopmentofmoleculartechniquesandgeneticdatabase,usingacombinationofmolecularmarkers,emergingidentificationtechnologiesandconventionalmethodswillenabletheclas-sificationandidentificationoflacticacidbacteriamoreaccurateandconvenien.tKeywords:lacticacidbacteria;food;brewing;identification
乳酸菌是利用可发酵糖产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。乳酸菌是广义范畴的概念,是非正式、非规范的细菌分类学名称
[1]
用API50CHL体系分析了317株可能为乳酸菌的菌株,只有38%分离株被鉴定到种的水平。WIJTZEST等到种的水平。
虽然应用表型性状鉴定对部分乳酸菌是非常有用的,但对某些乳酸菌来说,即使表型性状很相似,也不意味着基因型亲源关系很近2DNA标记技术
传统的表型、生物化学方法鉴定微生物耗时耗力,培养条件的改变还可能导致结果发生改变,鉴定结果很不稳定。因此,人们希望能找到一种快速、稳定、灵敏的方法用于微生物的分类研究。从分子和基因水平来认识乳酸菌的遗传结构、组成和分类,许多新的分子标记技术被用来进行乳酸菌的分类和鉴定,如16SrDNA、16S~23SrRNA基因间隔区(IntergenicSpacerRegion,ISR)的序列分析和基于PCR技术的分子标记技术等,其中基于PCR技术的分子标记又可分为随机扩增多态性DNA(RandomlyAm-plifiedPolymorphicDNA,RAPD)、扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP)、限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymor-phism,RFLP)、重复基因外回文序列(RepetitiveExtragenic
[5]
[4]
利用
。当前,乳酸菌产品以其独特的生2种碳源发酵测试体系也未能将14种乳酸菌分离株鉴定
物学功能呈现出前所未有的商业开发利用价值,乳酸菌在酿造工业中有广泛的应用,如在白酒固态发酵酿造中,乳酸菌产生的乳酸可以与乙醇酯化生成乳酸乙酯,对于白酒的风味十分重要,用于葡萄酒及苹果酒酿造中的乳酸菌可以触发苹果酸、乳酸发酵等。所以优良菌株的筛选、生产菌种的保护越来越引起商家的重视。1经典方法(表型特征鉴定)
人类对乳酸菌的分类鉴定和利用已经有悠久的历史,并积累了丰富的经验和知识,形成了至今一直沿用的传统分类鉴定方法,包括形态特征、生理生化反应及血清学反应等,这些方法都是基于微生物表面受体的特异性,属于表型分类法。
一般情况下,表型鉴定是一种比较廉价的方法。GONZLEZCJ等
[2]
。
利用44种形态学和生理学特征从淡水
鱼及其生活环境中分离到249株乳酸菌进行鉴定,其中90%以上的分离株被鉴定到属的水平。目前已经有一些比较受欢迎的微生物鉴定体系,如API、BIOLOG和API50CHL等应用于微生物的鉴定。CORSETTIA等
收稿日期:2008-11-07
[3]
利
基金项目:国家 973 项目(2004CB719604 4);农业部核技术农业应用专项资助课题(200803034)
:1982-),,,博士研究生,;*,通讯作者。
2
2009No.6SerialNo.207
ChinaBrewing
ForumandSummary
PalindromicSequences,REP)、肠细菌基因间重复共有序列(EnterobacterialRepetitiveIntergenicConsensusSequences,ERIC)等。
2 1rDNA/rRNA序列的分子标记
16SrDNA或rRNA序列既具有保守性,又具有高变性,是目前细菌分类和鉴定经常使用的一种检测方法。CHOIIK等
[6]
REP)、肠细菌基因间重复共有序列(EnterobacterialRepe-titiveIntergenicConsensusSequences,ERIC)、BOX序列以及(GTG)5序列。
重复序列PCR(repetitivesequence-basedPCR,Rep-PCR)技术可以迅速而准确地在亚种和菌株水平上鉴别微生物分离株。rep-PCR主要应用于细菌,其中乳酸菌方面主要集中在双歧杆菌球菌
[15]
[10]
利用16SrDNA测序和DNA杂交技术研究、芽孢杆菌
[11-12]
、乳杆菌
[13-14]
、肠
了泡菜中乳酸菌的菌群变化,在泡菜(5d)的发酵过程中随机分离了120株乳酸菌,结果发现在发酵的前中期,柠檬明串珠菌(L citreum)是优势种,然而在后期主要为清酒乳杆菌(L sake)或弯曲乳杆菌以及短乳杆菌。WATERJ等
[7]
等。
2 2 3随机扩增多态性DNA技术(RandomAmplifiedPoly-morphicDNA,RAPD)
RAPD作为一种分子标记,具有种属甚至种间特异性。该方法的重现率较低,RAPD技术很难将乳酸菌鉴定到种的水平。现在主要和其他方法一起使用,如ANTON-SSONM等[16]先将分离自奶酪的33株乳酸菌分为10个RAPD型(RAPDtypes),再用温度梯度凝胶电泳(Temper-atureGradientGelElectrophoresis)技术将这些细菌鉴定到种的水平。CUSICKSM等
[17]
依据16S~23SrRNA的ISR设计的引物鉴定干酪乳
[8]
杆菌,可以区分干酪乳杆菌或类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌以及玉米乳杆菌。SCARPELLINIM等属菌种的鉴定。
但无论是16SrDNA序列还是16S~23SrDNAISR序列分析方法,都是针对乳酸菌基因组的一部分序列进行分析,而不是在全基因组的水平上分析,具有一定的局限性,并且该方法比较耗时,当样本数量很多时,测序费用较高。2 2基于PCR的DNA标记技术
随着DNA标记技术的不断成熟,人们建立了一系列以DNA标记为基础的微生物鉴定和检测技术,根据菌株之间遗传距离所产生的DNA指纹差异来直接反映检测微生物菌株的DNA多态性来对其鉴定和分型。这些技术的最大优势就是可以忽略各种复杂的微生物生长条件,不需要预先培养就可以鉴定和检测。多数研究结果表明,DNA标记分型技术具有从种属到菌株各种水平的鉴别能力,为乳酸菌的快速分子鉴定和分型提供了借鉴2 2 1特异性扩增靶片段
通过设计特异性的引物在一定条件下通过聚合酶链式反应选择性的特异扩增特定的靶DNA片段,理论上讲可以在任何分类水平上对微生物菌株进行区别和鉴定。虽然特异性扩增靶DNA片段可以快速准确地在种和亚种甚至菌株水平鉴定乳酸菌,但是需要较复杂的引物设计策略,并鉴定引物的有效性后才能获得一系列有效的引物。因此这种方法只有在对检测和鉴定的菌株完全了解的情况下,才最为有效和实用。2 2 2基因组短重复序列标记
这类标记主要是指基因组中的分散保守重复DNA元件(InterspersedConservedRepetitiveDNAElements),依据它们在整个细菌基因组DNA中存在多个拷贝进行引物设计。现在已有3类重复性元件得到了确认,即重复基因外回Palimic,
[9]
对Carnobacte-
rium属的现有种的16S~23SrDNA间区分析,能够进行该
利用改进RAPD技术将有
些乳酸菌鉴定到种和菌株的水平。
2 3限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLength
Polymorphism)
RFLP是BOSTEIN在1980年首先提出并最早发展的分子标记技术。该技术是可以用于种内水平鉴定乳酸菌分离株的一种DNA指纹方法。徐艳文等
[18]
使用26S
rDNA-RFLP分析了分离自甘肃莫高葡萄酒厂的29株非酿酒酵母菌,被测菌株被分为10个类型。通过26SrDNAD1/D2区序列分析验证,证明此方法在葡萄酿酒酵母菌种多样性研究中有良好的应用价值。
2 4扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPoly-morphism)
AFLP是最早由荷兰科学家ZABEAU发明并由VOS发展起来的一种分子标记技术,具有比RAPD和RFLP技术更大的优越性。AFLP主要用于流行病学及食品源性病原体毒力指标的测定研究(如李斯特杆菌和沙门菌),也有利用这一技术对种族遗传学上关系密切的菌种(戊糖乳杆菌、植物乳杆菌和类植物乳杆菌)进行种水平的鉴定[19]。
2 5电泳核型标记技术(EK)
电泳核型标记技术是利用脉冲场凝胶电泳(PulsedFieldGelElectrophoresis,PFGE)将用稀有位点酶(rare-cu-ttingenzymes)对菌株完整的基因组DNA进行消化后的大片段DNA进行分离生的DNA片段。
[21]
[20]
。
。乳酸菌的核糖体分型技术是利
用限制性内切酶消化DNA后,再用rDNA探针来检测产
I和21
专论与综述
中 国 酿 造
2009年第6期总第207期
3
株单核细胞增多性李斯特菌菌株基因组DNA进行酶切,用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法进行遗传多样性分析。结果表明,3株临床分离株(00181、00174和0194)分别存在于亚型A、B、D中;16个单核细胞增多性李斯特菌奶相关和环境分离株主要存在于4个亚型中,其中2个亚型(C、D)均为奶相关分离株(包括原料奶、均质奶(储奶罐)和成品奶分离株,而加工厂地面污水分离株为独立的一个亚型(A))。
2 6温度梯度凝胶电泳(TemperatureGradientGelElectro-phoresis,TGGE)/变性梯度凝胶电泳(Denaturinggra-dientgelelectrophoresis,DGGE)
TGGE技术的优点是可以从凝胶中切下谱带,然后通过测序分析来揭示群落成员系统发育的从属关系,进一步可以用类群特异探针同群落图谱杂交,检测出特异细菌种群的存在。
与TGGE技术相似的还有变性梯度凝胶电泳DGGE,是FISCHER和LERMAN于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。它的分辨精度比聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可以检测到一个核苷酸水平的差异。
MUYZER等
[22]
2 8扩增性rDNA限制性酶切片段分析(amplifiedriboso-malDNArestrictionanalysis,ARDRA)
ARDRA方法是1992年建立的,此方法不受菌株是否纯培养的限制,不受宿主的干扰,具备特异性强、效率高的特点,已广泛应用于微生物的分类、鉴定、分析及揭示微生物的多样性和系统发育关系的研究。
MICHELC等
[29]
使用该技术对不同来源的22种菌进
[30]
行分析,探讨了鱼及其生存环境中乳酸菌的多样性,探明了其中存在的乳酸菌。GIRAFFAG等
使用全基因序
列和ARDRA分析方法对干酪中的乳酸菌进行分析,为描述瑞士乳杆菌的微生物生态系提供了基础。RACHMANCN等
[31]
的实验证实当对16S~23SrDNA相近的乳酸菌使用
RFLP技术进行鉴定时可以很好地将香肠乳杆菌、消化乳杆菌、弯曲乳杆菌和植物乳杆菌区分开来。
3FtsZ(filamentoustemperature-sensitiveproteinZ)
FtsZ是一种广泛存在于细菌和古菌中的结构保守的蛋白质,在细胞分裂的过程中起关键的作用,是真核生物中微管蛋白的类似物。研究表明,FtsZ具有GTPase的活性,其N端的一段300多个氨基酸残基的肽段是GTP的结合位点和水解位点,且氨基酸序列比较保守,适用于细菌系统学研究。张斌等
[32]
发现DGGE只能对微生物群落中数量
大于1%的优势种群进行分析;梯度凝胶及电泳条件也很难适合所有微生物的DNA,不同菌的DNA扩增片段在电泳中可能走到相同的位置。
DGGE/TGGE带谱中每条带可能代表一个不同的微生物物种,电泳带谱中条带的数量反映环境微生物菌落中优势类群的数量
[23]
通过PCR扩增FtsZ基因的一
段800bp的核苷酸,构建了干酪乳杆菌-片球菌及相关乳酸菌的FtsZ蛋白系统发育树。将此系统树和16SrDNA系统树比较,发现二者的拓扑结构非常相似。在2个基因系统树中,片球菌与乳杆菌的种均显示较近的亲缘关系,而与其他球状的乳酸菌(如链球菌和肠球菌)的亲缘关系较远。研究还表明FtsZ蛋白序列分辨率>16SrDNA,更适用于乳酸菌种间的系统分类研究。4电子鼻(Electronicnose)
电子鼻是利用气体传感器阵列的响应曲线来识别气味的电子系统,可以在几小时、几天甚至数月的时间内连续、实时地监测特定位置的气味状况。电子鼻与普通的化学仪器(如色谱仪、光谱仪等)不同,得到的不是被测样品各种成分的定性和定量结果,而是给予样品中挥发成分的整体信息,也就是 指纹数据 。其不仅可以对不同样品的气味信息进行简单的比对分析,而且可以通过采集标样信息建立数据库,利用化学计量学的统计分析方法对未知样品进行定性和定量分析。
MARILLEYL等
[33]
。目前,DGGE和TGGE被广泛用于食
[24]
品和其他样品中的乳酸菌检测,是很有前景的直接鉴定方法。FAVIERCF等菌群的情况。
2 7DNA杂交和DNA探针技术
WEONHY等
[25]
应用DGGE技术通过观察2例新
生婴儿10个多月粪样菌群的动态变化来了解婴幼儿胃肠
研究表明,要在种的水平上鉴定新
的菌株,采用DNA杂交技术确定DNA的相似性是十分可取的。尽管这种方法在种的鉴定上具有一定的优势,但是耗时耗力,影响了该技术的推广应用。
WAYNES等
[26]
研究结果表明,DNA的相似性在70%
以上可以认为是同一个种;而JOHNSON等认为DNA的相似性在20%~60%可以认为是属的水平上相关的。DU-TOIT等利用DNA杂交技术从297株乳杆菌中成功筛选出了益生菌。LYHSU等MANEROG等
[28]
[27]
利用基于电子鼻技术的质谱分析
应用核糖体分型技术成功鉴系统对乳酸菌的挥发性化合物进行评估,得到的分类鉴定结果与用分子生物学方法得到的结果相同。这种方法可用于区分样品中的细菌群落,发现新的能够产生气定了真空包装食品中的296个乳酸菌分离株;GARCIA-应用基因组DNA探针成功鉴定了从酒
4
2009No.6SerialNo.207
ChinaBrewing
ForumandSummary
5分子荧光光谱法(Molecularfluorescencespectroscopy)
荧光是受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。分子荧光光谱法又称为荧光光谱法或荧光分析法,是以物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析,以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析。
AMMORS等
[34]
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利用乳酸菌样品内所含物质的3种
激发光:250nm(氨基酸+核酸)、316nm(NADH)、380nm(NAD),数据的分析采用主成分分析法和因子判别式法,分别在种、类、种类水平上对所收集到的乳酸菌样品进行分离鉴定。内在的荧光可作为一种经济有效的手段来鉴定野生型乳酸菌。6总结与展望
表型、生物化学鉴定方法耗时耗力,而且培养条件的改变可能导致结果发生改变,很不稳定,且仍是表观的,很难反映生物的遗传本质
[35]
;分子标记技术快速、准确、
灵敏,但是通过对各个研究方法的比较,会发现不同方法检测到的乳酸菌种类多样性结果可能不完全一致,这说明各种方法都有一定的选择性和局限性。目前还没有一种技术能单独胜任对乳酸菌的鉴定,只有把各种方法结合起来进行比较研究,尤其是将传统方法和分子生物学方法、新兴的方法等结合起来使用,才会得到比较满意的结果,使乳酸菌的分类、鉴定更为准确、便捷。参考文献:
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[8],.D
专论与综述
中 国 酿 造
2009年第6期总第207期
5
中国酒曲微生物研究进展
荣瑞金
1,2
,李祖明
1*
,王德良,白志辉,李鸿玉,荣瑞芬,叶 磊
34111
(1 北京联合大学师范学院,北京100011;2 山西省杏花村汾酒集团有限责任公司汾青分厂,山西孝义032300;
3 中国食品发酵工业研究院,北京100027;4 中国科学院生态环境研究中心,北京100085)
摘 要:综述了中国酒曲微生物在分离与鉴定、组成、性能和育种方面的研究进展,并简单介绍了中国酒曲微生物在酿酒工业、乳酸和单细胞蛋白生产、功能保健食品与食品添加剂、酶制剂等领域的应用,最后展望了中国酒曲微生物研究的广阔前景。关 键 词:中国酒曲;微生物;研究进展
中图分类号:TS261 1 文献标识码:A 文章编号:0254-5071(2009)06-0005-04
ResearchprogressonmicroorganismsinChineseliquorQu
RONGRuijin,LIZuming,WANGDeliang,BAIZhihui,LIHongyu,RONGRuifen,YELei
1,2
1*
3
4
1
1
1
(1.TeacherCollegeofBeijingUnionUniversity,Beijing100011,China;2.FenqingBranchFactoryofShanxiXinghuacunFenChiew(Group)Co.,Ltd,Xiaoyi032300,China;3.ChinaNationalResearchInstituteofFoodandFermentationIndustry,Beijing100027,China;4.ResearchCenterforEco-EnviromentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China)Abstract:Thespecificflavor,highqualityandrecoveryrateofChineseliquorwascloselyrelatedtothemicroorganismsinChineseliquorQu.The
researchprogressinisolationandidentification,composition,performanceandscreeningofthemicroorganismsinChineseliquorQuwassumma-rized,aswellastheapplicationofthemicroorganismsinChineseliquorQuinthefieldsofliquor-makingindustry,productionoflacticacidandsingle-cel-lprotein,functionalfoodandfoodadditives,enzymepreparation.AndthevastrangeofprospectsfortheresearchonmicroorganismsinChineseliquorQuwasforecasted.Keywords:ChineseliquorQu;microorganism;researchprogress
用曲酿酒是中国酒的特色,在世界酿酒史上独树一帜,是我国的一项伟大发明。日本著名酿酒专家板口谨一郎先生曾经评论: 中国发明酒曲酿酒,其影响之大,堪与中国四大发明相比 。传统的微生物工艺过程(如食
收稿日期:2009-02-06
基金项目:北京市属市管高校人才强教计划资助项目
[1]
品、饮料发酵和废物处理)几乎都是多种微生物共同作用的结果,如传统的制曲是多种微生物进入曲料竞争生存,能适应制曲环境的保存下来,并生长繁殖,积累了丰富的代谢产物和种类繁多的酶系的过程
[2]
。酒曲是中国酒酿
作者简介:荣瑞金(1962-),男,山西孝义人,主要从事白酒生产及技术管理工作;李祖明*,讲师,通讯作者。
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