第27卷第8期2010年8月
沈 阳 药 科 大 学 学 报
Journal of Shenyang Phar m aceutical U niversity
V ol 127
N o 18
A ug 12010p 1669
文章编号:100622858(2010) 0820669206
聚合物胶束口服吸收机制的研究进展
陈 东, 丁平田, 邓意辉
(沈阳药科大学药学院, 辽宁沈阳100016)
摘要:目的对聚合物胶束作为口服给药载体的研究方法和吸收机制进行综述。方法参考近年来
国内外文献共19篇, 总结有关聚合物胶束作为口服给药载体的研究, 对其中涉及到的口服吸收机制做以分类和总结。结果目前在聚合物的口服吸收常用的研究方法有Caco 22细胞模型、小肠翻转模型和动物模型, 共同作为研究聚合物口服吸收机制的手段。聚合物胶束作为药物载体口服的吸收机制分为:a 1通过抑制P 2糖蛋白增加吸收; b 1以胞饮形式吸收; c 1经被动扩散; d 1与胆汗相关的吸收。结论对聚合物胶束作为口服给药载体的研究方法和吸收机制进行了报道, 为聚合物口服研究提供了参考。
关键词:聚合物胶束; 口服; 生物利用度; 吸收机制中图分类号:R 94 文献标志码:A
药方式, 因为它服用和携带方便, 所接受, 患者来说, 途径。此外, , 细胞毒性剂类药物的口服比注射给药更适合长期用药, 可以达到更好的疾病治疗效果。
人体的胃、肠液的成分复杂, 由胆汁、离子、脂
[1]
类、胆固醇和各种酶等成分组成。用于口服的药物, 其活性成分应该首先溶解在人体的胃肠道
[2]
的液体中才有可能被人体吸收。因此, 药物的溶解性会直接影响口服给药的药效。
“高通量筛选”带给我们更多新的活性成分, 为了增强对受体的亲和力, 候选药物通常都携带一个亲脂性基团, 因此很多药物的水溶性并不理想。对这些药物来说, 药物的溶解度问题就成为其在胃肠道吸收的限制因素。为此, 药剂工作者针对脂溶性药物开发了一系列新的给药系统, 包括微粉化、复合物、固体分散体、脂质系统、表面活性剂和聚合物胶束等, 来提高难溶性药物的溶解度和溶出速度, 以改善难溶性药物的生物利用[3-4]度。其中, 聚合物胶束是一种很有前途的给药系统。
聚合物胶束(poly meric m icelles ) 由两亲性聚合物组成, 是当聚合物的浓度超过临界胶束浓度
on, C MC ) 后自发形成
, 根据聚合物结构和浓度的不
[5]
同可以具有不同形态, 一般来说, 作为药物载体的聚合物胶束为典型的核2壳结构, 大小在几十
[6]
到几百纳米范围内。目前, 聚合物胶束的研究
[7]
大多集中在注射给药, 因为它具有体积小(
本文作者将对目前国内外提出的聚合物胶束的口服吸收机制进行综述, 并归纳和总结在机制研究中使用的方法和模型。
1 用于研究聚合物胶束吸收机制的
方法和模型
科学合理的方法和模型是研究聚合物在人体胃肠道内吸收机制的基础。研究方法一般要求对聚合物能够准确的定性、定量, 以跟踪其体内外行为和分布; 适当的模型可以模拟口服吸收过程中胃肠道内的吸收屏障和生理环境, 弥补人体实验
收稿日期:2009211202
基金项目:国家重点基础研究发展计划资助项目(2009CB903302) 作者简介:陈东(19832) , 女(汉族) , 山东枣庄人, 博士研究生, E 2ma il chendong . ph @gm ail . com; 丁平田(19692) , 男(汉族) , 山东临朐人, 副教授, 主要从事药物新剂型研究, Tel . [1**********]5, E 2ma il dingp ingtian @yahoo . com. cn 。
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[11-12]
的局限性, 其结果则可用于预测聚合物胶束口服
后人体内的吸收、分布、代谢和排泄过程。111 聚合物的定量方法聚合物的分子量很大, 一般在几千至几万道尔顿范围内, 常用的药物定量分析方法对聚合物并不适用。在体内、外模型中, 通常在聚合物的某个基团上接上示踪剂, 以测定其行为。示踪剂, 是指为观察、研究和测定某物质在指定过程中的行为或性质而加入的一种标记物。作为示踪剂, 其性质或行为在试验过程中与被示踪物应完全相同或差别极小; 示踪剂的加入量应当很小, 对体系性质不产生显著的影响。此外, 示踪剂必须容易被探测。聚合物分析中常见的有同位素示踪剂、荧光标记示踪剂等。11111 荧光物质标记
荧光物质标记是聚合物常用的一种标记的方法, 在荧光检测器下, 的荧光, 。holkar , 二醇2聚(glycol 2phos 2phatidylethanola m PEG 2PE ) 胶束进行标记, 观
并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。在
细胞培养条件下, 可以形成连续的单层细胞。Ca 2co 22细胞与人体小肠上皮细胞在形态学上相似, 具有相同的细胞极性和紧密连接, 可以进行药物的跨膜转运实验。此细胞模型具有相对简单、重复性较好、应用范围较广的特点。在使用Caco 22细胞研究聚合物的透过实验的时候, 为了使结果有效、可信, 需要对细胞完整性以及材料和药物对其的毒性等进行考察, 在此基础上再研究其透膜行为。具体内容和方法如下:11211 细胞完整性考察
在使用Caco 22细胞模型时, 需要保证单层细胞的完整性, 经上皮细胞电阻的测定(trans 2ep i 2thelial electrical ) 就可以对其完整, , , 就意味着[的测定, 一般在透膜实验前以, 测得的电阻数值没有改变才能保证透膜实验数据的真实性。11212 细胞毒性试验
生物相容性好的材料和制剂不应破坏正常细胞的结构, 细胞毒性试验是常用来评价原料药或材料对单层细胞的安全性。在研究胶束透膜机制的方法中, 常用于评价细胞毒性的方法有红细胞溶血试验、乳酸脱氢酶检测、MTS 法, 其中MTS 法细胞毒试验是一种测定活细胞数量的比色法, 使用该法时, 利用细胞数与光密度(op 2tics density, OD ) 为线性关系, 定量评价细胞存活率。MTS 是32(4, 52di m ethylthiaz ol 222yl ) 252(32carboxy methoxyphenyl ) 222(42sulf ophenyl ) 22H 2tet 2raz oliu m ) 的简称。11213 细胞膜流动性测定
[12]
[9, 13]
[11]
察到了该聚合物在Caco 22细胞模型中的分布。
他将若丹明(rhoda m ine ) 标记的磷脂酰乙醇胺加入到聚乙二醇2聚磷脂酰乙醇胺中, 制备荧光标记的胶束, 在荧光显微镜下发现胶束分布在细胞核处, 累计量呈时间依赖性, 并随时间增加而增加。11112 同位素标记
“同位素标记”近些年来也越来越多的使用在聚合物的示踪试验。Mathot 等人应用同位素标
[9-10]
记的方法, 研究了聚乙二醇2聚(己内酯2co 2三甲基碳酸酯) [poly (ethyleneglycol ) 7502poly (cap 2r olact one 2co 2tri m ethylene carbonate ) , mmePEG 750P (CL 2co 2T MC ) ]胶束在Caco 22细胞模型以及大鼠
[8]
在体模型中的行为, 并用此方法得出结论, 即这种聚合物胶束可以通过饱和转运机制透过Caco 22单层细胞膜, 在大鼠体内的口服生物利用度为
14
40%。在他的实验中, 将C 标记的单体加入到反应原料中, 经过聚合反应成为聚合物的一部分, 因此更为稳定, 也更加准确的反应聚合物本身的性质。
112 Caco 22细胞模型
Caco 22细胞模型是目前国内外广泛采用的一种研究药物小肠吸收的体外模型, 其来源于人的直肠癌细胞, 结构和功能类似于人小肠上皮细胞,
正常细胞的磷脂双分子层处于动态平衡状态, 某些药物或载体材料会影响其流动性从而改变对药物的吸收行为。Zastre 等人利用荧光探针的方法, 采用荧光各向异性测定(fluores 2cence anis otr opy measurements ) , 分别考察了聚乙二醇2聚己内酯(methoxypolyethylene glycol 2b 2polycap rolact one, M ePEG 172b 2PCL 5) 对细胞膜中脂溶性部分(磷脂酰) 和极性部分的流动性的影响, 结果说明, 这种聚合物会降低Caco 22细胞膜的流动性。11214 透膜试验
Caco 22细胞模型主要用来考察口服给药时药
[12]
第8期陈 东等:聚合物胶束口服吸收机制的研究进展671
物在胃肠道中是否可以透过细胞膜, 并对透膜机
制进行探讨, 以预测在体吸收情况。试验时, 可以在单层细胞膜的顶侧或者底外侧给药, 间隔一段时间后, 在另一侧测定聚合物的量, 用来测定顶侧
[3, 9]
到底侧或反方向的透膜量。通过测定不同温度、时间条件下, 不同浓度药物的透过量, 或者在能量缺失、破坏胞间连接、抑制P 2糖蛋白的条件下进行测定, 预测药物的透膜机制。113 大鼠小肠翻转模型
在细胞中的分布, 是造成细胞对化疗药物耐药的
主要原因。P 2糖蛋白是药物流出转运蛋白中的一种, 它的分子量为170k Da, 为跨膜转运蛋白, 由多药耐药基因编码, 广泛存在于肠、肺、肾、肝、血脑屏障和胎盘中。肠道中的P 2糖蛋白位于极性上皮细胞(肠细胞) 的刷状缘膜上, 这个关键性的部位会限制很多外源性物质的口服吸收。除P 2糖蛋白外, 还有一些其他多药耐药性蛋白也会影响药物的生物利用度。
目前, 克服P 2糖蛋白活性的方法主要是药物与P 2糖蛋白抑制剂合用。P 2糖蛋白抑制剂包括维拉帕米、环孢菌素A 、环孢菌素衍生物等, 它们通常经过竞争性或非竞争性阻止底物和P 2糖蛋白结合。P 蛋白的化合物是, 280、聚氧乙烯P 2糖蛋白的, 目前一般认为, 表面活性剂可, 改变细胞膜结构, 从而增加细胞膜流动性, 此外表面活性剂还可以降低P 2糖
[16]
蛋白ATP 酶的活性。
Lev B r omberg 的研究小组在考察Plur onic 2P AA (泊洛沙姆2聚丙烯酸) 的时候发现, 在水溶液
中Plur onic 2P AA 可以与细胞膜作用, 同时抑制P
[17]
2糖蛋白, 从而增加所载药物2阿霉素的吸收。Zastre 等人的研究结果表明
[13, 18]
大鼠小肠翻转模型可以用来研究聚合物口服
后在肠道中的吸收情况, 同时可以考察聚合物胶束的粘附性。通常来说, 载体材料具有粘附性可以延长药物与粘膜的接触时间, 从而有利于药物的吸收, 因为人体胃肠道上皮细胞表面存在一个不流动水层, 是疏水性药物吸收的一个主要屏障, 要让胶束透过粘膜层, 必须提高胶束与内皮的接触时间来释放药物。胃肠道表面的滞留时间, 面的接触, [11]
的基团。Sezgin 用该模型研究了聚乙二醇2聚磷脂酰乙醇胺胶束的口服吸收和粘附性能。结果说明, 该种聚合物具有良好的粘附性, 但在该模型中药物的透膜性并不理想。114 动物在体模型
:低分子量的
一般来说, 聚合物胶束口服给药研究包括体外试验和在体试验, 这两部分内容结合就可以比较完整地评价聚合物胶束作为口服给药载体的效果。其中, 动物在体模型能够更全面地模拟人体口服聚合物胶束后的吸收、分布、代谢、排泄过程。在该模型中, 通常将口服给药与注射给药相对比, 然后分别测定实验动物血液、尿液、组织及粪便中的药量以及聚合物的量, 由得到的药代动力学数
[3-4, 14-15]
据分析和评价聚合物的在体内行为。动物在体模型研究的对象通常包括:血液、组织、尿液、粪便等, 给药后分别测定其中聚合物的量并绘制浓度2时间曲线, 从这条曲线上就可以了解聚合物口服后在动物体内的吸收、分布、代谢、排泄情况。
MePEG 2b 2PCL 可以提高P 2糖蛋白底物2若丹明在Caco 22细胞中的聚集性, 同时减小其从细胞底外
侧向细胞表面透过。因此, 抑制P 2糖蛋白可能是聚合物胶束提高生物利用度的机制之一。212 以胞饮形式吸收
C MC (临界胶束浓度) 值是两亲性聚合物的
一个重要参数, 它是指两亲性聚合物在水溶液自发形成胶束的临界浓度。在Caco 22细胞模型的研究中, 很多研究者都发现, 在C MC 值以下的时候, 聚合物并不能显著提高药物透过单层细胞的量, 而当细胞顶侧的聚合物浓度接近或超过C MC 值时, 药物在细胞中的累积量就会增加。而当聚合物的浓度进一步增加的时候, 细胞中的累计药
[9, 13]
量又会降低。
Zastre 等人以若丹明作为模型药物进行研究
2 聚合物胶束口服吸收机制
211 通过抑制P 2糖蛋白增加吸收
药物流出转运蛋白是ATP 2结合盒(ATP 2
binding cassette ) 大家族中的一员, 它会改变药物
时发现, 当聚合物浓度低于C MC 值时, 细胞中几乎没有发现若丹明的存在, 而当聚合物浓度为C MC 值的4～100倍时, 若丹明在细胞中的累积量逐渐增加。因此, 他认为聚合物分子具有抑制
672沈 阳 药 科 大 学 学 报第27卷
P 2糖蛋白的作用。当聚合物浓度在C MC 值以下
的时候, 分配进入细胞膜的聚合物单体量比较少,
而当浓度大于C MC 的时候, 有更多的单体进入细胞膜, 所以细胞中聚集的药量就增加。因此得出
[18]
结论:该胶束是通过胞饮作用透过细胞膜的。他们的实验结论后来被Dabholkar 等人利用荧光
[19]
标记的方法再次证明。
Mathot 等人使用了多种ATP 抑制剂, 在能量耗尽的条件下考察了在C MC 值以上以及C MC 值以下的聚合物透膜情况。结果发现, 当浓度在C MC 值以下时, 细胞中能量的耗尽对透膜量没有影响, 而当浓度在C MC 以上的时候, 能量耗尽会减少透膜量, 因此说, 聚合物胶束是以胞饮作用透过单层细胞膜的。213 被动扩散
作为口服给药载体的聚合物, 除聚合物胶束外, 还有以单体形式存在的聚合物单体, 膜。
Mathot (parallel ar 2tificial me mbrane assay (P AMP A ) ) 考察两亲性聚合物单体透过单层细胞膜的机制, 发现mme PEG 750P (CL 2co 2T MC ) 在低浓度的时候通过被动扩散的机制透过细胞膜。当聚合物浓度在C MC 值以下时, 只有聚合物单体存在, 此时表观渗透系数与聚合物的浓度成正比, 符合Fick ′s 定
[9-10]
律, 从逻辑上解释了被动扩散的假设。
两亲性聚合物以被动扩散的形式透过脂质双分子层可能是由于干扰了脂质屏障的结构。
[19]
De m ina 等人认为, 两亲性聚合物的一些特殊性质使其能够影响脂质双分子层, 包括较长的疏水性片段、比磷脂大的分子量和适度的疏水度, 这些性质可以影响细胞膜中的脂质双分子层, 从而增加聚合物本身以及所载药物透过细胞膜的量。而这些性质, 恰恰与Mathot 等人的mmePEG 750P 研究结果一致。
214 与胆汁相关的吸收
哺乳动物胃肠道摄取特定的脂溶性物质是个很复杂的系统, 其中包括对脂溶性维生素和胆固醇这类物质的吸收。在吸收过程中, 食物中的脂肪通过脂肪酶水解成脂溶性弱的产物, 如脂肪酸和单酰甘油。胆汁主要由磷脂和胆酸组成, 可以起到增溶的作用, 它们与脂肪降解产物一起形成胶束, 使脂溶性物质通过肠细胞吸收。从这一点(CL 2co 2T MC )
[9-10]
[9]
上来说, 人体的胆汁有可能与口服给药中胶束的
吸收有关。
Hasselt 等人研究了维生素K 在mPEG 50002b 2p (HP MAm 2Lac 2) [methoxypolyethylene glycol 2b 2po 2ly 2(22hydr oxyp r opyl ) 2methacryla m ide dilactate ]胶
[4]
束中的口服吸收, 结果发现, 维生素K 的吸收依赖于胆酸的存在。在给予维生素K 胶束制剂后, 胆管结扎的大鼠血浆中维生素K 的水平要显著低于未进行胆管结扎的大鼠。对胆管结扎的大鼠在给予胶束制剂的同时给予胆酸, 吸收又得到恢复。他因此认为, 胶束的吸收依赖于胆汁, 虽然不能够排除胶束可能以胞饮形式吸收, 但不会是主要方式。
3, 其吸收机制也。许多胶束口服的研究小组都在进行吸收机制的探讨, 但至今还没有形式统一的观点。近年来在关于胶束口服研究的相关文献中, 吸收机制研究的模型大致分为Caco 22细胞模型、大鼠小肠翻转模型和动物在体模型。对于聚合物胶束制剂提高难溶性药物的口服生物利用度的吸收机制, 目前主要提出了四种假设, 即:①抑制肠道上皮的P 2糖蛋白, 增加药物透过细胞膜的量; ②通过胞饮作用将包裹在胶束内部的药物吸收; ③改变细胞膜的流动性, 聚合物和从胶束中解析释放的药物都以被动扩散的形式透过细胞膜; ④在胆汁的协同作用下吸收。
聚合物胶束作为一种新兴的口服给药体系, 具有很多优势, 已知和未知的一切都激励着我们进行更多、更全面、更深入的研究, 并不断地完善和发展这一系统, 使之真正成为难溶性药物口服给药的载体。参考文献:
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Advances on the ora l absorpti on of poly m er i c m i 2
celles
674沈 阳 药 科 大 学 学 报第27卷
CH EN D ong, D I N G Ping 2tian, D EN G Y i 2hu i
(School of Pha r m acy, Shenyang Pha r m aceutica l U niversity, Shenyang 110016, C h ina )
Abstract:O bjecti ve To summ arize the m ethods and m echanis m s involved in researches about o ral polym er 2
ic m icelles . M ethods A ccording to the polym eric m icelles w ith regard to carrier of o ral up take, the oral ab 2sor p tion of polym eric m icelles w ere classified and review ed on the basis of pub lished literatures . Results C a 2co 22cells, reverted rat intestine, and an i m al m odel can be used as comm on m odels to investigate the absorp 2tion m echanis m fo r oral polym eric m icelles . W ith these m odels, four m echanism s had been introduced to ex 2p lain the phenom enon related to m icelles absor p tion, i . e . inhib ition on P 2gp, p inocytosis, si m p le passive dif 2fusion and the oral up take w ith the influence of the bile . Conclusi on s The m ethods and m echanis m s involved in researches about oral p olym eric m icelles are review ed, and this article w ill p rovide references for the stud 2ies of polym eric m icelles for oral adm inistration .
Key words:poly meric m icelles; oral adm inistrati on; bi oavailability; abs or p ti on m (上接第651页)
ZHAN G C ong , W AN G Shao 2jie , M A R ong G , T ian 2hong
(11School of P ha r m acy, Shenyang Pha l 110016, C h ina; 21School of Pha r 2
m aceutica l Eng ineering, Shenyang 110016, C hina )
12111
Abstract:O an H PL C m ethod for deter m ining the con ten t of febuxostat and its related
substances . M ethods The deter m ination of febuxostat and the separation of its related substances w as p er 2for m ed on a C 18colum n (200mm ×416mm , 5μm ) . The m obile phase w as m ethanol 2acetonitrile 20105%(φ) phosp horic acid (V ∶V ∶V =24∶46∶30) . The flow rate w as 110mL ・m in . U ltraviolet absorp tion detector w as set at 315nm and colum n tem perature w as 35℃. Results The linear range of febuxostat w as bet w een
-1
1517and 9413m g ・L
-1
(r =019998) . The average recovery w as 10015%w ith RSD of 110%.The related
substances of febuxostat could be com p letely separated from febuxostat . The li m it of detection (LOD ) w as
015ng . Conclusi on s The m ethod is si m p le and accurate fo r quality contro l of the febuxostat . Key words:febuxostat; HP LC; related substance
第27卷第8期2010年8月
沈 阳 药 科 大 学 学 报
Journal of Shenyang Phar m aceutical U niversity
V ol 127
N o 18
A ug 12010p 1669
文章编号:100622858(2010) 0820669206
聚合物胶束口服吸收机制的研究进展
陈 东, 丁平田, 邓意辉
(沈阳药科大学药学院, 辽宁沈阳100016)
摘要:目的对聚合物胶束作为口服给药载体的研究方法和吸收机制进行综述。方法参考近年来
国内外文献共19篇, 总结有关聚合物胶束作为口服给药载体的研究, 对其中涉及到的口服吸收机制做以分类和总结。结果目前在聚合物的口服吸收常用的研究方法有Caco 22细胞模型、小肠翻转模型和动物模型, 共同作为研究聚合物口服吸收机制的手段。聚合物胶束作为药物载体口服的吸收机制分为:a 1通过抑制P 2糖蛋白增加吸收; b 1以胞饮形式吸收; c 1经被动扩散; d 1与胆汗相关的吸收。结论对聚合物胶束作为口服给药载体的研究方法和吸收机制进行了报道, 为聚合物口服研究提供了参考。
关键词:聚合物胶束; 口服; 生物利用度; 吸收机制中图分类号:R 94 文献标志码:A
药方式, 因为它服用和携带方便, 所接受, 患者来说, 途径。此外, , 细胞毒性剂类药物的口服比注射给药更适合长期用药, 可以达到更好的疾病治疗效果。
人体的胃、肠液的成分复杂, 由胆汁、离子、脂
[1]
类、胆固醇和各种酶等成分组成。用于口服的药物, 其活性成分应该首先溶解在人体的胃肠道
[2]
的液体中才有可能被人体吸收。因此, 药物的溶解性会直接影响口服给药的药效。
“高通量筛选”带给我们更多新的活性成分, 为了增强对受体的亲和力, 候选药物通常都携带一个亲脂性基团, 因此很多药物的水溶性并不理想。对这些药物来说, 药物的溶解度问题就成为其在胃肠道吸收的限制因素。为此, 药剂工作者针对脂溶性药物开发了一系列新的给药系统, 包括微粉化、复合物、固体分散体、脂质系统、表面活性剂和聚合物胶束等, 来提高难溶性药物的溶解度和溶出速度, 以改善难溶性药物的生物利用[3-4]度。其中, 聚合物胶束是一种很有前途的给药系统。
聚合物胶束(poly meric m icelles ) 由两亲性聚合物组成, 是当聚合物的浓度超过临界胶束浓度
on, C MC ) 后自发形成
, 根据聚合物结构和浓度的不
[5]
同可以具有不同形态, 一般来说, 作为药物载体的聚合物胶束为典型的核2壳结构, 大小在几十
[6]
到几百纳米范围内。目前, 聚合物胶束的研究
[7]
大多集中在注射给药, 因为它具有体积小(
本文作者将对目前国内外提出的聚合物胶束的口服吸收机制进行综述, 并归纳和总结在机制研究中使用的方法和模型。
1 用于研究聚合物胶束吸收机制的
方法和模型
科学合理的方法和模型是研究聚合物在人体胃肠道内吸收机制的基础。研究方法一般要求对聚合物能够准确的定性、定量, 以跟踪其体内外行为和分布; 适当的模型可以模拟口服吸收过程中胃肠道内的吸收屏障和生理环境, 弥补人体实验
收稿日期:2009211202
基金项目:国家重点基础研究发展计划资助项目(2009CB903302) 作者简介:陈东(19832) , 女(汉族) , 山东枣庄人, 博士研究生, E 2ma il chendong . ph @gm ail . com; 丁平田(19692) , 男(汉族) , 山东临朐人, 副教授, 主要从事药物新剂型研究, Tel . [1**********]5, E 2ma il dingp ingtian @yahoo . com. cn 。
670沈 阳 药 科 大 学 学 报第27卷
[11-12]
的局限性, 其结果则可用于预测聚合物胶束口服
后人体内的吸收、分布、代谢和排泄过程。111 聚合物的定量方法聚合物的分子量很大, 一般在几千至几万道尔顿范围内, 常用的药物定量分析方法对聚合物并不适用。在体内、外模型中, 通常在聚合物的某个基团上接上示踪剂, 以测定其行为。示踪剂, 是指为观察、研究和测定某物质在指定过程中的行为或性质而加入的一种标记物。作为示踪剂, 其性质或行为在试验过程中与被示踪物应完全相同或差别极小; 示踪剂的加入量应当很小, 对体系性质不产生显著的影响。此外, 示踪剂必须容易被探测。聚合物分析中常见的有同位素示踪剂、荧光标记示踪剂等。11111 荧光物质标记
荧光物质标记是聚合物常用的一种标记的方法, 在荧光检测器下, 的荧光, 。holkar , 二醇2聚(glycol 2phos 2phatidylethanola m PEG 2PE ) 胶束进行标记, 观
并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。在
细胞培养条件下, 可以形成连续的单层细胞。Ca 2co 22细胞与人体小肠上皮细胞在形态学上相似, 具有相同的细胞极性和紧密连接, 可以进行药物的跨膜转运实验。此细胞模型具有相对简单、重复性较好、应用范围较广的特点。在使用Caco 22细胞研究聚合物的透过实验的时候, 为了使结果有效、可信, 需要对细胞完整性以及材料和药物对其的毒性等进行考察, 在此基础上再研究其透膜行为。具体内容和方法如下:11211 细胞完整性考察
在使用Caco 22细胞模型时, 需要保证单层细胞的完整性, 经上皮细胞电阻的测定(trans 2ep i 2thelial electrical ) 就可以对其完整, , , 就意味着[的测定, 一般在透膜实验前以, 测得的电阻数值没有改变才能保证透膜实验数据的真实性。11212 细胞毒性试验
生物相容性好的材料和制剂不应破坏正常细胞的结构, 细胞毒性试验是常用来评价原料药或材料对单层细胞的安全性。在研究胶束透膜机制的方法中, 常用于评价细胞毒性的方法有红细胞溶血试验、乳酸脱氢酶检测、MTS 法, 其中MTS 法细胞毒试验是一种测定活细胞数量的比色法, 使用该法时, 利用细胞数与光密度(op 2tics density, OD ) 为线性关系, 定量评价细胞存活率。MTS 是32(4, 52di m ethylthiaz ol 222yl ) 252(32carboxy methoxyphenyl ) 222(42sulf ophenyl ) 22H 2tet 2raz oliu m ) 的简称。11213 细胞膜流动性测定
[12]
[9, 13]
[11]
察到了该聚合物在Caco 22细胞模型中的分布。
他将若丹明(rhoda m ine ) 标记的磷脂酰乙醇胺加入到聚乙二醇2聚磷脂酰乙醇胺中, 制备荧光标记的胶束, 在荧光显微镜下发现胶束分布在细胞核处, 累计量呈时间依赖性, 并随时间增加而增加。11112 同位素标记
“同位素标记”近些年来也越来越多的使用在聚合物的示踪试验。Mathot 等人应用同位素标
[9-10]
记的方法, 研究了聚乙二醇2聚(己内酯2co 2三甲基碳酸酯) [poly (ethyleneglycol ) 7502poly (cap 2r olact one 2co 2tri m ethylene carbonate ) , mmePEG 750P (CL 2co 2T MC ) ]胶束在Caco 22细胞模型以及大鼠
[8]
在体模型中的行为, 并用此方法得出结论, 即这种聚合物胶束可以通过饱和转运机制透过Caco 22单层细胞膜, 在大鼠体内的口服生物利用度为
14
40%。在他的实验中, 将C 标记的单体加入到反应原料中, 经过聚合反应成为聚合物的一部分, 因此更为稳定, 也更加准确的反应聚合物本身的性质。
112 Caco 22细胞模型
Caco 22细胞模型是目前国内外广泛采用的一种研究药物小肠吸收的体外模型, 其来源于人的直肠癌细胞, 结构和功能类似于人小肠上皮细胞,
正常细胞的磷脂双分子层处于动态平衡状态, 某些药物或载体材料会影响其流动性从而改变对药物的吸收行为。Zastre 等人利用荧光探针的方法, 采用荧光各向异性测定(fluores 2cence anis otr opy measurements ) , 分别考察了聚乙二醇2聚己内酯(methoxypolyethylene glycol 2b 2polycap rolact one, M ePEG 172b 2PCL 5) 对细胞膜中脂溶性部分(磷脂酰) 和极性部分的流动性的影响, 结果说明, 这种聚合物会降低Caco 22细胞膜的流动性。11214 透膜试验
Caco 22细胞模型主要用来考察口服给药时药
[12]
第8期陈 东等:聚合物胶束口服吸收机制的研究进展671
物在胃肠道中是否可以透过细胞膜, 并对透膜机
制进行探讨, 以预测在体吸收情况。试验时, 可以在单层细胞膜的顶侧或者底外侧给药, 间隔一段时间后, 在另一侧测定聚合物的量, 用来测定顶侧
[3, 9]
到底侧或反方向的透膜量。通过测定不同温度、时间条件下, 不同浓度药物的透过量, 或者在能量缺失、破坏胞间连接、抑制P 2糖蛋白的条件下进行测定, 预测药物的透膜机制。113 大鼠小肠翻转模型
在细胞中的分布, 是造成细胞对化疗药物耐药的
主要原因。P 2糖蛋白是药物流出转运蛋白中的一种, 它的分子量为170k Da, 为跨膜转运蛋白, 由多药耐药基因编码, 广泛存在于肠、肺、肾、肝、血脑屏障和胎盘中。肠道中的P 2糖蛋白位于极性上皮细胞(肠细胞) 的刷状缘膜上, 这个关键性的部位会限制很多外源性物质的口服吸收。除P 2糖蛋白外, 还有一些其他多药耐药性蛋白也会影响药物的生物利用度。
目前, 克服P 2糖蛋白活性的方法主要是药物与P 2糖蛋白抑制剂合用。P 2糖蛋白抑制剂包括维拉帕米、环孢菌素A 、环孢菌素衍生物等, 它们通常经过竞争性或非竞争性阻止底物和P 2糖蛋白结合。P 蛋白的化合物是, 280、聚氧乙烯P 2糖蛋白的, 目前一般认为, 表面活性剂可, 改变细胞膜结构, 从而增加细胞膜流动性, 此外表面活性剂还可以降低P 2糖
[16]
蛋白ATP 酶的活性。
Lev B r omberg 的研究小组在考察Plur onic 2P AA (泊洛沙姆2聚丙烯酸) 的时候发现, 在水溶液
中Plur onic 2P AA 可以与细胞膜作用, 同时抑制P
[17]
2糖蛋白, 从而增加所载药物2阿霉素的吸收。Zastre 等人的研究结果表明
[13, 18]
大鼠小肠翻转模型可以用来研究聚合物口服
后在肠道中的吸收情况, 同时可以考察聚合物胶束的粘附性。通常来说, 载体材料具有粘附性可以延长药物与粘膜的接触时间, 从而有利于药物的吸收, 因为人体胃肠道上皮细胞表面存在一个不流动水层, 是疏水性药物吸收的一个主要屏障, 要让胶束透过粘膜层, 必须提高胶束与内皮的接触时间来释放药物。胃肠道表面的滞留时间, 面的接触, [11]
的基团。Sezgin 用该模型研究了聚乙二醇2聚磷脂酰乙醇胺胶束的口服吸收和粘附性能。结果说明, 该种聚合物具有良好的粘附性, 但在该模型中药物的透膜性并不理想。114 动物在体模型
:低分子量的
一般来说, 聚合物胶束口服给药研究包括体外试验和在体试验, 这两部分内容结合就可以比较完整地评价聚合物胶束作为口服给药载体的效果。其中, 动物在体模型能够更全面地模拟人体口服聚合物胶束后的吸收、分布、代谢、排泄过程。在该模型中, 通常将口服给药与注射给药相对比, 然后分别测定实验动物血液、尿液、组织及粪便中的药量以及聚合物的量, 由得到的药代动力学数
[3-4, 14-15]
据分析和评价聚合物的在体内行为。动物在体模型研究的对象通常包括:血液、组织、尿液、粪便等, 给药后分别测定其中聚合物的量并绘制浓度2时间曲线, 从这条曲线上就可以了解聚合物口服后在动物体内的吸收、分布、代谢、排泄情况。
MePEG 2b 2PCL 可以提高P 2糖蛋白底物2若丹明在Caco 22细胞中的聚集性, 同时减小其从细胞底外
侧向细胞表面透过。因此, 抑制P 2糖蛋白可能是聚合物胶束提高生物利用度的机制之一。212 以胞饮形式吸收
C MC (临界胶束浓度) 值是两亲性聚合物的
一个重要参数, 它是指两亲性聚合物在水溶液自发形成胶束的临界浓度。在Caco 22细胞模型的研究中, 很多研究者都发现, 在C MC 值以下的时候, 聚合物并不能显著提高药物透过单层细胞的量, 而当细胞顶侧的聚合物浓度接近或超过C MC 值时, 药物在细胞中的累积量就会增加。而当聚合物的浓度进一步增加的时候, 细胞中的累计药
[9, 13]
量又会降低。
Zastre 等人以若丹明作为模型药物进行研究
2 聚合物胶束口服吸收机制
211 通过抑制P 2糖蛋白增加吸收
药物流出转运蛋白是ATP 2结合盒(ATP 2
binding cassette ) 大家族中的一员, 它会改变药物
时发现, 当聚合物浓度低于C MC 值时, 细胞中几乎没有发现若丹明的存在, 而当聚合物浓度为C MC 值的4～100倍时, 若丹明在细胞中的累积量逐渐增加。因此, 他认为聚合物分子具有抑制
672沈 阳 药 科 大 学 学 报第27卷
P 2糖蛋白的作用。当聚合物浓度在C MC 值以下
的时候, 分配进入细胞膜的聚合物单体量比较少,
而当浓度大于C MC 的时候, 有更多的单体进入细胞膜, 所以细胞中聚集的药量就增加。因此得出
[18]
结论:该胶束是通过胞饮作用透过细胞膜的。他们的实验结论后来被Dabholkar 等人利用荧光
[19]
标记的方法再次证明。
Mathot 等人使用了多种ATP 抑制剂, 在能量耗尽的条件下考察了在C MC 值以上以及C MC 值以下的聚合物透膜情况。结果发现, 当浓度在C MC 值以下时, 细胞中能量的耗尽对透膜量没有影响, 而当浓度在C MC 以上的时候, 能量耗尽会减少透膜量, 因此说, 聚合物胶束是以胞饮作用透过单层细胞膜的。213 被动扩散
作为口服给药载体的聚合物, 除聚合物胶束外, 还有以单体形式存在的聚合物单体, 膜。
Mathot (parallel ar 2tificial me mbrane assay (P AMP A ) ) 考察两亲性聚合物单体透过单层细胞膜的机制, 发现mme PEG 750P (CL 2co 2T MC ) 在低浓度的时候通过被动扩散的机制透过细胞膜。当聚合物浓度在C MC 值以下时, 只有聚合物单体存在, 此时表观渗透系数与聚合物的浓度成正比, 符合Fick ′s 定
[9-10]
律, 从逻辑上解释了被动扩散的假设。
两亲性聚合物以被动扩散的形式透过脂质双分子层可能是由于干扰了脂质屏障的结构。
[19]
De m ina 等人认为, 两亲性聚合物的一些特殊性质使其能够影响脂质双分子层, 包括较长的疏水性片段、比磷脂大的分子量和适度的疏水度, 这些性质可以影响细胞膜中的脂质双分子层, 从而增加聚合物本身以及所载药物透过细胞膜的量。而这些性质, 恰恰与Mathot 等人的mmePEG 750P 研究结果一致。
214 与胆汁相关的吸收
哺乳动物胃肠道摄取特定的脂溶性物质是个很复杂的系统, 其中包括对脂溶性维生素和胆固醇这类物质的吸收。在吸收过程中, 食物中的脂肪通过脂肪酶水解成脂溶性弱的产物, 如脂肪酸和单酰甘油。胆汁主要由磷脂和胆酸组成, 可以起到增溶的作用, 它们与脂肪降解产物一起形成胶束, 使脂溶性物质通过肠细胞吸收。从这一点(CL 2co 2T MC )
[9-10]
[9]
上来说, 人体的胆汁有可能与口服给药中胶束的
吸收有关。
Hasselt 等人研究了维生素K 在mPEG 50002b 2p (HP MAm 2Lac 2) [methoxypolyethylene glycol 2b 2po 2ly 2(22hydr oxyp r opyl ) 2methacryla m ide dilactate ]胶
[4]
束中的口服吸收, 结果发现, 维生素K 的吸收依赖于胆酸的存在。在给予维生素K 胶束制剂后, 胆管结扎的大鼠血浆中维生素K 的水平要显著低于未进行胆管结扎的大鼠。对胆管结扎的大鼠在给予胶束制剂的同时给予胆酸, 吸收又得到恢复。他因此认为, 胶束的吸收依赖于胆汁, 虽然不能够排除胶束可能以胞饮形式吸收, 但不会是主要方式。
3, 其吸收机制也。许多胶束口服的研究小组都在进行吸收机制的探讨, 但至今还没有形式统一的观点。近年来在关于胶束口服研究的相关文献中, 吸收机制研究的模型大致分为Caco 22细胞模型、大鼠小肠翻转模型和动物在体模型。对于聚合物胶束制剂提高难溶性药物的口服生物利用度的吸收机制, 目前主要提出了四种假设, 即:①抑制肠道上皮的P 2糖蛋白, 增加药物透过细胞膜的量; ②通过胞饮作用将包裹在胶束内部的药物吸收; ③改变细胞膜的流动性, 聚合物和从胶束中解析释放的药物都以被动扩散的形式透过细胞膜; ④在胆汁的协同作用下吸收。
聚合物胶束作为一种新兴的口服给药体系, 具有很多优势, 已知和未知的一切都激励着我们进行更多、更全面、更深入的研究, 并不断地完善和发展这一系统, 使之真正成为难溶性药物口服给药的载体。参考文献:
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Advances on the ora l absorpti on of poly m er i c m i 2
celles
674沈 阳 药 科 大 学 学 报第27卷
CH EN D ong, D I N G Ping 2tian, D EN G Y i 2hu i
(School of Pha r m acy, Shenyang Pha r m aceutica l U niversity, Shenyang 110016, C h ina )
Abstract:O bjecti ve To summ arize the m ethods and m echanis m s involved in researches about o ral polym er 2
ic m icelles . M ethods A ccording to the polym eric m icelles w ith regard to carrier of o ral up take, the oral ab 2sor p tion of polym eric m icelles w ere classified and review ed on the basis of pub lished literatures . Results C a 2co 22cells, reverted rat intestine, and an i m al m odel can be used as comm on m odels to investigate the absorp 2tion m echanis m fo r oral polym eric m icelles . W ith these m odels, four m echanism s had been introduced to ex 2p lain the phenom enon related to m icelles absor p tion, i . e . inhib ition on P 2gp, p inocytosis, si m p le passive dif 2fusion and the oral up take w ith the influence of the bile . Conclusi on s The m ethods and m echanis m s involved in researches about oral p olym eric m icelles are review ed, and this article w ill p rovide references for the stud 2ies of polym eric m icelles for oral adm inistration .
Key words:poly meric m icelles; oral adm inistrati on; bi oavailability; abs or p ti on m (上接第651页)
ZHAN G C ong , W AN G Shao 2jie , M A R ong G , T ian 2hong
(11School of P ha r m acy, Shenyang Pha l 110016, C h ina; 21School of Pha r 2
m aceutica l Eng ineering, Shenyang 110016, C hina )
12111
Abstract:O an H PL C m ethod for deter m ining the con ten t of febuxostat and its related
substances . M ethods The deter m ination of febuxostat and the separation of its related substances w as p er 2for m ed on a C 18colum n (200mm ×416mm , 5μm ) . The m obile phase w as m ethanol 2acetonitrile 20105%(φ) phosp horic acid (V ∶V ∶V =24∶46∶30) . The flow rate w as 110mL ・m in . U ltraviolet absorp tion detector w as set at 315nm and colum n tem perature w as 35℃. Results The linear range of febuxostat w as bet w een
-1
1517and 9413m g ・L
-1
(r =019998) . The average recovery w as 10015%w ith RSD of 110%.The related
substances of febuxostat could be com p letely separated from febuxostat . The li m it of detection (LOD ) w as
015ng . Conclusi on s The m ethod is si m p le and accurate fo r quality contro l of the febuxostat . Key words:febuxostat; HP LC; related substance