Chinese Journal of Forensic Sciences , 2009, No．3Total No.44
鉴定科学
Research Paper
头发中乙基葡萄糖醛酸苷分析的研究进展
施妍1,2, 向平1，沈保华1，沈敏1
（1. 司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063；
2. 复旦大学上海医学院法医系，上海200032）
摘要：乙基葡萄糖醛酸酐（ethyl glucuronide ，EtG ）为乙醇的体内代谢物，摄入的乙醇大约0.02%～0.06%以EtG 的形式排出，其消除时间较乙醇缓慢，即使当乙醇在体内完全消除后，EtG 仍可作为酒精滥用的生物学标志。测定头发中的EtG 可延长检测时限，获取饮酒史的信息，在法庭科学和临床医学领域已成为研究热点。头发中EtG 的检测主要采用以串联质谱为主的高灵敏的分析方法，且注重头发采样、去污、水解、提取、分析等各环节的质量控制, 避免出现假阳性结果。头发中EtG 的研究结果可广泛应用于法庭科学、临床医学、征兵、招工、驾驶能力测试等领域。关键词：EtG ；头发分析；串联质谱；酒精滥用中图分类号：DF795.1文献标志码：A 文章编号：1671-2072-（2009）03-0024-07
Review of Ethyl Glucuronide in Hair Analysis
SHI Yan 1,2, XIANG Ping 1, SHEN Bao-hua 1, SHEN Min 1
(1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine, Institute of Forensic Science, Ministry of Justice, Shanghai 200063, China ；
2. Shanghai Medical College of Fudan University, Shanghai 200032, China)
Abstract:Ethyl glucuronide (EtG)is a minor metabolite of ethanol, which only represents 0.02%-0.06%of the total ethanol intake. Following alcohol intake, EtG is reported to be detectable for an extended period of time after the complete elimination of ethanol from the body, so it can be used as a marker of alcohol abuse. Its detection in hair has become a hot subject of re -search in both clinical and forensic context for the purpose of alcohol abuse monitoring. The hair analysis of EtG requires more sensitive methods for its low concentration, which needs to be carried out by LC -MS/MSor GC -MS/MS.Special attentions should be paid in the decontamination procedures of hair sampling, washing and extracting to avoid a false positive result. Moreover, EtG concentration in hair may help to estimate the daily alcohol intake and can confirm abstinence, so it can be widely used in forensic science, treatment programs, workplaces, schools, troops as well as driving ability test to provide legal proof of drinking.
Key words :ethyl glucuronide (EtG);hair analysis; tandem mass-spectrum (MS/MS);alcohol abuse
酒精滥用是众多国家存在的社会问题之一。多年来，国内外学者们都在致力寻找并研究合适的生物学标记物，用以评估酒精滥用情况，其中乙基葡萄糖醛酸苷（ethyl glucuronide ，EtG ）就是近年来被广泛关注的一种重要的酒精滥用判断指标[1]。
热点，其研究成果不仅适用于法医学领域，还可用于临床医学，职业卫生学等方面[2]。
但是，头发中EtG 的质量分数极低，要求分析方法有极高的灵敏度和可靠性。近年来的研究，从头发采样、去污、水解、提取到串联质谱分析，各环节条件不断优化，方法灵敏度逐渐提高，最低检测限（limit of
EtG 是乙醇的体内代谢物之一，在体内可以进入
头发，并在头发中累积。由于头发样品易采集、易保存，根据头发长度还可以检测数月乃至数年内的酒精滥用情况，提供长程信息，因此头发中EtG 的分析弥补了血液和尿液分析的不足。检测头发中的EtG 可以反映被测者的酒精滥用史状况，区分日常饮酒与酗酒，因而成为近年来法庭科学和临床医学领域的研究
收稿日期：2009-01-09
基金项目：国家科技部公益基金资助项目（2007GY0701），正谊学者项目（JYE101001）。
作者简介：施妍(1984-)，女，博士研究生。E －mail:ydeedyx@
detection, LOD ）从最初的2ng/mg[3]已达0.7pg/mg[4]，
大大拓展了方法的应用范围。本综述旨在对1993年以来建立的头发中EtG 的分析方法作一比较分析，并阐述该研究成果的应用价值和应用状况。
1EtG 的生物学特性及体内代谢
EtG 是不挥发的、水溶性的、非氧化性的乙醇代
谢物，相对分子质量为222，分子式为C 8H 14O 7，结构式如图1，其沸点约为150℃。
乙醇进入体内后大约90%~95%在肝中被氧化成乙醛，而仅有约0.02%~0.06%以EtG 的形式消除[5]。
sina.com.
通信作者：沈敏(1955-)，女，研究员，博士生导师。
中国司法鉴定
EtG 是乙醇的第二相代谢物，其在肝中发生生物转
化，在尿苷-5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶的作用下，由葡萄糖醛酸活化而来[6]。
饮酒后，EtG 存在于血液、尿液、头发以及其它组织和体液中，其半衰期长于原体乙醇。由于摄入乙醇量的不同，机体代谢的差异，乙醇在体内消除后，6~
2009年第3期（总第44期）
0.001）%，损失几乎可以忽略不计。
3头发中EtG 的提取处理
为了能在头发中提取最大量的目标物，通常需要
先对清洗和干燥后的头发进行前处理，将其剪成约
1mm 长的小段，或用球磨机粉碎，使结合在头发中的EtG 尽量地释放出来。头发用量各实验室有所不同，
从10~100mg 头发不等[2,17]。
18h 内仍可在血液中检测到EtG ，80h 内可在尿液中
检测到EtG [7]。然而，对于区分长期饮酒和偶尔饮酒而言，血液和尿液中EtG 分析的检测时限还是很短的，不能反映长程的酒精滥用情况。此外，血液腐败能导致EtG 的降解，出现假阴性结果[8]，尿路感染者因细菌
3.1样品前处理
常用的水解方法有酸水解、碱水解、酶解以及甲
醇超声、缓冲液浸泡法。头发水解后，可直接用液-液提取（LLE ）或固相萃取（SPE ）来提取头发中的EtG 。
(大肠埃希菌、肠球菌、B 群溶血性链球菌等) 的作用可
出现假阳性结果[9-11]。因此，头发EtG 分析具有独特的应用价值而成为研究热点。
Jurado 等[14]在2004年曾对提取EtG 的以下4种
萃取液进行了比较：(a)甲醇；（b ）甲醇∶水（1∶1）；（c ）水；（d ）甲醇∶三氟醋酸（TFA ）（9∶1），结果显示用（b ）和（c ）溶液提取可得到较高的回收率和较低的变异系数（图
2）。但用（c ）提取时，基质效应更小，信噪比更高，因而
可以达到较低的LOD 和LOQ 。综合考虑，液-液法提取EtG 时用水作萃取液较好。
液-液法提取耗时较长，需要样本的量较大，处理时易造成样本的损失，而采用固相萃取（SPE ）法可以减少损失，提高目标物的回收率。固相微萃取（SPME ）、顶空固相微萃取（HS-SPME) ，微波辅助提取（MAE ）等。对于提取EtG 而言，具体采用哪种方法要根据实验室的具体条件而定。本文将详细介绍固相萃取法和微波辅助提取法。
2
2.1
头发的采集与清洗
头发的采集
头发采集部位和采集方法应最大限度地反映其
生长情况，由于头顶后部的头发有着较为稳定的生长速度而成为首选的头发采集部位，一般用剪刀贴着头皮剪取即可[12-13]。
2.2头发的清洗
头发样品在分析前必须进行清洗，以去除外源性
污染（环境污染，粉尘吸附等）和内源性污染（汗液、皮脂腺分泌等）。从上世纪90年代始至今，对于EtG 头发样品的清洗尚无统一的操作规范, 各文献报道的清洗步骤和有机溶剂不完全相同。清洗溶剂主要有甲醇/丙酮[2]、乙醚/丙酮[3]、正己烷[10]、水/丙酮[14]、水/丙酮/甲醇[15]、二氯甲烷/甲醇[16]、甲醇/水[17]、Tween80/水[18]等。
要注意的是由于EtG 具有亲水性，其与头发结合的主要途径很可能是通过汗液，因而不稳定；另由于
图2
从头发中提取EtG 的四种萃取液的比较
（由于样品量少，样品3只比较了3种提取液）
3.1.1固相萃取（SPE ）
固相萃取法与液-液提取相比，大大地缩短了样本制备时间，所需样品量少，避免了乳化现象，而且便于自动化操作，是生物样品处理中具有发展优势的技术之一。
EtG 的强极性，与头发的角化基质结合不牢固。因此，
常规的洗涤和头发处理可能会损失EtG 的含量，清洗不当甚至会导致EtG 完全被洗掉[10]。Morini 等[16]对毛发清洗进行深入研究后发现，用甲醇和二氯甲烷清洗，EtG 的损失率分别为（2.332±0.224）%和（0.219%±
Janda 等[19]用氨丙基柱固相萃取水相中EtG 。首先分别用3mL 甲醇，3mL 水，3mL 乙腈活化SPE 柱
，
25·
Chinese Journal of Forensic Sciences , 2009, No．3Total No.44确保活化过程中柱子不干。然后将经过清洗和前处理离心后的含有目标物的上清液上样，再用3mL 正己烷淋洗小柱。为了去除残余液体，需在强真空下吹
谱行为，提高分析灵敏度，采用气-质联用分析必须进行衍生化。文献报道的衍生化试剂有N-O-双三甲基甲硅烷基（BSTFA ）/吡啶[2]、N-甲基-N （三甲基硅烷基）三氟醚乙酰胺（MSTFA ）[3]、五氟代丙酸酐（PFPA ）/五氟丙醇PFPOH [10,20]、PFPA [4,14,21]、BSTFA/三甲基氯硅烷（TM -
15min 。最后用1.8mL V （水）∶V （25%氨水）=98∶2溶
液洗脱目标物。洗脱液在30℃水浴下用氮气吹干，溶于100μL 0.1%的甲酸中。
CS ）、七氟代丁酸酐（HFBA ）[14]、乙酸乙酯/BSTFA[17]。
Jurado 等[14]比较了三种衍生化试剂∶V （BSTFA ）∶V
（TMCS ）＝（99∶1）、PFPA 、HFBA 的衍生化效果，发现用
Paul 等[17]在此基础上进一步改进，用Oasis MAX
阴离子交换柱（Waters ，德国）进行固相萃取，减少了样品量，缩短了提取时间。先用1mL 甲醇，1mL 去离子水进行活化，再将500μL 样品上样，最后用1mL
HFBA 衍生化后色谱图基质峰较大，而用BSTFA 衍
生化后的产物稳定性较差，综合评价认为用PFPA 衍生化较佳，其最佳反应时间和温度为室温下衍生化30min 。
5%的氨水，1mL 2%的氨溶液（溶于甲醇）洗脱，洗脱液干燥，用2mL V （甲醇）∶V （甲酸）=98∶2溶液定容。3.1.2微波辅助提取（MAE ）
MAE 是体内滥用药物分析中的一种新的提取技
术，该方法稳定、溶剂耗量少、省时、省力[19]。
微波提取系统为ETHOS PLUS MPR300/12S
4头发中EtG 的分析方法
头发中乙醇代谢物EtG 的分析方法多样，可采用
GC-MS-EI 法[3,14,18,22-23]，GC-MS-NCI 法[4,10,20-21,24]，也可
用GC-MS/MS[17,28]及LC-MS/MS[16,19,25-27,29]法。
饮酒后头发中EtG 的质量分数常在pg/mg级,
(Milestone,意大利) 配有溶剂感应器，可以在同一条件
下（温度、压力）同时提取12组样品，内置控制系统用来控制提取EtG 的条件，烘箱最大功率1000W ，可以调节和维持所选定的温度。将处理好的头发样品加入
Sachs [22]最早分析头发中的EtG 时只能检测到ng/mg
级的目标物，灵敏度比较低。1993年以来，清洗、提取、衍生化及仪器检测各环节均得到不断改进，方法灵敏度逐渐提高，随着高灵敏度的液相或气相色谱串联质谱(LC-MS/MS、GC-MS/MS)的应用，最低检测限已达到0.7pg/mg[4]，各种分析方法的比较见表1。
8mL V （正己烷）∶V （水）=1∶1的混合物，混匀后即可进行微波辅助提取。设定110℃，10min ，完成后离心取
上清即可。
3.2衍生化
由于EtG 的分子量比较小、极性强，为了改善色
表1
头发中EtG 的分析方法及灵敏度比较
中国司法鉴定
续表1
2009年第3期（总第44期）
5结果分析及影响因素
随着分析方法的发展，已可检测到pg/mg级的头
在所有研究中，已知有酗酒行为者头发中EtG 的质量分数范围为0.03~13.3ng/mg[30]，而所有不饮酒者检查结果均为阴性。因此大于30pg/mg的质量分数被认为是酒精滥用的强有力证据。但在进行结果解释时，阴性结果并不能排除酒精滥用的情况。有研究表明，清洗过程不当或漂白、烫染等头发处理过程会使头发中EtG 的含量减少，出现假阴性结果[10]。同时头发易被汗液污染，若去污不彻底也可能出现假阳性结果。进行结果解释时应当结合多种因素，综合考虑。
发中EtG 质量分数。按照头发一般1cm/月的生长速度，从发根起采集一定长度的头发样品，可获得被检者某一特定时间的酒精滥用信息，区分酗酒者、日常饮酒者和不饮酒者，解决法庭科学和临床医学领域面临的诸多问题。
Alt 等[2]对31例头发样品（分别来自16例有酒精
滥用史的尸体；4例已明确诊断酒精滥用的病人；6例每天饮酒20g 的日常饮酒者；5例儿童）进行分析，其中18例检测到EtG ，但2例有酒精滥用史的尸体头发却未能发现EtG ，推测可能是受染发的影响。日常饮酒者和儿童的头发中未检测到EtG 。Skopp 等[3]在此基础上，分析了11例无烫染等处理的头发样品，其中
5.1漂白及色素
Yegles 等[10]用商品化的洗化用品对头发进行漂白，
发现EtG 的质量分数下降了78%。Appenzeller 等[24]研究了21个样本，EtG 质量分数范围为6~1239pg/mg，发现色素对头发中EtG 的质量分数没有影响。无色素头发与有色素头发中EtG 的质量分数无明显差异。
6例EtG 阳性，均为有酒精滥用史者。Yegles 等[10]还进
行了头发分段分析，发现不同段头发中EtG 的分布不同，从近头皮端到远端质量分数逐渐降低。
5.2稳定性
Kharbouche 等[28]对两例尸体头发样品进行分析，
在黑暗室温下放置几个月后，头发中EtG 的质量分数
27·
Chinese Journal of Forensic Sciences , 2009, No．3Total No.44仅下降15%，说明EtG 在头发基质中稳定性较好。
EtG 质量分数小于头发，其他部位（除阴毛、腋毛外）
的毛发中EtG 的质量分数与头发相似。
5.3与药物的作用
Paul 等[17]比较了滥用药物组（57例）与非用药组
（42例）的EtG 水平，发现有滥用药物行为者头发中的EtG 质量浓度明显比不用药者要低（图3）。Klys 等
[15]
5.5临界值
头发中的EtG 是一个很有应用价值的判断酒精
滥用的生物学标志，但至今仍无明确的界定值。对于设定区分酗酒者与日常饮酒者的临界值，目前不同的实验室有不同的指标。在以前的研究中发现，被诊断为酒精滥用的患者头发中EtG 质量分数介于30~
还研究了1例氯丙咪嗪对长期饮酒者的毒性，一方
面长期饮酒会加快药物代谢，因而酗酒者的药物剂量应有别于非饮酒者，另一方面，急性饮酒最基本的影响是阻断药物代谢，因此需要综合药物与酒精的相互作用。
13800pg/mg之间，因此Yegles 等[10]强烈建议将30pg/mg作为区分酗酒与日常饮酒的临界值。Bendroth
等[27]用100mg 头发测定EtG 时，也设定临界值是
30pg/mg，检测了65例头发样本，其中49例质量分数
为7.5~10400pg/mg，39例在临界值之上。Kintz 等[29]所在实验室根据文献报道的数据（表2），则设定50pg/
mg 为区分日常饮酒和酗酒的临界值。Kerekes 等[4]在比
较了头发和其他部位毛发分析结果之后，认为7pg/
mg 可作为区别饮酒（包括日常饮酒和酗酒）与非饮酒
的界定值，25pg/mg作为日常饮酒与酗酒者的界定值，Pragst 等[31]也认同此结果。
图3
滥用药物组与非用药组头发中EtG
质量浓度的比较
5.4不同部位毛发质量分数比较
当不能采集到头顶部的头发时，其他部位的毛发
是否可以替代头发是很多学者关注的。Kerekes 等[4]比较了32例头发、胡须、胸毛、腋毛、阴毛、腿毛等的
EtG 质量分数。32例中包括从不饮酒者，日常饮酒者
（10~40g/d）和酗酒者（＞60g/d），且25例的饮酒情况是已知的。以7pg/mg为区分饮酒与非饮酒者的界值，12例头发检测结果阴性，但其中5例阴毛EtG 质量分数大于7pg/mg；20例头发检测结果阳性，阴毛EtG 质量分数大于头发中的EtG 质量分数。Kintz 等[29]的研究也证实了这一结果。可能原因是头发的生长速度快（平均1cm/月），而阴毛几个月甚至几年才长1cm 。同时阴毛还可能受到尿液和汗液的污染。研究显示腋毛的
由于样本量有限，各实验室方法、条件不一，目前仍无公认的临界值，尚需进一步扩大样本量以确定此值，同时也应对各实验室的条件和分析方法予以考虑。
6
6.1
应用
法庭科学领域
常规检测头发中的EtG 可以作为血、
尿检查的辅
中国司法鉴定
助手段，判断醉酒驾驶，或在交通肇事逃逸案件中提供酒后驾车的证据。此外，很多滥用药物者都有酗酒的习惯，酒精和药物协同作用有时会加快代谢，导致死亡，分析死者头发中EtG 可以协助判断死因[23,31]。
目前检测头发中的EtG 已经被一些实验室[14,28]作为常规项目应用于法庭科学领域，表3显示了7个离婚案例中头发分析结果。7例样品中检测到的EtG 都在50pg/mg之上，其中2例头发分析结果显示除饮酒外未摄取其它违禁药物，而其他5例头发中还检测到了其它滥用药物。这些检测结果都在法庭上被用作证据，引导离婚案的宣判。
新生儿成长[32]。
2009年第3期（总第44期
）
Appenzeller [21]分析了15例在戒酒治疗中病人的
头发样本，质量分数范围为8~261pg/mg。其中一名头发漂白的病人头发中EtG 的质量分数最低，头发检测结果显示大部分病人EtG 的含量与慕尼黑酒精测试调查表（MALT ）中自我报告饮酒量相符。临床医生常依赖头发分析结果来了解戒酒情况，一般头发中EtG 质量分数的下降可以在戒酒一个月后从根部头发中检测到。根据图4显示：病人N 遵从戒酒治疗，头发中
EtG 的质量分数下降；相反，病人D 就没有听从医嘱，
而是持续饮酒；而病人L 则是戒酒一段时间后又复饮酒。头发分析可以帮助医生了解在治疗中病人有无遵从医嘱，制定下一步治疗计划。
6.2临床医学方面
头发分析EtG 可监测在酒精依赖性治疗过程中
的酒精使用情况，指导酗酒者的药物治疗，还可以预知新生儿疾病。现在有很多孕妇隐瞒了饮酒史，使得新生儿出生后患上胎儿酒精综合征（FAS ），早期无明显症状，不易察觉。若能通过头发EtG 分析对新生儿进行筛检，则可以尽早进行治疗，以免延误治疗影响
6.3其他方面应用
在职业卫生和其他社会领域，EtG 的研究结果还
可广泛应用于征兵、招工、驾驶能力测试、保险理赔等方面[21]。
图4戒酒治疗过程中病人头发中EtG 的含量
（Y 轴为EtG 的质量分数pg/mg，X 轴为靠近头皮头发的长度cm ）
7进一步研究方向
EtG 进入头发的机制尚不明确，酒精摄入量与头
发中EtG 的质量分数关系还需进一步探讨，毛囊自身的代谢、葡萄糖醛酸转移酶、酒精代谢酶对毛发中
EtG 质量分数的影响也有待研究[3]。从代谢组学、基因
组学等方面进一步研究毛发中EtG 的质量分数、分布以及结合机制，并与其他酒精生物学标志（如脂肪酸乙酯，乙基硫酸酯等）相结合，科学解释毛发分析结果，是进一步研究的方向。
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(本文编辑:卓先义)
Chinese Journal of Forensic Sciences , 2009, No．3Total No.44
鉴定科学
Research Paper
头发中乙基葡萄糖醛酸苷分析的研究进展
施妍1,2, 向平1，沈保华1，沈敏1
（1. 司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063；
2. 复旦大学上海医学院法医系，上海200032）
摘要：乙基葡萄糖醛酸酐（ethyl glucuronide ，EtG ）为乙醇的体内代谢物，摄入的乙醇大约0.02%～0.06%以EtG 的形式排出，其消除时间较乙醇缓慢，即使当乙醇在体内完全消除后，EtG 仍可作为酒精滥用的生物学标志。测定头发中的EtG 可延长检测时限，获取饮酒史的信息，在法庭科学和临床医学领域已成为研究热点。头发中EtG 的检测主要采用以串联质谱为主的高灵敏的分析方法，且注重头发采样、去污、水解、提取、分析等各环节的质量控制, 避免出现假阳性结果。头发中EtG 的研究结果可广泛应用于法庭科学、临床医学、征兵、招工、驾驶能力测试等领域。关键词：EtG ；头发分析；串联质谱；酒精滥用中图分类号：DF795.1文献标志码：A 文章编号：1671-2072-（2009）03-0024-07
Review of Ethyl Glucuronide in Hair Analysis
SHI Yan 1,2, XIANG Ping 1, SHEN Bao-hua 1, SHEN Min 1
(1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine, Institute of Forensic Science, Ministry of Justice, Shanghai 200063, China ；
2. Shanghai Medical College of Fudan University, Shanghai 200032, China)
Abstract:Ethyl glucuronide (EtG)is a minor metabolite of ethanol, which only represents 0.02%-0.06%of the total ethanol intake. Following alcohol intake, EtG is reported to be detectable for an extended period of time after the complete elimination of ethanol from the body, so it can be used as a marker of alcohol abuse. Its detection in hair has become a hot subject of re -search in both clinical and forensic context for the purpose of alcohol abuse monitoring. The hair analysis of EtG requires more sensitive methods for its low concentration, which needs to be carried out by LC -MS/MSor GC -MS/MS.Special attentions should be paid in the decontamination procedures of hair sampling, washing and extracting to avoid a false positive result. Moreover, EtG concentration in hair may help to estimate the daily alcohol intake and can confirm abstinence, so it can be widely used in forensic science, treatment programs, workplaces, schools, troops as well as driving ability test to provide legal proof of drinking.
Key words :ethyl glucuronide (EtG);hair analysis; tandem mass-spectrum (MS/MS);alcohol abuse
酒精滥用是众多国家存在的社会问题之一。多年来，国内外学者们都在致力寻找并研究合适的生物学标记物，用以评估酒精滥用情况，其中乙基葡萄糖醛酸苷（ethyl glucuronide ，EtG ）就是近年来被广泛关注的一种重要的酒精滥用判断指标[1]。
热点，其研究成果不仅适用于法医学领域，还可用于临床医学，职业卫生学等方面[2]。
但是，头发中EtG 的质量分数极低，要求分析方法有极高的灵敏度和可靠性。近年来的研究，从头发采样、去污、水解、提取到串联质谱分析，各环节条件不断优化，方法灵敏度逐渐提高，最低检测限（limit of
EtG 是乙醇的体内代谢物之一，在体内可以进入
头发，并在头发中累积。由于头发样品易采集、易保存，根据头发长度还可以检测数月乃至数年内的酒精滥用情况，提供长程信息，因此头发中EtG 的分析弥补了血液和尿液分析的不足。检测头发中的EtG 可以反映被测者的酒精滥用史状况，区分日常饮酒与酗酒，因而成为近年来法庭科学和临床医学领域的研究
收稿日期：2009-01-09
基金项目：国家科技部公益基金资助项目（2007GY0701），正谊学者项目（JYE101001）。
作者简介：施妍(1984-)，女，博士研究生。E －mail:ydeedyx@
detection, LOD ）从最初的2ng/mg[3]已达0.7pg/mg[4]，
大大拓展了方法的应用范围。本综述旨在对1993年以来建立的头发中EtG 的分析方法作一比较分析，并阐述该研究成果的应用价值和应用状况。
1EtG 的生物学特性及体内代谢
EtG 是不挥发的、水溶性的、非氧化性的乙醇代
谢物，相对分子质量为222，分子式为C 8H 14O 7，结构式如图1，其沸点约为150℃。
乙醇进入体内后大约90%~95%在肝中被氧化成乙醛，而仅有约0.02%~0.06%以EtG 的形式消除[5]。
sina.com.
通信作者：沈敏(1955-)，女，研究员，博士生导师。
中国司法鉴定
EtG 是乙醇的第二相代谢物，其在肝中发生生物转
化，在尿苷-5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶的作用下，由葡萄糖醛酸活化而来[6]。
饮酒后，EtG 存在于血液、尿液、头发以及其它组织和体液中，其半衰期长于原体乙醇。由于摄入乙醇量的不同，机体代谢的差异，乙醇在体内消除后，6~
2009年第3期（总第44期）
0.001）%，损失几乎可以忽略不计。
3头发中EtG 的提取处理
为了能在头发中提取最大量的目标物，通常需要
先对清洗和干燥后的头发进行前处理，将其剪成约
1mm 长的小段，或用球磨机粉碎，使结合在头发中的EtG 尽量地释放出来。头发用量各实验室有所不同，
从10~100mg 头发不等[2,17]。
18h 内仍可在血液中检测到EtG ，80h 内可在尿液中
检测到EtG [7]。然而，对于区分长期饮酒和偶尔饮酒而言，血液和尿液中EtG 分析的检测时限还是很短的，不能反映长程的酒精滥用情况。此外，血液腐败能导致EtG 的降解，出现假阴性结果[8]，尿路感染者因细菌
3.1样品前处理
常用的水解方法有酸水解、碱水解、酶解以及甲
醇超声、缓冲液浸泡法。头发水解后，可直接用液-液提取（LLE ）或固相萃取（SPE ）来提取头发中的EtG 。
(大肠埃希菌、肠球菌、B 群溶血性链球菌等) 的作用可
出现假阳性结果[9-11]。因此，头发EtG 分析具有独特的应用价值而成为研究热点。
Jurado 等[14]在2004年曾对提取EtG 的以下4种
萃取液进行了比较：(a)甲醇；（b ）甲醇∶水（1∶1）；（c ）水；（d ）甲醇∶三氟醋酸（TFA ）（9∶1），结果显示用（b ）和（c ）溶液提取可得到较高的回收率和较低的变异系数（图
2）。但用（c ）提取时，基质效应更小，信噪比更高，因而
可以达到较低的LOD 和LOQ 。综合考虑，液-液法提取EtG 时用水作萃取液较好。
液-液法提取耗时较长，需要样本的量较大，处理时易造成样本的损失，而采用固相萃取（SPE ）法可以减少损失，提高目标物的回收率。固相微萃取（SPME ）、顶空固相微萃取（HS-SPME) ，微波辅助提取（MAE ）等。对于提取EtG 而言，具体采用哪种方法要根据实验室的具体条件而定。本文将详细介绍固相萃取法和微波辅助提取法。
2
2.1
头发的采集与清洗
头发的采集
头发采集部位和采集方法应最大限度地反映其
生长情况，由于头顶后部的头发有着较为稳定的生长速度而成为首选的头发采集部位，一般用剪刀贴着头皮剪取即可[12-13]。
2.2头发的清洗
头发样品在分析前必须进行清洗，以去除外源性
污染（环境污染，粉尘吸附等）和内源性污染（汗液、皮脂腺分泌等）。从上世纪90年代始至今，对于EtG 头发样品的清洗尚无统一的操作规范, 各文献报道的清洗步骤和有机溶剂不完全相同。清洗溶剂主要有甲醇/丙酮[2]、乙醚/丙酮[3]、正己烷[10]、水/丙酮[14]、水/丙酮/甲醇[15]、二氯甲烷/甲醇[16]、甲醇/水[17]、Tween80/水[18]等。
要注意的是由于EtG 具有亲水性，其与头发结合的主要途径很可能是通过汗液，因而不稳定；另由于
图2
从头发中提取EtG 的四种萃取液的比较
（由于样品量少，样品3只比较了3种提取液）
3.1.1固相萃取（SPE ）
固相萃取法与液-液提取相比，大大地缩短了样本制备时间，所需样品量少，避免了乳化现象，而且便于自动化操作，是生物样品处理中具有发展优势的技术之一。
EtG 的强极性，与头发的角化基质结合不牢固。因此，
常规的洗涤和头发处理可能会损失EtG 的含量，清洗不当甚至会导致EtG 完全被洗掉[10]。Morini 等[16]对毛发清洗进行深入研究后发现，用甲醇和二氯甲烷清洗，EtG 的损失率分别为（2.332±0.224）%和（0.219%±
Janda 等[19]用氨丙基柱固相萃取水相中EtG 。首先分别用3mL 甲醇，3mL 水，3mL 乙腈活化SPE 柱
，
25·
Chinese Journal of Forensic Sciences , 2009, No．3Total No.44确保活化过程中柱子不干。然后将经过清洗和前处理离心后的含有目标物的上清液上样，再用3mL 正己烷淋洗小柱。为了去除残余液体，需在强真空下吹
谱行为，提高分析灵敏度，采用气-质联用分析必须进行衍生化。文献报道的衍生化试剂有N-O-双三甲基甲硅烷基（BSTFA ）/吡啶[2]、N-甲基-N （三甲基硅烷基）三氟醚乙酰胺（MSTFA ）[3]、五氟代丙酸酐（PFPA ）/五氟丙醇PFPOH [10,20]、PFPA [4,14,21]、BSTFA/三甲基氯硅烷（TM -
15min 。最后用1.8mL V （水）∶V （25%氨水）=98∶2溶
液洗脱目标物。洗脱液在30℃水浴下用氮气吹干，溶于100μL 0.1%的甲酸中。
CS ）、七氟代丁酸酐（HFBA ）[14]、乙酸乙酯/BSTFA[17]。
Jurado 等[14]比较了三种衍生化试剂∶V （BSTFA ）∶V
（TMCS ）＝（99∶1）、PFPA 、HFBA 的衍生化效果，发现用
Paul 等[17]在此基础上进一步改进，用Oasis MAX
阴离子交换柱（Waters ，德国）进行固相萃取，减少了样品量，缩短了提取时间。先用1mL 甲醇，1mL 去离子水进行活化，再将500μL 样品上样，最后用1mL
HFBA 衍生化后色谱图基质峰较大，而用BSTFA 衍
生化后的产物稳定性较差，综合评价认为用PFPA 衍生化较佳，其最佳反应时间和温度为室温下衍生化30min 。
5%的氨水，1mL 2%的氨溶液（溶于甲醇）洗脱，洗脱液干燥，用2mL V （甲醇）∶V （甲酸）=98∶2溶液定容。3.1.2微波辅助提取（MAE ）
MAE 是体内滥用药物分析中的一种新的提取技
术，该方法稳定、溶剂耗量少、省时、省力[19]。
微波提取系统为ETHOS PLUS MPR300/12S
4头发中EtG 的分析方法
头发中乙醇代谢物EtG 的分析方法多样，可采用
GC-MS-EI 法[3,14,18,22-23]，GC-MS-NCI 法[4,10,20-21,24]，也可
用GC-MS/MS[17,28]及LC-MS/MS[16,19,25-27,29]法。
饮酒后头发中EtG 的质量分数常在pg/mg级,
(Milestone,意大利) 配有溶剂感应器，可以在同一条件
下（温度、压力）同时提取12组样品，内置控制系统用来控制提取EtG 的条件，烘箱最大功率1000W ，可以调节和维持所选定的温度。将处理好的头发样品加入
Sachs [22]最早分析头发中的EtG 时只能检测到ng/mg
级的目标物，灵敏度比较低。1993年以来，清洗、提取、衍生化及仪器检测各环节均得到不断改进，方法灵敏度逐渐提高，随着高灵敏度的液相或气相色谱串联质谱(LC-MS/MS、GC-MS/MS)的应用，最低检测限已达到0.7pg/mg[4]，各种分析方法的比较见表1。
8mL V （正己烷）∶V （水）=1∶1的混合物，混匀后即可进行微波辅助提取。设定110℃，10min ，完成后离心取
上清即可。
3.2衍生化
由于EtG 的分子量比较小、极性强，为了改善色
表1
头发中EtG 的分析方法及灵敏度比较
中国司法鉴定
续表1
2009年第3期（总第44期）
5结果分析及影响因素
随着分析方法的发展，已可检测到pg/mg级的头
在所有研究中，已知有酗酒行为者头发中EtG 的质量分数范围为0.03~13.3ng/mg[30]，而所有不饮酒者检查结果均为阴性。因此大于30pg/mg的质量分数被认为是酒精滥用的强有力证据。但在进行结果解释时，阴性结果并不能排除酒精滥用的情况。有研究表明，清洗过程不当或漂白、烫染等头发处理过程会使头发中EtG 的含量减少，出现假阴性结果[10]。同时头发易被汗液污染，若去污不彻底也可能出现假阳性结果。进行结果解释时应当结合多种因素，综合考虑。
发中EtG 质量分数。按照头发一般1cm/月的生长速度，从发根起采集一定长度的头发样品，可获得被检者某一特定时间的酒精滥用信息，区分酗酒者、日常饮酒者和不饮酒者，解决法庭科学和临床医学领域面临的诸多问题。
Alt 等[2]对31例头发样品（分别来自16例有酒精
滥用史的尸体；4例已明确诊断酒精滥用的病人；6例每天饮酒20g 的日常饮酒者；5例儿童）进行分析，其中18例检测到EtG ，但2例有酒精滥用史的尸体头发却未能发现EtG ，推测可能是受染发的影响。日常饮酒者和儿童的头发中未检测到EtG 。Skopp 等[3]在此基础上，分析了11例无烫染等处理的头发样品，其中
5.1漂白及色素
Yegles 等[10]用商品化的洗化用品对头发进行漂白，
发现EtG 的质量分数下降了78%。Appenzeller 等[24]研究了21个样本，EtG 质量分数范围为6~1239pg/mg，发现色素对头发中EtG 的质量分数没有影响。无色素头发与有色素头发中EtG 的质量分数无明显差异。
6例EtG 阳性，均为有酒精滥用史者。Yegles 等[10]还进
行了头发分段分析，发现不同段头发中EtG 的分布不同，从近头皮端到远端质量分数逐渐降低。
5.2稳定性
Kharbouche 等[28]对两例尸体头发样品进行分析，
在黑暗室温下放置几个月后，头发中EtG 的质量分数
27·
Chinese Journal of Forensic Sciences , 2009, No．3Total No.44仅下降15%，说明EtG 在头发基质中稳定性较好。
EtG 质量分数小于头发，其他部位（除阴毛、腋毛外）
的毛发中EtG 的质量分数与头发相似。
5.3与药物的作用
Paul 等[17]比较了滥用药物组（57例）与非用药组
（42例）的EtG 水平，发现有滥用药物行为者头发中的EtG 质量浓度明显比不用药者要低（图3）。Klys 等
[15]
5.5临界值
头发中的EtG 是一个很有应用价值的判断酒精
滥用的生物学标志，但至今仍无明确的界定值。对于设定区分酗酒者与日常饮酒者的临界值，目前不同的实验室有不同的指标。在以前的研究中发现，被诊断为酒精滥用的患者头发中EtG 质量分数介于30~
还研究了1例氯丙咪嗪对长期饮酒者的毒性，一方
面长期饮酒会加快药物代谢，因而酗酒者的药物剂量应有别于非饮酒者，另一方面，急性饮酒最基本的影响是阻断药物代谢，因此需要综合药物与酒精的相互作用。
13800pg/mg之间，因此Yegles 等[10]强烈建议将30pg/mg作为区分酗酒与日常饮酒的临界值。Bendroth
等[27]用100mg 头发测定EtG 时，也设定临界值是
30pg/mg，检测了65例头发样本，其中49例质量分数
为7.5~10400pg/mg，39例在临界值之上。Kintz 等[29]所在实验室根据文献报道的数据（表2），则设定50pg/
mg 为区分日常饮酒和酗酒的临界值。Kerekes 等[4]在比
较了头发和其他部位毛发分析结果之后，认为7pg/
mg 可作为区别饮酒（包括日常饮酒和酗酒）与非饮酒
的界定值，25pg/mg作为日常饮酒与酗酒者的界定值，Pragst 等[31]也认同此结果。
图3
滥用药物组与非用药组头发中EtG
质量浓度的比较
5.4不同部位毛发质量分数比较
当不能采集到头顶部的头发时，其他部位的毛发
是否可以替代头发是很多学者关注的。Kerekes 等[4]比较了32例头发、胡须、胸毛、腋毛、阴毛、腿毛等的
EtG 质量分数。32例中包括从不饮酒者，日常饮酒者
（10~40g/d）和酗酒者（＞60g/d），且25例的饮酒情况是已知的。以7pg/mg为区分饮酒与非饮酒者的界值，12例头发检测结果阴性，但其中5例阴毛EtG 质量分数大于7pg/mg；20例头发检测结果阳性，阴毛EtG 质量分数大于头发中的EtG 质量分数。Kintz 等[29]的研究也证实了这一结果。可能原因是头发的生长速度快（平均1cm/月），而阴毛几个月甚至几年才长1cm 。同时阴毛还可能受到尿液和汗液的污染。研究显示腋毛的
由于样本量有限，各实验室方法、条件不一，目前仍无公认的临界值，尚需进一步扩大样本量以确定此值，同时也应对各实验室的条件和分析方法予以考虑。
6
6.1
应用
法庭科学领域
常规检测头发中的EtG 可以作为血、
尿检查的辅
中国司法鉴定
助手段，判断醉酒驾驶，或在交通肇事逃逸案件中提供酒后驾车的证据。此外，很多滥用药物者都有酗酒的习惯，酒精和药物协同作用有时会加快代谢，导致死亡，分析死者头发中EtG 可以协助判断死因[23,31]。
目前检测头发中的EtG 已经被一些实验室[14,28]作为常规项目应用于法庭科学领域，表3显示了7个离婚案例中头发分析结果。7例样品中检测到的EtG 都在50pg/mg之上，其中2例头发分析结果显示除饮酒外未摄取其它违禁药物，而其他5例头发中还检测到了其它滥用药物。这些检测结果都在法庭上被用作证据，引导离婚案的宣判。
新生儿成长[32]。
2009年第3期（总第44期
）
Appenzeller [21]分析了15例在戒酒治疗中病人的
头发样本，质量分数范围为8~261pg/mg。其中一名头发漂白的病人头发中EtG 的质量分数最低，头发检测结果显示大部分病人EtG 的含量与慕尼黑酒精测试调查表（MALT ）中自我报告饮酒量相符。临床医生常依赖头发分析结果来了解戒酒情况，一般头发中EtG 质量分数的下降可以在戒酒一个月后从根部头发中检测到。根据图4显示：病人N 遵从戒酒治疗，头发中
EtG 的质量分数下降；相反，病人D 就没有听从医嘱，
而是持续饮酒；而病人L 则是戒酒一段时间后又复饮酒。头发分析可以帮助医生了解在治疗中病人有无遵从医嘱，制定下一步治疗计划。
6.2临床医学方面
头发分析EtG 可监测在酒精依赖性治疗过程中
的酒精使用情况，指导酗酒者的药物治疗，还可以预知新生儿疾病。现在有很多孕妇隐瞒了饮酒史，使得新生儿出生后患上胎儿酒精综合征（FAS ），早期无明显症状，不易察觉。若能通过头发EtG 分析对新生儿进行筛检，则可以尽早进行治疗，以免延误治疗影响
6.3其他方面应用
在职业卫生和其他社会领域，EtG 的研究结果还
可广泛应用于征兵、招工、驾驶能力测试、保险理赔等方面[21]。
图4戒酒治疗过程中病人头发中EtG 的含量
（Y 轴为EtG 的质量分数pg/mg，X 轴为靠近头皮头发的长度cm ）
7进一步研究方向
EtG 进入头发的机制尚不明确，酒精摄入量与头
发中EtG 的质量分数关系还需进一步探讨，毛囊自身的代谢、葡萄糖醛酸转移酶、酒精代谢酶对毛发中
EtG 质量分数的影响也有待研究[3]。从代谢组学、基因
组学等方面进一步研究毛发中EtG 的质量分数、分布以及结合机制，并与其他酒精生物学标志（如脂肪酸乙酯，乙基硫酸酯等）相结合，科学解释毛发分析结果，是进一步研究的方向。
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(本文编辑:卓先义)