June2012，Vol.4，No.2中国癌症防治杂志2012年6月第4卷第2期ChinJofOncolPrevandTreat，
·123·
·肝癌专栏·基础研究
肝癌耐药细胞株的建立及癌干细胞的特性
陶璐1蔡捷3邝晓聪2陈相宜1作者单位：530021南宁
1
23
广西医科大学研究生学院；广西医科大学病理生理学教研室；广西医科大学实验中心
【摘要】目的建立肝癌耐药细胞株，并观察耐药细胞株癌干细胞的相关生物学特性。方法采用阿霉素（ADM）浓度梯度递增法诱导建立耐药BEL-7404人肝癌细胞株，并对亲代与耐药肝癌细胞株进行癌细胞基本特性、癌干细胞相关细胞学倍增时间与MTT法测耐药倍数；单个细胞成株培养、平板克隆形成实验、特性进行检测，用计数法检测癌细胞生长曲线、“球囊”细胞培养实验。结果耐药BEL-7404人肝癌细胞与亲本细胞相似，呈上皮样生长方式，但其中梭状细胞略多，耐生长曲线表明其增殖速度明显低于亲本BEL-7404人肝癌细胞，且倍增时间增加；耐药BEL-7404肝癌药倍数为292倍；
“球囊”细胞形成率均明显低于其亲本BEL-7404人肝癌细胞。结论低浓度阿霉素持续增量法可诱导细胞克隆形成率、
形成耐药肝癌细胞株，但耐药肝癌细胞株的癌干细胞特征并不明显。【关键词】肝肿瘤；耐药性；癌干细胞；耐药诱导【中图分类号】R735.7
【文献标识码】A
【文章编号】1674-5671(2012)02-04
doi:10.3969/j.issn.1674-5671.2012.02.07
Establishmentofadrug-resistantlivercancercelllineanditscancerstemcellcharacteris-tics
112
TAOLu1，CAIJie3，KUANGXiao-cong2，CHENXiang-yi（GraduateSchoolofGuangxiMedicalUniversity；DepartmentofPathophysi-3ology，GuangxiMedicalUniversity；ExperimentalCenter，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，P.R.China）
Correspondingauthor：KUANGXiao-cong；E-mail：[1**********]@139.com
【Abstract】ObjectiveToestablishadrug-resistantlivercancercelllineandexamineitscancerstemcellcharacteristics.MethodsThedrug-resistantcelllineBEL-7404wasinducedusingaconcentrationgradientofadriamycin（ADM）.Basiccharacteristicsofthesuchascellgrowth，celldoublingtime，cellcy-drug-resistantcelllinewereanalyzedandcomparedtothoseoftheparentalcellline，
cle，resistanceindex（RI），singlecellculture，colonyformationandballooncellculture.ResultsSimilartoitsparentalcellline，thebutwithslightlymorespindlecells.BEL-7404cellshadanRIofdrug-resistantBEL-7404lineshowedanepithelioidgrowthpattern，
292，andtheircellproliferationratewassignificantlyslowerthanthatoftheparentalcells，withincreasedcelldoublingtimeandsig-nificantlylowerratesofcolonyformationandballooncellformation.ConclusionsSustainedincrementalexposuretolowconcentra-tionsofADMcaninduceadrug-resistantcellline，thoughthecancerstemcellcharacteristicsofthislinearenotobvious.【Keywords】Liverneoplasms；Resistance；Cancerstemcells；Resistanceinduced
目前研究认为癌干细胞（cancerstemcell，CSC）是一类具有自我更新、增殖和分化的癌细胞，在肿瘤组织中存在数量极少，以类似干细胞的角色在肿瘤形成和生长中起着决定性的作用。近年研究表明CSC
多表达ABCG1、ABCG2和BCRP等耐药相关分子，可将药物泵出细胞，表现出耐药特性；CSC极有可能是造成肿瘤耐药的最根本原因之一；还有学者通过拒染Hoechst3334荧光染料，采用流式细胞术分离出SP（side
【基金项目】：国家自然科学基金资助项目（30860326）；广西自然科学基金资助项目（桂科自0991139）；广西科技创新能力与条件建设项目资助
（桂科改0993003C-1）
【通讯作者】：邝晓聪。E-mail:[1**********]@139.com
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population）细胞，以此作为富集和纯化CSC的方式及
重要模式，是研究CSC的重要基本技术［1，2］
。因此，基
于CSC耐药特性进行CSC纯化与富集模式研究的不断深入，本研究以体外建立耐药细胞系干预模式为基础，建立BEL-7404人肝癌细胞株，并观察耐药细胞株的癌干细胞的相关生物学特性，为建立富集CSC体外模式进行实验探索研究。1材料与方法1.1细胞株
人肝癌细胞株BEL-7404购于中山大学细胞库。1.2
主要试剂与仪器设备
RPMI1640培养液(美国Hyclone公司)、胎牛血清(FBS，美国Hyclone公司)、Water-JacketCO2培养箱（美国ThermoForma公司）、流式细胞仪（美国BD公司）、倒置光学显微镜（NIKON公司）、噻唑蓝(MTT，华美公司)、
MK3型酶标仪美国(Thermo公司)、人胚胎干细胞培养基（mTeSRTM1）（STEMCELLTECH-NOLOGIES公司）。1.3实验方法
1.3.1
细胞耐药诱导模式的建立
采用阿霉素
ADM）浓度梯度递增法诱导细胞耐药。取对数生长期的BEL-7404细胞，光镜下观察细胞生长至铺满70%瓶底面积时，将培养基换成含0.01μg/mlADM、20%FBS的RPMI1640培养基；待细胞生长状态良好后，根据存活细胞增殖情况逐级提高药物浓度；如此反复，直到细胞能在含1.2μg/mlADM的RPMI1640培养液中稳定、良好地生长，并能持续传代；BEL-7404耐药细胞株用“7404/ADM（浓度）”表示，如7404/ADM（1.2μg/ml）为BEL-7404耐1.2μg/mlADM的细胞株。1.3.2
亲本与耐药细胞生长曲线和倍增时间的测定调整亲本与耐药细胞密度至5×104个/ml，每孔0.4ml接种到24孔板，每日计数2孔取平均值，连续观察7d，根据公式细胞倍增时间（Td）计算公式：Td（h）=T×log2/（lgN1-lgN0）。1.3.3
亲本耐药细胞株耐药倍数的检测
MTT法测
定耐药指数，将处于对数生长期的亲本细胞和耐药细胞调整细胞浓度至1×105个/ml，每孔100μl接种于96孔培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。弃除孔内上清液，分别加入用倍比稀释法稀释的ADM溶液，并设立空白对照组。培养24h，去上清，用酶标
仪在波长490nm下检测吸光度值（OD值）。根据公式计算抑制率（%）＝（1-实验孔OD值/对照孔OD值）×100%，并计算出IC50值及其耐药指数（RI）。1.3.4
单个细胞成克隆实验
消化细胞，将细胞悬液
稀释至极低密度，每100μl培养基中含有1个细胞，以每孔100μl接种于96孔板后，倒置显微镜下观察记录含有单个细胞的孔数，置于培养箱培养中，每2~3d加25μl培养基。培养2周，计算显微镜下计数大于70个细胞的克隆个数。计算单克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100%。1.3.5
细胞克隆形成能力平板克隆形成试验
调整
细胞密度为1×103个/ml。
6孔板中每孔加入细胞悬液1ml置于培养箱中培养7d。计算显微镜下计数大于70个细胞的克隆个数。克隆形成率（‰）=克隆数/接种细胞数×1000‰。1.3.6“球囊”形成实验
分别取对数生长期的BEL-7404及BEL-7404/ADM细胞，消化后用人胚胎干细胞基础培养基重悬，密度调整为1×104/ml，种入培养瓶中，置培养箱中培养，观察细胞生长情况。1.4
统计学方法
采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料的比较用t检验;计数资料比较用χ2检验，P
2.1耐药细胞株的诱导及其诱导过程中形态学变化倒置相差显微镜观察：BEL-7404细胞为上皮样细胞，即扁平，多角形，呈“铺路石”样排列，可见巨核、多核细胞，核分裂象多见，核浆比例增大，核仁明显，为典型的鳞状上皮细胞的形态。见图1。BEL-7404/ADM细胞同样呈上皮样单层排列贴壁生长，但细胞大小不一，部分细胞变形，并可见体积增大的异形细胞，且细胞增殖速度明显减慢。见图2
。
（
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2.2亲本与耐药细胞生长曲线和倍增时间的测定亲本与耐药细胞每日计数2孔取平均值，连续观察
2.3亲本与耐药细胞耐药倍数
本实验成功地诱导了耐药细胞株，7404/ADM
7d后绘制生长曲线。人肝癌耐药细胞株BEL-7404/ADM的增殖能力显著降低，表现为细胞生长曲线增长缓慢，倍增时间由33.82h延长至95.97h。见图3。
表1
（0.2μg/ml）细胞的IC50为90.58，耐药倍数将近29倍，7404/ADM（0.4μg/ml）细胞的IC50为49.34，耐药倍数将近292倍。见表1。
BEL-7404耐药细胞的耐药试验结果
）抑制率（%
ADM（μg/ml）100202512.56.253.131.560.780.390.120.090.05IC50（μg/ml）耐药指数RI
7404/ADM（0.2μg/ml）
51.2344.2441.1636.6731.3524.4522.4520.2117.463.6612.068.9090.5829.28
BEL-740491.2284.0577.1667.4666.0658.4726.2835.145.4819.9620.242.393.09
7404/ADM（0.4μg/ml）
54.4244.3636.2837.0729.6822.2818.0314.114.2610.191.795.1549.34292.98
BEL-740494.1893.8992.4789.2082.9578.8474.4371.1659.8050.9940.91
89.20
2.4细胞平板克隆形成能力
单个细胞成克隆培养及平板克隆形成实验在
细胞BEL-7404
表2亲本细胞株与耐药细胞平板克隆形成结果n44
单克隆形成率（%）平板克隆形成率（‰）
21.60±6.220.02±0.01△
161.25±18.30113.75±18.89△
BEL-7404亲本细胞单细胞的克隆形成率和平板克隆形成率分别为（21.60±6.22）%和（161.25±18.30）‰，而BEL-7404/ADM细胞单细胞的克隆形成率和平板克隆形成率分别为（0.02±0.01）%和（113.75±18.89）‰。见表2
。
BEL-7404/ADM
注：分别与BEL-7404耐药细胞系的单克隆形成率、平板克隆形成率
△
比较，P
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June2012，Vol.4，No.2中国癌症防治杂志2012年6月第4卷第2期ChinJofOncolPrevandTreat，
2.5“球囊”形成能力
培养第7~14天BEL-7404亲本细胞，细胞悬浮，聚集成团。BEL-7404/ADM耐药细胞，悬浮细胞存在，细胞边界不清且皱缩。见图4。
3讨论
能够耐受化疗药物的杀伤作用是癌的恶性特征之一，近年来研究发现其基础是癌细胞群中包含癌干细胞，提示癌干细胞可有较强耐药特性。在本研究中，采用阿霉素（ADM）浓度梯度递增诱导法建立的BEL-7404/ADM细胞株，耐药指数高达292倍，并且以亲本细胞作为对照，观察其癌细胞与癌干细胞生物学特性的变化。
结果人肝癌耐药细胞株BEL-7404/ADM的增殖能力显著降低，表现为细胞生长曲线增长缓慢，倍增时间由33.82h延长至95.97h，进一步研究其癌干细胞的“干性”特征，发现耐药细胞株的克隆形成率降低，单个细胞培养中成克隆的能力减弱，在干细胞培养基中，“球囊”形成率也明显低于亲本细胞，提示经过耐药诱导处理后，
BEL-7404人肝癌细胞株的“干性”反而减弱了。以上实验结果均不支持本研究中体外ADM浓度梯度递增法为富集肝癌干细胞的首选模式，但其中具体作用方式与实验结果值得进一步分析。
在癌干细胞研究领域中根据癌干细胞的耐药特性设计富集模式的基础手段，主要分为体外与在体富集模式，本研究主要以体外施加化疗药物富集癌干细
胞的模式。目前Ma等［3］
采用顺铂与紫杉醇联合干预
SKOV3卵巢癌细胞系，随后形成“悬浮球”，对阿霉素、紫杉醇、甲氨喋呤以及顺铂有耐药性，并且高表达Oct4、Nanog、nestin、sox2等“干性”基因与干细胞因子受体CD117，
表明经过化疗药物干预后可富集癌干细胞，后续检测也凸显其癌干细胞特性，提示该模式可以是癌干细胞有效的富集模式。所以在以耐药为基础的癌干细胞富集模式设计中，应当考虑癌细胞与化疗药物种类匹配、作用时间与强度等因素。
针对本研究有以下思考：在体外诱导模式中，化疗药物ADM作用时间过长，从耐药干预到耐药细胞株的建立经过8个月，
且细胞在形态与行为学明显改变，细胞特性可能已经明显异化，因而不能富集目前研究中获取所期望的癌干细胞类型。也说明低浓度阿霉素持
续增量法可诱导形成耐药肝癌细胞株，并不是有效富集特定的肝癌干细胞的模式，但可以作为癌干细胞富集模式设计的教训与借鉴。根据癌细胞异质性的相关
假说肿瘤干细胞模型和克隆进化模型［4］，进一步分析
本研究干预模式所获取的耐药细胞株是否包含另一种类型的癌干细胞，与目前所关注的癌干细胞类型不同，其特点可能是增殖周期长且耐药性强，是否存在新的癌干细胞亚群，还需要做进一步的研究。
参考文献
［1］MichaelD，TitoF，SusanB.Tumourstemcellsanddrugresistance
［J］.NatRevCancer，2005，5:275-284.
［2］PatrawalaL，CalhounT，Schneider-BroussardR，etal.Sidepopula-tionisenrichedintumorigenic，stem-likecancercells，whereasABCG2+andABCG2-cancercellsaresimilarlytumorigenic［J］.CancerRes，2005，65:（14）:6207-6219.
［3］MaL，LaiD，LiuT，etal.Cancerstem-likecellscanbeisolatedwith
drugseletioninhumanovariancancercelllineSKOV3［J］.ActaBiochimBiophysSin，2010，42（9）:593-602.
［4］MaenhautC，DumontJE，RogerPP，etal.Cancerstemcells:areali-ty，amyth，afuzzyconceptoramisnomer?Ananalysis［J］.Carcino-genesis，2010，31（2）:149-158.
［2012-03-05收稿］［2012-04-09修回］［编辑阮萃才
］
June2012，Vol.4，No.2中国癌症防治杂志2012年6月第4卷第2期ChinJofOncolPrevandTreat，
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·肝癌专栏·基础研究
肝癌耐药细胞株的建立及癌干细胞的特性
陶璐1蔡捷3邝晓聪2陈相宜1作者单位：530021南宁
1
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广西医科大学研究生学院；广西医科大学病理生理学教研室；广西医科大学实验中心
【摘要】目的建立肝癌耐药细胞株，并观察耐药细胞株癌干细胞的相关生物学特性。方法采用阿霉素（ADM）浓度梯度递增法诱导建立耐药BEL-7404人肝癌细胞株，并对亲代与耐药肝癌细胞株进行癌细胞基本特性、癌干细胞相关细胞学倍增时间与MTT法测耐药倍数；单个细胞成株培养、平板克隆形成实验、特性进行检测，用计数法检测癌细胞生长曲线、“球囊”细胞培养实验。结果耐药BEL-7404人肝癌细胞与亲本细胞相似，呈上皮样生长方式，但其中梭状细胞略多，耐生长曲线表明其增殖速度明显低于亲本BEL-7404人肝癌细胞，且倍增时间增加；耐药BEL-7404肝癌药倍数为292倍；
“球囊”细胞形成率均明显低于其亲本BEL-7404人肝癌细胞。结论低浓度阿霉素持续增量法可诱导细胞克隆形成率、
形成耐药肝癌细胞株，但耐药肝癌细胞株的癌干细胞特征并不明显。【关键词】肝肿瘤；耐药性；癌干细胞；耐药诱导【中图分类号】R735.7
【文献标识码】A
【文章编号】1674-5671(2012)02-04
doi:10.3969/j.issn.1674-5671.2012.02.07
Establishmentofadrug-resistantlivercancercelllineanditscancerstemcellcharacteris-tics
112
TAOLu1，CAIJie3，KUANGXiao-cong2，CHENXiang-yi（GraduateSchoolofGuangxiMedicalUniversity；DepartmentofPathophysi-3ology，GuangxiMedicalUniversity；ExperimentalCenter，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，P.R.China）
Correspondingauthor：KUANGXiao-cong；E-mail：[1**********]@139.com
【Abstract】ObjectiveToestablishadrug-resistantlivercancercelllineandexamineitscancerstemcellcharacteristics.MethodsThedrug-resistantcelllineBEL-7404wasinducedusingaconcentrationgradientofadriamycin（ADM）.Basiccharacteristicsofthesuchascellgrowth，celldoublingtime，cellcy-drug-resistantcelllinewereanalyzedandcomparedtothoseoftheparentalcellline，
cle，resistanceindex（RI），singlecellculture，colonyformationandballooncellculture.ResultsSimilartoitsparentalcellline，thebutwithslightlymorespindlecells.BEL-7404cellshadanRIofdrug-resistantBEL-7404lineshowedanepithelioidgrowthpattern，
292，andtheircellproliferationratewassignificantlyslowerthanthatoftheparentalcells，withincreasedcelldoublingtimeandsig-nificantlylowerratesofcolonyformationandballooncellformation.ConclusionsSustainedincrementalexposuretolowconcentra-tionsofADMcaninduceadrug-resistantcellline，thoughthecancerstemcellcharacteristicsofthislinearenotobvious.【Keywords】Liverneoplasms；Resistance；Cancerstemcells；Resistanceinduced
目前研究认为癌干细胞（cancerstemcell，CSC）是一类具有自我更新、增殖和分化的癌细胞，在肿瘤组织中存在数量极少，以类似干细胞的角色在肿瘤形成和生长中起着决定性的作用。近年研究表明CSC
多表达ABCG1、ABCG2和BCRP等耐药相关分子，可将药物泵出细胞，表现出耐药特性；CSC极有可能是造成肿瘤耐药的最根本原因之一；还有学者通过拒染Hoechst3334荧光染料，采用流式细胞术分离出SP（side
【基金项目】：国家自然科学基金资助项目（30860326）；广西自然科学基金资助项目（桂科自0991139）；广西科技创新能力与条件建设项目资助
（桂科改0993003C-1）
【通讯作者】：邝晓聪。E-mail:[1**********]@139.com
·124·
June2012，Vol.4，No.2中国癌症防治杂志2012年6月第4卷第2期ChinJofOncolPrevandTreat，
population）细胞，以此作为富集和纯化CSC的方式及
重要模式，是研究CSC的重要基本技术［1，2］
。因此，基
于CSC耐药特性进行CSC纯化与富集模式研究的不断深入，本研究以体外建立耐药细胞系干预模式为基础，建立BEL-7404人肝癌细胞株，并观察耐药细胞株的癌干细胞的相关生物学特性，为建立富集CSC体外模式进行实验探索研究。1材料与方法1.1细胞株
人肝癌细胞株BEL-7404购于中山大学细胞库。1.2
主要试剂与仪器设备
RPMI1640培养液(美国Hyclone公司)、胎牛血清(FBS，美国Hyclone公司)、Water-JacketCO2培养箱（美国ThermoForma公司）、流式细胞仪（美国BD公司）、倒置光学显微镜（NIKON公司）、噻唑蓝(MTT，华美公司)、
MK3型酶标仪美国(Thermo公司)、人胚胎干细胞培养基（mTeSRTM1）（STEMCELLTECH-NOLOGIES公司）。1.3实验方法
1.3.1
细胞耐药诱导模式的建立
采用阿霉素
ADM）浓度梯度递增法诱导细胞耐药。取对数生长期的BEL-7404细胞，光镜下观察细胞生长至铺满70%瓶底面积时，将培养基换成含0.01μg/mlADM、20%FBS的RPMI1640培养基；待细胞生长状态良好后，根据存活细胞增殖情况逐级提高药物浓度；如此反复，直到细胞能在含1.2μg/mlADM的RPMI1640培养液中稳定、良好地生长，并能持续传代；BEL-7404耐药细胞株用“7404/ADM（浓度）”表示，如7404/ADM（1.2μg/ml）为BEL-7404耐1.2μg/mlADM的细胞株。1.3.2
亲本与耐药细胞生长曲线和倍增时间的测定调整亲本与耐药细胞密度至5×104个/ml，每孔0.4ml接种到24孔板，每日计数2孔取平均值，连续观察7d，根据公式细胞倍增时间（Td）计算公式：Td（h）=T×log2/（lgN1-lgN0）。1.3.3
亲本耐药细胞株耐药倍数的检测
MTT法测
定耐药指数，将处于对数生长期的亲本细胞和耐药细胞调整细胞浓度至1×105个/ml，每孔100μl接种于96孔培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。弃除孔内上清液，分别加入用倍比稀释法稀释的ADM溶液，并设立空白对照组。培养24h，去上清，用酶标
仪在波长490nm下检测吸光度值（OD值）。根据公式计算抑制率（%）＝（1-实验孔OD值/对照孔OD值）×100%，并计算出IC50值及其耐药指数（RI）。1.3.4
单个细胞成克隆实验
消化细胞，将细胞悬液
稀释至极低密度，每100μl培养基中含有1个细胞，以每孔100μl接种于96孔板后，倒置显微镜下观察记录含有单个细胞的孔数，置于培养箱培养中，每2~3d加25μl培养基。培养2周，计算显微镜下计数大于70个细胞的克隆个数。计算单克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100%。1.3.5
细胞克隆形成能力平板克隆形成试验
调整
细胞密度为1×103个/ml。
6孔板中每孔加入细胞悬液1ml置于培养箱中培养7d。计算显微镜下计数大于70个细胞的克隆个数。克隆形成率（‰）=克隆数/接种细胞数×1000‰。1.3.6“球囊”形成实验
分别取对数生长期的BEL-7404及BEL-7404/ADM细胞，消化后用人胚胎干细胞基础培养基重悬，密度调整为1×104/ml，种入培养瓶中，置培养箱中培养，观察细胞生长情况。1.4
统计学方法
采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料的比较用t检验;计数资料比较用χ2检验，P
2.1耐药细胞株的诱导及其诱导过程中形态学变化倒置相差显微镜观察：BEL-7404细胞为上皮样细胞，即扁平，多角形，呈“铺路石”样排列，可见巨核、多核细胞，核分裂象多见，核浆比例增大，核仁明显，为典型的鳞状上皮细胞的形态。见图1。BEL-7404/ADM细胞同样呈上皮样单层排列贴壁生长，但细胞大小不一，部分细胞变形，并可见体积增大的异形细胞，且细胞增殖速度明显减慢。见图2
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（
June2012，Vol.4，No.2中国癌症防治杂志2012年6月第4卷第2期ChinJofOncolPrevandTreat，
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2.2亲本与耐药细胞生长曲线和倍增时间的测定亲本与耐药细胞每日计数2孔取平均值，连续观察
2.3亲本与耐药细胞耐药倍数
本实验成功地诱导了耐药细胞株，7404/ADM
7d后绘制生长曲线。人肝癌耐药细胞株BEL-7404/ADM的增殖能力显著降低，表现为细胞生长曲线增长缓慢，倍增时间由33.82h延长至95.97h。见图3。
表1
（0.2μg/ml）细胞的IC50为90.58，耐药倍数将近29倍，7404/ADM（0.4μg/ml）细胞的IC50为49.34，耐药倍数将近292倍。见表1。
BEL-7404耐药细胞的耐药试验结果
）抑制率（%
ADM（μg/ml）100202512.56.253.131.560.780.390.120.090.05IC50（μg/ml）耐药指数RI
7404/ADM（0.2μg/ml）
51.2344.2441.1636.6731.3524.4522.4520.2117.463.6612.068.9090.5829.28
BEL-740491.2284.0577.1667.4666.0658.4726.2835.145.4819.9620.242.393.09
7404/ADM（0.4μg/ml）
54.4244.3636.2837.0729.6822.2818.0314.114.2610.191.795.1549.34292.98
BEL-740494.1893.8992.4789.2082.9578.8474.4371.1659.8050.9940.91
89.20
2.4细胞平板克隆形成能力
单个细胞成克隆培养及平板克隆形成实验在
细胞BEL-7404
表2亲本细胞株与耐药细胞平板克隆形成结果n44
单克隆形成率（%）平板克隆形成率（‰）
21.60±6.220.02±0.01△
161.25±18.30113.75±18.89△
BEL-7404亲本细胞单细胞的克隆形成率和平板克隆形成率分别为（21.60±6.22）%和（161.25±18.30）‰，而BEL-7404/ADM细胞单细胞的克隆形成率和平板克隆形成率分别为（0.02±0.01）%和（113.75±18.89）‰。见表2
。
BEL-7404/ADM
注：分别与BEL-7404耐药细胞系的单克隆形成率、平板克隆形成率
△
比较，P
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June2012，Vol.4，No.2中国癌症防治杂志2012年6月第4卷第2期ChinJofOncolPrevandTreat，
2.5“球囊”形成能力
培养第7~14天BEL-7404亲本细胞，细胞悬浮，聚集成团。BEL-7404/ADM耐药细胞，悬浮细胞存在，细胞边界不清且皱缩。见图4。
3讨论
能够耐受化疗药物的杀伤作用是癌的恶性特征之一，近年来研究发现其基础是癌细胞群中包含癌干细胞，提示癌干细胞可有较强耐药特性。在本研究中，采用阿霉素（ADM）浓度梯度递增诱导法建立的BEL-7404/ADM细胞株，耐药指数高达292倍，并且以亲本细胞作为对照，观察其癌细胞与癌干细胞生物学特性的变化。
结果人肝癌耐药细胞株BEL-7404/ADM的增殖能力显著降低，表现为细胞生长曲线增长缓慢，倍增时间由33.82h延长至95.97h，进一步研究其癌干细胞的“干性”特征，发现耐药细胞株的克隆形成率降低，单个细胞培养中成克隆的能力减弱，在干细胞培养基中，“球囊”形成率也明显低于亲本细胞，提示经过耐药诱导处理后，
BEL-7404人肝癌细胞株的“干性”反而减弱了。以上实验结果均不支持本研究中体外ADM浓度梯度递增法为富集肝癌干细胞的首选模式，但其中具体作用方式与实验结果值得进一步分析。
在癌干细胞研究领域中根据癌干细胞的耐药特性设计富集模式的基础手段，主要分为体外与在体富集模式，本研究主要以体外施加化疗药物富集癌干细
胞的模式。目前Ma等［3］
采用顺铂与紫杉醇联合干预
SKOV3卵巢癌细胞系，随后形成“悬浮球”，对阿霉素、紫杉醇、甲氨喋呤以及顺铂有耐药性，并且高表达Oct4、Nanog、nestin、sox2等“干性”基因与干细胞因子受体CD117，
表明经过化疗药物干预后可富集癌干细胞，后续检测也凸显其癌干细胞特性，提示该模式可以是癌干细胞有效的富集模式。所以在以耐药为基础的癌干细胞富集模式设计中，应当考虑癌细胞与化疗药物种类匹配、作用时间与强度等因素。
针对本研究有以下思考：在体外诱导模式中，化疗药物ADM作用时间过长，从耐药干预到耐药细胞株的建立经过8个月，
且细胞在形态与行为学明显改变，细胞特性可能已经明显异化，因而不能富集目前研究中获取所期望的癌干细胞类型。也说明低浓度阿霉素持
续增量法可诱导形成耐药肝癌细胞株，并不是有效富集特定的肝癌干细胞的模式，但可以作为癌干细胞富集模式设计的教训与借鉴。根据癌细胞异质性的相关
假说肿瘤干细胞模型和克隆进化模型［4］，进一步分析
本研究干预模式所获取的耐药细胞株是否包含另一种类型的癌干细胞，与目前所关注的癌干细胞类型不同，其特点可能是增殖周期长且耐药性强，是否存在新的癌干细胞亚群，还需要做进一步的研究。
参考文献
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［4］MaenhautC，DumontJE，RogerPP，etal.Cancerstemcells:areali-ty，amyth，afuzzyconceptoramisnomer?Ananalysis［J］.Carcino-genesis，2010，31（2）:149-158.
［2012-03-05收稿］［2012-04-09修回］［编辑阮萃才
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