生物技术通报
#技术与方法#
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2006年第1期
胚胎干细胞建系方法
梁琳 王振飞 李煜
(内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室,呼和浩特 010021)
摘 要: 胚胎干细胞具有的独特特征)))分化全能性是生物学各研究领域多年来的热点之一。胚胎干细胞独特的生物学特征在生殖细胞与体细胞及动物个体之间建立了广泛的联系。胚胎干细胞应用前景有着巨大的潜力。为此,对其培养建系的完善性研究显得格外重要。在此,对胚胎干细胞建系方法方面做一简要综述,尤其对建系过程中内细胞团的分离方法及干细胞集落的获取方法进行探讨。
关键词: 胚胎干细胞 饲养层 内细胞团分离 细胞增殖 集落ICM
MethodofEstablishingEmbryonicStem(ES)Cellline
LiangLin WangZhenfei LiYu
(KeyLaboratoryofMammalReproductiveBiologyandBiotechnology,MinistryofEducation,
InnerMongoliaUniversity,Huhhot,China 010021)
Abstract: EmbryonicStem(ES)Cellwhichpossestheomnipotenceandtheabilitytoproliferateindefinitelyinvitro,ThespecialfeatheristheHotspotofbiologicalresearchfield.EmbryonicStem(ES)Cellsconnectsomaticcellandgermcellwithindividualanimal.thattheyhavegreatapplicationsperspectiveinphysic.CultureandestablishtheEScelllinesisbecomingimportantasthewidelyusedofEScells.ThisarticlegivesasummaryinthemethodofestablishingtheEScelllines,especiallyintheisolationoftheICMandtheESclones.
Keywords:
EScell Feeder LIF Cellproliferation ICMisolation
胚胎干细胞(EScells)是从早期胚胎内细胞团(ICM)或桑椹胚分离出来的高度未分化的全能性细胞。体外培养的胚胎干细胞经诱导可分化为不同类型的组织细胞,在研究组织分化、组织修复、外源基因导入等许多领域被广泛地应用。胚胎干细胞建系,要求原代细胞具有良好的多向分化潜能,同时要求在传代过程中始终保持这种特性而不发生分化。ES细胞的分离、培养和建系方法多种多样,近年来这方面的研究取得了一些新的成就,本文就此进行讨论。
时间保持ES细胞的原初特性。用作饲养层的细胞多数是具有贴附能力的细胞(如成纤维细胞、子宫内皮细胞、3T3细胞、肿瘤细胞等)。接种ES细胞之前必须对饲养层细胞进行有丝分裂阻断,使其保持活力但不会增殖。由于细胞外基质中存在大量锚定的LIF因子,从而可抑制ES细胞分化,维持ES细胞的增殖和多能性
[1]
。饲养层的存在更好地模拟了
体内的生存环境,有利于ES细胞保持旺盛的增殖能力和维持低分化状态。
C射线及丝裂霉素C均可抑制饲养层增殖。制备饲养层细胞时,培养皿也可预先用明胶(gelatin0.1%)处理,以增加细胞的贴壁能力和对ES细胞的粘附性。在培养过程中,饲养层产生分化抑制因子和增殖促进因子的能力逐渐降低,故一周后不可再使用。
小鼠胚胎原代成纤维细胞(PMEF)饲养层可用
1 建立ES细胞培养体系的方法
1.1 有饲养层培养体系
胚胎干细胞是动物个体发生过程中具有全能性的原始细胞,维持ES细胞的不分化状态由细胞内一些结构蛋白和多肽因子进行内源性调控。体外培养的ES细胞,接种在饲养层细胞上培养时可以长
收稿日期:2005-11-28作者简介:梁琳(1981-),女,蒙古族,内蒙古大学在读硕士,主要从事细胞培养方面的研究,Email:[email protected]
2006年第1期 梁琳等:胚胎干细胞建系方法
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于大多数动物ES细胞的培养,但不同种类动物胚胎所需的最佳饲养层不尽相同。Thomson于1998年报道了利用小鼠STO细胞做饲养层,培养人受精卵发育的内胚团细胞,建立了人的ES细胞系。Shamblott于5~6周流产胎儿的生殖嵴细胞建立了人EG细胞系[3]。从小鼠STO饲养层细胞培养液中提取的分化抑制因子(DIA)能部分抑制EC细胞分化,但较PMEF培养的内细胞团中分离的ES细胞存活率及嵌合力低[4]]。
其他饲养层作用类似:胎牛肝成纤维细胞(BFLF)作为饲养层可用于培养分离到绵羊和山羊类ES细胞[5],原代鸡胚成纤维细胞饲养层可使小鼠ES细胞克隆传10代以上[6]。ES细胞在肿瘤细胞饲养层上生长也较旺盛[7~8]。
1.2 无饲养层培养体系
饲养层细胞分泌的因子难以支持某些ES细胞的增殖。ES细胞也可在无饲养层细胞的环境中建立和维持
[9]
[2]
ers等发现LIF对牛ES细胞的分离克隆无积极作用;Booth认为无血清培养基中维持猪ES细胞克隆必须有高浓度的LIF(10ng/ml),而Shim认为猪ES细胞分离培养时,STO饲养层或PGC本身产生的因子就足以维持其存活和增殖,外源性LIF并非必须。
MakinoH等认为鼠类ES细胞也可以在固定的LIF因子上进行培养,其方法是合成明胶和LIF因子的混合物,将其铺在聚苯乙烯平皿上,晾干洗涤至LIF不再释放[13]。
2 胚胎采集
分离具有发育全能性的ES细胞,要求选择合适阶段的胚胎。采卵时一般取囊胚或后期桑椹胚。胚胎体外培养时间过长也影响建系成功率。目前,各种动物一般采用囊胚期胚胎来分离ES细胞。在小鼠试验中观察,桑椹胚贴壁时间早、贴壁率高于囊胚;但贴壁后易退化且传代情况不佳。这可能是由于对体外培养系统适应能力不如囊胚
[14]
,培养液中添加LIF因子或使用能分泌。
LIF的细胞制备条件培养液均可。例如用大鼠肝细
胞(BRL)培养液制备大鼠肝细胞条件培养基(BRL-CM)或2~3周龄大鼠心肌细胞培养基(RH–CM)。含70%RH-CM的ES细胞培养基可以在10~20代内维持其未分化状态和正常二倍体核型[10]。从小鼠STO饲养层细胞培养液中提取的分化抑制因子(DIA)能部分抑制EC细胞分化,但较PMEF培养的内细胞团中分离的ES细胞存活率及嵌合力低[4]。用于制备条件培养基的还有HBC(人膀胱癌细胞株5637)和PSA-1、T3细胞(均为小鼠EC细胞)等。也有学者认为LIF不能完全取代饲养层的作用[11]。
在体外分离克隆ES细胞时,除利用饲养层和添加外源LIF外,杜宪兴等将外源LIF的cDNA引入ES细胞,建立了过度分泌LIF的ESL(+)细胞株。可以在无外源LIF的常规培养液中传13代以上,可完全脱离外源性LIF。
在一定浓度范围内,LIF与ES细胞克隆效率之间存在量效关系。浓度达到1000~5000IU/ml时,从增殖的ICM分离ES细胞的效率可达95%以上。但对于家畜则争论较大:如sSaito认为LIF有[12]
3 ICM的获取
从着床前的胚泡中分离内细胞团,是从早期胚胎建立ES细胞系的先决条件。常用的免疫外科手术法、组织培养法和机械剥离法等,均可分离获得全能性ICM。3.1 直接分离法
此方法是将囊胚放在饲养层上让其自然孵出透明带,贴附于饲养层。待ICM细胞扩大增殖时挑出分离,移到铺有新饲养层的培养皿。若内胚层样细胞形成则使得ES细胞增殖力降低且极易分化,故操作时选择消化时机非常重要。也可使用链酶蛋白酶处理或机械切割将透明带除去,获得裸胚直接培养。
3.2 免疫分离法
为了避免滋胚层细胞对ICM的竞争性抑制和诱导分化作用,可以根据补体溶解抗原-抗体复合物的免疫学原理,去除滋养层细胞,保留ICM细胞进行培养。
操作时收集发育到囊胚晚期的胚泡,先用0.5%链酶蛋白酶去除透明带,洗涤3次后转移至补体灭活的兔抗鼠脾细胞抗血清中(分离小鼠的ES细),i
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生物技术通报Biotechnology Bulletin
2006年第1期
[20]
中。处理10~30分钟左右,胚泡的滋养外胚层细胞被破坏即成泡状,此时转移洗涤,微滴不宜过小,否则抗体和补体不易结合上去。吸取ICM细胞移到铺有饲养层的平皿。经过培养,约一周可以传代。分别使用抗体补体的二步法较繁琐,可以用一步法简化操作,即直接去除裸露胚泡的滋胚层。将裸露胚泡置于含有未灭活抗血清的和培养液1B4比例的微滴中约10分钟,待滋胚层溶解后,即囊胚腔萎缩变小时,迅速移入不含抗血清的培养液中洗涤洗液中[15]。
3.3 热休克法
在小鼠中有热休克法的报道。将收集的2-细胞至桑椹胚期的胚胎体外37e培养2h后置于41e持续培养1~2h。然后用于ES细胞的分离培养。目的是阻滞胚胎的分化,增加ICM的细胞数3.4 延迟着床法
[16]
有ES生长集落,碱性磷酸酶染色成呈强阳性3.6 饲养层倒置培养
。
该方法是将桑椹胚放入饲养层下方进行培养。操作时用显微操作仪将桑椹胚植入饲养层下面,或者在饲养层上制备微穴,将胚胎放入后再用饲养层将其覆盖。二者均是利用压力等因素使滋胚层生长受抑制,可避免滋胚层过度生长从而影响ICM增殖。
4 内胚团的离散
分离ICM时可用吸管将其从滋养层细胞上转移到胰蛋白酶微滴中,大约3~5分钟ICM细胞彼此解离。在0.25%胰酶/0.04%EDTA或0.125%胰酶/0.02%EDTA酶消化液中添加1%鸡血清,可以减小对ES细胞的损害而不降低消化能力。将内细胞团离散成较小的细胞团(约3~4个细胞)会提高接种后克隆的形成比率。
细胞悬液转移到加有饲养层细胞的组织培养皿中,3~4天可见分散的ICM细胞增殖形成克隆。7~10天后将出现ES细胞。从分离的ICM中获得ES细胞系的成功率在10%~30%。
不同动物ICM增殖时间、离散时机对ES集落形成及建系率略有影响,如129/ter、C57BL/6J、BALA/C、KM和ICR小鼠品系ICM适宜的离散时机分别为增殖4~6d、3~3.5d、4d、4~5d和4~5d
[21]
。
在胚胎早期,通过切除卵巢,并辅以激素处理,影响子宫内环境和胚胎正常发育而使胚胎着床延迟。此法可以增加内细胞团的细胞数,易于获得
干细胞。
不同方法处理的胚胎对ES分离培养也有影响。Evans认为分离ES细胞必须在十分精确的时间内进行,而延迟着床的囊胚正处于这一最佳时期。可能是由于胚胎延迟着床增加了未分化细胞的增殖时间,提高了建立ES细胞系的效率。其成功率达47.7%。但建立的细胞系是否易分化不明。桑椹胚在体外培养中形成的囊胚也可用于ES细胞的分离,与直接培养囊胚无显著差异。Eistetter认为离散小鼠早期胚胎桑椹胚成的卵裂球(16~22个细胞),用来分离ES细胞,较直接培养囊胚或桑椹胚效果好。可能由于桑椹胚处于较早期发育阶段分化程度较低,同时去除了滋胚层的分化诱导作用
[19][18]
[17]
。
当ICM增殖到可以离散的程度时,状态好的ICM因其外围粘性较大,、附着力强,故吸取时容易丢失,这可通过加大大毛细吸管管末端直径解决。为防止吸管丢失细胞,可用微量加样器替代
[21]
。
5 ES细胞的鉴定
在体外培养形成细胞克隆后,需进一步分析鉴定。ES集落形态通常是排列很紧密的巢状,只要细胞增殖而不分化,集落的大小就会增加。ES细胞的低分化状态也是决定其是否具有高生殖腺嵌合能力的先决条件。作为从早期胚胎中分离而来的干细胞系,ES细胞具备一系列低分化指标,常用的检测指标有碱性磷酸酶、OCT-4、细胞特异性表面抗原(SSEA-l)等。
测定胚胎干细胞的体内分化能力是通过制备嵌[22]
。
3.5 ES细胞组织块培养
谌兵来等认为小鼠子宫内膜液中丰富表达的LIF与胚胎着床侵入子宫内膜无关,而是维持内细胞团不分化。在小鼠妊娠4~6天,LIF为高表达期,着床初期小鼠子宫内膜环境可能是一个天然的ES细胞培养体系。小鼠子宫内膜组织中必定含有大量的未分化抑制内细胞团分化的因子。这时取子,
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育过程,是胚胎干细胞能否用于遗传操作的最重要的特性。
ES细胞系不仅是研究细胞分化的模型,也是研究某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系,小鼠胚胎干细胞又是可以研究细胞致突变性的细胞株,具有广泛的应用前景。然而很多哺乳动物只是建成了类ES细胞系,距离我们的治疗性目标仍有大量工作。建立各种动物ES细胞特异的高效分化抑制体系及有效增殖的培养系统仍有待深入探讨。
参考文献
1 蒙超衡.广西科学,2002,9(4):302~305,311.
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190.
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237~246.
8 LedernannB,BurkiK.ExpcellRes,1991,197(2):254~258.9 杜忠伟,丛笑倩,等.细胞生物学杂志,1998,20(3):102~107.10 童英,邹冀中,尚克刚,等.北京大学学报(自然科学版),2000,
36(4):472~476.
11 ThomsonJA,KaalishmanJ,GolosTG,etal.procNatlAcad
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13 MakinoH,HasudaH,ItoY.JBiosciBioeng,2004,98(5):
374~379.
14 董晓,冯书堂,郑行,等.畜牧兽医学报,2002,33(5):433~438.15 张肇英,王达珍,李煜,等.内蒙古大学学报(自然科学版),
1990,21(3):438~445.
16 StoklosinskiA,KruseH,RichterLandsbergC,etal.ExpCell
Res,1992,200:89~96.
17 沈干,汪铮,丛笑倩,等.国外医学生物医学工程分册,2001,24
(3),97~133.
18 WellsDN,etal.Theriogenology,1991,35(1):293.
19 EistetterHR,DevGowthanddifferent,1988,31:275~282.20 谌兵来,胡随瑜,谢小毛胡随瑜,谢小毛,等.湖南大学学报,
2003,30(5):1~6.
21 孟国良,汤富酬,滕路,等.遗传,2001,23(3):292~294.22 张良,唐仕波,郭芬芬,等.中山大学学报,2003,42(5):87~
89.
#国外动态#
韩发现荞麦种子蛋白酶抑制剂具有抗人T-急性
成淋巴细胞白血病细胞系的抑制活性
AppliedBiochemistryandBiotechnology2004年117卷2期65~74页报道:已知马铃薯抑制剂I族成员荞麦蛋白酶抑制剂BWT-1可抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,而与豌豆球蛋白族同源的新的蛋白酶抑制剂荞麦蛋白酶抑制剂BWI-2a,则只能抑制胰蛋白酶。
最近,韩国ChejuHalla学院Cheju传统食品研究所的科学家Sung-SooPark等观察了BWI-1和BWI-2a的抗人肿瘤T-急性成淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞,诸如JURKAT和CCRF-CEM和人正常血淋巴细胞的抑制活性。
结果发现,根据可溶性3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(四唑/甲月替测定法)判断,上述两种抑制剂均可强烈抑制T-ALL细胞的生长。而且,JURKAT细胞对荞麦抑制剂的易感性还略高于CCRF-CEM细胞。还发现,利用1,2-环已二酮修改抑制剂中的精氨酸(Arg)残基,可使其丧失胰蛋白酸抑制活性,从而显著消除了其对人T-ALL细胞系生长的阻遏活性。这提示,胰蛋白酶抑制活性是参与人T-ALL细胞系生长的阻遏的。此外,Park等进一步发现,上述两种抑制剂可通过DNA片段化,而在上述细胞系中引发细胞程序性死亡(细胞凋亡)。汪开治
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摘 要: 胚胎干细胞具有的独特特征)))分化全能性是生物学各研究领域多年来的热点之一。胚胎干细胞独特的生物学特征在生殖细胞与体细胞及动物个体之间建立了广泛的联系。胚胎干细胞应用前景有着巨大的潜力。为此,对其培养建系的完善性研究显得格外重要。在此,对胚胎干细胞建系方法方面做一简要综述,尤其对建系过程中内细胞团的分离方法及干细胞集落的获取方法进行探讨。
关键词: 胚胎干细胞 饲养层 内细胞团分离 细胞增殖 集落ICM
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LiangLin WangZhenfei LiYu
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Abstract: EmbryonicStem(ES)Cellwhichpossestheomnipotenceandtheabilitytoproliferateindefinitelyinvitro,ThespecialfeatheristheHotspotofbiologicalresearchfield.EmbryonicStem(ES)Cellsconnectsomaticcellandgermcellwithindividualanimal.thattheyhavegreatapplicationsperspectiveinphysic.CultureandestablishtheEScelllinesisbecomingimportantasthewidelyusedofEScells.ThisarticlegivesasummaryinthemethodofestablishingtheEScelllines,especiallyintheisolationoftheICMandtheESclones.
Keywords:
EScell Feeder LIF Cellproliferation ICMisolation
胚胎干细胞(EScells)是从早期胚胎内细胞团(ICM)或桑椹胚分离出来的高度未分化的全能性细胞。体外培养的胚胎干细胞经诱导可分化为不同类型的组织细胞,在研究组织分化、组织修复、外源基因导入等许多领域被广泛地应用。胚胎干细胞建系,要求原代细胞具有良好的多向分化潜能,同时要求在传代过程中始终保持这种特性而不发生分化。ES细胞的分离、培养和建系方法多种多样,近年来这方面的研究取得了一些新的成就,本文就此进行讨论。
时间保持ES细胞的原初特性。用作饲养层的细胞多数是具有贴附能力的细胞(如成纤维细胞、子宫内皮细胞、3T3细胞、肿瘤细胞等)。接种ES细胞之前必须对饲养层细胞进行有丝分裂阻断,使其保持活力但不会增殖。由于细胞外基质中存在大量锚定的LIF因子,从而可抑制ES细胞分化,维持ES细胞的增殖和多能性
[1]
。饲养层的存在更好地模拟了
体内的生存环境,有利于ES细胞保持旺盛的增殖能力和维持低分化状态。
C射线及丝裂霉素C均可抑制饲养层增殖。制备饲养层细胞时,培养皿也可预先用明胶(gelatin0.1%)处理,以增加细胞的贴壁能力和对ES细胞的粘附性。在培养过程中,饲养层产生分化抑制因子和增殖促进因子的能力逐渐降低,故一周后不可再使用。
小鼠胚胎原代成纤维细胞(PMEF)饲养层可用
1 建立ES细胞培养体系的方法
1.1 有饲养层培养体系
胚胎干细胞是动物个体发生过程中具有全能性的原始细胞,维持ES细胞的不分化状态由细胞内一些结构蛋白和多肽因子进行内源性调控。体外培养的ES细胞,接种在饲养层细胞上培养时可以长
收稿日期:2005-11-28作者简介:梁琳(1981-),女,蒙古族,内蒙古大学在读硕士,主要从事细胞培养方面的研究,Email:[email protected]
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于大多数动物ES细胞的培养,但不同种类动物胚胎所需的最佳饲养层不尽相同。Thomson于1998年报道了利用小鼠STO细胞做饲养层,培养人受精卵发育的内胚团细胞,建立了人的ES细胞系。Shamblott于5~6周流产胎儿的生殖嵴细胞建立了人EG细胞系[3]。从小鼠STO饲养层细胞培养液中提取的分化抑制因子(DIA)能部分抑制EC细胞分化,但较PMEF培养的内细胞团中分离的ES细胞存活率及嵌合力低[4]]。
其他饲养层作用类似:胎牛肝成纤维细胞(BFLF)作为饲养层可用于培养分离到绵羊和山羊类ES细胞[5],原代鸡胚成纤维细胞饲养层可使小鼠ES细胞克隆传10代以上[6]。ES细胞在肿瘤细胞饲养层上生长也较旺盛[7~8]。
1.2 无饲养层培养体系
饲养层细胞分泌的因子难以支持某些ES细胞的增殖。ES细胞也可在无饲养层细胞的环境中建立和维持
[9]
[2]
ers等发现LIF对牛ES细胞的分离克隆无积极作用;Booth认为无血清培养基中维持猪ES细胞克隆必须有高浓度的LIF(10ng/ml),而Shim认为猪ES细胞分离培养时,STO饲养层或PGC本身产生的因子就足以维持其存活和增殖,外源性LIF并非必须。
MakinoH等认为鼠类ES细胞也可以在固定的LIF因子上进行培养,其方法是合成明胶和LIF因子的混合物,将其铺在聚苯乙烯平皿上,晾干洗涤至LIF不再释放[13]。
2 胚胎采集
分离具有发育全能性的ES细胞,要求选择合适阶段的胚胎。采卵时一般取囊胚或后期桑椹胚。胚胎体外培养时间过长也影响建系成功率。目前,各种动物一般采用囊胚期胚胎来分离ES细胞。在小鼠试验中观察,桑椹胚贴壁时间早、贴壁率高于囊胚;但贴壁后易退化且传代情况不佳。这可能是由于对体外培养系统适应能力不如囊胚
[14]
,培养液中添加LIF因子或使用能分泌。
LIF的细胞制备条件培养液均可。例如用大鼠肝细
胞(BRL)培养液制备大鼠肝细胞条件培养基(BRL-CM)或2~3周龄大鼠心肌细胞培养基(RH–CM)。含70%RH-CM的ES细胞培养基可以在10~20代内维持其未分化状态和正常二倍体核型[10]。从小鼠STO饲养层细胞培养液中提取的分化抑制因子(DIA)能部分抑制EC细胞分化,但较PMEF培养的内细胞团中分离的ES细胞存活率及嵌合力低[4]。用于制备条件培养基的还有HBC(人膀胱癌细胞株5637)和PSA-1、T3细胞(均为小鼠EC细胞)等。也有学者认为LIF不能完全取代饲养层的作用[11]。
在体外分离克隆ES细胞时,除利用饲养层和添加外源LIF外,杜宪兴等将外源LIF的cDNA引入ES细胞,建立了过度分泌LIF的ESL(+)细胞株。可以在无外源LIF的常规培养液中传13代以上,可完全脱离外源性LIF。
在一定浓度范围内,LIF与ES细胞克隆效率之间存在量效关系。浓度达到1000~5000IU/ml时,从增殖的ICM分离ES细胞的效率可达95%以上。但对于家畜则争论较大:如sSaito认为LIF有[12]
3 ICM的获取
从着床前的胚泡中分离内细胞团,是从早期胚胎建立ES细胞系的先决条件。常用的免疫外科手术法、组织培养法和机械剥离法等,均可分离获得全能性ICM。3.1 直接分离法
此方法是将囊胚放在饲养层上让其自然孵出透明带,贴附于饲养层。待ICM细胞扩大增殖时挑出分离,移到铺有新饲养层的培养皿。若内胚层样细胞形成则使得ES细胞增殖力降低且极易分化,故操作时选择消化时机非常重要。也可使用链酶蛋白酶处理或机械切割将透明带除去,获得裸胚直接培养。
3.2 免疫分离法
为了避免滋胚层细胞对ICM的竞争性抑制和诱导分化作用,可以根据补体溶解抗原-抗体复合物的免疫学原理,去除滋养层细胞,保留ICM细胞进行培养。
操作时收集发育到囊胚晚期的胚泡,先用0.5%链酶蛋白酶去除透明带,洗涤3次后转移至补体灭活的兔抗鼠脾细胞抗血清中(分离小鼠的ES细),i
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中。处理10~30分钟左右,胚泡的滋养外胚层细胞被破坏即成泡状,此时转移洗涤,微滴不宜过小,否则抗体和补体不易结合上去。吸取ICM细胞移到铺有饲养层的平皿。经过培养,约一周可以传代。分别使用抗体补体的二步法较繁琐,可以用一步法简化操作,即直接去除裸露胚泡的滋胚层。将裸露胚泡置于含有未灭活抗血清的和培养液1B4比例的微滴中约10分钟,待滋胚层溶解后,即囊胚腔萎缩变小时,迅速移入不含抗血清的培养液中洗涤洗液中[15]。
3.3 热休克法
在小鼠中有热休克法的报道。将收集的2-细胞至桑椹胚期的胚胎体外37e培养2h后置于41e持续培养1~2h。然后用于ES细胞的分离培养。目的是阻滞胚胎的分化,增加ICM的细胞数3.4 延迟着床法
[16]
有ES生长集落,碱性磷酸酶染色成呈强阳性3.6 饲养层倒置培养
。
该方法是将桑椹胚放入饲养层下方进行培养。操作时用显微操作仪将桑椹胚植入饲养层下面,或者在饲养层上制备微穴,将胚胎放入后再用饲养层将其覆盖。二者均是利用压力等因素使滋胚层生长受抑制,可避免滋胚层过度生长从而影响ICM增殖。
4 内胚团的离散
分离ICM时可用吸管将其从滋养层细胞上转移到胰蛋白酶微滴中,大约3~5分钟ICM细胞彼此解离。在0.25%胰酶/0.04%EDTA或0.125%胰酶/0.02%EDTA酶消化液中添加1%鸡血清,可以减小对ES细胞的损害而不降低消化能力。将内细胞团离散成较小的细胞团(约3~4个细胞)会提高接种后克隆的形成比率。
细胞悬液转移到加有饲养层细胞的组织培养皿中,3~4天可见分散的ICM细胞增殖形成克隆。7~10天后将出现ES细胞。从分离的ICM中获得ES细胞系的成功率在10%~30%。
不同动物ICM增殖时间、离散时机对ES集落形成及建系率略有影响,如129/ter、C57BL/6J、BALA/C、KM和ICR小鼠品系ICM适宜的离散时机分别为增殖4~6d、3~3.5d、4d、4~5d和4~5d
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在胚胎早期,通过切除卵巢,并辅以激素处理,影响子宫内环境和胚胎正常发育而使胚胎着床延迟。此法可以增加内细胞团的细胞数,易于获得
干细胞。
不同方法处理的胚胎对ES分离培养也有影响。Evans认为分离ES细胞必须在十分精确的时间内进行,而延迟着床的囊胚正处于这一最佳时期。可能是由于胚胎延迟着床增加了未分化细胞的增殖时间,提高了建立ES细胞系的效率。其成功率达47.7%。但建立的细胞系是否易分化不明。桑椹胚在体外培养中形成的囊胚也可用于ES细胞的分离,与直接培养囊胚无显著差异。Eistetter认为离散小鼠早期胚胎桑椹胚成的卵裂球(16~22个细胞),用来分离ES细胞,较直接培养囊胚或桑椹胚效果好。可能由于桑椹胚处于较早期发育阶段分化程度较低,同时去除了滋胚层的分化诱导作用
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当ICM增殖到可以离散的程度时,状态好的ICM因其外围粘性较大,、附着力强,故吸取时容易丢失,这可通过加大大毛细吸管管末端直径解决。为防止吸管丢失细胞,可用微量加样器替代
[21]
。
5 ES细胞的鉴定
在体外培养形成细胞克隆后,需进一步分析鉴定。ES集落形态通常是排列很紧密的巢状,只要细胞增殖而不分化,集落的大小就会增加。ES细胞的低分化状态也是决定其是否具有高生殖腺嵌合能力的先决条件。作为从早期胚胎中分离而来的干细胞系,ES细胞具备一系列低分化指标,常用的检测指标有碱性磷酸酶、OCT-4、细胞特异性表面抗原(SSEA-l)等。
测定胚胎干细胞的体内分化能力是通过制备嵌[22]
。
3.5 ES细胞组织块培养
谌兵来等认为小鼠子宫内膜液中丰富表达的LIF与胚胎着床侵入子宫内膜无关,而是维持内细胞团不分化。在小鼠妊娠4~6天,LIF为高表达期,着床初期小鼠子宫内膜环境可能是一个天然的ES细胞培养体系。小鼠子宫内膜组织中必定含有大量的未分化抑制内细胞团分化的因子。这时取子,
2006年第1期 梁琳等:胚胎干细胞建系方法
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育过程,是胚胎干细胞能否用于遗传操作的最重要的特性。
ES细胞系不仅是研究细胞分化的模型,也是研究某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系,小鼠胚胎干细胞又是可以研究细胞致突变性的细胞株,具有广泛的应用前景。然而很多哺乳动物只是建成了类ES细胞系,距离我们的治疗性目标仍有大量工作。建立各种动物ES细胞特异的高效分化抑制体系及有效增殖的培养系统仍有待深入探讨。
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#国外动态#
韩发现荞麦种子蛋白酶抑制剂具有抗人T-急性
成淋巴细胞白血病细胞系的抑制活性
AppliedBiochemistryandBiotechnology2004年117卷2期65~74页报道:已知马铃薯抑制剂I族成员荞麦蛋白酶抑制剂BWT-1可抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,而与豌豆球蛋白族同源的新的蛋白酶抑制剂荞麦蛋白酶抑制剂BWI-2a,则只能抑制胰蛋白酶。
最近,韩国ChejuHalla学院Cheju传统食品研究所的科学家Sung-SooPark等观察了BWI-1和BWI-2a的抗人肿瘤T-急性成淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞,诸如JURKAT和CCRF-CEM和人正常血淋巴细胞的抑制活性。
结果发现,根据可溶性3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(四唑/甲月替测定法)判断,上述两种抑制剂均可强烈抑制T-ALL细胞的生长。而且,JURKAT细胞对荞麦抑制剂的易感性还略高于CCRF-CEM细胞。还发现,利用1,2-环已二酮修改抑制剂中的精氨酸(Arg)残基,可使其丧失胰蛋白酸抑制活性,从而显著消除了其对人T-ALL细胞系生长的阻遏活性。这提示,胰蛋白酶抑制活性是参与人T-ALL细胞系生长的阻遏的。此外,Park等进一步发现,上述两种抑制剂可通过DNA片段化,而在上述细胞系中引发细胞程序性死亡(细胞凋亡)。汪开治