泸州医学院学报２００９年第３２卷第６期ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｕｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＶ０１．３２Ｎｏ．６２００９
６５５
综述
紧密连接蛋白ｃｌａｕｄｉｎ的研究进展
雷军综述，夏祥国审校
（泸州医学院附属医院神经外科，四川泸州６４６０００）
中图分类号Ｑ５１
文献标识码Ａ
文章编号１０００—２６６９（２００９）６－－０６５５－０３
细胞粘附既是维持组织结构稳定的基本条件，也是细胞运动和发挥功能的调节因素，并且对细胞的增殖、分化有重要影响。现已知的粘附结构包括４种细胞间连接形式：紧密连接（ｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｓ，ＴＪ）、枯附带、缝隙连接和桥粒１１１。在上皮组织中，细胞一细胞间的相互作用由连接复合体调节。位于连接复合体最顶端的就是紧密连接。紧密连接由咬合蛋白ｏｃ—ｃｌｕｄｉｎ、闭合蛋白ｃｈｕｄｉｎｓ和连接粘附分子Ｏｕｎｃｆｉｏｎ
ｍｏｌｅｕｃｕＩｅ
ａｄｈｅｓｉｏｎ
酶作用于不同的ｃｈｕｄｉｍ分子，在研究卵巢癌中ｃｌａｕｄｉｎｓ的调节机制时发现，当ＰＫＡ和ＰＫＣ激活后，它们作用在不同的靶蛋白：ＰＫＡ作用于ｃｌａｕｄｉｎ一３上Ｃ－末端第１９２位氨基酸，而ＰＫＣ使ｃｈｕｄｉｎ一４磷酸化。ｃｌａｕｄｉｍ的改变可以影响整个紧密连接的结构和功能。这种改变可以是ｃｈｕｄｉｎｓ数量上的改变，也可以是基因的突变。一旦紧密连接功能下降，上皮细胞的极性即遭到破坏，不同液性空间的脂质和完整蛋白可自由扩散，上皮细胞两个不同环境之间的渗透屏障同样遭到破坏，直接导致其生物学特性的改变，甚至潜在的有害物质或病原体进入机体。
２．Ｃｌａｕｄｉｎｓ与血脑屏障
ＪＡＭｓ）３种完整的膜蛋白和闭合小环蛋白（ＺＯ一１，
ＺＯ－２和ＺＯ－３）等外周胞浆蛋白组成阁。目前认为起主要作用的是前二者．尤以ｃｈｕ击ｍ的功能最为重要，它是构成紧密连接的主要骨架蛋白。
１．Ｃｌａｕｄｉｎｓ的分子结构和生物学特性
血脑屏障主要由内皮细胞、周细胞构成，星形细胞足突包绕毛细血管外周。内皮细胞１司的紧密连接是构成血脑屏障的重要部分。在脑微血管循环内皮系统中，ｄａｕｄｉｎ一３和ｃｌａｕｄｉｎ一５表达丰富。ｃｌａｕｄｉｎ蛋白在脂质内膜与外膜的表达比率大概为５５％和４５％，而在非血脑屏障内皮细胞中，紧密连接只与脂质外膜联系。Ｗｏｌｂｕｒｇ等研究在自身免疫性脑脊髓炎和人类成胶质细胞细胞瘤的脑和脊髓中，炎性物质包绕的小静脉上紧密连接失去ｃｌａｕｄｉｎ一３的免疫着色，而其他紧密连接蛋白未发生改变，因此推断ｃｌａｕｄｉｎ一３是决定体内血脑屏障紧密连接的主要成分。Ｓｈｏｉｃｈｉｒｏ等人认为ｃｌａｕｄｉｎ一５是脑血管内皮细胞通透性调节的最重要调节因子，对血脑屏障通透性可能起着至关重要的调节作用。ｌｓｈｉｚａｋｉ等人的研究证明，ｃＡＭＰ可以通过依赖或非依赖蛋白激酶Ａ途径，通过苏氨酸磷酸化而上调猪血脑屏障上ｄａｕｄｉｎ一５的表达，从而促进内皮细胞上紧密连接的功能。然而，Ｋａｒｌ等人的研究却发现，敲除ｃｈｕｄｉｎ一５基因大鼠的血脑屏障在结构和形态上并未出现明显变化，结果只是血脑屏障上的小分子物质（小于ｓｏｏｇＪ））在细胞间的通透性升高，而且这种通透性升高是非特异性的，具体机制尚不清楚。另有研究发现，ｄａｕｄｉｎ一５可以促进基质金属蛋白酶（ＭＭＰ一２）的激活。Ｃｌａｕｄｉｎ一５的这项新功能对于血管发生和血管通透性增高都起了重要的作用。总的说来，ｃｈｕｄｍ在血脑屏障上的研究仍是热点，并存在较大争议，为了临床上能选择性开放血脑屏障，ｃｌａｕｄｉｎ对其的调节机制需待深入研究。
３．Ｃｌａｕｄｉｎｓ基因突变与紧密连接遗传疾病
Ｆｕｒｕｓｅ等首先发现了鼠ＴＪ带中两种不同于ｏｃｃｌｕｄｉｎ的可蛋白，分别包括２１１个和２３０个氨基酸，亲水性的分析显示它们均有４个跨膜区，并分别命名为ｃｌａｕｄｉｎ一１和ｄａｕｄｉｎ一２。而Ｓｗｉｓｓｈｅｌｍ等在１９９９年首先克隆出了人类ｃｌａｕｄｉｎ基因。目前已发现ｃｈｕｄｉｎｓ家族由２４个跨膜蛋白亚型组成，分子量约２０－２７ＫＤ，其序列的一致性为１２．５盼咱９．７％。每一个ｃｈｕｄｉｎ分子均由４个跨膜结构域组成，氨基和羧基末端都在细胞内，羧基末端富含丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基【３Ｊ。ｃｈｕｄｉｍ有２个长度不等的细胞外环，在不同ｃｈｕｄｉｎ分子之间，第１和第４个跨膜片段以及细胞外环的氨基酸序列具有高度保守性。ｃｈｕｄｉｍ直接作用于紧密连接膜相关蛋白的鸟苷酸激酶同工酶、ＺＯ一１、ＺＯ一２、ＺＯ－３以及富含ＰＤＺ结构域的蛋白，并间接同ＡＦ－６和菌环蛋白作用，维持紧密连接特有的栅栏功能和屏障功能。多种信号分子参与紧密连接的调节，如Ｒｈｏ因子，ｃａ２＋，ＰＫＣ，异三聚体Ｇ蛋白Ｇａｌｐｈａｌ２等。这些分子有两个共同的作用靶位点：肌动蛋白和肌球蛋白，肌球蛋白与肌动蛋白相连并定位于从底部到顶点的连接复合物，肌球蛋白结构收缩可以对紧密连接膜产生离心性的牵引、进而调节紧密连接的渗透性。Ｃｈｕｄｉｎｓ对细胞连接处选择渗透性的调节主要通过蛋白激酶途径实现，蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）或蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）作用于ｃｈｕｄｉｎｓ上特定氨基酸靶点，一般以丝氨酸、苏氨酸为主。ｃｈｕｄｉｎｓ磷酸化后，紧密连接功能下降，表现为氯化物渗透性增加。可能原因是磷酸化的ｃｈｕｄｉｎｓ干扰紧密连接的形成州，从而破坏细胞间紧密连接的正常功能。不同蛋白激作者简介：雷军（１９７９一），男，住院医师，硕士生
Ｈａｄｊ～Ｋａｂｉａｓ等发现，人和动物的大多数胆汁郁积症与肝细胞骨架和紧密连接的改变有关，这些在肝内和肝外的胆汁
万方数据
６５６
郁积症都不是特异性的改变。在家族性高胆固醇血症的病人中，发现了紧密连接蛋白２的错义突变以及ｃｌａｕｄｉｎ一１基因的外显子１有两个碱基的缺失，他们认为该疾病与ｃｌａｕｄｉｎ—ｌ基因的突变有关；ＳｉｍｏｎＤＢ等通过定位克隆技术，鉴定了一个人类基因，命名为ｐａｍｃｅｌｌｉｎ－ｌ（ｃｌａｕｄｉｎ－１６）。编码紧密连接蛋白ｃｈｕｄｉｎ一１６的该基因突变会发生一种常染色体隐性疾病，它的突变导致ｃｌａｕｄｉｎ一１６的ＰＤＺ结合域失活，ｃｈｕｄｉｎ一１６不能与ＺＯ—ｌ结合，影响细胞间二价阳离子的选择性和渗透性。这种突变的杂合性携带者可发生肾脏的钙质沉着。慢性间质性肾炎，肾脏重吸收Ｍ９２＋障碍，造成严重的低镁血症１５１；Ｂｅｎ．Ｙｏｓｅｆ等１６１研究发现ｃｌａｕｄｉｎ一１４突变引起小鼠耳蜗外部毛细胞的快速退化，内部毛细胞缓慢退化，最终导致耳聋；Ｒａｂｉａｌ７１等研究发现ｃｌａｕｄｉｎ一１基因第１个外显子２００和２０１位置上２个碱基的缺失突变可产生成熟前终止密码子，导致旰脏和皮肤ｃｈｕｄｉｎ一１的完全缺失，而这就是新生儿硬化性胆管炎和鱼鳞病的发病原因。
４．Ｃｌａｕｄｉｎｓ与神经和生殖系统疾病
Ｃｌａｕｄｉｎ一１１是髓磷脂和睾丸中的跨膜蛋白，通过它们之间的相互作用调节细胞的增殖和迁移，对于维持精子生成和神经系统功能十分重要。缺乏ｃｌａｕｄｉｎ一１１的小鼠会出现神经和生殖方面的缺陷，因此，ｃｌａｕｄｉｎ－１１在少突胶质细胞和其他中枢神经系统外细胞的生长和分化过程中必定是十分关键的。同时，Ｃｈｕｄｉｎ－１１也作为一种自身抗原参与自身免疫性脱髓鞘疾病。此外悯，正常人的中枢神经系统血管中可以检测到ｃｈｕｄｉｎ－３和ｃｌａｕｄｉｎ一５等紧密连接蛋白的存在，而脑肿瘤水肿时ｃｌａｕｄｉｎｓ则部分表达为缺失或下调，证明ｃｌａｕｄｉｎｓ可能参与了脑肿瘤瘤周水肿的形成。
５．Ｃｌａｕｄｉｎｓ表达水平改变与肿瘤
正常分化组织的细胞组成是高度有序的，癌组织则通常缺乏这种特性，肿瘤细胞常常是分化变差、细胞极性消失及胞间紧密连接功能失常。紧密连接完整性的破坏可能是导致肿瘤细胞生长所需的营养因子及其他因子扩散的原因。许多肿瘤发生时，ｃｌａｕｄｉｎｓ表达水平明显下降。如在多种乳腺癌细胞系和原发性乳腺癌中ｃｌａｕｄｉｎ一１和ｃｌａｕｄｉｎ一７ｍＲＮＡ和蛋白质水平均显著降低并且降低表达与较高的｜ｊ中瘤分级、肿瘤的复发和转移相关；Ｓｏｉｎｉ恻通过免疫组化发现Ｃｌａｕｄｉｎ一２在前列腺癌、乳腺癌中，Ｃｌａｕｄｉｎ一３在肾癌、膀胱癌中，以及Ｃｌａｕｄｉｎ－４在肾癌、肝癌中的表达均是下调的，而淋巴瘤中，Ｃｌａｕｄｉｎ一１—５和７均不表达；Ｍｏｕｓｔａｆａ等Ｉ删用逆转录聚合酶链反应（１ＬＴ－ＰＣＲ）和蛋白印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）方法证实头颈部鳞癌中，Ｃｌａｕｄｉｎ一７的表达较周围正常组织也是降低的。Ｃｌａｕｄｉｍ蛋白表达水平的降低并不是由于其基因的改变引起的，ｃｈｕｄｉｍ基因的启动子和编码区序列并未发生遗传学上的变化，提示其他调节或外源性的因素在肿瘤发展过程中影响ｃｈｕｄｉｎｓ的下调。这些外源性因素至今尚不清楚。然而在更多肿瘤组织中ｄａｕｄｉｎｓ表达水平明显较周围组织中增高。且随着肿瘤级别的升高、淋巴结转移的发生，表达水平随之升高。
万方数据
泸州医学院学报
２００９年第３２卷
第６期
Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＬｕｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏＨｅｇｅ
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２００９
Ｌｏｎｇ等［ｈｉ利用Ｎｏｒｔｈｅｎ印迹发现在人类前列腺癌上皮中，Ｃｌａｕｄｉｎ－３基因转录的ｍＲ．ＮＡ量较周围正常组织明显增高，同时用免疫组化发现Ｃｌａｕｄｉｎ－３蛋自在骨转移灶中的表达也是增高的；Ｒａｎｇｅｌ等比较分析了７０例的卵巢癌、正常组织及卵巢囊腺瘤，结果发现Ｃｌａｕｄｉｎ－３、４在卵巢癌各亚型中均高表达且定位于胞浆；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等“２１发现Ｃｌａｕｄｉｎ一３、４，７在胃腺癌、食管癌及胃黏膜分化不良细胞、Ｂａｒｒｅｕ’Ｓ食管中的表达均较正常组织增高；ＮｉｃｈｏｌｓｌＵｌ等发现胰腺癌９９％的原发灶和１００％转移灶的癌细胞膜上高表达Ｃｌａｕｄｉｎ一４；Ｒｅｓｎｉｃｋ等１１４１发现Ｃｌａｕｄｉｎ－１、３、４在肠型胃癌中是高表达的。另外，Ｑｌｉｖｅｉｒａａ等Ｉ均也证实在大肠癌中Ｃｌａｕｄｉｎ一１、３、４的表达是较正常组织增高的。除此之外，在一些有ｄａｕｄｉｎ高表达的肿瘤中，其表达水平与肿瘤的恶性等级、侵袭性以及淋巴转移有关。ＬａｎｄｅｒｓＫＡ等㈣利用实时ＲＴ－ＰＣＩＬ，蛋白质印迹法和免疫组化的方法发现在前列腺原发肿瘤中ｃｈｕｄｉｎ一４都是上调的，而它在低等级（Ｇｌｅａｓｏｎ６）癌组织中的表达明显高于其在高等级（Ｇｌｅａｓｏｎ大于等于７）癌组织中的表达。Ｙｏｎｇ－ＬｉａｎＷｕ等Ｉ研在胃腺癌研究中得到的结论是ｃｌａｕｄｉｎ—Ｉ在低分化腺
癌中的表达低于高、中分化腺癌中的表达，而在已侵及固有肌层和腹壁或淋巴转移的腺癌中表达明显高于仅侵及黏膜和黏膜下层而无淋巴转移的腺癌。肿瘤组织中ｃｈｕｄｉｎｓ过表达的机制目前正在研究中，研究结直肠癌组织中ｃｌａｕｄｉｎ－１过表达的机制时发现，ｄａｕｄｉｎ一１过表达可以抑制Ｅ—ｃａｄｈｅｆｉｎ表达，失去Ｅ—ｃａｄｈｅｒｉｎ表达使Ｅ—ｃａｄｈｅｆｉｎ／Ｔｃｆ信号通路上调。Ｃｈｕｄｉｎ一１在细胞膜上定位的改变、Ｅ—ｃａｄｈｅ６ｎ表达减少、Ｅ—ｃａｄｈｅｒｉｎ／Ｔｃｆ信号通路上调共同作用促进肿瘤的发生发展。Ｃｌａｕｄｉｎｓ虽在各种肿瘤中的表达水平有高有低，但这并不矛盾，它们在恶性肿瘤组织中的表达无论高低或是否被磷酸化，最终总是引起紧密连接屏障的正常结构破坏而导致胞间分子异常侧向扩散、细胞极性消失等一系列变化１１搠，Ｃｌａｕｄｉｍ接触抑制的丢失。是肿瘤进展早期（细胞极性的丢失和生长失控）和晚期（浸润和转移）的典型特征。
６．Ｃｌａｕｄｉｎｓ蛋白应用于肿瘤诊断、治疗
由于Ｃｈｕｄｉｎ蛋白的表达是具有高度组织特异性的，使它们有希望应用于不同肿瘤的早期诊断及鉴别。如前所述，Ｃｈｕｄｉｎ－３、４在卵巢癌、乳腺癌、肠型胃癌、大肠癌等组织中的高表达，可参与早期诊断，而它们又较少在弥漫型胃癌中表达则有利于胃癌类型的早期鉴别；Ｃｌａｕｄｉｎ一４在胆管癌细胞中高表达而在肝细胞癌及正常肝组织中不表达，也可应用于两者的早期鉴别；Ｃｌａｕｄｉｎ一５仅在血管肉瘤及良性脉管肿瘤中表达，可作为其标记物；Ｃｌａｕｄｉｎ一１０的表达与否则可作为原发性肝癌根治术后复发的独立预后因子，以及甲状腺乳头状癌、滤泡状癌的鉴别手段。产气荚膜杆菌外毒素（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｍｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ
ＣＰＥ）在人群中可引起食物中毒，而
Ｃｈｕｄｉｎ一３、４蛋白是ＣＰＥ的受体。这种细菌有一个ｊ虫特的作用机制，当它与其受体结合后，可以形成一种大的、十二烷基硫酸钠抵抗的复合物，这种复合物促使细胞膜通透性的改变，导致细胞溶解坏死。而Ｃｌａｕｄｉｎ一３、４在不同人类肿瘤组织中
第６期雷军等：紧密连接蛋白ｅｌａｕｄｉｎ的研究进展的含量是不同的，由此想到在Ｃｌａｕｄｉｎ－３、４高表达的癌组织中，可以利用这种细菌进行肿瘤治疗。Ｍｉｃｈｌ等曾描述了用细胞病变效应ＣＰＥ瘤内注射异种嫁接的胰腺癌细胞，结果引起肿瘤细胞大面积坏死，明显延缓了肿瘤生长，同时证实了ＣＰＥ的细胞毒性仅限于ｃｌａｕｄｉｎ－４高表达的癌细胞，并呈剂量依赖性。ＣＰＥ的功能区域可以分为受体结合区（Ｃ—ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｏｆ
ｃＰＥ，Ｃ—ＣＰＥ）和细胞毒素区（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｏｆ
ＣＰＥ）。Ｍａｓｕｏ
ｋｏｎｄｏｈ等发现了Ｃ—ＣＰＥ有使药物吸收增加的效应，而且没有粘膜毒性。同时，考虑到若能在肿瘤化疗药物中整合入ＣＰＥ的骨架，使其能结合特异的Ｃｌａｕｄｉｎ受体，则可使化疗药物具有肿瘤特异性，从而可增强化疗效果、减少副作用。其次，Ｃｈｕｒｎ蛋白均是跨膜蛋白，胞外通常具有两个环，如果使用特异的抗体识别结合特异的Ｃｈｕｄｉｎ蛋白胞外环靶点，将可能成为有前景的肿瘤治疗方法之一。重组单克隆抗体已开始应用于肿瘤治疗研究，如人类免疫球蛋白Ｇ（１９Ｇ）抗体应用于乳腺癌、鸡单克隆抗体应用于Ｃｌａｕｄｉｎ－１、３、４高表达肿瘤的治疗研究等Ｉ“。再者，由于某些Ｃｌａｕｄｉｎ蛋白在肿瘤细胞中的表达是下调或缺失的，所以如何转导或激活此类蛋白的基因、转录因子从而恢复细胞间正常紧密连接结构、减弱肿瘤细胞侵袭转移等问题也是今后的研究方向。
综上所述，ｃｈｕｄｉｍ作为细胞间紧密连接的主要功能蛋白通过细胞屏障、细胞旁路转运和信号转导保持了细胞内环境的平衡。编码它的基因改变以及它在多种疾病特别是不同肿瘤组织中的异常表达已成为细胞生物学以及众多相关学者的研究热点。虽然目前已完成的研究主要是侧重于基础及动物实验，而且Ｃｈｕｄｉｎ蛋白在相关疾病及肿瘤发生、发展过程中究竟确切作用机制如何，目前尚不是很清楚。但通过对ｃｈｕｄｉｍ家族编码的蛋白在肿瘤和正常组织中的差异表达，利用ｃｈｕｄｉｎｓ表达存在高度的组织特异性，有可能将其作为多种肿瘤侵袭和转移的标志。同时随着对ｃｈｕｄｉｎｓ结构和功能的进一步深入研究和分子生物学技术的飞速发展，ｃｈｕｄｉｍ在药理学和在肿瘤的检测、诊断、治疗中必定会有一个非常好的前景。
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文献标识码Ａ
文章编号１０００—２６６９（２００９）６－－０６５５－０３
细胞粘附既是维持组织结构稳定的基本条件，也是细胞运动和发挥功能的调节因素，并且对细胞的增殖、分化有重要影响。现已知的粘附结构包括４种细胞间连接形式：紧密连接（ｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｓ，ＴＪ）、枯附带、缝隙连接和桥粒１１１。在上皮组织中，细胞一细胞间的相互作用由连接复合体调节。位于连接复合体最顶端的就是紧密连接。紧密连接由咬合蛋白ｏｃ—ｃｌｕｄｉｎ、闭合蛋白ｃｈｕｄｉｎｓ和连接粘附分子Ｏｕｎｃｆｉｏｎ
ｍｏｌｅｕｃｕＩｅ
ａｄｈｅｓｉｏｎ
酶作用于不同的ｃｈｕｄｉｍ分子，在研究卵巢癌中ｃｌａｕｄｉｎｓ的调节机制时发现，当ＰＫＡ和ＰＫＣ激活后，它们作用在不同的靶蛋白：ＰＫＡ作用于ｃｌａｕｄｉｎ一３上Ｃ－末端第１９２位氨基酸，而ＰＫＣ使ｃｈｕｄｉｎ一４磷酸化。ｃｌａｕｄｉｍ的改变可以影响整个紧密连接的结构和功能。这种改变可以是ｃｈｕｄｉｎｓ数量上的改变，也可以是基因的突变。一旦紧密连接功能下降，上皮细胞的极性即遭到破坏，不同液性空间的脂质和完整蛋白可自由扩散，上皮细胞两个不同环境之间的渗透屏障同样遭到破坏，直接导致其生物学特性的改变，甚至潜在的有害物质或病原体进入机体。
２．Ｃｌａｕｄｉｎｓ与血脑屏障
ＪＡＭｓ）３种完整的膜蛋白和闭合小环蛋白（ＺＯ一１，
ＺＯ－２和ＺＯ－３）等外周胞浆蛋白组成阁。目前认为起主要作用的是前二者．尤以ｃｈｕ击ｍ的功能最为重要，它是构成紧密连接的主要骨架蛋白。
１．Ｃｌａｕｄｉｎｓ的分子结构和生物学特性
血脑屏障主要由内皮细胞、周细胞构成，星形细胞足突包绕毛细血管外周。内皮细胞１司的紧密连接是构成血脑屏障的重要部分。在脑微血管循环内皮系统中，ｄａｕｄｉｎ一３和ｃｌａｕｄｉｎ一５表达丰富。ｃｌａｕｄｉｎ蛋白在脂质内膜与外膜的表达比率大概为５５％和４５％，而在非血脑屏障内皮细胞中，紧密连接只与脂质外膜联系。Ｗｏｌｂｕｒｇ等研究在自身免疫性脑脊髓炎和人类成胶质细胞细胞瘤的脑和脊髓中，炎性物质包绕的小静脉上紧密连接失去ｃｌａｕｄｉｎ一３的免疫着色，而其他紧密连接蛋白未发生改变，因此推断ｃｌａｕｄｉｎ一３是决定体内血脑屏障紧密连接的主要成分。Ｓｈｏｉｃｈｉｒｏ等人认为ｃｌａｕｄｉｎ一５是脑血管内皮细胞通透性调节的最重要调节因子，对血脑屏障通透性可能起着至关重要的调节作用。ｌｓｈｉｚａｋｉ等人的研究证明，ｃＡＭＰ可以通过依赖或非依赖蛋白激酶Ａ途径，通过苏氨酸磷酸化而上调猪血脑屏障上ｄａｕｄｉｎ一５的表达，从而促进内皮细胞上紧密连接的功能。然而，Ｋａｒｌ等人的研究却发现，敲除ｃｈｕｄｉｎ一５基因大鼠的血脑屏障在结构和形态上并未出现明显变化，结果只是血脑屏障上的小分子物质（小于ｓｏｏｇＪ））在细胞间的通透性升高，而且这种通透性升高是非特异性的，具体机制尚不清楚。另有研究发现，ｄａｕｄｉｎ一５可以促进基质金属蛋白酶（ＭＭＰ一２）的激活。Ｃｌａｕｄｉｎ一５的这项新功能对于血管发生和血管通透性增高都起了重要的作用。总的说来，ｃｈｕｄｍ在血脑屏障上的研究仍是热点，并存在较大争议，为了临床上能选择性开放血脑屏障，ｃｌａｕｄｉｎ对其的调节机制需待深入研究。
３．Ｃｌａｕｄｉｎｓ基因突变与紧密连接遗传疾病
Ｆｕｒｕｓｅ等首先发现了鼠ＴＪ带中两种不同于ｏｃｃｌｕｄｉｎ的可蛋白，分别包括２１１个和２３０个氨基酸，亲水性的分析显示它们均有４个跨膜区，并分别命名为ｃｌａｕｄｉｎ一１和ｄａｕｄｉｎ一２。而Ｓｗｉｓｓｈｅｌｍ等在１９９９年首先克隆出了人类ｃｌａｕｄｉｎ基因。目前已发现ｃｈｕｄｉｎｓ家族由２４个跨膜蛋白亚型组成，分子量约２０－２７ＫＤ，其序列的一致性为１２．５盼咱９．７％。每一个ｃｈｕｄｉｎ分子均由４个跨膜结构域组成，氨基和羧基末端都在细胞内，羧基末端富含丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基【３Ｊ。ｃｈｕｄｉｍ有２个长度不等的细胞外环，在不同ｃｈｕｄｉｎ分子之间，第１和第４个跨膜片段以及细胞外环的氨基酸序列具有高度保守性。ｃｈｕｄｉｍ直接作用于紧密连接膜相关蛋白的鸟苷酸激酶同工酶、ＺＯ一１、ＺＯ一２、ＺＯ－３以及富含ＰＤＺ结构域的蛋白，并间接同ＡＦ－６和菌环蛋白作用，维持紧密连接特有的栅栏功能和屏障功能。多种信号分子参与紧密连接的调节，如Ｒｈｏ因子，ｃａ２＋，ＰＫＣ，异三聚体Ｇ蛋白Ｇａｌｐｈａｌ２等。这些分子有两个共同的作用靶位点：肌动蛋白和肌球蛋白，肌球蛋白与肌动蛋白相连并定位于从底部到顶点的连接复合物，肌球蛋白结构收缩可以对紧密连接膜产生离心性的牵引、进而调节紧密连接的渗透性。Ｃｈｕｄｉｎｓ对细胞连接处选择渗透性的调节主要通过蛋白激酶途径实现，蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）或蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）作用于ｃｈｕｄｉｎｓ上特定氨基酸靶点，一般以丝氨酸、苏氨酸为主。ｃｈｕｄｉｎｓ磷酸化后，紧密连接功能下降，表现为氯化物渗透性增加。可能原因是磷酸化的ｃｈｕｄｉｎｓ干扰紧密连接的形成州，从而破坏细胞间紧密连接的正常功能。不同蛋白激作者简介：雷军（１９７９一），男，住院医师，硕士生
Ｈａｄｊ～Ｋａｂｉａｓ等发现，人和动物的大多数胆汁郁积症与肝细胞骨架和紧密连接的改变有关，这些在肝内和肝外的胆汁
万方数据
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郁积症都不是特异性的改变。在家族性高胆固醇血症的病人中，发现了紧密连接蛋白２的错义突变以及ｃｌａｕｄｉｎ一１基因的外显子１有两个碱基的缺失，他们认为该疾病与ｃｌａｕｄｉｎ—ｌ基因的突变有关；ＳｉｍｏｎＤＢ等通过定位克隆技术，鉴定了一个人类基因，命名为ｐａｍｃｅｌｌｉｎ－ｌ（ｃｌａｕｄｉｎ－１６）。编码紧密连接蛋白ｃｈｕｄｉｎ一１６的该基因突变会发生一种常染色体隐性疾病，它的突变导致ｃｌａｕｄｉｎ一１６的ＰＤＺ结合域失活，ｃｈｕｄｉｎ一１６不能与ＺＯ—ｌ结合，影响细胞间二价阳离子的选择性和渗透性。这种突变的杂合性携带者可发生肾脏的钙质沉着。慢性间质性肾炎，肾脏重吸收Ｍ９２＋障碍，造成严重的低镁血症１５１；Ｂｅｎ．Ｙｏｓｅｆ等１６１研究发现ｃｌａｕｄｉｎ一１４突变引起小鼠耳蜗外部毛细胞的快速退化，内部毛细胞缓慢退化，最终导致耳聋；Ｒａｂｉａｌ７１等研究发现ｃｌａｕｄｉｎ一１基因第１个外显子２００和２０１位置上２个碱基的缺失突变可产生成熟前终止密码子，导致旰脏和皮肤ｃｈｕｄｉｎ一１的完全缺失，而这就是新生儿硬化性胆管炎和鱼鳞病的发病原因。
４．Ｃｌａｕｄｉｎｓ与神经和生殖系统疾病
Ｃｌａｕｄｉｎ一１１是髓磷脂和睾丸中的跨膜蛋白，通过它们之间的相互作用调节细胞的增殖和迁移，对于维持精子生成和神经系统功能十分重要。缺乏ｃｌａｕｄｉｎ一１１的小鼠会出现神经和生殖方面的缺陷，因此，ｃｌａｕｄｉｎ－１１在少突胶质细胞和其他中枢神经系统外细胞的生长和分化过程中必定是十分关键的。同时，Ｃｈｕｄｉｎ－１１也作为一种自身抗原参与自身免疫性脱髓鞘疾病。此外悯，正常人的中枢神经系统血管中可以检测到ｃｈｕｄｉｎ－３和ｃｌａｕｄｉｎ一５等紧密连接蛋白的存在，而脑肿瘤水肿时ｃｌａｕｄｉｎｓ则部分表达为缺失或下调，证明ｃｌａｕｄｉｎｓ可能参与了脑肿瘤瘤周水肿的形成。
５．Ｃｌａｕｄｉｎｓ表达水平改变与肿瘤
正常分化组织的细胞组成是高度有序的，癌组织则通常缺乏这种特性，肿瘤细胞常常是分化变差、细胞极性消失及胞间紧密连接功能失常。紧密连接完整性的破坏可能是导致肿瘤细胞生长所需的营养因子及其他因子扩散的原因。许多肿瘤发生时，ｃｌａｕｄｉｎｓ表达水平明显下降。如在多种乳腺癌细胞系和原发性乳腺癌中ｃｌａｕｄｉｎ一１和ｃｌａｕｄｉｎ一７ｍＲＮＡ和蛋白质水平均显著降低并且降低表达与较高的｜ｊ中瘤分级、肿瘤的复发和转移相关；Ｓｏｉｎｉ恻通过免疫组化发现Ｃｌａｕｄｉｎ一２在前列腺癌、乳腺癌中，Ｃｌａｕｄｉｎ一３在肾癌、膀胱癌中，以及Ｃｌａｕｄｉｎ－４在肾癌、肝癌中的表达均是下调的，而淋巴瘤中，Ｃｌａｕｄｉｎ一１—５和７均不表达；Ｍｏｕｓｔａｆａ等Ｉ删用逆转录聚合酶链反应（１ＬＴ－ＰＣＲ）和蛋白印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）方法证实头颈部鳞癌中，Ｃｌａｕｄｉｎ一７的表达较周围正常组织也是降低的。Ｃｌａｕｄｉｍ蛋白表达水平的降低并不是由于其基因的改变引起的，ｃｈｕｄｉｍ基因的启动子和编码区序列并未发生遗传学上的变化，提示其他调节或外源性的因素在肿瘤发展过程中影响ｃｈｕｄｉｎｓ的下调。这些外源性因素至今尚不清楚。然而在更多肿瘤组织中ｄａｕｄｉｎｓ表达水平明显较周围组织中增高。且随着肿瘤级别的升高、淋巴结转移的发生，表达水平随之升高。
万方数据
泸州医学院学报
２００９年第３２卷
第６期
Ｊｏｕｒｎａｌ
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Ｖ０１．３２
Ｎｏ．６
２００９
Ｌｏｎｇ等［ｈｉ利用Ｎｏｒｔｈｅｎ印迹发现在人类前列腺癌上皮中，Ｃｌａｕｄｉｎ－３基因转录的ｍＲ．ＮＡ量较周围正常组织明显增高，同时用免疫组化发现Ｃｌａｕｄｉｎ－３蛋自在骨转移灶中的表达也是增高的；Ｒａｎｇｅｌ等比较分析了７０例的卵巢癌、正常组织及卵巢囊腺瘤，结果发现Ｃｌａｕｄｉｎ－３、４在卵巢癌各亚型中均高表达且定位于胞浆；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等“２１发现Ｃｌａｕｄｉｎ一３、４，７在胃腺癌、食管癌及胃黏膜分化不良细胞、Ｂａｒｒｅｕ’Ｓ食管中的表达均较正常组织增高；ＮｉｃｈｏｌｓｌＵｌ等发现胰腺癌９９％的原发灶和１００％转移灶的癌细胞膜上高表达Ｃｌａｕｄｉｎ一４；Ｒｅｓｎｉｃｋ等１１４１发现Ｃｌａｕｄｉｎ－１、３、４在肠型胃癌中是高表达的。另外，Ｑｌｉｖｅｉｒａａ等Ｉ均也证实在大肠癌中Ｃｌａｕｄｉｎ一１、３、４的表达是较正常组织增高的。除此之外，在一些有ｄａｕｄｉｎ高表达的肿瘤中，其表达水平与肿瘤的恶性等级、侵袭性以及淋巴转移有关。ＬａｎｄｅｒｓＫＡ等㈣利用实时ＲＴ－ＰＣＩＬ，蛋白质印迹法和免疫组化的方法发现在前列腺原发肿瘤中ｃｈｕｄｉｎ一４都是上调的，而它在低等级（Ｇｌｅａｓｏｎ６）癌组织中的表达明显高于其在高等级（Ｇｌｅａｓｏｎ大于等于７）癌组织中的表达。Ｙｏｎｇ－ＬｉａｎＷｕ等Ｉ研在胃腺癌研究中得到的结论是ｃｌａｕｄｉｎ—Ｉ在低分化腺
癌中的表达低于高、中分化腺癌中的表达，而在已侵及固有肌层和腹壁或淋巴转移的腺癌中表达明显高于仅侵及黏膜和黏膜下层而无淋巴转移的腺癌。肿瘤组织中ｃｈｕｄｉｎｓ过表达的机制目前正在研究中，研究结直肠癌组织中ｃｌａｕｄｉｎ－１过表达的机制时发现，ｄａｕｄｉｎ一１过表达可以抑制Ｅ—ｃａｄｈｅｆｉｎ表达，失去Ｅ—ｃａｄｈｅｒｉｎ表达使Ｅ—ｃａｄｈｅｆｉｎ／Ｔｃｆ信号通路上调。Ｃｈｕｄｉｎ一１在细胞膜上定位的改变、Ｅ—ｃａｄｈｅ６ｎ表达减少、Ｅ—ｃａｄｈｅｒｉｎ／Ｔｃｆ信号通路上调共同作用促进肿瘤的发生发展。Ｃｌａｕｄｉｎｓ虽在各种肿瘤中的表达水平有高有低，但这并不矛盾，它们在恶性肿瘤组织中的表达无论高低或是否被磷酸化，最终总是引起紧密连接屏障的正常结构破坏而导致胞间分子异常侧向扩散、细胞极性消失等一系列变化１１搠，Ｃｌａｕｄｉｍ接触抑制的丢失。是肿瘤进展早期（细胞极性的丢失和生长失控）和晚期（浸润和转移）的典型特征。
６．Ｃｌａｕｄｉｎｓ蛋白应用于肿瘤诊断、治疗
由于Ｃｈｕｄｉｎ蛋白的表达是具有高度组织特异性的，使它们有希望应用于不同肿瘤的早期诊断及鉴别。如前所述，Ｃｈｕｄｉｎ－３、４在卵巢癌、乳腺癌、肠型胃癌、大肠癌等组织中的高表达，可参与早期诊断，而它们又较少在弥漫型胃癌中表达则有利于胃癌类型的早期鉴别；Ｃｌａｕｄｉｎ一４在胆管癌细胞中高表达而在肝细胞癌及正常肝组织中不表达，也可应用于两者的早期鉴别；Ｃｌａｕｄｉｎ一５仅在血管肉瘤及良性脉管肿瘤中表达，可作为其标记物；Ｃｌａｕｄｉｎ一１０的表达与否则可作为原发性肝癌根治术后复发的独立预后因子，以及甲状腺乳头状癌、滤泡状癌的鉴别手段。产气荚膜杆菌外毒素（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｍｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ
ＣＰＥ）在人群中可引起食物中毒，而
Ｃｈｕｄｉｎ一３、４蛋白是ＣＰＥ的受体。这种细菌有一个ｊ虫特的作用机制，当它与其受体结合后，可以形成一种大的、十二烷基硫酸钠抵抗的复合物，这种复合物促使细胞膜通透性的改变，导致细胞溶解坏死。而Ｃｌａｕｄｉｎ一３、４在不同人类肿瘤组织中
第６期雷军等：紧密连接蛋白ｅｌａｕｄｉｎ的研究进展的含量是不同的，由此想到在Ｃｌａｕｄｉｎ－３、４高表达的癌组织中，可以利用这种细菌进行肿瘤治疗。Ｍｉｃｈｌ等曾描述了用细胞病变效应ＣＰＥ瘤内注射异种嫁接的胰腺癌细胞，结果引起肿瘤细胞大面积坏死，明显延缓了肿瘤生长，同时证实了ＣＰＥ的细胞毒性仅限于ｃｌａｕｄｉｎ－４高表达的癌细胞，并呈剂量依赖性。ＣＰＥ的功能区域可以分为受体结合区（Ｃ—ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｏｆ
ｃＰＥ，Ｃ—ＣＰＥ）和细胞毒素区（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｏｆ
ＣＰＥ）。Ｍａｓｕｏ
ｋｏｎｄｏｈ等发现了Ｃ—ＣＰＥ有使药物吸收增加的效应，而且没有粘膜毒性。同时，考虑到若能在肿瘤化疗药物中整合入ＣＰＥ的骨架，使其能结合特异的Ｃｌａｕｄｉｎ受体，则可使化疗药物具有肿瘤特异性，从而可增强化疗效果、减少副作用。其次，Ｃｈｕｒｎ蛋白均是跨膜蛋白，胞外通常具有两个环，如果使用特异的抗体识别结合特异的Ｃｈｕｄｉｎ蛋白胞外环靶点，将可能成为有前景的肿瘤治疗方法之一。重组单克隆抗体已开始应用于肿瘤治疗研究，如人类免疫球蛋白Ｇ（１９Ｇ）抗体应用于乳腺癌、鸡单克隆抗体应用于Ｃｌａｕｄｉｎ－１、３、４高表达肿瘤的治疗研究等Ｉ“。再者，由于某些Ｃｌａｕｄｉｎ蛋白在肿瘤细胞中的表达是下调或缺失的，所以如何转导或激活此类蛋白的基因、转录因子从而恢复细胞间正常紧密连接结构、减弱肿瘤细胞侵袭转移等问题也是今后的研究方向。
综上所述，ｃｈｕｄｉｍ作为细胞间紧密连接的主要功能蛋白通过细胞屏障、细胞旁路转运和信号转导保持了细胞内环境的平衡。编码它的基因改变以及它在多种疾病特别是不同肿瘤组织中的异常表达已成为细胞生物学以及众多相关学者的研究热点。虽然目前已完成的研究主要是侧重于基础及动物实验，而且Ｃｈｕｄｉｎ蛋白在相关疾病及肿瘤发生、发展过程中究竟确切作用机制如何，目前尚不是很清楚。但通过对ｃｈｕｄｉｍ家族编码的蛋白在肿瘤和正常组织中的差异表达，利用ｃｈｕｄｉｎｓ表达存在高度的组织特异性，有可能将其作为多种肿瘤侵袭和转移的标志。同时随着对ｃｈｕｄｉｎｓ结构和功能的进一步深入研究和分子生物学技术的飞速发展，ｃｈｕｄｉｍ在药理学和在肿瘤的检测、诊断、治疗中必定会有一个非常好的前景。
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