第五章 酶工程技术
【典型案例】
图1 啤酒生产线 图2 石油泄漏污染海湾
案例1：酶制剂在啤酒生产中的应用
酶制剂在啤酒生产中的应用较为广泛，酶制剂的使用，能降低啤酒生产成本，在液化、糖化、啤酒澄清、防腐以及防止老化过程中应用效果明显。辅料淀粉的液化一般选用 a-淀粉酶，a-淀粉酶可将淀粉液化成可溶于水的糊精、低聚糖、麦芽糖以及葡萄糖。糖化过程中，辅料的糊化醪（液化）和麦芽中淀粉受到麦芽中水解酶及外加酶制剂作用，形成以麦芽糖为主的可发酵性糖。这一过程添加的酶有：β-淀粉酶、糖化酶、支链淀粉酶、半纤维素酶等。啤酒在贮存过程中，由于环境条件的作用，如光照、氧气、震动等，会产生浑浊、沉淀等现象。此类浑浊的形成，和啤酒中残留的蛋白质关系密切，严重影响啤酒的质量和在市场上的竞争力。添加蛋白酶可分解啤酒中的大分子蛋白质，有效去除啤酒中的沉淀物，澄清过程中主要用到的酶有木瓜蛋白酶、、生姜蛋白酶和中性蛋白酶。超氧化物歧化酶和葡萄糖氧化酶可防止啤酒中风味老化物质的前提被氧自由基氧化而造成啤酒老化。同时，为了啤酒防腐保鲜，可在啤酒生产的发酵期、包装过程中添加少量溶菌酶，溶菌酶可作用于革兰氏阳性菌细胞胞壁的 N-乙酰胞壁酸与N-脱氢基葡萄糖之间β-1,4糖苷键，从而破坏细菌细胞壁，使细菌溶解死死亡，但对啤酒酵母不起作用。
案例2：酶制剂在石油废水处理中的应用
石油是含有多种烃类（正烷烃、支链烷烃、芳烃、环烃）及少量其他有机物（硫化物、氮化物、酸类）的复杂混合物。2013年底发生的黄岛石油管道爆炸
事件导致胶州湾近1万平方米海域受到石油污染，每年因油轮失事、油田漏油、喷井等事故流入海洋的石油污染物约有1千万吨。目前针对石油生物降解主要集中于具有较强降解能力的菌株的筛选上，然而这些微生物在海水中的繁殖受各种环境条件的影响，繁殖率很低。石油烃降解酶的分离纯化不仅是石油降解工程菌构建的基础，还可直接用于石油的生物降解，提高石油生物降解的效率。目前常用的石油烃降解酶包括甲烷单加氧酶、环羟基化双加氧酶、邻苯二酚双加氧酶、萘双加氧酶等。
以上是酶工程技术在食品生产技术和环境保护方面的二个案例。通过广泛学习和调研，我们还可以了解更多的酶工程技术在我们日常生活中发挥的重要作用。
第一节 概述
一、酶的概念及酶的研究意义
酶是具有生物催化功能的生物大分子，按照其化学组成，可以分为蛋白质类酶（P 酶）和核酸类酶（R 酶）。蛋白类酶主要由蛋白质组成，核酸类酶主要由核糖核酸（RNA ）组成。
目前已发现的酶有7000种以上。它们分布于细胞的不同细胞器中，催化细胞生长代谢过程中的各种生物化学反应。在直径不足2µm 的细菌细胞中，就有1000多种酶参与生物催化反应。细胞生命代谢中的化学反应都是在酶的催化作用之下进行的。没有酶的存在，生命就会停止。
酶与生物科学密切相关。酶既是分子生物学研究的重要对象，又是研究生物学的重要工具。酶作为基因的切割工具具有独到的作用，它能够用于基因分离与重组。在基因工程研究中，多种工具酶相继发现，使得基因体外操作成为现实。工具酶成为基因工程的三大重要支撑技术之一。
对酶的深入研究推动了多种学科的发展，产生了多个交叉新学科。20世纪以来，先后形成了生物化学、生物技术、生物有机化学、生物无机化学、以及仿生学等。其中生物技术占有核心地位，其研究与应用推动了工业、农业、食品环保、医药卫生甚至国防航天事业的快速发展，成为21世纪发展的主导学科之一。酶工程作为生物技术的分支，在上述领域的发展中起到了十分重要的作用。
二、酶的研究简史
据资料记载，4000多年前的夏禹时代已经出现酿酒技术，酒是酵母发酵的产物，是酵母细胞内酶作用的结果。公元10世纪，我国人民发明了通过霉菌发酵将豆类做成豆酱；3000年前使用麦曲制造饴糖和使用曲类治疗消化不良都是利用淀粉酶和水解酶的作用。
真正出现酶的概念是1878年。当时德国的Kuhne 将从麦芽中分离出来的一种能够水解淀粉的物质称为“Enzyme ”，后来被翻译为“酶”。1896年德国人Buchner 兄弟发现酵母的破碎细胞分离液体与完整酵母一样具有将葡萄糖降解为乙醇和二氧化碳的作用，他们将该物质称为酒化酶。因此比较公认的看法是，酶学的研究是从1896年Buchner 兄弟的实验开始的。
20世纪初，酶学得到了迅速发展。一是发现酶的种类越来越多，二是开展了对酶的作用机理研究，如酶反应的条件与反应机制等，同时发现了辅酶在酶催化反应中的重要意义。Michaelis Menton 于1913年提出了酶促反应动力学原理——米氏学说。1926年，Summer 从刀豆中得到脲酶结晶，经过反复实验证实，酶本身就是一种蛋白质。在后来获得多种酶的结晶后人们接受了Summer 的结论。1947年Summer 获得诺贝尔化学奖。与此同时，运用X 射线衍射分析，人们相继弄明确了溶菌酶、胰凝乳蛋白酶等多种酶的结构和作用机制。
20世纪中期，针对酶在反应中表现出来的相对专一性和绝对专一性，Koshland 提出了“诱导契合”学说。Monod 提出了“变构模型”，解释了酶的调控机制。
1969年我国科学家首次人工合成具有生物活性的牛胰岛素，这一成就成为酶学研究的重要里程碑。
基因工程技术的诞生为酶的研究和发展带来了一次重要的机遇。DNA 定点突变技术可以改变酶的活性及专一性。特别是酶活性中心的氨基酸残基的变化对酶
的作用是十分显著的。
1982年，Cech 等人发现核酸也具有生物催化功能。“核酶”（ribozyme ）概念的出现对于传统的“酶是具有催化功能的蛋白质”的表述是极大的挑战。人们接受了核酸具有催化功能的事实，最终将酶定义为“酶是具有生物催化功能的生物大分子”。
现在酶的应用领域越来越广。食品工业、医药卫生、轻纺化工、环保等领域都是酶的重点开发方向。酶的应用改变了人们的生活。如在日常生活中使用的加酶洗衣粉，同一般的洗衣粉相比，加酶洗衣粉中含有蛋白质和脂肪酶等多种酶，去除汗渍和油污的能力比传统的洗衣粉强了许多倍。酶的应用同时促进了酶工程的发展。
三、酶工程技术
所谓酶工程，就是在一定的生物反应器中，利用酶的催化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术。而且酶工程在生物工程占极其重要的地位，没有酶的作用，任何生物工程技术都不能实现。
概括地说，酶工程包括酶制剂的生产和应用两个方面。
虽然已知酶的种类约7000多种，但实际已被运用于工业生产的仅10余种。已经能够实现工业化生产的酶有淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶等，其中碱性蛋白酶用于加酶洗涤剂，占酶销售额的首位，青霉素固化酶用于医疗，占世界用量的第二位。
在初期酶制剂主要来源于动植物材料，今天酶的来源主要来自微生物。生产酶制剂的过程包括酶的产生、提取、纯化和固定化等步骤。
1. 酶的产生、提取和纯化
（1）酶的产生 酶普遍存在于动物、植物和微生物体内。人们最早是从植物的器官和组织中提取酶的。例如，从胰脏中提取蛋白酶，从麦芽中提取淀粉酶；现在，酶大都来自微生物发酵生产，这是因为同植物和动物相比，微生物具有容易培养、繁殖速度快和便于大规模生产等优点。只要提供必要的条件，就可以利用微生物发酵来生产酶。
（2） 酶的提取和纯化 从微生物、动植物细胞中得到含有多种酶的提取液后，为了从混合液中获得所需要的某一种酶，必须将提取液中的其他物质分离，以获得纯化酶的目的。
2. 酶的固定化
酶固定化技术是先将纯化的酶连接到一定的载体上，使用时将被固定的酶投放到反应溶液中，催化反应结束后又能将被固定的酶回收。
固定化酶的技术是1969年日本首先研制成功，现在该方法已经应用到多种酶的生产中。固定化酶一般是呈膜状、颗粒状或粉状的酶制剂，它在一定的空间范围内催化底物反应。
3. 固定化细胞
利用胞内酶制作固定化酶时，先要把细胞打碎，才能将里面的酶提取出来，这就增加了酶制剂生产的工序和成本。直接固定细胞同样可以提供我们所需的酶（胞内酶），因此固定化细胞同样可以代替酶进行催化反应。例如，将酵母细胞吸附到多孔塑料的表面上或包埋在琼脂中，制成的固定化酵母细胞，可以用于酒类的发酵生产。
四、酶制剂的应用
目前随着酶工程技术的发展，酶已经广泛应用于医药卫生、食品加工、环境保护和轻化工业上。如在医药上胰岛素作为治疗糖尿病的常用药品；尿激酶可以用来活化人体内的溶纤维蛋白酶原，使溶纤维蛋白酶原转化为溶纤维蛋白酶，溶化血栓，治疗脑溢血、心肌梗塞、肺动脉阻塞等心脑血管疾病。在食品加工上，利用酶制剂生产产品，可以提高生产效率。如酿酒厂和饮料厂利用果胶酶来澄清果酒和果汁；如用葡萄糖氧化酶可以除去密封饮料和罐头中的氧气，从而有效地防止饮料和食品氧化变质；再如，用木瓜蛋白酶制成的嫩肉粉，可以使肉丝、肉片等烹调后吃起来嫩滑可口等等。在环境保护上，利用固定化多酚氧化酶研制成多酚氧化酶传感器，快速测定出炼油和炼焦工厂排放到河流和湖泊水中的酚量。在化学纺织工业等方面，应用蛋白酶，既加速皮革的浸水、脱毛、软化过程， 改变旧工艺脏、累、臭的状况；在纺织方面，一些纺织原料也可以利用酶制剂进行加工；利用蛋白酶对天然蚕丝进行脱胶，脱胶后的蚕丝具有鲜亮的色泽和柔滑的手感。
酶的应用例子很多，将在后续的章节中重点介绍。
第二节 酶的发酵生产
商业用酶来源于动植物组织和某些微生物。传统上由植物组织提供的酶有蛋
白酶、淀粉酶、氧化酶和其他酶，由动物组织提供的酶主要有胰蛋白酶、脂肪酶和凝乳酶。但是，从动物组织或植物组织大量提取的酶，经常会涉及到技术、经济以及伦理上的问题，许多传统的酶源已远远不能适应当今世界对酶的需求。为了扩大酶源，人们正越来越多地求助于微生物。
微生物作为酶生产的主要来源有以下原因。
①生物生长繁殖快，世代时间短，产量高。②微生物培养方法简单，生产原料来源丰富，价格低廉，机械化程度高, 经济效益高。③微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全。④微生物有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶菌种。
虽然如此，但能够用于酶工业化生产的微生物种类还是十分有限的。主要是使用未经检验的微生物进行生产存在产品毒性与安全性问题。基于这个原因，目前大多数工业微生物酶的生产，都局限于使用仅有的极少数的真菌或细菌。其次，产酶菌株的筛选也有较严格的标准。
一、产酶优良菌种的筛选
1. 优良菌株的标准
优良的产酶菌种是提高酶产量的关键，筛选符合生产需要的菌种是发酵生产酶的首要环节，一个优良的产酶菌种应具备以下特点：
（1）繁殖快、产量高、生产周期短。
（2）适宜生长的底物低廉易得。
（3）产酶性能稳定、不易退化、不易受噬菌体侵袭。
（4）产生的酶容易分离纯化。
（5）安全可靠，非致病菌，不会产生有毒物质。
2．筛选过程
产酶菌种的筛选方法主要包括以下几个步骤：含菌样品的采集，菌种分离，产酶性能测定及复筛等。对于产生胞外酶的菌株，经常采用分离、定性和半定量测定相结合的方法，在分离时就基本能够预测菌株的产酶性能。
胞外酶产酶菌株的筛选操作如下：将酶的底物和培养基混合倒入培养皿中制成平板，然后将待测菌涂布在培养基表面，如果菌落周围的底物浓度发生变化，即证明它产酶。
如果是产生胞内酶的菌株筛选，则可采用固体培养法或液体培养法来确定。①固体培养法。将菌种接入固体培养基中保温数天，用水或缓冲液将酶抽提，测定酶活力，这种方法主要适用于霉菌。②液体培养法。将菌种接入液体培养基后，静置或振荡培养一段时间(视菌种而异) ，再测定培养物中酶的活力，通过比较，筛选出产酶性能较高的菌种继续筛选。
3. 产酶常用的微生物
按照产酶微生物的筛选标准，常用的产酶微生物有以下几类：
（1）细菌 细菌是工业上有重要应用价值的原核微生物。在酶的生产中，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。大肠杆菌可以用于生产多种酶，如谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶等；枯草芽孢杆菌可以生产α-淀粉酶、蛋白酶、碱性磷酸酶等。
（2）放线菌 常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌。链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物，同时也可以生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。
（3）霉菌 霉菌是一类丝状真菌，用于酶生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等，生产的酶种类有糖化酶、果胶酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核酸核糖酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、凝乳酶等20多种酶。
（4）酵母 常用于产酶的酵母有啤酒酵母和假丝酵母。啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产，此外，还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶的生产；假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、转化酶等。
二、基因工程菌株(细胞)
基因工程技术可以将未经批准的产酶微生物的基因或由生长缓慢的动植物细胞产酶的基因，克隆到安全的、生长迅速的、产量很高的微生物体内，形成基因工程菌株，然后发酵生产。基因工程技术还可以通过增加基因的拷贝数，来提高微生物产生的酶数量。目前，世界上最大的工业酶制剂生产厂商丹麦诺维信公司(Novozyme)，生产酶制剂的菌种约有80%是基因工程菌。至今已有100多种酶基因克隆成功，包括尿激酶基因、凝乳酶基因等。
要构建一个具有良好产酶性能的基因工程菌株，必须具备良好的宿主-载体
系统。
理想的宿主应具备以下几个特性：
① 体与宿主相容，携带酶基因的载体能在宿主体内稳定维持； ②菌体容易大规模培养，生长无特殊要求，且能利用廉价的原料；
③所产生的目标酶占总蛋白量的比例较高，且能以活性形式分泌；
④宿主菌对人安全，不分泌毒素。
自然界蕴藏着巨大的微生物资源，在发现的微生物中，有99%的微生物是在实验室内使用常规的培养方法培养不出的微生物。现在人们可以采用新的分子生物学方法直接从这类微生物中探索和寻找有开发价值的新的微生物菌种、基因和酶。目前科学家们热衷于从极端环境条件下生长的微生物中筛选新的酶，主要研究嗜热微生物、嗜冷微生物、嗜盐微生物、嗜酸微生物、嗜硫微生物和嗜压微生物等。这就为新酶种和酶的新功能开发提供了广阔的空间。目前在嗜热微生物的研究方面取得了可喜的进展，例如耐高温的淀粉酶和DNA 聚合酶等已得到广泛的应用。
三、微生物酶的发酵生产
微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基和发酵方式的选择及发酵条件的控制管理等方面的内容。
1. 培养基
(1)碳源 碳源是微生物细胞生命活动的基础，是合成酶的主要原料之一。工业生产上应考虑原料的价格及来源，通常使用各种淀粉及它们的水解物如糊精、葡萄糖等作为碳源。在微生物发酵中，为减少葡萄糖所引起的分解代谢物的阻遏作用，采用淀粉质材料或它们的不完全水解物比葡萄糖更有利。一些特殊的产酶菌需要特殊的碳源才能产酶，如利用黄青霉生产葡萄糖氧化酶时，以甜菜糖蜜作碳源时不产生目的酶，而以蔗糖为碳源时产酶量显著提高。
(2)氮源 氮源可分为有机氮和无机氮。选用何种氮源因微生物或酶种类的不同而不同，如用于生产蛋白酶、淀粉酶的发酵培养基，多数以豆饼粉、花生饼粉等为氮源，因为这些高分子有机氮对蛋白酶的形成有一定程度的诱导作用；而利用绿木霉生产纤维素酶时，应选用无机氮为氮源，因为有机氮会促进菌体的生长繁
殖，对酶的合成不利。
(3)无机盐类 有些金属离子是酶的组成成分，如钙离子是淀粉酶的成分之一，也是芽孢形成所必需的金属离子。无机盐一般在低浓度情况下有利于酶产量的提高，而高浓度则容易产生抑制。
(4)生长因子 生长因子是指细胞生长必需的微量有机物，如维生素、氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱等。有些氨基酸还可以诱导或阻遏酶的合成，如在培养基中添加大豆的酒精抽提物，米曲霉的蛋白酶产量可提高约2倍。
(5)pH 值 在配制培养基时应根据微生物的需要调节pH 。一般情况下，多数细菌、放线菌生长的最适pH 为中性至微碱性，而霉菌、酵母则偏好微酸性。培养基的pH 不仅影响微生物的生长和产酶，而且对酶的分泌也有影响。如用米曲霉生产α-淀粉酶，当培养基的pH 由酸性向碱性偏移时，胞外酶的合成减少，而胞内酶的合成增多。
2. 酶的发酵生产方式
酶的发酵生产方式有两种，一种是固体发酵，另一种是液体深层发酵。固体发酵法用于真菌的酶生产，其中用米曲霉生产淀粉酶，以及用曲霉和毛霉生产蛋白酶在我国已有悠久的历史。这种培养方法虽然简单，但是操作条件不易控制。随着微生物发酵工业的发展，现在大多数的酶是通过液体深层发酵培养生产的。液体深层培养应注意控制以下条件：
(1)温度 温度不仅影响微生物的繁殖，而且也显著影响酶和其他代谢产物的形成和分泌。一般情况下产酶温度低于最适生长温度，例如酱油曲霉蛋白合成酶合成的最适温度为28℃，而其生长的最佳温度为40℃。
(2)通气和搅拌 需氧菌的呼吸作用要消耗氧气，如果氧气供应不足，将影响微生物的生长发育和酶的产生。为提高氧气的溶解度，应对培养液加以通气和搅拌。但是通气和搅拌应适当，以能满足微生物对氧的需求为妥，过度通气对有些酶（如青霉素酰化酶）的生产会有明显的抑制作用，而且剧烈搅拌和通气容易引起酶蛋白变性失活。
(3)pH 的控制 在发酵过程中要密切注意控制培养基pH 的变化。有些微生物能同时产生几种酶，可以通过控制培养基的pH 以影响各种酶之间的比例，例如当利用米曲霉生产蛋白酶时，提高pH 有利于碱性蛋白酶的形成，降低pH 则主要
产生酸性蛋白酶。
3. 提高酶产量的措施
在酶的发酵生产过程中，为了提高酶的产量，除了选育优良的产酶菌株外，还可以采用其他措施，例如添加诱导物、控制阻遏物浓度等。
(1)添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。诱导物一般可分为三类：①酶的作用底物，例如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物；②酶的反应产物，例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生；③酶的底物类似物，例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对β-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。而使用最广泛的诱导物是不参与代谢的底物类似物。
(2)降低阻遏物浓度 微生物酶的生产会受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分批添加碳源的方法使培养基中的碳源保持在不至于引起分解代谢物阻遏的浓度。例如在β-半乳糖苷酶的生产中，只有在培养基中不含葡萄糖时，才能大量诱导产酶。对于受末端产物阻遏的酶，可通过控制末端产物的浓度使阻遏解除。例如，在组氨酸的合成途径中，10种酶的生物合成受到组氨酸的反馈阻遏，若在培养基中添加组氨酸类似物，如2-噻唑丙氨酸，可使这10种酶的产量增加10倍。
(3)表面活性剂 在发酵生产中，非离子型的表面活性剂常被用作产酶促进剂，但它的作用机制尚未明确；可能是由于它的作用改变了细胞的通透性，使更多的酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来，从而打破胞内酶合成的反馈平衡，提高了酶的产量。此外，有些表面活性剂对酶分子有一定的稳定作用，可以提高酶的活力，例如利用霉菌发酵生产纤维素酶，添加1%的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。
（4）添加产酶促进剂 产酶促进剂是指那些能提高酶产量但作用机制尚未阐明的物质，它可能是酶的激活剂或稳定剂，也可能是产酶微生物的生长因子，或有害金属的螯合剂，例如添加植物钙可使多种霉菌的蛋白酶和橘青霉的5ˊ-磷酸二酯酶的产量提高2-20倍。
第三节 酶的提取与分离技术
酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质
分离，而获得所需酶的过程。主要内容包括细胞破碎、酶的提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。
一、细胞破碎
除胞外酶外，绝大多数酶都存在于细胞内部。为了获得细胞内的酶，首先要收集细胞、破碎细胞，让酶从细胞内释放出来，然后进行酶的提取和分离纯化。
细胞的破碎方法可以分为机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶促破碎法等。在实际应用时应当根据具体情况选择适宜的细胞破碎方法，有时也采用两种或者两种以上的方法联合使用，达到较好的破碎效果。
表5-1列出了几种细胞破碎方法及原理。
表5-1 细胞破碎方法及原理
分类
机械破碎法 细胞破碎方法 捣碎法
研磨法
匀浆法
物理破碎法 温度差破碎法
压力差破碎法
超声波破碎法
化学破碎法
酶促破碎法 添加有机溶剂 添加表面活性剂 自溶法
外加酶制剂法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，是细胞外层结构破坏，而使细胞破碎 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而是细胞破碎 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，从而使细胞破碎。 细胞破碎原理 通过机械运动产生的剪切力，是组织、细胞破碎
二、酶的提取
酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶液或溶剂处理含酶原料，使酶溶解到溶剂中来，实际上就是酶的抽提过程。
酶提取时，溶剂的选择与酶的结构和溶解性质有关。一般来说，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶液中，碱性物质易溶于酸性溶液中。
根据酶的结构特点，绝大部分酶都能够溶于水中，通常可以采用稀酸、稀碱、稀盐溶液提取；有些酶与脂类物质结合或者带较多的非极性基团，则采用有机溶剂提取。
表5-2列出了提取酶的各种方法。
表5-2 酶的主要提取方法
提取方法
盐溶液提取
酸溶液提取
碱溶液提取
有机溶剂提取 用于提取的溶剂 0.02-0.5mol/L的盐溶液 pH2-6的水溶液 pH8-12的水溶液 可与水混溶的有机溶剂 提取的酶的性质 在低盐溶液中溶解度较大的酶 在稀酸溶液中溶解度较大且稳定性较好的酶 在稀碱溶液中溶解度较大且稳定性较好的酶 与脂类结合或者含较多非极性基团的酶
为了提高酶的提取效率并防止酶变性失活，在提取过程中要注意控制温度、pH 值等提取条件。
三、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某些物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出与其他溶质分离的技术过程。
沉淀分离的方法主要有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法等。
表5-3列出了各种沉淀法的分离原理。
表5-3 沉淀分离方法
沉淀分离方法
盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 分离原理 利用酶（蛋白质）不同盐浓度下的溶解度不同的原理，使酶或者杂质析出沉淀，从而使酶与杂质分离 利用两性电解质在等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质有不同的等电点的特性，调节溶液的pH 值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的有机溶剂，使酶与杂质沉淀析出，使酶与杂质分离 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离
四、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
根据离心机最大转速的不同，可以分为低速离心机、高速离心机和超速离心机三种。
低速离心机的最大转速在8000rpm 。在酶的分离纯化中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离，也可用于酶的结晶等较大颗粒的分离。
高速离心机的最大转速为（1-2.5）ｘ104 rpm 。在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞碎片和细胞器的分离。为防止高速离心时产生高温导致酶变性失活，
配置冷冻降温装置，称为高速冷冻离心机。
超速离心机的最大转速达到（2.5-12）ｘ104 rpm 。主要用于DNA 、RNA 、蛋白质等生物大分子以及细胞器和病毒的分离纯化；沉降系数和相对分子质量的测定等。超速离心机的要求较高，均配置有冷冻系统、控温系统、真空系统、制动系统和安全系统等。
五、过滤与膜分离
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。可以作为过滤介质的物质有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等。根据过滤介质的不同，过滤可以分为膜过滤和非膜过滤。将粗滤及部分微滤采用高分子膜以外的物质作为过滤介质，称为非膜过滤；而大部分微滤以及超滤、反渗透、透析、电渗析等采用各种高分子膜作为过滤介质，称为膜过滤或膜分离技术。
根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透等四大类。表5-4列出了它们的主要特性。
表5-4 过滤的种类及特性
类别
粗滤
微滤
超滤
反渗透 截留的颗粒大小 >2µm 0.2-2µm 20 Å-2µm
六、层析分离
层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数）的不同，使各组分以不同比例分配在两相中。其中一个相为固定的称为固定相，另一个为流动的称为流动相。当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。
分离酶常用的层析方法有吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等。表5-5列出各种层析方法采用的依据。
表5-5 层析分离方法
层析方法
吸附层析
分配层析
离子交换层析
凝胶层析
亲和层析 分离依据 利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 利用各组分在两相中的分配系数不同而使各组分分离 利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同而达到分离的目的 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中各组分的相对分子质量不同而使各组分分离 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化
层析聚焦 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离
七、电泳分离
带电离子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。物质颗粒在电场中的移动方向为：带正电荷的颗粒向电场的阴极移动；带负电荷的颗粒则向阳极移动；净电荷为零的颗粒在电场中不移动。颗粒在电场中的移动速度主要取决于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和大小的影响。此外还受电场强度、溶液的pH 值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。
电泳的方法有多种。按照使用的支持体的不同，可以分为纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳和等电聚焦电泳等。
在酶学研究中，电泳技术主要用于酶的纯度鉴定、酶的分子质量测定、酶等电点测定以及少量酶的分离纯化。
八、萃取分离
萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取中的两相一般为互不相溶的两个液相或其它流体。
按照两相的组成不同，萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取等。
1. 有机溶剂萃取
有机溶剂萃取的两相分别为水相和有机溶剂相，利用溶质在水和有机溶剂中的溶解度不同而达到分离。用于萃取的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。
2. 双水相萃取
双水相萃取的两相分别为互不相溶的两个水相。利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离。双水相萃取中使用的双水相一般是按一定比例组成的互不相溶的盐溶液和高分子溶液或者两种互不相溶的高分子溶液组成。
3. 超临界萃取
超临界萃取又称为超临界液体萃取，是利用欲分离物质在超临界液体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。超临界流体的物理特性和传质特性介于液体和气体之间，具有和液体同样的溶解能力，其萃取速度很高；但其随温度和压力的变化，超临界流体转变为气体，使萃取的物质很容易从超临界流体中分离出来。在超临界流体中，不同的物质具有不同的溶解度，溶解度大的物质容易与溶
解度少或不溶解的物质分离出来。目前在超临界萃取中最常用的超临界流体是CO 2。CO 2超临界点的温度为31.3℃，超临界压力为7.3MPa, 超临界密度为0.47g·ml -1。特别适合生物活性物质的提取和分离。
九、结晶
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定纯度和浓度。通常在50%以上的纯度才能结晶，纯度越高越容易结晶；同样，浓度也是结晶的一个很重要因素，浓度过低无法析出结晶。此外，在结晶过程中还要控制好温度、pH 值、离子强度等结晶条件，才能得到结构完整、大小均一的晶体。
结晶的方法很多，主要有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法和等电点结晶法等方法。其原理与本章中沉淀分离的原理类似。
十、干燥
干燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分，以获得含水分较少的固体物质的过程。酶经过干燥后，可以提高酶的稳定性，利于产品保存、运输和使用。常用的干燥方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥等。
纤维素酶的分离纯化
纤维素是地球上最丰富的可再生性碳源物质，其降解是自然界碳素循环的中心环节。有效利用纤维素可有效解决能源危机和环境污染等重大问题。采用纤维素酶进行水解是保证无污染地将这些纤维素物质转化成简单糖的关键，是纤维素被彻底分解的有效途径。纤维素酶来源广泛，植物、微生物、软体动物、原生动物、昆虫等都能产纤维素酶。其组分较复杂，主要有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶三种。不同组分的分子量和等电点大多不同，给纤维素酶分离纯化造成了一定的困难。因而，选择适宜的分离纯化方法是降低纤维素酶生产成本、提高纤维素酶活力的主要途径。
目前常用的纤维素酶的分离纯化法包括沉淀法、凝胶层析法、离子交换层析
法、亲和层析法、疏水层析法、电泳分离以及萃取分离法等。这些方法可单独作用来分离纯化纤维素酶，也可组合运用，以达到更好的分离效果。下面以沉淀法和层析法为例说明从黑曲霉中分离纯化纤维素酶的过程。
1. 盐析沉淀
硫酸铵是盐析中最为常用的盐，具有不会使蛋白质变性、盐析能力强、溶解度大等优点。分段硫酸铵盐析需要确定所需硫酸铵的饱和度区间以及溶液的pH 。因此在不同pH 的酶液中加硫酸铵固体至不同饱和度，高速离心后，测沉淀的纤维素酶活力，以此确定最佳硫酸铵饱和度。
2.Sephadex G-100 凝胶柱层析
取上述所得最佳相对饱和度硫酸铵盐析后的沉淀物，溶解于pH 5.0的缓冲溶液中，用滴管小心缓慢加入凝胶柱。滴管口伸入液面下位于柱中央，勿扰动上层凝胶。打开出液口，使酶液慢慢渗入凝胶。待酶液刚刚渗入凝胶时，关闭出液口，用滴管在距胶面2~3处沿柱壁慢慢加入缓冲液，在距胶面5cm 时接上洗脱管，打开出液口，开始洗脱。测各收集管中酶液的蛋白含量及内切酶酶活，以期对纤维素酶初酶液进行初步分离。凝胶层析法是以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中各组分的相对分子质量不同而使各组分分离。但仅根据分子量大小的差别很难将纤维素酶各组分完全分开。因此需要采用离子交换层析对分子量相近的成分进一步分离。
3.DEAE-FF 弱阴离子交换柱层析
1mL 预装柱，pH5.0缓冲液平衡DEAE-FF 弱阴离子交换柱。将经过Sephadex G-100柱层析的内切酶峰值溶液，上阴离子交换柱。含1mol/L NaCl的上述平衡液进行梯度洗脱，洗脱速度为1 mL/min，分步收集器自动收集，每管1mL 。对纤维素酶酶液进行进一步分离。离子交换层析法可进一步将凝胶层析法无法分离的酶组分进行分离，得到纯化倍数更高的酶。
纤维素酶的分离纯化工作非常重要，只有得到纯酶，才能了解其组成、性质及相互关系，并可根据纤维素酶的不同理化性质，开展纤维素酶降解机制的研究，为缓解能源危机和控制环境污染提供技术支持。
第四节 酶分子修饰
酶分子是具有完整的化学结构和空间结构的生物大分子。酶的结构决定了酶的性质和功能。当酶分子的结构发生改变时，将引起酶的性质和功能的改变。
酶分子完整的空间结构给予了酶分子的生物催化功能，使其具有催化高效性、作用专一性和反应条件温和等特点。但另一方面，也是因为酶的分子结构使酶具有稳定性差、活性不高和可能具有抗原性等弱点，限制了酶的应用。因此人们需要进行酶分子修饰的研究。
所谓酶分子修饰，就是通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术。
酶分子修饰的方法多种多样。归纳起来，酶分子修饰主要包括金属离子置换修饰、大分子结合修饰、侧链基团修饰、肽链有限水解修饰、核苷酸链有限水解修饰、氨基酸置换修饰和酶分子物理修饰等。
下面介绍前三种方法。
一、金属离子置换修饰
将酶分子中的金属离子置换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。
通过金属离子置换修饰，可以了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明酶分子的催化作用机制，提高酶活力，增强稳定性，甚至改变酶的某些动力学性质。
有些酶分子中的金属离子，往往是酶活性中心的组成部分，对酶的催化功能起到非常重要的作用。如过氧化氢酶分子中的Fe 2+, 超氧化歧化酶分子中的Cu 2+、Zn 2+等。
若从酶分子中除去所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可使酶的活性降低甚至丧失，有的可以使酶的活性提高或者增加酶的稳定性。如α-淀粉酶分子中大多数含有钙离子，有些含有镁离子或者锌离子。若将镁离子、锌离子置换为钙离子，则结晶的钙型α-淀粉酶活力比一般结晶的杂型α-淀粉酶活力提高3倍以上。
二、大分子修饰置换
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰。
大分子结合修饰具有以下作用。
1. 通过修饰提高酶活力
水溶性大分子与酶的侧链基团通过共价结合后，可使酶的空间构象发生改变，使酶活性中心更有利于与底物结合，并形成准确的催化部位，从而提高酶的活力。例如每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶的活力提高5.1倍。
2. 通过修饰增强酶的稳定性
酶的稳定性可以用酶的半衰期表示。酶的半衰期长，说明酶的稳定性好，反之则差。不同的酶具有不同的半衰期。如超氧化歧化酶在人体血浆中的半衰期只有6-30分钟。而通过聚乙二醇修饰后，半衰期提高到35小时。
3. 消除酶蛋白的抗原性
对人体来讲，来源于动植物或者微生物细胞的酶是一种外源蛋白，往往具有抗原性。进入人体会刺激产生抗体。抗体与抗原结合会使酶失去催化功能。通过酶分子结构修饰，可以降低甚至消除抗原性。如具有抗癌作用的精氨酸酶经过聚乙二醇结合修饰，生成聚乙二醇-精氨酸酶后其抗原性消失，使精氨酸酶很好地发挥了抗癌效能。
三、酶分子的侧链基团修饰
采用一定的化学方法使酶分子的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。
酶的侧链基团修饰可以用于研究酶分子的结构与功能。如侧链基团对酶分子活力与稳定性的影响；对酶的功能的贡献及测定某一基团在酶分子中的数量。
酶的侧链基团修饰的方法很多，主要有氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、胍基修饰、酚基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰、分子内交联修饰等。
第五节 酶的固定化
酶的固定化可以通过多种形式实现。固定化酶、固定化细胞、固定化原生质体都是酶的固定化形式。通常将未经固定的酶或细胞称为游离酶（天然酶）或细
胞，固定的酶称为固定化酶 ，固定的微生物细胞称为固定化细胞。固定化酶(细胞) 用于发酵可称为固定化酶(细胞)
发酵，或简称固定化发酵。
一、固定化的优势
将酶固定在载体上形成固定化酶具有如下优势：
①固定化酶（细胞）可以重复使用。 游离酶(细胞) 与底物作用是一次性的，非连续性的发酵罐发酵也是一次性的，而固定化酶（细胞）与反应物作用可多次使用，有的可达几十、几百次，甚至连续使用几年，尤其是固定化细胞，可以看作是固定化细胞的连续发酵，极大地提高了生产效率，如用固定化梭状芽胞杆菌厌氧条件下连续发酵生产正丁醇和异丙醇，已获得产率高出分批发酵4倍的产量。 ②产物的分离、提纯等后处理比较容易。游离酶与产品混在一起难分离，发酵的产品与大量的菌体和非需要的产物混在一起，分离、纯化工艺难度较大，利用固定化酶和细胞的产物相对少地含有非需要产物和菌体，产品分离容易。
③固定化酶（细胞）一般都做成了球形颗粒或薄片状，使产品的生产工艺操作简化，易于实行机械化和自动化操作，所需的设备和器材也较简易。
④固定化酶（细胞）可以制成酶活力很高或细胞密度很大，而且抗酸、碱、温度变化的性能高，酶活性较稳定。因而反应速度加快，生产周期缩短。
⑤固定化酶与固定化细胞相比，各有所长。固定化酶相对产物更单一，非需要的产物更少些，生产操作条件更易控制；而固定化细胞不需要酶的提取，减少了酶活力的损失和操作，还可以利用细胞中的多酶体系，完成需要多种酶参加的反应。此外固定的细胞可以是死的，也可以是活的。活的细胞在生产过程中可同时增殖，更有利于重复使用和加快反应速度，许多固定化的微生物活细胞，用来处理某些
污水的工艺，一直运转几年，固定化细胞仍可使用。
二、固定化的类型
用不同的载体和不同的操作方法将酶或微生物细胞固定，根据固定化的主要机理，一般分成五类。
①吸附固定化 按照正、负电荷相吸的原理，酶或细胞吸附在载体的表面而被固定(图5-1a) 。例如，用瓷碎片、玻璃球、尼龙网、棉花、木屑、毛发等做载体，经一定操作处理后，将酶或细胞吸附固定在其表面。
②包埋固定化 大分子的有机或无机聚合物，将酶或细胞包裹、载留在凝胶中而被固定(图5-1b) 。例如：可用琼脂、明胶、海藻酸钙、k -角叉菜聚糖、聚丙烯酰胺等做载体，经一定的操作处理后，将酶或细胞包埋在里面。
③共价固定化 酶或细胞与载体通过共价键而被固定(图5-1c) 。例如 ：酶或细胞溶液与含羧酸载体(R-COOH)或氨基载体(R-NH2) ，在缩合剂碳化二亚胺作用下，
经搅拌等处理，而制成固定化酶或细胞。
④交联固定化 采用酶分子或细胞上的化合物基团之间在双功能基团交联剂作用下，与载体上的化合基团相互交联呈网状结构而被固定(图5-1d) ，最常用的交联剂是戊二醛。
⑤微囊固定化 用一层亲水性的半透膜将酶或细胞固定在珠状的微囊里(图5-1e) 。例如：用海藻酸钠溶液与酶或细胞混合，滴入CaCl 2溶液中形成凝胶微
珠，然后用聚赖氨酸溶液处理微珠表面，再用柠檬酸去除海藻钙微珠的钙离子，使微珠内海藻酸成液态，酶或细胞悬浮其中，而微珠表面由于受到聚赖氨酸的处理，钙不被去掉，从而不再溶解，形成一层微囊膜，酶或细胞包在微囊中而被固定。
有的固定化酶（细胞）的制作机理既有吸附原理，也有包埋作用或化合键的形成，根据多种原理制成的固定化酶（细胞）其附着力更强，催化效率更好。
三、固定化酶应用存在的问题
固定化技术在微生物工业方面的应用，经以往20多年的研究开发，其优势越来越强，应用面越来越广。固定化酶由于研究开发较早，而且较易控制，比固定化细胞的应用更为广泛和深入。现实中固定化细胞应用于工业化生产与我们的期望还有距离，因此还需要不断拓宽应用范围和改进固定化技术。
存在的主要问题有：
(1)对好氧反应的影响。 好氧反应需要充足的氧气，固定化后的细胞壁和细胞膜，造成了底物或产物进、出的障碍和通气困难，往往严重影响反应速率，导致产量低下。
(2)细胞（酶）与载体的稳定问题。有的固定化细胞容易自溶或污染，或固定化颗粒机械强度差，或细胞（酶）容易从载体脱落，或细胞（酶）的活性很快被抑制，使反复利用次数少，产品质量和数量不稳定。
(3)基础条件问题。固定化酶（细胞）反应动力学及其有关机理、专用设备研究缺乏，也阻碍了该技术的应用。
随着深入的研究开发，特别是分子生物学技术手段的加强，新材料的采用，先进化工工艺的借鉴，计算机的利用，上述问题将会很快解决，微生物工业将发生巨大的变革。我国利用固定化细胞发酵生产酒精和啤酒已取得了很好的经济效益，使我们对固定化细胞的大规模应用充满信心。
固定化酶与我们的日常生活
酶与我们的日常生活息息相关，我们所熟知的加酶洗衣粉中的酶是固定化酶还是游离酶呢？通过前面章节的学习，我们知道固定化酶的制作方法包括包埋法、吸附法和交联法等，并且，固定化酶可重复使用。因此显而易见，加酶洗衣粉当中的酶属于游离酶。那么固定化酶在我们的日常生活中有哪些方面的应用呢？下面主要通过固定化酶在食品工业中的应用来介绍固定化酶与我们日常生活的关系。
1. 固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的应用
固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一种固定化酶，1973年就已应用在工业化生产，它可以用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果糖糖浆。用淀粉生产高果糖浆包含三步：（1）用淀粉酶液化淀粉；（2）用糖化酶将其转化为葡萄糖，即糖化；（3）用葡萄糖异构酶将葡萄糖异构为果糖。由此可得到含果糖55%的高果糖浆，当与蔗糖同等甜度时，其价格要低10%~20%，因此具有经济推动力。高果糖浆用于替代蔗糖，目前世界上的产量约9000kt 。固定化葡萄糖异构酶是固定化酶应用得很成功的工业实例，今后几十年中它将是应用最广，市场份额最大的固定化酶。
2. 固定化酶在柑橘汁加工中的应用
柑桔加工产品出现过度苦味是柑桔加工业中较棘手的问题，苦味物质主要由2类物质组成：一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物（A 和D 环）；另一类为果实中多种黄酮苷，其中柚皮苷为葡萄柚和苦橙等柑桔类果汁中主要的黄酮苷。可以利用不同的固定化酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷，使之转化为不含苦味的物质，从而达到解决柑桔加工产品过度苦味问题的目的。
3. 固定化酶在啤酒澄清中的应用
啤酒以其清晰度高、泡沫适中、营养丰富和口感好得到人们的偏爱。但是，由于啤酒中含有一定量的蛋白质，它会与游离于啤酒中的多酚、单宁等结合产生不溶性胶体或沉淀，造成啤酒混浊，严重影响啤酒的质量。温燕梅等采用吸附—交联法，使胰蛋白酶先吸附于磁性胶体粒子表面，后用戊二醛双功能试剂交联，形成“酶网”裹着载体形成固定化酶，该磁性酶对澄清啤酒防止冷浑浊有明显效果。赵炳超等在戊二醛做交联剂的条件下，以介孔分子筛MCM248作载体固定化木瓜蛋白酶，所得固定化酶的热稳定性有了显著提高，固定化酶的pH 值稳定性和储藏稳定性也有了明显改善。
4. 固定化酶用于水解牛奶中的乳
牛奶中含有4.3%~4.5%的乳糖。患乳糖酶缺乏症的人饮用牛奶后可能出现呕吐、腹泻、烦躁不安等症状。用乳糖酶可以将乳糖分解为组成乳糖的两个单糖：半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反应器可以连续处理牛奶，将乳糖分解，用于连续化生产低乳糖奶，该技术已于1977年实现工业化。此外，乳糖在温度较低时易结晶，用固定化乳糖酶处理后，可以防止其在冰淇淋类产品中结晶，改善口感，增加甜度。固定化乳糖酶还可以用来分解乳糖，制造具有葡萄糖和半乳糖甜味的糖浆。
5. 固定化酶在食品检测以及传感器中的应用
食品中的农药残留分析越来越受到人们的关注，蔬菜中有机磷农药残留的快速检测已成为目前人们研究的热点。应用有机磷农药对胆碱酯酶特异性抑制的酶化学比色分析法已被广泛应用于有机磷农药的定性、定量检测。
5. 固定化酶在传感器中的应用
生物传感器被认为是一种由受体、抗体或酶构成的生物感应层于换能器紧密连接而能提供环境组成信息的感应器。如：测量电流以及电位的酶电极，酶热
敏电阻装置，以场效应管为基础的生物传感器，以及生物发光及化学发光为基础的纤维—光学传感器等，不同的传感器都应用不同类型的固定化酶。
四、固定化技术在食品工业中应用的前景和发展
随着生物技术的迅速发展，固定化酶在工业中的应用日益广泛，从以上黎自可以看出，固定化酶在食品生产中起着举足轻重的作用。除了以上几种典型应用外，固定化酶还可应用于食品中农药残留的检测，以及作为生物传感器的重要部件，与信息科学结合，更高效地服务于我们的生活，生物传感器将在下一章节详细介绍。随着生物技术以及材料、化工、信息技术等各相关学科的发展，我们可以通过发展酶的定向固定化技术、探索新型载体、建立多酶固定化系统和开发新型、高效固定化酶反应器等反方法来增加了酶的稳定性，提高酶的利用效率，更好地为我们的生产、生活服务。
第六节 生物传感器
从上世纪60年代Clark 和Lyon 提出生物传感器的设想开始，生物传感器的发展距今已有40多年的历史了。作为一门在生命科学和信息科学之间发展起来的交叉学科，生物传感器在发酵工艺、环境监测、食品工程、临床医学、军事及军事医学等方面得到了重度重视和发展。随着社会信息化进程的进一步加快，生物传感器必将得到越来越广泛的应用。
一、生物传感器的定义
生物传感器是使用固定化的生物分子结合换能器，用于侦测生物体内或生物体外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置。生物最基本特征之一就是能够对外界的各种刺激作出反应。首先是由于生物体能感受外界的各类刺激信号，并将这些信号转换成体内信息系统所能接收并处理的信号。例如，人能通过眼、耳、鼻、舌、身等感觉器官将外界的光、声、温度及其它各种化学和物理信号转换成人体内神经信息系统能够接收和处理的信号并采取应对措施。现代和未来的信息社会中，信息处理系统要对自然和社会的各种变化作出反应，首先需要通过传感器对外界各种信息的感应并转换成信息系统中的信息处理单元（即计算机）能够接收和处理的信号。
生物传感器的诞生是酶技术与信息技术结合的产物。
二、生物传感器的结构与分类
生物传感器由两个主要关键部分构成。一部分是生物传感器信号接收或产生部分，来自于生物体分子、组织部分或个体细胞的分子辨认组件；另一部分为属于硬件仪器组件部分，主要为物理信号转换组件。
可以根据感受器中所采用的生命物质不同将生物传感器分为组织传感器、细胞传感器、酶传感器等等，也可根据所监测的物理量、化学量或生物量将其命名为热传感器、光传感器、胰岛素传感器等，还可根据其用途统称为免疫传感器、药物传感器等等（如图5-2）。
三、生物传感器的发展历史
第一代生物传感器：1962年Clark 和Lyon 两人首先报道了用葡萄糖氧化酶与氧电极相结合监测葡萄糖的结果，1967年Updike 和Hicks 将葡萄糖氧化酶固定在氧电极表面，成功研制出酶电极，被认为是世界上第一个生物传感器。但这类传感器抗干扰能力差，背景电流打，易受溶液中氧浓度变化的影响。1977年铃木周一等发表了关于对生化需氧量（BOD ）进行快速测定的微生物传感器的报道，并在微生物传感器对发酵过程的控制等方面作了详细的报道，正式提出了对生物传感器的命名。1979年，第一代生物传感器投入医检市场，为美国YSI 公司（维赛仪器公司）生产的血糖测试用酵素电极。YSI 公司的成功上市与80年代电子信息业的蓬勃发展有很密切的关系，并且一举带动了生物传感器的研发热潮。美国Medisense 公司（1995年被雅培公司收购）继续以研发第一代酵素电极为主，1988年公司成功地开发出便携式的电化学血糖仪-Exactechpen ，在第一代生物传感器产品中占有70%以上的市场分额。目前全球每天仍有250万人使用Medisense 的血糖仪。
第二代生物传感器：为克服第一代生物传感器受氧分压影响和H 2O 2过电位
高、干扰多、受氧溶解度限制等，自80年代起人们开始用小分子的电子传递媒介体来代替氧沟通酶的活性中心与电极之间的电子通道，通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化，构造了第二代生物传感器——媒介型生物传感器。第二代的生物传感器代表是1991年上市的瑞典Pharmacia 公司推出的BIAcore 与BIAlite 两项产品。
第三代生物传感器：尽管媒介体型第二代生物传感器有许多优点，人们仍在追求酶与电极间的直接电子转移，因为基于这种原理制备的传感器与氧或其它电子受体无关，无需引入外加媒介体，因此固定化相对简单，无外加毒性物质，是最理想的生物传感器，人们将这种无需外加媒介体的生物传感器称为第三代生物传感器。第三代的生物传感器定位在更具携带式、自动化与实时测定功能。迄今为止，报道较多的主要是过氧化物酶传感器。
四、生物传感器主要应用领域
1．应用于发酵工业
因为发酵过程中常存在酶的干扰物质，并且发酵液往往不是清澈透明的，不适用于光谱等方法测定。而应用微生物传感器则极有可能消除干扰，并且不受发酵液混浊程度的限制。同时，由于发酵工业是大规模的生产，微生物传感器成本低、设备简单的特点、能够排除干扰使其具有极大的优势，所以微生物传感器在发酵工业中得到了广泛的应用。具体表现在下列几个方面：
(1)原材料及代谢产物的测定 微生物传感器可用于原材料如糖蜜、乙酸等的测定，代谢产物如头孢霉素、谷氨酸、甲酸、甲烷、醇类、青霉素、乳酸等的测定。测量的原理基本上都是用适合的微生物电极与氧电极组成，利用微生物的同化作用耗氧，通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量，从而达到测量底物浓度的目的。
(2)微生物细胞总数的测定 在发酵控制方面，一直需要直接测定细胞数目的简单而连续的方法。人们发现在阳极表面，细菌可以直接被氧化并产生电流。这种电化学系统已应用于细胞数目的测定，其结果与传统的菌斑计数法测细胞数是相同的。
(3)代谢试验的鉴定 传统的微生物代谢类型的鉴定都是根据微生物在某种培养基上的生长情况进行的。这些实验方法需要较长的培养时间和专门的技术。微
生物对底物的同化作用可以通过其呼吸活性进行测定。用氧电极可以直接测量微生物的呼吸活性。因此，可以用微生物传感器来测定微生物的代谢特征。这个系统已用于微生物的简单鉴定、微生物培养基的选择、微生物酶活性的测定、废水处理的微生物选择、活性污泥的同化作用试验、生物降解物的确定、微生物的保存方法选择等。
2．应用于食品工业
（1）新鲜度与成熟度的检测 生物传感器可以用来检测食品中营养成分和有害成分的含量、食品的新鲜程度等。如已经开发出来的酶电极型生物传感器可用来分析白酒、苹果汁、果酱和蜂蜜中的葡萄糖含量，从而衡量水果的成熟度。
（2）食品添加剂分析 食品添加剂的种类很多，如甜味剂、酸味剂、抗氧化剂等。将生物传感器用于食品添加剂的分析较为快速准确。亚硫酸盐通常作为食品工业的漂白剂和防腐剂。采用亚硫酸盐氧化酶为敏感材料制成的电流型二氧化硫酶电极可用于测定食品中的亚硫酸含量。
（3）农药残留、重金属分析 应用电化学生物传感器检测残留农药，如对于有机磷农药和氨基甲酸酯类农药，已经开发出一系列用于胆碱酯酶电化学生物传感器。在重金属分析中，选择合适的酶并将其固定在亲和性膜上，结合Clark 氧电极，通过计算氧的消耗量就可以推知重金属的污染程度。
3．应用于医学领域
生物传感器在医学领域也发挥着越来越大的作用：临床上用免疫传感器等生物传感器来检测体液中的各种化学成分，为医生的诊断提供依据；在军事医学中，对生物毒素的及时快速检测是防御生物武器的有效措施。生物传感器已应用于监测多种细菌、病毒及其毒素。生物传感器还可以用来测量乙酸、乳酸、乳糖、尿酸、尿素、抗生素、谷氨酸等各种氨基酸，以及各种致癌和致突变物质。
4．应用于环境监测
环保问题已经引起了全球性的广泛关注，用于环境监测的专业仪器市场也越来越大，如生化需氧量（BOD 值）的测定、各种污染物（常用的重要污染指标有氨、亚硝酸盐、硫化物、磷酸盐、致癌物质与致变物质、重金属离子、酚类化合物）浓度的测定等都已经成功采用了生物传感器进行检测。
未来的生物传感器是怎样的？
近年来，随着生物科学、信息科学和材料科学发展成果的推动，生物传感器技术的发展突飞猛进。但是，目前生物传感器的广泛应用仍面临着许多困难，今后一段时间里，生物传感器的研究工作将主要围绕选择活性强、选择性高的生物传感原件；提高信号检测器的使用寿命；提高信号转化器的使用寿命；生物响应的稳定性和生物传感器的微型化、便携式等问题。可以预见，未来的生物传感器将具有以下特点：
1. 功能更加全面，朝微型化方向发展
未来的生物传感器将进一步涉及医疗保健、食品检测、环境监测、发酵工业的各个领域。当前生物传感器研究中的重要内容之一就是研究能代替生物视觉、听觉和触觉等感觉器官的生物传感器, 即仿生传感器。已报道有植入体内的微小传感器实时监测血糖变化或通过脑电波监测预知癫痫的发作。而且随着微加工技术、纳米技术和芯片技术的进步，生物传感器将不断地朝着微型化方向发展，各种便携式微型生物传感器将不断地出现在人们面前。
2. 智能化和集成化程度更高
未来的生物传感器将会和计算机完美紧密的结合，能够自动采集数据、处理数据，可以更科学、更准确地提供检测结果，实现采样、进样、最终形成检测的自动化系统。同时, 芯片技术将越来越多地进入传感器领域, 实现检测系统的集成化、一体化。
3. 充当密码作用
日前，美国加州大学伯克利分校的科学家正试图通过生物识别传感器来替代传统的密码，他们成功打造出了一款类似于传统耳机的脑电图扫描仪，在进行登陆操作的时候将会根据用户的脑电波进行身份验证从而保证唯一性。
生物识别传感器, 这项技术似乎听着更加玄乎, 但是却已经出现在不少手机之中，例如支持指纹识别的手机已经层出不穷，iPhone 5S和东芝G500等都已经采用了这项技术。为免除用户记忆日益增多的网络密码的烦恼，近日英特尔研究人员在平板电脑中集成一个生物识别传感器，能识别用户手掌上独特的纹理。让笔
记本、平板电脑和智能手机负责识别用户身份，将使各个网站没有必要再次识别，避免在各个网站输入密码。
4. 联用技术
生物传感器将不断与其他分析技术联用，如流动注射技术、色谱等，互相取长补短。
总之，未来的生物传感器技术将朝着微型化、智能化、低成本、高寿命、高灵敏度、强稳定性的方向发展。另一方面，这些特性的改善也会加速生物传感器的市场化、商品化进程。相信在不久的将来，生物传感器必定会给人们的生活带来巨大的变化。
复习思考题：
1．名词解释：酶 酶工程 固定化酶（细胞） 酶活性中心 生物传感器
2．为什么酶的生产主要来源于微生物？
3．如何获得优良的产酶菌株？
4．酶分离纯化的主要技术措施有哪些？
5．酶分子修饰的含义是什么？有何意义？
6．简述酶工程技术在食品工业、医药工业、环保行业等各领域的应用。
7．什么是生物传感器？其工作原理是什么？
8．谈谈酶工程技术与生物技术各个学科之间的关系。
第五章 酶工程技术
【典型案例】
图1 啤酒生产线 图2 石油泄漏污染海湾
案例1：酶制剂在啤酒生产中的应用
酶制剂在啤酒生产中的应用较为广泛，酶制剂的使用，能降低啤酒生产成本，在液化、糖化、啤酒澄清、防腐以及防止老化过程中应用效果明显。辅料淀粉的液化一般选用 a-淀粉酶，a-淀粉酶可将淀粉液化成可溶于水的糊精、低聚糖、麦芽糖以及葡萄糖。糖化过程中，辅料的糊化醪（液化）和麦芽中淀粉受到麦芽中水解酶及外加酶制剂作用，形成以麦芽糖为主的可发酵性糖。这一过程添加的酶有：β-淀粉酶、糖化酶、支链淀粉酶、半纤维素酶等。啤酒在贮存过程中，由于环境条件的作用，如光照、氧气、震动等，会产生浑浊、沉淀等现象。此类浑浊的形成，和啤酒中残留的蛋白质关系密切，严重影响啤酒的质量和在市场上的竞争力。添加蛋白酶可分解啤酒中的大分子蛋白质，有效去除啤酒中的沉淀物，澄清过程中主要用到的酶有木瓜蛋白酶、、生姜蛋白酶和中性蛋白酶。超氧化物歧化酶和葡萄糖氧化酶可防止啤酒中风味老化物质的前提被氧自由基氧化而造成啤酒老化。同时，为了啤酒防腐保鲜，可在啤酒生产的发酵期、包装过程中添加少量溶菌酶，溶菌酶可作用于革兰氏阳性菌细胞胞壁的 N-乙酰胞壁酸与N-脱氢基葡萄糖之间β-1,4糖苷键，从而破坏细菌细胞壁，使细菌溶解死死亡，但对啤酒酵母不起作用。
案例2：酶制剂在石油废水处理中的应用
石油是含有多种烃类（正烷烃、支链烷烃、芳烃、环烃）及少量其他有机物（硫化物、氮化物、酸类）的复杂混合物。2013年底发生的黄岛石油管道爆炸
事件导致胶州湾近1万平方米海域受到石油污染，每年因油轮失事、油田漏油、喷井等事故流入海洋的石油污染物约有1千万吨。目前针对石油生物降解主要集中于具有较强降解能力的菌株的筛选上，然而这些微生物在海水中的繁殖受各种环境条件的影响，繁殖率很低。石油烃降解酶的分离纯化不仅是石油降解工程菌构建的基础，还可直接用于石油的生物降解，提高石油生物降解的效率。目前常用的石油烃降解酶包括甲烷单加氧酶、环羟基化双加氧酶、邻苯二酚双加氧酶、萘双加氧酶等。
以上是酶工程技术在食品生产技术和环境保护方面的二个案例。通过广泛学习和调研，我们还可以了解更多的酶工程技术在我们日常生活中发挥的重要作用。
第一节 概述
一、酶的概念及酶的研究意义
酶是具有生物催化功能的生物大分子，按照其化学组成，可以分为蛋白质类酶（P 酶）和核酸类酶（R 酶）。蛋白类酶主要由蛋白质组成，核酸类酶主要由核糖核酸（RNA ）组成。
目前已发现的酶有7000种以上。它们分布于细胞的不同细胞器中，催化细胞生长代谢过程中的各种生物化学反应。在直径不足2µm 的细菌细胞中，就有1000多种酶参与生物催化反应。细胞生命代谢中的化学反应都是在酶的催化作用之下进行的。没有酶的存在，生命就会停止。
酶与生物科学密切相关。酶既是分子生物学研究的重要对象，又是研究生物学的重要工具。酶作为基因的切割工具具有独到的作用，它能够用于基因分离与重组。在基因工程研究中，多种工具酶相继发现，使得基因体外操作成为现实。工具酶成为基因工程的三大重要支撑技术之一。
对酶的深入研究推动了多种学科的发展，产生了多个交叉新学科。20世纪以来，先后形成了生物化学、生物技术、生物有机化学、生物无机化学、以及仿生学等。其中生物技术占有核心地位，其研究与应用推动了工业、农业、食品环保、医药卫生甚至国防航天事业的快速发展，成为21世纪发展的主导学科之一。酶工程作为生物技术的分支，在上述领域的发展中起到了十分重要的作用。
二、酶的研究简史
据资料记载，4000多年前的夏禹时代已经出现酿酒技术，酒是酵母发酵的产物，是酵母细胞内酶作用的结果。公元10世纪，我国人民发明了通过霉菌发酵将豆类做成豆酱；3000年前使用麦曲制造饴糖和使用曲类治疗消化不良都是利用淀粉酶和水解酶的作用。
真正出现酶的概念是1878年。当时德国的Kuhne 将从麦芽中分离出来的一种能够水解淀粉的物质称为“Enzyme ”，后来被翻译为“酶”。1896年德国人Buchner 兄弟发现酵母的破碎细胞分离液体与完整酵母一样具有将葡萄糖降解为乙醇和二氧化碳的作用，他们将该物质称为酒化酶。因此比较公认的看法是，酶学的研究是从1896年Buchner 兄弟的实验开始的。
20世纪初，酶学得到了迅速发展。一是发现酶的种类越来越多，二是开展了对酶的作用机理研究，如酶反应的条件与反应机制等，同时发现了辅酶在酶催化反应中的重要意义。Michaelis Menton 于1913年提出了酶促反应动力学原理——米氏学说。1926年，Summer 从刀豆中得到脲酶结晶，经过反复实验证实，酶本身就是一种蛋白质。在后来获得多种酶的结晶后人们接受了Summer 的结论。1947年Summer 获得诺贝尔化学奖。与此同时，运用X 射线衍射分析，人们相继弄明确了溶菌酶、胰凝乳蛋白酶等多种酶的结构和作用机制。
20世纪中期，针对酶在反应中表现出来的相对专一性和绝对专一性，Koshland 提出了“诱导契合”学说。Monod 提出了“变构模型”，解释了酶的调控机制。
1969年我国科学家首次人工合成具有生物活性的牛胰岛素，这一成就成为酶学研究的重要里程碑。
基因工程技术的诞生为酶的研究和发展带来了一次重要的机遇。DNA 定点突变技术可以改变酶的活性及专一性。特别是酶活性中心的氨基酸残基的变化对酶
的作用是十分显著的。
1982年，Cech 等人发现核酸也具有生物催化功能。“核酶”（ribozyme ）概念的出现对于传统的“酶是具有催化功能的蛋白质”的表述是极大的挑战。人们接受了核酸具有催化功能的事实，最终将酶定义为“酶是具有生物催化功能的生物大分子”。
现在酶的应用领域越来越广。食品工业、医药卫生、轻纺化工、环保等领域都是酶的重点开发方向。酶的应用改变了人们的生活。如在日常生活中使用的加酶洗衣粉，同一般的洗衣粉相比，加酶洗衣粉中含有蛋白质和脂肪酶等多种酶，去除汗渍和油污的能力比传统的洗衣粉强了许多倍。酶的应用同时促进了酶工程的发展。
三、酶工程技术
所谓酶工程，就是在一定的生物反应器中，利用酶的催化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术。而且酶工程在生物工程占极其重要的地位，没有酶的作用，任何生物工程技术都不能实现。
概括地说，酶工程包括酶制剂的生产和应用两个方面。
虽然已知酶的种类约7000多种，但实际已被运用于工业生产的仅10余种。已经能够实现工业化生产的酶有淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶等，其中碱性蛋白酶用于加酶洗涤剂，占酶销售额的首位，青霉素固化酶用于医疗，占世界用量的第二位。
在初期酶制剂主要来源于动植物材料，今天酶的来源主要来自微生物。生产酶制剂的过程包括酶的产生、提取、纯化和固定化等步骤。
1. 酶的产生、提取和纯化
（1）酶的产生 酶普遍存在于动物、植物和微生物体内。人们最早是从植物的器官和组织中提取酶的。例如，从胰脏中提取蛋白酶，从麦芽中提取淀粉酶；现在，酶大都来自微生物发酵生产，这是因为同植物和动物相比，微生物具有容易培养、繁殖速度快和便于大规模生产等优点。只要提供必要的条件，就可以利用微生物发酵来生产酶。
（2） 酶的提取和纯化 从微生物、动植物细胞中得到含有多种酶的提取液后，为了从混合液中获得所需要的某一种酶，必须将提取液中的其他物质分离，以获得纯化酶的目的。
2. 酶的固定化
酶固定化技术是先将纯化的酶连接到一定的载体上，使用时将被固定的酶投放到反应溶液中，催化反应结束后又能将被固定的酶回收。
固定化酶的技术是1969年日本首先研制成功，现在该方法已经应用到多种酶的生产中。固定化酶一般是呈膜状、颗粒状或粉状的酶制剂，它在一定的空间范围内催化底物反应。
3. 固定化细胞
利用胞内酶制作固定化酶时，先要把细胞打碎，才能将里面的酶提取出来，这就增加了酶制剂生产的工序和成本。直接固定细胞同样可以提供我们所需的酶（胞内酶），因此固定化细胞同样可以代替酶进行催化反应。例如，将酵母细胞吸附到多孔塑料的表面上或包埋在琼脂中，制成的固定化酵母细胞，可以用于酒类的发酵生产。
四、酶制剂的应用
目前随着酶工程技术的发展，酶已经广泛应用于医药卫生、食品加工、环境保护和轻化工业上。如在医药上胰岛素作为治疗糖尿病的常用药品；尿激酶可以用来活化人体内的溶纤维蛋白酶原，使溶纤维蛋白酶原转化为溶纤维蛋白酶，溶化血栓，治疗脑溢血、心肌梗塞、肺动脉阻塞等心脑血管疾病。在食品加工上，利用酶制剂生产产品，可以提高生产效率。如酿酒厂和饮料厂利用果胶酶来澄清果酒和果汁；如用葡萄糖氧化酶可以除去密封饮料和罐头中的氧气，从而有效地防止饮料和食品氧化变质；再如，用木瓜蛋白酶制成的嫩肉粉，可以使肉丝、肉片等烹调后吃起来嫩滑可口等等。在环境保护上，利用固定化多酚氧化酶研制成多酚氧化酶传感器，快速测定出炼油和炼焦工厂排放到河流和湖泊水中的酚量。在化学纺织工业等方面，应用蛋白酶，既加速皮革的浸水、脱毛、软化过程， 改变旧工艺脏、累、臭的状况；在纺织方面，一些纺织原料也可以利用酶制剂进行加工；利用蛋白酶对天然蚕丝进行脱胶，脱胶后的蚕丝具有鲜亮的色泽和柔滑的手感。
酶的应用例子很多，将在后续的章节中重点介绍。
第二节 酶的发酵生产
商业用酶来源于动植物组织和某些微生物。传统上由植物组织提供的酶有蛋
白酶、淀粉酶、氧化酶和其他酶，由动物组织提供的酶主要有胰蛋白酶、脂肪酶和凝乳酶。但是，从动物组织或植物组织大量提取的酶，经常会涉及到技术、经济以及伦理上的问题，许多传统的酶源已远远不能适应当今世界对酶的需求。为了扩大酶源，人们正越来越多地求助于微生物。
微生物作为酶生产的主要来源有以下原因。
①生物生长繁殖快，世代时间短，产量高。②微生物培养方法简单，生产原料来源丰富，价格低廉，机械化程度高, 经济效益高。③微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全。④微生物有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶菌种。
虽然如此，但能够用于酶工业化生产的微生物种类还是十分有限的。主要是使用未经检验的微生物进行生产存在产品毒性与安全性问题。基于这个原因，目前大多数工业微生物酶的生产，都局限于使用仅有的极少数的真菌或细菌。其次，产酶菌株的筛选也有较严格的标准。
一、产酶优良菌种的筛选
1. 优良菌株的标准
优良的产酶菌种是提高酶产量的关键，筛选符合生产需要的菌种是发酵生产酶的首要环节，一个优良的产酶菌种应具备以下特点：
（1）繁殖快、产量高、生产周期短。
（2）适宜生长的底物低廉易得。
（3）产酶性能稳定、不易退化、不易受噬菌体侵袭。
（4）产生的酶容易分离纯化。
（5）安全可靠，非致病菌，不会产生有毒物质。
2．筛选过程
产酶菌种的筛选方法主要包括以下几个步骤：含菌样品的采集，菌种分离，产酶性能测定及复筛等。对于产生胞外酶的菌株，经常采用分离、定性和半定量测定相结合的方法，在分离时就基本能够预测菌株的产酶性能。
胞外酶产酶菌株的筛选操作如下：将酶的底物和培养基混合倒入培养皿中制成平板，然后将待测菌涂布在培养基表面，如果菌落周围的底物浓度发生变化，即证明它产酶。
如果是产生胞内酶的菌株筛选，则可采用固体培养法或液体培养法来确定。①固体培养法。将菌种接入固体培养基中保温数天，用水或缓冲液将酶抽提，测定酶活力，这种方法主要适用于霉菌。②液体培养法。将菌种接入液体培养基后，静置或振荡培养一段时间(视菌种而异) ，再测定培养物中酶的活力，通过比较，筛选出产酶性能较高的菌种继续筛选。
3. 产酶常用的微生物
按照产酶微生物的筛选标准，常用的产酶微生物有以下几类：
（1）细菌 细菌是工业上有重要应用价值的原核微生物。在酶的生产中，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。大肠杆菌可以用于生产多种酶，如谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶等；枯草芽孢杆菌可以生产α-淀粉酶、蛋白酶、碱性磷酸酶等。
（2）放线菌 常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌。链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物，同时也可以生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。
（3）霉菌 霉菌是一类丝状真菌，用于酶生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等，生产的酶种类有糖化酶、果胶酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核酸核糖酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、凝乳酶等20多种酶。
（4）酵母 常用于产酶的酵母有啤酒酵母和假丝酵母。啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产，此外，还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶的生产；假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、转化酶等。
二、基因工程菌株(细胞)
基因工程技术可以将未经批准的产酶微生物的基因或由生长缓慢的动植物细胞产酶的基因，克隆到安全的、生长迅速的、产量很高的微生物体内，形成基因工程菌株，然后发酵生产。基因工程技术还可以通过增加基因的拷贝数，来提高微生物产生的酶数量。目前，世界上最大的工业酶制剂生产厂商丹麦诺维信公司(Novozyme)，生产酶制剂的菌种约有80%是基因工程菌。至今已有100多种酶基因克隆成功，包括尿激酶基因、凝乳酶基因等。
要构建一个具有良好产酶性能的基因工程菌株，必须具备良好的宿主-载体
系统。
理想的宿主应具备以下几个特性：
① 体与宿主相容，携带酶基因的载体能在宿主体内稳定维持； ②菌体容易大规模培养，生长无特殊要求，且能利用廉价的原料；
③所产生的目标酶占总蛋白量的比例较高，且能以活性形式分泌；
④宿主菌对人安全，不分泌毒素。
自然界蕴藏着巨大的微生物资源，在发现的微生物中，有99%的微生物是在实验室内使用常规的培养方法培养不出的微生物。现在人们可以采用新的分子生物学方法直接从这类微生物中探索和寻找有开发价值的新的微生物菌种、基因和酶。目前科学家们热衷于从极端环境条件下生长的微生物中筛选新的酶，主要研究嗜热微生物、嗜冷微生物、嗜盐微生物、嗜酸微生物、嗜硫微生物和嗜压微生物等。这就为新酶种和酶的新功能开发提供了广阔的空间。目前在嗜热微生物的研究方面取得了可喜的进展，例如耐高温的淀粉酶和DNA 聚合酶等已得到广泛的应用。
三、微生物酶的发酵生产
微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基和发酵方式的选择及发酵条件的控制管理等方面的内容。
1. 培养基
(1)碳源 碳源是微生物细胞生命活动的基础，是合成酶的主要原料之一。工业生产上应考虑原料的价格及来源，通常使用各种淀粉及它们的水解物如糊精、葡萄糖等作为碳源。在微生物发酵中，为减少葡萄糖所引起的分解代谢物的阻遏作用，采用淀粉质材料或它们的不完全水解物比葡萄糖更有利。一些特殊的产酶菌需要特殊的碳源才能产酶，如利用黄青霉生产葡萄糖氧化酶时，以甜菜糖蜜作碳源时不产生目的酶，而以蔗糖为碳源时产酶量显著提高。
(2)氮源 氮源可分为有机氮和无机氮。选用何种氮源因微生物或酶种类的不同而不同，如用于生产蛋白酶、淀粉酶的发酵培养基，多数以豆饼粉、花生饼粉等为氮源，因为这些高分子有机氮对蛋白酶的形成有一定程度的诱导作用；而利用绿木霉生产纤维素酶时，应选用无机氮为氮源，因为有机氮会促进菌体的生长繁
殖，对酶的合成不利。
(3)无机盐类 有些金属离子是酶的组成成分，如钙离子是淀粉酶的成分之一，也是芽孢形成所必需的金属离子。无机盐一般在低浓度情况下有利于酶产量的提高，而高浓度则容易产生抑制。
(4)生长因子 生长因子是指细胞生长必需的微量有机物，如维生素、氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱等。有些氨基酸还可以诱导或阻遏酶的合成，如在培养基中添加大豆的酒精抽提物，米曲霉的蛋白酶产量可提高约2倍。
(5)pH 值 在配制培养基时应根据微生物的需要调节pH 。一般情况下，多数细菌、放线菌生长的最适pH 为中性至微碱性，而霉菌、酵母则偏好微酸性。培养基的pH 不仅影响微生物的生长和产酶，而且对酶的分泌也有影响。如用米曲霉生产α-淀粉酶，当培养基的pH 由酸性向碱性偏移时，胞外酶的合成减少，而胞内酶的合成增多。
2. 酶的发酵生产方式
酶的发酵生产方式有两种，一种是固体发酵，另一种是液体深层发酵。固体发酵法用于真菌的酶生产，其中用米曲霉生产淀粉酶，以及用曲霉和毛霉生产蛋白酶在我国已有悠久的历史。这种培养方法虽然简单，但是操作条件不易控制。随着微生物发酵工业的发展，现在大多数的酶是通过液体深层发酵培养生产的。液体深层培养应注意控制以下条件：
(1)温度 温度不仅影响微生物的繁殖，而且也显著影响酶和其他代谢产物的形成和分泌。一般情况下产酶温度低于最适生长温度，例如酱油曲霉蛋白合成酶合成的最适温度为28℃，而其生长的最佳温度为40℃。
(2)通气和搅拌 需氧菌的呼吸作用要消耗氧气，如果氧气供应不足，将影响微生物的生长发育和酶的产生。为提高氧气的溶解度，应对培养液加以通气和搅拌。但是通气和搅拌应适当，以能满足微生物对氧的需求为妥，过度通气对有些酶（如青霉素酰化酶）的生产会有明显的抑制作用，而且剧烈搅拌和通气容易引起酶蛋白变性失活。
(3)pH 的控制 在发酵过程中要密切注意控制培养基pH 的变化。有些微生物能同时产生几种酶，可以通过控制培养基的pH 以影响各种酶之间的比例，例如当利用米曲霉生产蛋白酶时，提高pH 有利于碱性蛋白酶的形成，降低pH 则主要
产生酸性蛋白酶。
3. 提高酶产量的措施
在酶的发酵生产过程中，为了提高酶的产量，除了选育优良的产酶菌株外，还可以采用其他措施，例如添加诱导物、控制阻遏物浓度等。
(1)添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。诱导物一般可分为三类：①酶的作用底物，例如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物；②酶的反应产物，例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生；③酶的底物类似物，例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对β-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。而使用最广泛的诱导物是不参与代谢的底物类似物。
(2)降低阻遏物浓度 微生物酶的生产会受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分批添加碳源的方法使培养基中的碳源保持在不至于引起分解代谢物阻遏的浓度。例如在β-半乳糖苷酶的生产中，只有在培养基中不含葡萄糖时，才能大量诱导产酶。对于受末端产物阻遏的酶，可通过控制末端产物的浓度使阻遏解除。例如，在组氨酸的合成途径中，10种酶的生物合成受到组氨酸的反馈阻遏，若在培养基中添加组氨酸类似物，如2-噻唑丙氨酸，可使这10种酶的产量增加10倍。
(3)表面活性剂 在发酵生产中，非离子型的表面活性剂常被用作产酶促进剂，但它的作用机制尚未明确；可能是由于它的作用改变了细胞的通透性，使更多的酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来，从而打破胞内酶合成的反馈平衡，提高了酶的产量。此外，有些表面活性剂对酶分子有一定的稳定作用，可以提高酶的活力，例如利用霉菌发酵生产纤维素酶，添加1%的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。
（4）添加产酶促进剂 产酶促进剂是指那些能提高酶产量但作用机制尚未阐明的物质，它可能是酶的激活剂或稳定剂，也可能是产酶微生物的生长因子，或有害金属的螯合剂，例如添加植物钙可使多种霉菌的蛋白酶和橘青霉的5ˊ-磷酸二酯酶的产量提高2-20倍。
第三节 酶的提取与分离技术
酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质
分离，而获得所需酶的过程。主要内容包括细胞破碎、酶的提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。
一、细胞破碎
除胞外酶外，绝大多数酶都存在于细胞内部。为了获得细胞内的酶，首先要收集细胞、破碎细胞，让酶从细胞内释放出来，然后进行酶的提取和分离纯化。
细胞的破碎方法可以分为机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶促破碎法等。在实际应用时应当根据具体情况选择适宜的细胞破碎方法，有时也采用两种或者两种以上的方法联合使用，达到较好的破碎效果。
表5-1列出了几种细胞破碎方法及原理。
表5-1 细胞破碎方法及原理
分类
机械破碎法 细胞破碎方法 捣碎法
研磨法
匀浆法
物理破碎法 温度差破碎法
压力差破碎法
超声波破碎法
化学破碎法
酶促破碎法 添加有机溶剂 添加表面活性剂 自溶法
外加酶制剂法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，是细胞外层结构破坏，而使细胞破碎 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而是细胞破碎 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，从而使细胞破碎。 细胞破碎原理 通过机械运动产生的剪切力，是组织、细胞破碎
二、酶的提取
酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶液或溶剂处理含酶原料，使酶溶解到溶剂中来，实际上就是酶的抽提过程。
酶提取时，溶剂的选择与酶的结构和溶解性质有关。一般来说，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶液中，碱性物质易溶于酸性溶液中。
根据酶的结构特点，绝大部分酶都能够溶于水中，通常可以采用稀酸、稀碱、稀盐溶液提取；有些酶与脂类物质结合或者带较多的非极性基团，则采用有机溶剂提取。
表5-2列出了提取酶的各种方法。
表5-2 酶的主要提取方法
提取方法
盐溶液提取
酸溶液提取
碱溶液提取
有机溶剂提取 用于提取的溶剂 0.02-0.5mol/L的盐溶液 pH2-6的水溶液 pH8-12的水溶液 可与水混溶的有机溶剂 提取的酶的性质 在低盐溶液中溶解度较大的酶 在稀酸溶液中溶解度较大且稳定性较好的酶 在稀碱溶液中溶解度较大且稳定性较好的酶 与脂类结合或者含较多非极性基团的酶
为了提高酶的提取效率并防止酶变性失活，在提取过程中要注意控制温度、pH 值等提取条件。
三、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某些物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出与其他溶质分离的技术过程。
沉淀分离的方法主要有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法等。
表5-3列出了各种沉淀法的分离原理。
表5-3 沉淀分离方法
沉淀分离方法
盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 分离原理 利用酶（蛋白质）不同盐浓度下的溶解度不同的原理，使酶或者杂质析出沉淀，从而使酶与杂质分离 利用两性电解质在等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质有不同的等电点的特性，调节溶液的pH 值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的有机溶剂，使酶与杂质沉淀析出，使酶与杂质分离 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离
四、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
根据离心机最大转速的不同，可以分为低速离心机、高速离心机和超速离心机三种。
低速离心机的最大转速在8000rpm 。在酶的分离纯化中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离，也可用于酶的结晶等较大颗粒的分离。
高速离心机的最大转速为（1-2.5）ｘ104 rpm 。在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞碎片和细胞器的分离。为防止高速离心时产生高温导致酶变性失活，
配置冷冻降温装置，称为高速冷冻离心机。
超速离心机的最大转速达到（2.5-12）ｘ104 rpm 。主要用于DNA 、RNA 、蛋白质等生物大分子以及细胞器和病毒的分离纯化；沉降系数和相对分子质量的测定等。超速离心机的要求较高，均配置有冷冻系统、控温系统、真空系统、制动系统和安全系统等。
五、过滤与膜分离
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。可以作为过滤介质的物质有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等。根据过滤介质的不同，过滤可以分为膜过滤和非膜过滤。将粗滤及部分微滤采用高分子膜以外的物质作为过滤介质，称为非膜过滤；而大部分微滤以及超滤、反渗透、透析、电渗析等采用各种高分子膜作为过滤介质，称为膜过滤或膜分离技术。
根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透等四大类。表5-4列出了它们的主要特性。
表5-4 过滤的种类及特性
类别
粗滤
微滤
超滤
反渗透 截留的颗粒大小 >2µm 0.2-2µm 20 Å-2µm
六、层析分离
层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数）的不同，使各组分以不同比例分配在两相中。其中一个相为固定的称为固定相，另一个为流动的称为流动相。当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。
分离酶常用的层析方法有吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等。表5-5列出各种层析方法采用的依据。
表5-5 层析分离方法
层析方法
吸附层析
分配层析
离子交换层析
凝胶层析
亲和层析 分离依据 利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 利用各组分在两相中的分配系数不同而使各组分分离 利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同而达到分离的目的 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中各组分的相对分子质量不同而使各组分分离 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化
层析聚焦 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离
七、电泳分离
带电离子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。物质颗粒在电场中的移动方向为：带正电荷的颗粒向电场的阴极移动；带负电荷的颗粒则向阳极移动；净电荷为零的颗粒在电场中不移动。颗粒在电场中的移动速度主要取决于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和大小的影响。此外还受电场强度、溶液的pH 值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。
电泳的方法有多种。按照使用的支持体的不同，可以分为纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳和等电聚焦电泳等。
在酶学研究中，电泳技术主要用于酶的纯度鉴定、酶的分子质量测定、酶等电点测定以及少量酶的分离纯化。
八、萃取分离
萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取中的两相一般为互不相溶的两个液相或其它流体。
按照两相的组成不同，萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取等。
1. 有机溶剂萃取
有机溶剂萃取的两相分别为水相和有机溶剂相，利用溶质在水和有机溶剂中的溶解度不同而达到分离。用于萃取的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。
2. 双水相萃取
双水相萃取的两相分别为互不相溶的两个水相。利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离。双水相萃取中使用的双水相一般是按一定比例组成的互不相溶的盐溶液和高分子溶液或者两种互不相溶的高分子溶液组成。
3. 超临界萃取
超临界萃取又称为超临界液体萃取，是利用欲分离物质在超临界液体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。超临界流体的物理特性和传质特性介于液体和气体之间，具有和液体同样的溶解能力，其萃取速度很高；但其随温度和压力的变化，超临界流体转变为气体，使萃取的物质很容易从超临界流体中分离出来。在超临界流体中，不同的物质具有不同的溶解度，溶解度大的物质容易与溶
解度少或不溶解的物质分离出来。目前在超临界萃取中最常用的超临界流体是CO 2。CO 2超临界点的温度为31.3℃，超临界压力为7.3MPa, 超临界密度为0.47g·ml -1。特别适合生物活性物质的提取和分离。
九、结晶
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定纯度和浓度。通常在50%以上的纯度才能结晶，纯度越高越容易结晶；同样，浓度也是结晶的一个很重要因素，浓度过低无法析出结晶。此外，在结晶过程中还要控制好温度、pH 值、离子强度等结晶条件，才能得到结构完整、大小均一的晶体。
结晶的方法很多，主要有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法和等电点结晶法等方法。其原理与本章中沉淀分离的原理类似。
十、干燥
干燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分，以获得含水分较少的固体物质的过程。酶经过干燥后，可以提高酶的稳定性，利于产品保存、运输和使用。常用的干燥方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥等。
纤维素酶的分离纯化
纤维素是地球上最丰富的可再生性碳源物质，其降解是自然界碳素循环的中心环节。有效利用纤维素可有效解决能源危机和环境污染等重大问题。采用纤维素酶进行水解是保证无污染地将这些纤维素物质转化成简单糖的关键，是纤维素被彻底分解的有效途径。纤维素酶来源广泛，植物、微生物、软体动物、原生动物、昆虫等都能产纤维素酶。其组分较复杂，主要有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶三种。不同组分的分子量和等电点大多不同，给纤维素酶分离纯化造成了一定的困难。因而，选择适宜的分离纯化方法是降低纤维素酶生产成本、提高纤维素酶活力的主要途径。
目前常用的纤维素酶的分离纯化法包括沉淀法、凝胶层析法、离子交换层析
法、亲和层析法、疏水层析法、电泳分离以及萃取分离法等。这些方法可单独作用来分离纯化纤维素酶，也可组合运用，以达到更好的分离效果。下面以沉淀法和层析法为例说明从黑曲霉中分离纯化纤维素酶的过程。
1. 盐析沉淀
硫酸铵是盐析中最为常用的盐，具有不会使蛋白质变性、盐析能力强、溶解度大等优点。分段硫酸铵盐析需要确定所需硫酸铵的饱和度区间以及溶液的pH 。因此在不同pH 的酶液中加硫酸铵固体至不同饱和度，高速离心后，测沉淀的纤维素酶活力，以此确定最佳硫酸铵饱和度。
2.Sephadex G-100 凝胶柱层析
取上述所得最佳相对饱和度硫酸铵盐析后的沉淀物，溶解于pH 5.0的缓冲溶液中，用滴管小心缓慢加入凝胶柱。滴管口伸入液面下位于柱中央，勿扰动上层凝胶。打开出液口，使酶液慢慢渗入凝胶。待酶液刚刚渗入凝胶时，关闭出液口，用滴管在距胶面2~3处沿柱壁慢慢加入缓冲液，在距胶面5cm 时接上洗脱管，打开出液口，开始洗脱。测各收集管中酶液的蛋白含量及内切酶酶活，以期对纤维素酶初酶液进行初步分离。凝胶层析法是以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中各组分的相对分子质量不同而使各组分分离。但仅根据分子量大小的差别很难将纤维素酶各组分完全分开。因此需要采用离子交换层析对分子量相近的成分进一步分离。
3.DEAE-FF 弱阴离子交换柱层析
1mL 预装柱，pH5.0缓冲液平衡DEAE-FF 弱阴离子交换柱。将经过Sephadex G-100柱层析的内切酶峰值溶液，上阴离子交换柱。含1mol/L NaCl的上述平衡液进行梯度洗脱，洗脱速度为1 mL/min，分步收集器自动收集，每管1mL 。对纤维素酶酶液进行进一步分离。离子交换层析法可进一步将凝胶层析法无法分离的酶组分进行分离，得到纯化倍数更高的酶。
纤维素酶的分离纯化工作非常重要，只有得到纯酶，才能了解其组成、性质及相互关系，并可根据纤维素酶的不同理化性质，开展纤维素酶降解机制的研究，为缓解能源危机和控制环境污染提供技术支持。
第四节 酶分子修饰
酶分子是具有完整的化学结构和空间结构的生物大分子。酶的结构决定了酶的性质和功能。当酶分子的结构发生改变时，将引起酶的性质和功能的改变。
酶分子完整的空间结构给予了酶分子的生物催化功能，使其具有催化高效性、作用专一性和反应条件温和等特点。但另一方面，也是因为酶的分子结构使酶具有稳定性差、活性不高和可能具有抗原性等弱点，限制了酶的应用。因此人们需要进行酶分子修饰的研究。
所谓酶分子修饰，就是通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术。
酶分子修饰的方法多种多样。归纳起来，酶分子修饰主要包括金属离子置换修饰、大分子结合修饰、侧链基团修饰、肽链有限水解修饰、核苷酸链有限水解修饰、氨基酸置换修饰和酶分子物理修饰等。
下面介绍前三种方法。
一、金属离子置换修饰
将酶分子中的金属离子置换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。
通过金属离子置换修饰，可以了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明酶分子的催化作用机制，提高酶活力，增强稳定性，甚至改变酶的某些动力学性质。
有些酶分子中的金属离子，往往是酶活性中心的组成部分，对酶的催化功能起到非常重要的作用。如过氧化氢酶分子中的Fe 2+, 超氧化歧化酶分子中的Cu 2+、Zn 2+等。
若从酶分子中除去所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可使酶的活性降低甚至丧失，有的可以使酶的活性提高或者增加酶的稳定性。如α-淀粉酶分子中大多数含有钙离子，有些含有镁离子或者锌离子。若将镁离子、锌离子置换为钙离子，则结晶的钙型α-淀粉酶活力比一般结晶的杂型α-淀粉酶活力提高3倍以上。
二、大分子修饰置换
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰。
大分子结合修饰具有以下作用。
1. 通过修饰提高酶活力
水溶性大分子与酶的侧链基团通过共价结合后，可使酶的空间构象发生改变，使酶活性中心更有利于与底物结合，并形成准确的催化部位，从而提高酶的活力。例如每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶的活力提高5.1倍。
2. 通过修饰增强酶的稳定性
酶的稳定性可以用酶的半衰期表示。酶的半衰期长，说明酶的稳定性好，反之则差。不同的酶具有不同的半衰期。如超氧化歧化酶在人体血浆中的半衰期只有6-30分钟。而通过聚乙二醇修饰后，半衰期提高到35小时。
3. 消除酶蛋白的抗原性
对人体来讲，来源于动植物或者微生物细胞的酶是一种外源蛋白，往往具有抗原性。进入人体会刺激产生抗体。抗体与抗原结合会使酶失去催化功能。通过酶分子结构修饰，可以降低甚至消除抗原性。如具有抗癌作用的精氨酸酶经过聚乙二醇结合修饰，生成聚乙二醇-精氨酸酶后其抗原性消失，使精氨酸酶很好地发挥了抗癌效能。
三、酶分子的侧链基团修饰
采用一定的化学方法使酶分子的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。
酶的侧链基团修饰可以用于研究酶分子的结构与功能。如侧链基团对酶分子活力与稳定性的影响；对酶的功能的贡献及测定某一基团在酶分子中的数量。
酶的侧链基团修饰的方法很多，主要有氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、胍基修饰、酚基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰、分子内交联修饰等。
第五节 酶的固定化
酶的固定化可以通过多种形式实现。固定化酶、固定化细胞、固定化原生质体都是酶的固定化形式。通常将未经固定的酶或细胞称为游离酶（天然酶）或细
胞，固定的酶称为固定化酶 ，固定的微生物细胞称为固定化细胞。固定化酶(细胞) 用于发酵可称为固定化酶(细胞)
发酵，或简称固定化发酵。
一、固定化的优势
将酶固定在载体上形成固定化酶具有如下优势：
①固定化酶（细胞）可以重复使用。 游离酶(细胞) 与底物作用是一次性的，非连续性的发酵罐发酵也是一次性的，而固定化酶（细胞）与反应物作用可多次使用，有的可达几十、几百次，甚至连续使用几年，尤其是固定化细胞，可以看作是固定化细胞的连续发酵，极大地提高了生产效率，如用固定化梭状芽胞杆菌厌氧条件下连续发酵生产正丁醇和异丙醇，已获得产率高出分批发酵4倍的产量。 ②产物的分离、提纯等后处理比较容易。游离酶与产品混在一起难分离，发酵的产品与大量的菌体和非需要的产物混在一起，分离、纯化工艺难度较大，利用固定化酶和细胞的产物相对少地含有非需要产物和菌体，产品分离容易。
③固定化酶（细胞）一般都做成了球形颗粒或薄片状，使产品的生产工艺操作简化，易于实行机械化和自动化操作，所需的设备和器材也较简易。
④固定化酶（细胞）可以制成酶活力很高或细胞密度很大，而且抗酸、碱、温度变化的性能高，酶活性较稳定。因而反应速度加快，生产周期缩短。
⑤固定化酶与固定化细胞相比，各有所长。固定化酶相对产物更单一，非需要的产物更少些，生产操作条件更易控制；而固定化细胞不需要酶的提取，减少了酶活力的损失和操作，还可以利用细胞中的多酶体系，完成需要多种酶参加的反应。此外固定的细胞可以是死的，也可以是活的。活的细胞在生产过程中可同时增殖，更有利于重复使用和加快反应速度，许多固定化的微生物活细胞，用来处理某些
污水的工艺，一直运转几年，固定化细胞仍可使用。
二、固定化的类型
用不同的载体和不同的操作方法将酶或微生物细胞固定，根据固定化的主要机理，一般分成五类。
①吸附固定化 按照正、负电荷相吸的原理，酶或细胞吸附在载体的表面而被固定(图5-1a) 。例如，用瓷碎片、玻璃球、尼龙网、棉花、木屑、毛发等做载体，经一定操作处理后，将酶或细胞吸附固定在其表面。
②包埋固定化 大分子的有机或无机聚合物，将酶或细胞包裹、载留在凝胶中而被固定(图5-1b) 。例如：可用琼脂、明胶、海藻酸钙、k -角叉菜聚糖、聚丙烯酰胺等做载体，经一定的操作处理后，将酶或细胞包埋在里面。
③共价固定化 酶或细胞与载体通过共价键而被固定(图5-1c) 。例如 ：酶或细胞溶液与含羧酸载体(R-COOH)或氨基载体(R-NH2) ，在缩合剂碳化二亚胺作用下，
经搅拌等处理，而制成固定化酶或细胞。
④交联固定化 采用酶分子或细胞上的化合物基团之间在双功能基团交联剂作用下，与载体上的化合基团相互交联呈网状结构而被固定(图5-1d) ，最常用的交联剂是戊二醛。
⑤微囊固定化 用一层亲水性的半透膜将酶或细胞固定在珠状的微囊里(图5-1e) 。例如：用海藻酸钠溶液与酶或细胞混合，滴入CaCl 2溶液中形成凝胶微
珠，然后用聚赖氨酸溶液处理微珠表面，再用柠檬酸去除海藻钙微珠的钙离子，使微珠内海藻酸成液态，酶或细胞悬浮其中，而微珠表面由于受到聚赖氨酸的处理，钙不被去掉，从而不再溶解，形成一层微囊膜，酶或细胞包在微囊中而被固定。
有的固定化酶（细胞）的制作机理既有吸附原理，也有包埋作用或化合键的形成，根据多种原理制成的固定化酶（细胞）其附着力更强，催化效率更好。
三、固定化酶应用存在的问题
固定化技术在微生物工业方面的应用，经以往20多年的研究开发，其优势越来越强，应用面越来越广。固定化酶由于研究开发较早，而且较易控制，比固定化细胞的应用更为广泛和深入。现实中固定化细胞应用于工业化生产与我们的期望还有距离，因此还需要不断拓宽应用范围和改进固定化技术。
存在的主要问题有：
(1)对好氧反应的影响。 好氧反应需要充足的氧气，固定化后的细胞壁和细胞膜，造成了底物或产物进、出的障碍和通气困难，往往严重影响反应速率，导致产量低下。
(2)细胞（酶）与载体的稳定问题。有的固定化细胞容易自溶或污染，或固定化颗粒机械强度差，或细胞（酶）容易从载体脱落，或细胞（酶）的活性很快被抑制，使反复利用次数少，产品质量和数量不稳定。
(3)基础条件问题。固定化酶（细胞）反应动力学及其有关机理、专用设备研究缺乏，也阻碍了该技术的应用。
随着深入的研究开发，特别是分子生物学技术手段的加强，新材料的采用，先进化工工艺的借鉴，计算机的利用，上述问题将会很快解决，微生物工业将发生巨大的变革。我国利用固定化细胞发酵生产酒精和啤酒已取得了很好的经济效益，使我们对固定化细胞的大规模应用充满信心。
固定化酶与我们的日常生活
酶与我们的日常生活息息相关，我们所熟知的加酶洗衣粉中的酶是固定化酶还是游离酶呢？通过前面章节的学习，我们知道固定化酶的制作方法包括包埋法、吸附法和交联法等，并且，固定化酶可重复使用。因此显而易见，加酶洗衣粉当中的酶属于游离酶。那么固定化酶在我们的日常生活中有哪些方面的应用呢？下面主要通过固定化酶在食品工业中的应用来介绍固定化酶与我们日常生活的关系。
1. 固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的应用
固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一种固定化酶，1973年就已应用在工业化生产，它可以用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果糖糖浆。用淀粉生产高果糖浆包含三步：（1）用淀粉酶液化淀粉；（2）用糖化酶将其转化为葡萄糖，即糖化；（3）用葡萄糖异构酶将葡萄糖异构为果糖。由此可得到含果糖55%的高果糖浆，当与蔗糖同等甜度时，其价格要低10%~20%，因此具有经济推动力。高果糖浆用于替代蔗糖，目前世界上的产量约9000kt 。固定化葡萄糖异构酶是固定化酶应用得很成功的工业实例，今后几十年中它将是应用最广，市场份额最大的固定化酶。
2. 固定化酶在柑橘汁加工中的应用
柑桔加工产品出现过度苦味是柑桔加工业中较棘手的问题，苦味物质主要由2类物质组成：一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物（A 和D 环）；另一类为果实中多种黄酮苷，其中柚皮苷为葡萄柚和苦橙等柑桔类果汁中主要的黄酮苷。可以利用不同的固定化酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷，使之转化为不含苦味的物质，从而达到解决柑桔加工产品过度苦味问题的目的。
3. 固定化酶在啤酒澄清中的应用
啤酒以其清晰度高、泡沫适中、营养丰富和口感好得到人们的偏爱。但是，由于啤酒中含有一定量的蛋白质，它会与游离于啤酒中的多酚、单宁等结合产生不溶性胶体或沉淀，造成啤酒混浊，严重影响啤酒的质量。温燕梅等采用吸附—交联法，使胰蛋白酶先吸附于磁性胶体粒子表面，后用戊二醛双功能试剂交联，形成“酶网”裹着载体形成固定化酶，该磁性酶对澄清啤酒防止冷浑浊有明显效果。赵炳超等在戊二醛做交联剂的条件下，以介孔分子筛MCM248作载体固定化木瓜蛋白酶，所得固定化酶的热稳定性有了显著提高，固定化酶的pH 值稳定性和储藏稳定性也有了明显改善。
4. 固定化酶用于水解牛奶中的乳
牛奶中含有4.3%~4.5%的乳糖。患乳糖酶缺乏症的人饮用牛奶后可能出现呕吐、腹泻、烦躁不安等症状。用乳糖酶可以将乳糖分解为组成乳糖的两个单糖：半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反应器可以连续处理牛奶，将乳糖分解，用于连续化生产低乳糖奶，该技术已于1977年实现工业化。此外，乳糖在温度较低时易结晶，用固定化乳糖酶处理后，可以防止其在冰淇淋类产品中结晶，改善口感，增加甜度。固定化乳糖酶还可以用来分解乳糖，制造具有葡萄糖和半乳糖甜味的糖浆。
5. 固定化酶在食品检测以及传感器中的应用
食品中的农药残留分析越来越受到人们的关注，蔬菜中有机磷农药残留的快速检测已成为目前人们研究的热点。应用有机磷农药对胆碱酯酶特异性抑制的酶化学比色分析法已被广泛应用于有机磷农药的定性、定量检测。
5. 固定化酶在传感器中的应用
生物传感器被认为是一种由受体、抗体或酶构成的生物感应层于换能器紧密连接而能提供环境组成信息的感应器。如：测量电流以及电位的酶电极，酶热
敏电阻装置，以场效应管为基础的生物传感器，以及生物发光及化学发光为基础的纤维—光学传感器等，不同的传感器都应用不同类型的固定化酶。
四、固定化技术在食品工业中应用的前景和发展
随着生物技术的迅速发展，固定化酶在工业中的应用日益广泛，从以上黎自可以看出，固定化酶在食品生产中起着举足轻重的作用。除了以上几种典型应用外，固定化酶还可应用于食品中农药残留的检测，以及作为生物传感器的重要部件，与信息科学结合，更高效地服务于我们的生活，生物传感器将在下一章节详细介绍。随着生物技术以及材料、化工、信息技术等各相关学科的发展，我们可以通过发展酶的定向固定化技术、探索新型载体、建立多酶固定化系统和开发新型、高效固定化酶反应器等反方法来增加了酶的稳定性，提高酶的利用效率，更好地为我们的生产、生活服务。
第六节 生物传感器
从上世纪60年代Clark 和Lyon 提出生物传感器的设想开始，生物传感器的发展距今已有40多年的历史了。作为一门在生命科学和信息科学之间发展起来的交叉学科，生物传感器在发酵工艺、环境监测、食品工程、临床医学、军事及军事医学等方面得到了重度重视和发展。随着社会信息化进程的进一步加快，生物传感器必将得到越来越广泛的应用。
一、生物传感器的定义
生物传感器是使用固定化的生物分子结合换能器，用于侦测生物体内或生物体外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置。生物最基本特征之一就是能够对外界的各种刺激作出反应。首先是由于生物体能感受外界的各类刺激信号，并将这些信号转换成体内信息系统所能接收并处理的信号。例如，人能通过眼、耳、鼻、舌、身等感觉器官将外界的光、声、温度及其它各种化学和物理信号转换成人体内神经信息系统能够接收和处理的信号并采取应对措施。现代和未来的信息社会中，信息处理系统要对自然和社会的各种变化作出反应，首先需要通过传感器对外界各种信息的感应并转换成信息系统中的信息处理单元（即计算机）能够接收和处理的信号。
生物传感器的诞生是酶技术与信息技术结合的产物。
二、生物传感器的结构与分类
生物传感器由两个主要关键部分构成。一部分是生物传感器信号接收或产生部分，来自于生物体分子、组织部分或个体细胞的分子辨认组件；另一部分为属于硬件仪器组件部分，主要为物理信号转换组件。
可以根据感受器中所采用的生命物质不同将生物传感器分为组织传感器、细胞传感器、酶传感器等等，也可根据所监测的物理量、化学量或生物量将其命名为热传感器、光传感器、胰岛素传感器等，还可根据其用途统称为免疫传感器、药物传感器等等（如图5-2）。
三、生物传感器的发展历史
第一代生物传感器：1962年Clark 和Lyon 两人首先报道了用葡萄糖氧化酶与氧电极相结合监测葡萄糖的结果，1967年Updike 和Hicks 将葡萄糖氧化酶固定在氧电极表面，成功研制出酶电极，被认为是世界上第一个生物传感器。但这类传感器抗干扰能力差，背景电流打，易受溶液中氧浓度变化的影响。1977年铃木周一等发表了关于对生化需氧量（BOD ）进行快速测定的微生物传感器的报道，并在微生物传感器对发酵过程的控制等方面作了详细的报道，正式提出了对生物传感器的命名。1979年，第一代生物传感器投入医检市场，为美国YSI 公司（维赛仪器公司）生产的血糖测试用酵素电极。YSI 公司的成功上市与80年代电子信息业的蓬勃发展有很密切的关系，并且一举带动了生物传感器的研发热潮。美国Medisense 公司（1995年被雅培公司收购）继续以研发第一代酵素电极为主，1988年公司成功地开发出便携式的电化学血糖仪-Exactechpen ，在第一代生物传感器产品中占有70%以上的市场分额。目前全球每天仍有250万人使用Medisense 的血糖仪。
第二代生物传感器：为克服第一代生物传感器受氧分压影响和H 2O 2过电位
高、干扰多、受氧溶解度限制等，自80年代起人们开始用小分子的电子传递媒介体来代替氧沟通酶的活性中心与电极之间的电子通道，通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化，构造了第二代生物传感器——媒介型生物传感器。第二代的生物传感器代表是1991年上市的瑞典Pharmacia 公司推出的BIAcore 与BIAlite 两项产品。
第三代生物传感器：尽管媒介体型第二代生物传感器有许多优点，人们仍在追求酶与电极间的直接电子转移，因为基于这种原理制备的传感器与氧或其它电子受体无关，无需引入外加媒介体，因此固定化相对简单，无外加毒性物质，是最理想的生物传感器，人们将这种无需外加媒介体的生物传感器称为第三代生物传感器。第三代的生物传感器定位在更具携带式、自动化与实时测定功能。迄今为止，报道较多的主要是过氧化物酶传感器。
四、生物传感器主要应用领域
1．应用于发酵工业
因为发酵过程中常存在酶的干扰物质，并且发酵液往往不是清澈透明的，不适用于光谱等方法测定。而应用微生物传感器则极有可能消除干扰，并且不受发酵液混浊程度的限制。同时，由于发酵工业是大规模的生产，微生物传感器成本低、设备简单的特点、能够排除干扰使其具有极大的优势，所以微生物传感器在发酵工业中得到了广泛的应用。具体表现在下列几个方面：
(1)原材料及代谢产物的测定 微生物传感器可用于原材料如糖蜜、乙酸等的测定，代谢产物如头孢霉素、谷氨酸、甲酸、甲烷、醇类、青霉素、乳酸等的测定。测量的原理基本上都是用适合的微生物电极与氧电极组成，利用微生物的同化作用耗氧，通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量，从而达到测量底物浓度的目的。
(2)微生物细胞总数的测定 在发酵控制方面，一直需要直接测定细胞数目的简单而连续的方法。人们发现在阳极表面，细菌可以直接被氧化并产生电流。这种电化学系统已应用于细胞数目的测定，其结果与传统的菌斑计数法测细胞数是相同的。
(3)代谢试验的鉴定 传统的微生物代谢类型的鉴定都是根据微生物在某种培养基上的生长情况进行的。这些实验方法需要较长的培养时间和专门的技术。微
生物对底物的同化作用可以通过其呼吸活性进行测定。用氧电极可以直接测量微生物的呼吸活性。因此，可以用微生物传感器来测定微生物的代谢特征。这个系统已用于微生物的简单鉴定、微生物培养基的选择、微生物酶活性的测定、废水处理的微生物选择、活性污泥的同化作用试验、生物降解物的确定、微生物的保存方法选择等。
2．应用于食品工业
（1）新鲜度与成熟度的检测 生物传感器可以用来检测食品中营养成分和有害成分的含量、食品的新鲜程度等。如已经开发出来的酶电极型生物传感器可用来分析白酒、苹果汁、果酱和蜂蜜中的葡萄糖含量，从而衡量水果的成熟度。
（2）食品添加剂分析 食品添加剂的种类很多，如甜味剂、酸味剂、抗氧化剂等。将生物传感器用于食品添加剂的分析较为快速准确。亚硫酸盐通常作为食品工业的漂白剂和防腐剂。采用亚硫酸盐氧化酶为敏感材料制成的电流型二氧化硫酶电极可用于测定食品中的亚硫酸含量。
（3）农药残留、重金属分析 应用电化学生物传感器检测残留农药，如对于有机磷农药和氨基甲酸酯类农药，已经开发出一系列用于胆碱酯酶电化学生物传感器。在重金属分析中，选择合适的酶并将其固定在亲和性膜上，结合Clark 氧电极，通过计算氧的消耗量就可以推知重金属的污染程度。
3．应用于医学领域
生物传感器在医学领域也发挥着越来越大的作用：临床上用免疫传感器等生物传感器来检测体液中的各种化学成分，为医生的诊断提供依据；在军事医学中，对生物毒素的及时快速检测是防御生物武器的有效措施。生物传感器已应用于监测多种细菌、病毒及其毒素。生物传感器还可以用来测量乙酸、乳酸、乳糖、尿酸、尿素、抗生素、谷氨酸等各种氨基酸，以及各种致癌和致突变物质。
4．应用于环境监测
环保问题已经引起了全球性的广泛关注，用于环境监测的专业仪器市场也越来越大，如生化需氧量（BOD 值）的测定、各种污染物（常用的重要污染指标有氨、亚硝酸盐、硫化物、磷酸盐、致癌物质与致变物质、重金属离子、酚类化合物）浓度的测定等都已经成功采用了生物传感器进行检测。
未来的生物传感器是怎样的？
近年来，随着生物科学、信息科学和材料科学发展成果的推动，生物传感器技术的发展突飞猛进。但是，目前生物传感器的广泛应用仍面临着许多困难，今后一段时间里，生物传感器的研究工作将主要围绕选择活性强、选择性高的生物传感原件；提高信号检测器的使用寿命；提高信号转化器的使用寿命；生物响应的稳定性和生物传感器的微型化、便携式等问题。可以预见，未来的生物传感器将具有以下特点：
1. 功能更加全面，朝微型化方向发展
未来的生物传感器将进一步涉及医疗保健、食品检测、环境监测、发酵工业的各个领域。当前生物传感器研究中的重要内容之一就是研究能代替生物视觉、听觉和触觉等感觉器官的生物传感器, 即仿生传感器。已报道有植入体内的微小传感器实时监测血糖变化或通过脑电波监测预知癫痫的发作。而且随着微加工技术、纳米技术和芯片技术的进步，生物传感器将不断地朝着微型化方向发展，各种便携式微型生物传感器将不断地出现在人们面前。
2. 智能化和集成化程度更高
未来的生物传感器将会和计算机完美紧密的结合，能够自动采集数据、处理数据，可以更科学、更准确地提供检测结果，实现采样、进样、最终形成检测的自动化系统。同时, 芯片技术将越来越多地进入传感器领域, 实现检测系统的集成化、一体化。
3. 充当密码作用
日前，美国加州大学伯克利分校的科学家正试图通过生物识别传感器来替代传统的密码，他们成功打造出了一款类似于传统耳机的脑电图扫描仪，在进行登陆操作的时候将会根据用户的脑电波进行身份验证从而保证唯一性。
生物识别传感器, 这项技术似乎听着更加玄乎, 但是却已经出现在不少手机之中，例如支持指纹识别的手机已经层出不穷，iPhone 5S和东芝G500等都已经采用了这项技术。为免除用户记忆日益增多的网络密码的烦恼，近日英特尔研究人员在平板电脑中集成一个生物识别传感器，能识别用户手掌上独特的纹理。让笔
记本、平板电脑和智能手机负责识别用户身份，将使各个网站没有必要再次识别，避免在各个网站输入密码。
4. 联用技术
生物传感器将不断与其他分析技术联用，如流动注射技术、色谱等，互相取长补短。
总之，未来的生物传感器技术将朝着微型化、智能化、低成本、高寿命、高灵敏度、强稳定性的方向发展。另一方面，这些特性的改善也会加速生物传感器的市场化、商品化进程。相信在不久的将来，生物传感器必定会给人们的生活带来巨大的变化。
复习思考题：
1．名词解释：酶 酶工程 固定化酶（细胞） 酶活性中心 生物传感器
2．为什么酶的生产主要来源于微生物？
3．如何获得优良的产酶菌株？
4．酶分离纯化的主要技术措施有哪些？
5．酶分子修饰的含义是什么？有何意义？
6．简述酶工程技术在食品工业、医药工业、环保行业等各领域的应用。
7．什么是生物传感器？其工作原理是什么？
8．谈谈酶工程技术与生物技术各个学科之间的关系。