北方园艺２００９０）：１１９～１２３
・专题综述・
植物抗冻基因最新研究进展
蔺忠龙１“，李维薇１，白现广１’３，吕广磊２“，程在全３
（１．云南大学生命科学学院，云南昆明６５００９１；２．云南农业大学农业与生物技术学院．云南昆明６５０２０１；
３．云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所．云南昆明６５０２２３）
摘要：低温冻害使许多植物生存受到严重危害，全球每年因低温冻害造成的农作物损失高达数千亿元。研究并提高植物抗冻性具有重要理论和现实意义。目前，通过对冷诱导基因、ＣＢＦ、ＩＣＥ、抗冻蛋白基因、脂肪酸去饱和酶基因、脯氨酸基因、ＳＯＤ基因等与抗冻相关的基因的研究表明，将这些抗冻相关基因进行转基因，可以提高植物的抗冻性。现综述植物抗冻性基因的类型及其抗冻转基因植物最新研究进展。
关键词：抗冻基因；冷诱导基因；ＣＢＦ；ＩＣＥ；抗冻蛋白；转基因植物
中图分类号：Ｓ６０３．４文献标识码：Ａ文章编号：１００１－－０００９（２００９）０１一０１１９—０５
随着人口的增长和耕地面积的不断减少，如何提高作物的产量越来越受到人们的广泛关注，而气候条件是影响作物产量的重要因素之一。冻害一直制约着作物产量的提高，低温冻害使许多植物生存受到严重危害，全球每年因低温冻害造成的农作物损失高达数千亿元。研究并提高植物抗冻能力，并培育出抗冻作物品种就可能延长作物的生育期，同时也会抵御骤然低温对作物造成的不良影响，对提高作物的产量有着非常重要的意义。因此，培育耐寒和抗冻的作物品种无疑是一种最佳的选择。但是通过常规育种方法很难培育出抗冻的作物品种。近年来，随着基因工程技术在作物品种改良方面取得了巨大进展。具有可控性强、效率高、周期短、成本低等优点的植物基因工程技术已经成为新品种选育的一条全新而有效的途径ｎ］。
苜蓿
离鉴定的植物冷诱导基因见表１。Ｗｅｉｓｅｒ认为植物在适应低温过程中基因表达发生改变，Ｇｕｙ等研究发现冷驯化能诱导和增加一些基因的表达，使多种基因表达发生改变。这些冷诱导基因表达的产物可分为２类，一是调控蛋白，调控寒冷信号传导、抗寒基因表达和抗寒蛋白活性；二是功能蛋白，与植物抗寒性的提高直接相关。
表１
试验材料拟南芥ｒｄ２９Ａ
ｒｄ２９Ｂ
已经分离鉴定的植物冷诱导基因［２ｑ１
蕊因
胁迫阴索
低珏矗胁ｊ［ｉ、Ｉ：ＨＩ胁迫低温胁迫、ｆ早胁迫低温胁迫、干早胁迫低温胁迫低温胁迫、盐胁迫
ＣＯＲ７８（Ｘ３Ｒ６．６‘．Ｘ３Ｒ４７
∞Ｒ】５Ｂ
ＫｈｌＫｉｎ２
ｋｉ７８ｌｉｔ４０
ＯＣＲｌＲｃｌｌＲＣｌ２ｆａｄ８
低＿瞌｛胁迫
低温胁迫、千早胁迫低温胁迫、干旱胁迫低赳胁迫低温胁ｊ［ｉ低温胁迫低锄胁迫
低泓胁迫、干旱胁迫
ＣＯＲｌ５Ａ１ｔ１６５Ｃｃｒ２Ｍ．ⅢｅｉＡＳＭ２０７５
ＳＭ２２０ｌＳＭ２３５８Ｍ日ｓ‘孙：Ｃａｓｌ５Ｃａｓｌ７Ｃａｓｌ８
１植物抗冻基因的研究现状
目前已知的植物抗冻基因主要为环境诱导表达的基因及某些组成性表达的基因。前者指冷驯化（植物自身适应环境的结果），后者是通过基因工程技术克隆出抗冻基因，连上强启动子或冷诱导启动子转入植物，获得转基因植株，进而提高植株的抗冻性［１］。如有骤然低温或霜冻来得较早的年份，前者来不及反应就受到冻害，而后者目的性强，对低温迅速做出反应，因此，育种上经常采用此种方法来培育抗冻作物品种。目前已分
小麦菠菜油菜
ＢＮｌｌ５ＢＮｌ９ＢＮ２６ＩＭｃ２４Ｂ
＆啦４Ａ
ａｄｈ
∞ｐ８５ｃａｐｌ６０低温胁迫、于早胁迫低温胁迫
低温胁迫．干早胁迫、脱落酸诱导低温胁迎、脱端酸诱导低潞胁ｉｆ！
低温胁迫、干旱胁迫、脱落酸诱导低镒胁迫
ＷＣＳｌ９
低韫胁迫
低温胁迫、１：早胁迫、脱落酸诱导低泓胁迫低洫胁迫
ＥＲ—ＨＳＣＴ０
马铃瞢Ａ１３
Ｃ１２Ｃ１７ｈｉｔｌ；０ｌ
大麦ＨＶＡｌ
ｂｈｌ０１ｂｉｔ６３ｂｌｔ４ｂｉｔ４．２ｂｈ４．９ｂｌｔ４．１Ａ０８６
Ｗｔ．笃１２０
ＣＯＲ３９
ＷＣＳ２００ＷＣＳ６６
Ｗｃｏｒ４１０
Ｐｂｃ４４２ｐｉｋｅ５９１ｐＢＣ６０１ｒｈｌ４２１
水稻ｐＢＣｌ２１
第一作者简介：蔺忠龙（１９８３一）．男．在读硕士，主要研究方向为植
物分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｔｏｍｌ０１＠ｅｙｏｕ．ｃｏｍ。通讯作者：程在全．
黑发Ｒｈｌ４１２
１．１
ＣＯＲ基因
基金项目：云南省自然科学基金资助项目（２００５０∞６３Ｍ）。
收稿日期：２００８一０８—１０
Ｏ［）Ｒ基因是冷诱导基因，在它的启动子区域含有具有５个碱基核心序列Ｃ．ＣＧＡＣ的脱水反应元素ＤＲＥ
１１９
万方数据
・专题综述・
（Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ）ＤＲＥ做为顺式作用启’
动子元素，能在低温胁迫时激活ＣＡ）Ｒ基因的表达Ｌ４＂１。
ｌＹＩａｓａｋａＺＵ
Ｈ等将Ｃｕ２ＣＯＲｌ９转入烟草，和对照烟草植
株相比较，转基因植株电渗值较低、发芽率较高、抗冻性有所提高口］。ＰｕｈａｋａｉｎｅｎＴ等于２００４年将ＲＡＢｌ８，ＣＯＲ４７（ｐＴＰ９）以及ＬＴｌ２９，ＬＴｌ３０（ｐＴＰｌ０）分别构建到植物表达载体ｐＤＥｌ００１，之后分别电击转化到农杆菌ｐＯＶ２２６０中，以此农杆菌分别侵染拟南芥。低温条件下，转基因拟南芥植株和对照植株相比降低了。ＬＴ５０，并且转基因植株的存活率也明显高于对照植株【６］。
１．２
ＣＢＦ（Ｃｒｅｐｅａｔｂｉｎｄｉｎｇ
ｆａｃｔｏｒ）转录因子
一个典型的植物转录因子包括：ＤＮＡ结合域、低聚糖位置、转录调节区域和一个核酸定位信号［７］。ＣＢＦ转录因子的发现是近年来植物抗逆研究方面最具突破性的发现。拟南芥中的ＣＢＦ家族包括ＣＢＦｌ、ＣＢ砣和ＣＢＦ３。ＣＢＦ２、ＣＢＦ３与ＣＢＦｌ的基因序列有较高的同源性，分别为８１％和８４％，ＣＢＦｌ、ＣＢＦ＇２和ＣＢＦ３位于拟南芥的第４号染色体，并且串联在上面［８］。这３种基因的强表达使拟南芥生长缓慢、花期延迟、脯氨酸和蔗糖含量增加，同时使拟南芥抗冻性也得到一定提高【９］。这３种ＣＢＦ结合到ＣＯＲ基因的ＤＲＥ序列上，从而诱导一系列ＣＯＲ基因的表达，因此有人把ＣＢＦ转录因子看作低温时激活一些ＣｏＲ基因的开关。目前已发现ＣＢＦ调控的抗冻基因至少有十几种，如：ｒｄ２９Ａ、Ｉｔｉ７８、ｃｏｒ７８、
ｃｏｒｌ５ａ、ｋｉｎ２，ｃｏｒ６．６、ｅｒｄｌ０、ｋｉｎｌ、ｒｄｌ７、ｅｏｒ４７、Ｆ１３２５Ａ３、
Ｆ１５２７７、Ｆ１５２９４、Ｆ１３２２７、Ｆ１１２５２２１２２和ｅｒｄｌ４［Ｉ］。
ＣＢＦｌ连上ＣａＭＶ３５Ｓ启动子转入拟南芥，检测未经低温处理的转基因植株发现：ＣＢＦｌ持续强表达诱导了ｃｏｒ６．６，ｃｏｒｌ５ａ，ｃｏｒ４７和ｃｏｒ４８基因的表达，提高了拟南芥植株的抗冻性［８】。ＣＢＦ２在拟南芥胁迫抗性中起重要作用，有试验表明在ＣＢＦ２被破坏的拟南芥植株中ＣＢＦＩ和ＣＢＩＲ３的表达增强，这表明：ＣＢＦ２是ＣＢＦＩ和ＣＢＦ３表达的一个负调节子［４ｊ。拟南芥中的ＣＢＦ３能刺激４０多种胁迫诱导基因的表达，如ｒｄ２９，ｃｏｒｌ５Ａ，ｃｏｒ４７等［１０］。
ＴｈｏｍａｓｈｏｗＭ
Ｆ等于２００１年将拟南芥中的ＣＢＦ３基因
分别连上ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、冷诱导启动子ｒｄ２９Ａ，之后转入烟草中，二者都显著提高了烟草植株的耐低温能力［引。
１．３
ＩＣＥ（ＩｎｄｕｃｅｒｏｆＣＢＦ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）转录激活因子
ＩＣＥ是在低温时诱导ＣＢＦ家族表达的转录激活因子，它在低温时能特定地结合到ＣＢＦ的启动子序列上，诱导ＣＢＦ的表达，而后ＣＢＦ结合到其下游目的基因启动子的ＤＲＥ序列上，诱导ＣＯＲ的表达，从而提高植株的抗冻性［８］。ＣｈｉｎｎｕＳａｍｙＶ等于２００３年已经从拟南芥中得到ＩＣＥＩ（Ｉｎｄｕｃｅｒ
ｏｆＣＢＦｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
１），并且连上
ＣａＭｖ３５Ｓ启动子转入拟南芥，获得了含ＩＣＥｌ基因的转
１２０
万方数据
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基因拟南芥植株，通过检测证实转基因拟南芥植株的抗冻性有很大的提高Ｄ０３。
２植物抗冻基因及转基因植物最新研究进展
近年来，随着人们对植物抗冻基因进行了深入的研究，揭示了植物抗冻性除受多基因协同调控外，某些单基因也起了重要作用。因此，这些单基因有可能用于植物抗冻基因工程。在不影响作物产量、品质的情况下，利用植物转抗冻蛋白基因手段培育抗冻品种已成为一条全新而有效的途径。抗冻蛋白（Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ，
ＡＦＰｓ）是２０世纪６０年代从极地海鱼的血清中发现的一种具有阻止体液内冰核的形成与生长、维持体液的非冰冻状态的高效抗冻活性物质。目前已发现的抗冻蛋白可分为４类：Ｉ型抗冻蛋白富含丙氨酸重复序列，具有ａ一螺旋结构的多肽，以美洲拟鲽的ＡＦＰ为代表；Ⅱ型抗冻蛋白是富含胱氨酸，并具有ｐ一折叠结构的多肽，以绒杜父鱼的ＡＦＰ为代表；Ⅲ型抗冻蛋白的氨基酸组成无明显偏向性，是无一定二级结构的多肽，以美洲大绵的ＡＦＰ为代表；Ⅳ型抗冻糖肽（Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ
ｇｌｙｃｏｐｅｐ－－－ｔｉｄｅ，
简称ＡＦＧＰ），主要代表为南极鳕鱼，可产生类似于糖三肽多聚体的ＡＦＧＰ。抗冻蛋白存在于不同的生物体中，包括鱼类、昆虫和植物，但对鱼类抗冻蛋白的研究较多…］。ＨｕａｎｇＴ等２００２年将树状抗冻基因ｄａｆｐ－１基因转入拟南芥中，而后和对照植株相比发现转基因植株的抗冻性提高了１．Ｏ～３．３＂Ｃ［１２｜。ＩｆｉＣＭ等２００６年从云杉蚜虫中分离得到抗冻蛋白ＣｆＡＦＰ一５０ｌ，并且分析出此蛋白的结构㈨ｊ。
２．１鱼类ＡＦＰｓ基因及其转基因植物
对鱼类ＡＦＰｓ研究的较多并且起步较早，早在２０世纪７０年代初期就已经从海洋鱼类的血清中发现了抗冻蛋白，并且已作了比较系统深入的研究。。利用鱼类抗冻蛋白基因对植物进行遗传转化的研究始于２０世纪８０年代末期，１９８７年Ｄａｖｉｅｓ等将抗冻基因ＡＦＰｓ整合到，ｆｉ质粒上，用叶圆片法转化郁金香、烟草和油菜等获得一定抗冻力。Ｃｕｒｌｅｒ等用冬比目鱼溶液处理植物组织的研究表明，用ＡＦＰ真空浸润马铃薯、欧洲油菜和拟南芥叶片可使叶片自发冰点显著降低，说明ＡＦＰ具有抗冻作用；用ＡＦＰ处理雀麦草及其悬浮培养细胞，可降低任何给定温度下冰冻的可冻水量，表明ＡＦＰ有低温保护作用；ＡＦＰ能降低冰晶形成的速度，在某些极地鱼中发现的类型Ｉ抗冻蛋白（ＡＦＰｓ）可防止组织细胞中冰晶的形成，并已通过转基因技术使ＡＦＰｓ在一些转基因植株中得到表达，如已经在转基因烟草中证明ＡＦＰｓ的积累具有低温特异性，它抑制冰晶的形成。鱼类抗冻蛋白基因转入烟草和番茄已获得较好表达，ＧｅｏｒｇｅｓＦ等将人工合成的黄盖鲽鱼抗冻蛋白基因导人玉米原生质体，在植物细胞中获得表达ｎ“。黄永芬等获得转美洲拟鲽抗冻
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基因ＡＦＰ的番茄，且低温下转基因植株长势优于对照，致死温度比对照降低２～４℃，一系列检测表明抗冻基因ＡＦＰ已整合到转化番茄基因组中并获得表达。Ｈｉｇｈｔ—
ｏｗｅｒ
Ｒ等利用农杆菌将比目鱼体内抗冻蛋白（ＡＦＰｓ）基因转入番茄，发现转基因番茄不但稳定转录ＡＦＰ的ｍＲＮＡ，还产生一种新的蛋白质，这种转基因番茄的组织提取液在冰冻条件下能有效阻止冰晶增长［１
５ｉ。
２．２
昆虫ＡＦＰｓ基因及其转基因植物
由于昆虫抗冻基因ＡＦＰｓ的热滞活性明显高于鱼
类和植物，因此，其抗冻基因Ａｎ’ｓ的导入可能更有效地提高转基因植物的抗冻性。冬季，某些昆虫血淋巴的热滞活性为３～６℃，最高达到８～９℃，明显高于血清抗冻蛋白的热滞活性（１～２℃）。Ｔｙｓｈｅｎｋｏ等于１９９７年从甲虫和云杉卷叶蛾中分离到的抗冻蛋白的活性是鱼类抗冻蛋白的１０～１００倍［１引。２００１年Ｈｏｌｍｂｅｒｇ等第一次将云杉蚜虫的抗冻基因ＡＦＰｓ与ＣａＭｖ３５Ｓ及胭脂碱合成酶基因组成重组基因后转人烟草，发现转基因烟草中质外体云杉蚜虫抗冻基因Ａｔ＇７的表达能抑制冰重结晶，并且提高了热滞值【ｌ
７｜。
２．３
植物ＡＦＰｓ基因及其转基因植物
与鱼类和昆虫抗冻蛋白相比，植物ＡＦＰｓ研究的较
晚。直到１９９８年ｌｏ月，Ｄａｗｎｏｒｒａｌｌ等在Ｃ％＇ｉｅｎｅｅ》上发表了胡萝卜ＡＦＰｓ及其基因的研究论文，这标志着第一
个植物趾甲基因的发现，并且将此』岍基因连接在表
达载体上转化烟草，获得了表达并且产生了√廿Ｐｓ，提高了转基因烟草植株的抗冻性［Ｊ引。１９９９年Ｍｉｃｈａｅｌ等从桃树（Ｐｒｕｎｕｓｐｅｒｓｉｃａ）的树皮中提取到一种脱水蛋白ＰＣＡ６０，这是第一次发现具有脱水素蛋白特性的抗冻蛋白，其富含赖氨酸、甘氨酸，分子量为５０ｋｕ，具有较强的修饰冰晶能力【ｌ…。
最近克隆到的植物抗冻蛋白基因还包括黑麦草
ｌ１１７
ｋＤ的ＡＦＴ的ｅＤＮＡ［２０］；冬黑麦［２１１中３
１１７ｋＤ的
ＡＦＰｓ的ＣＨＴ基因，２４１８ｋＤ的ＡＦＰｓ的ＣＨＴ４６基因。
其中来自冬黑麦中的这两个抗冻蛋白基因，均已被转化到大肠杆菌中，检测结果表明，表达蛋白具有抗冻活性。２００２年ＦａｎＹ等以胡萝卜幼苗为模板进行ＰＣＲ扩增，克隆到一个１
０９９
ｂｐ的抗冻蛋白基因，连上ＣａＭｖ３５Ｓ启动子，构建到ｐＣＡＭＢＩＡ２３００载体上后转入烟草，０℃条件下，转基因烟草所受的冻害明显低于对照烟草［２引。２．４脯氨酸基因及其转基因植物
冷驯化后脯氨酸含量增加，表明脯氨酸可能与植株抗冻性有关。脯氨酸是水合能力较强的氨基酸，其含量增加有助于细胞持水和生物大分子结构的稳定。Ｗａｎ－
ｎｅｒ
Ｌ
Ａ等报道，低温处理５ｄ的拟南芥植株中脯氨酸含
量比未低温处理的对照拟南芥植株高３～５倍［２“。低温处理条件下，ＣＢＦ３强表达的植株中脯氨酸的含量也
万方数据
・专题综述・
比对照植株高２－－３倍心引。ＰａｒｖａｎｏｖａＤ等于２００４年将脯氨酸基因转入拟南芥，转基因和对照植株经过２２℃处
理１２ｈ，转基因植株存活而对照植株则死亡【２引。Ｇｌｅｅ—
ｓｏｎ
Ｄ等于２００５年利用农杆菌将Ｖｉｇｎａａｅｏｎｉｔｉｆｏｌｉａ基因
转化到落叶松，结果转基因植株的脯氨酸含量比未转基因的对照植株高３０倍，转基因植株的抗冻性得到很大提高‘２引。
未经低温处理ＣＢＦ３强表达的拟南芥植株中脯氨酸的含量比对照植株高５倍，其含量相当于低温处理对照植株的脯氨酸含量。低温处理条件下，ＣＢＦ３强表达的植株中脯氨酸的含量也比对照植株高２～３倍。
Ｐａｒｖａｎｏｖａ
Ｄ等于２００４年将脯氨酸基因转入拟南芥，转
基因和对照植株经过一２＂Ｃ处理１２ｈ，转基因植株存活
而对照植株死亡。ＧｌｅｅｓｏｎＤ等于２００５年利用农杆菌将
Ｖｉｇｎａ
ａｃｏｎｉｔｉｆｏｌｉａ基因转化到落叶松，结果转基因植株的
脯氨酸含量比未转基因的对照植株高３０倍，转基因植株的抗冻性得到很大提高［２
７｜。
２．５
脂肪酸去饱和酶基因及其转基因植物
很多研究表明，低温冻害导致生物膜的透性改变。
低温引起膜脂的物相发生变化，使膜脂由正常的液晶态变为凝胶态，如果在低温下能保持膜脂的液晶状态，则植物的抗冻性提高；而增加膜脂中不饱和脂肪酸的比例即可维持膜的液晶状态，防止膜类固化，即能提高抗冻性。ＭｕｒａｔａＮＬ２８ｊ将南瓜藤和拟南芥中得到的甘油一３２一磷酸酰基转移酶基因导人烟草中，明显改变磷酸酰甘油的脂肪酸组成，并提高其抗冻力。ＰｏｌｓｈｏｃｋＪ等将酵母的△一９脂肪酸去饱和酶基因，ＫｏｄａｍａＨ等将拟南芥的编码ｃｔ广３脂肪酸去饱和酶基因ｆａｄ，ＭａＪ等将菠菜的硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因ＳＡＤ，分别导人烟草中均增强了转基因烟草的抗冻性［２¨引。ＫｏｄａｍａＨ等将拟南芥叶绿体ｏｒ３脂肪酸脱氢酶基因ｆａｄ７导人烟草中增强转基因烟草抗冷性¨¨。刘丹等利用脂肪酸去饱和的关键酶（ＳＡＤ）基因对烟草进行遗传转化，结果表明转基因烟草抗寒性明显增强。ＨａｙａｓｈｉＨ等将编码来自Ａｒ－
ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ或Ａ．ｐａｓｃｅｎｓ的胆碱氧化酶的基
因ｃｏｄＡ导人拟南芥获得抗冻转基因植株。
２．６
ＳＯＤ基因及其转基因植物
低温条件下，细胞内活性氧的产生和消耗平衡遭到
破坏，使膜系统稳定性受到影响，活性氧积累，从而使膜脂发生过氧化和脱脂作用。近而破坏膜结构。研究表明，ＳＯＤ可清除活性氧，维护膜系统稳定性。将含有ｓ（）Ｄ的ｅＤＮＡ转入烟草、番茄等植物中，强表达后都提高了植物的耐氧化能力，这对植物抗冻具有重要意义。
Ｍｃｋｅｒｓｉｅ将从烟草中克隆得到的ＭｎＳＯＤ的ｅＤＮＡ与
３５Ｓ启动子连接后转化苜蓿，结果转基因植株的抗冻性有所提高ｎ副。Ｌｅｅ
Ｈ
Ｓ等于１９９９年从木薯的ｅＤＮＡ中
１２１
・专题综述・
克隆到编码１５２个多肽的ｍＳＯＤＩ，并将ｍＳＯＤＩ基因转入木薯。转基因植株和对照植株相比抗冻性有一定提高¨引。ＢａｇｎｏｌｉＦ等于２００１年从桃树ｃＤＮＡ中克隆到
ＭｎＳＯＤ３“。３
植物抗冻基因研究中存在的问题及发展前景
提高植物的抗冻性，培育抗冻作物品种对于农业具
有十分重要的意义。然而，作物的抗冻性状一般受多基因控制，且与品质低劣性状（如矮化、倒伏、结实率低等）紧密连锁。解决这个问题有两个办法：一是转化那些翻译后修饰的转录因子基因，如非低温胁迫时３５Ｓ：
ＤＲＥＢ２Ａ（ＤＲＥ－ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ）植株只表现轻微的生长
阻碍，在低温时这种转录因子才诱导ＣＯＲ基因表达；二是使用冷诱导型的启动子，如使用冷诱导启动子ｒｄ２９Ａ的ＣＢＲ转基因时．拟南芥的不利性状大大减小。转抗冻基因技术如何达到高效、快速、简便，适用性广，仍然是植物抗冻基因工程的一个重要限制因子。
已研究的绝大多数植物材料中ＡＦＰ活性大大低于鱼类和昆虫，所研究的植物虽多达几十种，但真正被分离纯化出来的ＡＦＰ尚是很多。因此如何从植物中分离出更多的、活性更高的ＡＦＰ，并通过遗传转化将其导入抗冻性弱或不抗冻的植物中进而获得抗冻性强的转基因植株，将是今后植物抗冻性基因工程研究的主要内容
之一。
目前，抗冻蛋白在植物抗寒基因工程中的利用还非常有限，我们还需要分离和克隆更为优良的、能用于植物基因工程的抗冻蛋白基因，同时也需要对目前已获得的抗冻蛋白在结构、功能上进行深入分析。
尽管植物抗冻基因研究中还有许多问题等待解决，但是完整的植物基因工程的理论和技术体系已基本建立，植物基因工程技术已开始走向商业化的发展道路。尽管现在有关抗冻基因及转抗冻基因植物方面的研究不多，但在不远的将来转入抗冻基因的植物一定会得到飞速的发展。
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北方园艺２００９（１）：１２３～１２５・专题综述・
超滤膜技市在香菇萋糖提取巾的应用
李
琚１，钟耀广１，２，刘长江２
（１．上海水产大学食品学院。上海２０００９０；２．沈｜４｛农业大学食品学院．辽宁沈阳１１０１６１）
摘要：采用超滤膜技术提取纯化香菇多糖具有收率高、不易破坏多糖的生物活性、能耗低等特点，适于工业化生产。现就超滤膜分离技术的发展现状及其在香菇多糖提取中的应用进行
了综述。
关键词：香菇多糖；超滤；分离；纯化
中图分类号：Ｓ６４６．１＋２文献标识码：Ａ文章编号：１００ｌ—ｏ００９（２００９）０１一０１２３一０３
香菇是侧耳科的担子菌，世界名贵食药兼用菌之一，它含有多种有效药用组分，主要是香菇多糖（１ｅｎｔｉｎ—ａｎ，简称ＬＮＴ）。研究表明分子量在４０００００～８００
０００
在临床上具有很好的应用前景［２］。具有的生物活性已经引起了人们越来越多的关注。
香菇多糖的功能性与多糖的纯度有很大关系。近年来，有采用超滤法提取香菇多糖的研究，研究表明该方法可以降低成本，提高产率。现简要介绍超滤膜技术在香菇多糖提取、纯化中的应用及研究进展。
的ＬＮＴ具有显著的抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和抗感染活性Ⅲ，还有研究证明其对艾滋病有很好的疗效，
第一作者简介：李瑶（１９８４一）。女．硕士．研究方向为食品安全。
通讯作者：钟耀广。Ｅ－ｍａｒｌ：ｚｈｏｎｇｙａｏｇｕａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ。
１超滤膜分离技术的应用
ｌ－ｌ超滤膜技术的发展现状
膜分离是指以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力（如压差、浓度差、电位差等）时，原料组分可选择透过膜，从而达到分离提纯的过程。人们发现
基金项目：上海水产大学引进优秀人才科研基金资助项目；上海
水产大学研究生科研基金资助项目（Ａ－２５０ｌ＿０８－１９２）。收稿日期：２００８一０８—１０
［ｚ８３ＰｏｌａｓｈｏｃｋＪ．Ｌｉｐｓｏｎ１３．Ａ
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ｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｐｌａｎｔｆｒｅｅｉｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅａｎｄａｎｔｉｆｒｅｅｚｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓ；ＣＢＦ；ＩＣＥ；Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅｐｒｏｔｅｉｎ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ
１２３
ｇｅｎｅ；Ｃｏｌｄ
万方数据
植物抗冻基因最新研究进展
作者：作者单位：
蔺忠龙， 李维薇， 白现广， 吕广磊， 程在全， LIN Zhong-long， LI Wei-wei， BAI Xian-guang ， LV Guang-lei， CHENG Zai-quan
蔺忠龙,白现广,LIN Zhong-long,BAI Xian-guang(云南大学生命科学学院,云南昆明,650091;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南昆明,650223)， 李维薇,LIWei-wei(云南大学生命科学学院,云南昆明,650091)， 吕广磊,LV Guang-lei(云南农业大学农业与生物技术学院,云南昆明,650201;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南昆明,650223)， 程在全,CHENG Zai-quan(云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南昆明,650223)北方园艺
NORTHERN HORTICULTURE2009，""(1)2次
刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
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相似文献(1条)
1.期刊论文 黄文功. 殷奎德. 高中超. Huang Wengong. Yin Kuide. Gao Zhongchao 植物抗冻基因工程研究进展 -生物技术通报2006,""(2)
提高作物的抗冻性对于提高作物产量有着非常重要的意义.目前,对冷诱导基因、CBF、ICE、抗冻蛋白基因、脂肪酸去饱和酶基因、脯氨酸基因、SOD基因与抗冻的关系进行了广泛的研究,研究表明对这些抗冻相关基因进行转基因,可以提高植物的抗冻性.而一些抗冻基因应用到作物上,也可以提高作物的抗冻性.
引证文献(1条)
1. 郝凤. 刘晓静. 周爱琴. 于铁峰 抗冻基因及其在基因工程中的应用研究进展[期刊论文]-草原与草坪 2009(3)
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_bfyany200901040.aspx授权使用：陈燕霞(wfcngxu)，授权号：e18e5df0-d6d7-48a2-a5d2-9e3901617e2e
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北方园艺２００９０）：１１９～１２３
・专题综述・
植物抗冻基因最新研究进展
蔺忠龙１“，李维薇１，白现广１’３，吕广磊２“，程在全３
（１．云南大学生命科学学院，云南昆明６５００９１；２．云南农业大学农业与生物技术学院．云南昆明６５０２０１；
３．云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所．云南昆明６５０２２３）
摘要：低温冻害使许多植物生存受到严重危害，全球每年因低温冻害造成的农作物损失高达数千亿元。研究并提高植物抗冻性具有重要理论和现实意义。目前，通过对冷诱导基因、ＣＢＦ、ＩＣＥ、抗冻蛋白基因、脂肪酸去饱和酶基因、脯氨酸基因、ＳＯＤ基因等与抗冻相关的基因的研究表明，将这些抗冻相关基因进行转基因，可以提高植物的抗冻性。现综述植物抗冻性基因的类型及其抗冻转基因植物最新研究进展。
关键词：抗冻基因；冷诱导基因；ＣＢＦ；ＩＣＥ；抗冻蛋白；转基因植物
中图分类号：Ｓ６０３．４文献标识码：Ａ文章编号：１００１－－０００９（２００９）０１一０１１９—０５
随着人口的增长和耕地面积的不断减少，如何提高作物的产量越来越受到人们的广泛关注，而气候条件是影响作物产量的重要因素之一。冻害一直制约着作物产量的提高，低温冻害使许多植物生存受到严重危害，全球每年因低温冻害造成的农作物损失高达数千亿元。研究并提高植物抗冻能力，并培育出抗冻作物品种就可能延长作物的生育期，同时也会抵御骤然低温对作物造成的不良影响，对提高作物的产量有着非常重要的意义。因此，培育耐寒和抗冻的作物品种无疑是一种最佳的选择。但是通过常规育种方法很难培育出抗冻的作物品种。近年来，随着基因工程技术在作物品种改良方面取得了巨大进展。具有可控性强、效率高、周期短、成本低等优点的植物基因工程技术已经成为新品种选育的一条全新而有效的途径ｎ］。
苜蓿
离鉴定的植物冷诱导基因见表１。Ｗｅｉｓｅｒ认为植物在适应低温过程中基因表达发生改变，Ｇｕｙ等研究发现冷驯化能诱导和增加一些基因的表达，使多种基因表达发生改变。这些冷诱导基因表达的产物可分为２类，一是调控蛋白，调控寒冷信号传导、抗寒基因表达和抗寒蛋白活性；二是功能蛋白，与植物抗寒性的提高直接相关。
表１
试验材料拟南芥ｒｄ２９Ａ
ｒｄ２９Ｂ
已经分离鉴定的植物冷诱导基因［２ｑ１
蕊因
胁迫阴索
低珏矗胁ｊ［ｉ、Ｉ：ＨＩ胁迫低温胁迫、ｆ早胁迫低温胁迫、干早胁迫低温胁迫低温胁迫、盐胁迫
ＣＯＲ７８（Ｘ３Ｒ６．６‘．Ｘ３Ｒ４７
∞Ｒ】５Ｂ
ＫｈｌＫｉｎ２
ｋｉ７８ｌｉｔ４０
ＯＣＲｌＲｃｌｌＲＣｌ２ｆａｄ８
低＿瞌｛胁迫
低温胁迫、千早胁迫低温胁迫、干旱胁迫低赳胁迫低温胁ｊ［ｉ低温胁迫低锄胁迫
低泓胁迫、干旱胁迫
ＣＯＲｌ５Ａ１ｔ１６５Ｃｃｒ２Ｍ．ⅢｅｉＡＳＭ２０７５
ＳＭ２２０ｌＳＭ２３５８Ｍ日ｓ‘孙：Ｃａｓｌ５Ｃａｓｌ７Ｃａｓｌ８
１植物抗冻基因的研究现状
目前已知的植物抗冻基因主要为环境诱导表达的基因及某些组成性表达的基因。前者指冷驯化（植物自身适应环境的结果），后者是通过基因工程技术克隆出抗冻基因，连上强启动子或冷诱导启动子转入植物，获得转基因植株，进而提高植株的抗冻性［１］。如有骤然低温或霜冻来得较早的年份，前者来不及反应就受到冻害，而后者目的性强，对低温迅速做出反应，因此，育种上经常采用此种方法来培育抗冻作物品种。目前已分
小麦菠菜油菜
ＢＮｌｌ５ＢＮｌ９ＢＮ２６ＩＭｃ２４Ｂ
＆啦４Ａ
ａｄｈ
∞ｐ８５ｃａｐｌ６０低温胁迫、于早胁迫低温胁迫
低温胁迫．干早胁迫、脱落酸诱导低温胁迎、脱端酸诱导低潞胁ｉｆ！
低温胁迫、干旱胁迫、脱落酸诱导低镒胁迫
ＷＣＳｌ９
低韫胁迫
低温胁迫、１：早胁迫、脱落酸诱导低泓胁迫低洫胁迫
ＥＲ—ＨＳＣＴ０
马铃瞢Ａ１３
Ｃ１２Ｃ１７ｈｉｔｌ；０ｌ
大麦ＨＶＡｌ
ｂｈｌ０１ｂｉｔ６３ｂｌｔ４ｂｉｔ４．２ｂｈ４．９ｂｌｔ４．１Ａ０８６
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Ｐｂｃ４４２ｐｉｋｅ５９１ｐＢＣ６０１ｒｈｌ４２１
水稻ｐＢＣｌ２１
第一作者简介：蔺忠龙（１９８３一）．男．在读硕士，主要研究方向为植
物分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｔｏｍｌ０１＠ｅｙｏｕ．ｃｏｍ。通讯作者：程在全．
黑发Ｒｈｌ４１２
１．１
ＣＯＲ基因
基金项目：云南省自然科学基金资助项目（２００５０∞６３Ｍ）。
收稿日期：２００８一０８—１０
Ｏ［）Ｒ基因是冷诱导基因，在它的启动子区域含有具有５个碱基核心序列Ｃ．ＣＧＡＣ的脱水反应元素ＤＲＥ
１１９
万方数据
・专题综述・
（Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ）ＤＲＥ做为顺式作用启’
动子元素，能在低温胁迫时激活ＣＡ）Ｒ基因的表达Ｌ４＂１。
ｌＹＩａｓａｋａＺＵ
Ｈ等将Ｃｕ２ＣＯＲｌ９转入烟草，和对照烟草植
株相比较，转基因植株电渗值较低、发芽率较高、抗冻性有所提高口］。ＰｕｈａｋａｉｎｅｎＴ等于２００４年将ＲＡＢｌ８，ＣＯＲ４７（ｐＴＰ９）以及ＬＴｌ２９，ＬＴｌ３０（ｐＴＰｌ０）分别构建到植物表达载体ｐＤＥｌ００１，之后分别电击转化到农杆菌ｐＯＶ２２６０中，以此农杆菌分别侵染拟南芥。低温条件下，转基因拟南芥植株和对照植株相比降低了。ＬＴ５０，并且转基因植株的存活率也明显高于对照植株【６］。
１．２
ＣＢＦ（Ｃｒｅｐｅａｔｂｉｎｄｉｎｇ
ｆａｃｔｏｒ）转录因子
一个典型的植物转录因子包括：ＤＮＡ结合域、低聚糖位置、转录调节区域和一个核酸定位信号［７］。ＣＢＦ转录因子的发现是近年来植物抗逆研究方面最具突破性的发现。拟南芥中的ＣＢＦ家族包括ＣＢＦｌ、ＣＢ砣和ＣＢＦ３。ＣＢＦ２、ＣＢＦ３与ＣＢＦｌ的基因序列有较高的同源性，分别为８１％和８４％，ＣＢＦｌ、ＣＢＦ＇２和ＣＢＦ３位于拟南芥的第４号染色体，并且串联在上面［８］。这３种基因的强表达使拟南芥生长缓慢、花期延迟、脯氨酸和蔗糖含量增加，同时使拟南芥抗冻性也得到一定提高【９］。这３种ＣＢＦ结合到ＣＯＲ基因的ＤＲＥ序列上，从而诱导一系列ＣＯＲ基因的表达，因此有人把ＣＢＦ转录因子看作低温时激活一些ＣｏＲ基因的开关。目前已发现ＣＢＦ调控的抗冻基因至少有十几种，如：ｒｄ２９Ａ、Ｉｔｉ７８、ｃｏｒ７８、
ｃｏｒｌ５ａ、ｋｉｎ２，ｃｏｒ６．６、ｅｒｄｌ０、ｋｉｎｌ、ｒｄｌ７、ｅｏｒ４７、Ｆ１３２５Ａ３、
Ｆ１５２７７、Ｆ１５２９４、Ｆ１３２２７、Ｆ１１２５２２１２２和ｅｒｄｌ４［Ｉ］。
ＣＢＦｌ连上ＣａＭＶ３５Ｓ启动子转入拟南芥，检测未经低温处理的转基因植株发现：ＣＢＦｌ持续强表达诱导了ｃｏｒ６．６，ｃｏｒｌ５ａ，ｃｏｒ４７和ｃｏｒ４８基因的表达，提高了拟南芥植株的抗冻性［８】。ＣＢＦ２在拟南芥胁迫抗性中起重要作用，有试验表明在ＣＢＦ２被破坏的拟南芥植株中ＣＢＦＩ和ＣＢＩＲ３的表达增强，这表明：ＣＢＦ２是ＣＢＦＩ和ＣＢＦ３表达的一个负调节子［４ｊ。拟南芥中的ＣＢＦ３能刺激４０多种胁迫诱导基因的表达，如ｒｄ２９，ｃｏｒｌ５Ａ，ｃｏｒ４７等［１０］。
ＴｈｏｍａｓｈｏｗＭ
Ｆ等于２００１年将拟南芥中的ＣＢＦ３基因
分别连上ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、冷诱导启动子ｒｄ２９Ａ，之后转入烟草中，二者都显著提高了烟草植株的耐低温能力［引。
１．３
ＩＣＥ（ＩｎｄｕｃｅｒｏｆＣＢＦ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）转录激活因子
ＩＣＥ是在低温时诱导ＣＢＦ家族表达的转录激活因子，它在低温时能特定地结合到ＣＢＦ的启动子序列上，诱导ＣＢＦ的表达，而后ＣＢＦ结合到其下游目的基因启动子的ＤＲＥ序列上，诱导ＣＯＲ的表达，从而提高植株的抗冻性［８］。ＣｈｉｎｎｕＳａｍｙＶ等于２００３年已经从拟南芥中得到ＩＣＥＩ（Ｉｎｄｕｃｅｒ
ｏｆＣＢＦｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
１），并且连上
ＣａＭｖ３５Ｓ启动子转入拟南芥，获得了含ＩＣＥｌ基因的转
１２０
万方数据
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基因拟南芥植株，通过检测证实转基因拟南芥植株的抗冻性有很大的提高Ｄ０３。
２植物抗冻基因及转基因植物最新研究进展
近年来，随着人们对植物抗冻基因进行了深入的研究，揭示了植物抗冻性除受多基因协同调控外，某些单基因也起了重要作用。因此，这些单基因有可能用于植物抗冻基因工程。在不影响作物产量、品质的情况下，利用植物转抗冻蛋白基因手段培育抗冻品种已成为一条全新而有效的途径。抗冻蛋白（Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ，
ＡＦＰｓ）是２０世纪６０年代从极地海鱼的血清中发现的一种具有阻止体液内冰核的形成与生长、维持体液的非冰冻状态的高效抗冻活性物质。目前已发现的抗冻蛋白可分为４类：Ｉ型抗冻蛋白富含丙氨酸重复序列，具有ａ一螺旋结构的多肽，以美洲拟鲽的ＡＦＰ为代表；Ⅱ型抗冻蛋白是富含胱氨酸，并具有ｐ一折叠结构的多肽，以绒杜父鱼的ＡＦＰ为代表；Ⅲ型抗冻蛋白的氨基酸组成无明显偏向性，是无一定二级结构的多肽，以美洲大绵的ＡＦＰ为代表；Ⅳ型抗冻糖肽（Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ
ｇｌｙｃｏｐｅｐ－－－ｔｉｄｅ，
简称ＡＦＧＰ），主要代表为南极鳕鱼，可产生类似于糖三肽多聚体的ＡＦＧＰ。抗冻蛋白存在于不同的生物体中，包括鱼类、昆虫和植物，但对鱼类抗冻蛋白的研究较多…］。ＨｕａｎｇＴ等２００２年将树状抗冻基因ｄａｆｐ－１基因转入拟南芥中，而后和对照植株相比发现转基因植株的抗冻性提高了１．Ｏ～３．３＂Ｃ［１２｜。ＩｆｉＣＭ等２００６年从云杉蚜虫中分离得到抗冻蛋白ＣｆＡＦＰ一５０ｌ，并且分析出此蛋白的结构㈨ｊ。
２．１鱼类ＡＦＰｓ基因及其转基因植物
对鱼类ＡＦＰｓ研究的较多并且起步较早，早在２０世纪７０年代初期就已经从海洋鱼类的血清中发现了抗冻蛋白，并且已作了比较系统深入的研究。。利用鱼类抗冻蛋白基因对植物进行遗传转化的研究始于２０世纪８０年代末期，１９８７年Ｄａｖｉｅｓ等将抗冻基因ＡＦＰｓ整合到，ｆｉ质粒上，用叶圆片法转化郁金香、烟草和油菜等获得一定抗冻力。Ｃｕｒｌｅｒ等用冬比目鱼溶液处理植物组织的研究表明，用ＡＦＰ真空浸润马铃薯、欧洲油菜和拟南芥叶片可使叶片自发冰点显著降低，说明ＡＦＰ具有抗冻作用；用ＡＦＰ处理雀麦草及其悬浮培养细胞，可降低任何给定温度下冰冻的可冻水量，表明ＡＦＰ有低温保护作用；ＡＦＰ能降低冰晶形成的速度，在某些极地鱼中发现的类型Ｉ抗冻蛋白（ＡＦＰｓ）可防止组织细胞中冰晶的形成，并已通过转基因技术使ＡＦＰｓ在一些转基因植株中得到表达，如已经在转基因烟草中证明ＡＦＰｓ的积累具有低温特异性，它抑制冰晶的形成。鱼类抗冻蛋白基因转入烟草和番茄已获得较好表达，ＧｅｏｒｇｅｓＦ等将人工合成的黄盖鲽鱼抗冻蛋白基因导人玉米原生质体，在植物细胞中获得表达ｎ“。黄永芬等获得转美洲拟鲽抗冻
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基因ＡＦＰ的番茄，且低温下转基因植株长势优于对照，致死温度比对照降低２～４℃，一系列检测表明抗冻基因ＡＦＰ已整合到转化番茄基因组中并获得表达。Ｈｉｇｈｔ—
ｏｗｅｒ
Ｒ等利用农杆菌将比目鱼体内抗冻蛋白（ＡＦＰｓ）基因转入番茄，发现转基因番茄不但稳定转录ＡＦＰ的ｍＲＮＡ，还产生一种新的蛋白质，这种转基因番茄的组织提取液在冰冻条件下能有效阻止冰晶增长［１
５ｉ。
２．２
昆虫ＡＦＰｓ基因及其转基因植物
由于昆虫抗冻基因ＡＦＰｓ的热滞活性明显高于鱼
类和植物，因此，其抗冻基因Ａｎ’ｓ的导入可能更有效地提高转基因植物的抗冻性。冬季，某些昆虫血淋巴的热滞活性为３～６℃，最高达到８～９℃，明显高于血清抗冻蛋白的热滞活性（１～２℃）。Ｔｙｓｈｅｎｋｏ等于１９９７年从甲虫和云杉卷叶蛾中分离到的抗冻蛋白的活性是鱼类抗冻蛋白的１０～１００倍［１引。２００１年Ｈｏｌｍｂｅｒｇ等第一次将云杉蚜虫的抗冻基因ＡＦＰｓ与ＣａＭｖ３５Ｓ及胭脂碱合成酶基因组成重组基因后转人烟草，发现转基因烟草中质外体云杉蚜虫抗冻基因Ａｔ＇７的表达能抑制冰重结晶，并且提高了热滞值【ｌ
７｜。
２．３
植物ＡＦＰｓ基因及其转基因植物
与鱼类和昆虫抗冻蛋白相比，植物ＡＦＰｓ研究的较
晚。直到１９９８年ｌｏ月，Ｄａｗｎｏｒｒａｌｌ等在Ｃ％＇ｉｅｎｅｅ》上发表了胡萝卜ＡＦＰｓ及其基因的研究论文，这标志着第一
个植物趾甲基因的发现，并且将此』岍基因连接在表
达载体上转化烟草，获得了表达并且产生了√廿Ｐｓ，提高了转基因烟草植株的抗冻性［Ｊ引。１９９９年Ｍｉｃｈａｅｌ等从桃树（Ｐｒｕｎｕｓｐｅｒｓｉｃａ）的树皮中提取到一种脱水蛋白ＰＣＡ６０，这是第一次发现具有脱水素蛋白特性的抗冻蛋白，其富含赖氨酸、甘氨酸，分子量为５０ｋｕ，具有较强的修饰冰晶能力【ｌ…。
最近克隆到的植物抗冻蛋白基因还包括黑麦草
ｌ１１７
ｋＤ的ＡＦＴ的ｅＤＮＡ［２０］；冬黑麦［２１１中３
１１７ｋＤ的
ＡＦＰｓ的ＣＨＴ基因，２４１８ｋＤ的ＡＦＰｓ的ＣＨＴ４６基因。
其中来自冬黑麦中的这两个抗冻蛋白基因，均已被转化到大肠杆菌中，检测结果表明，表达蛋白具有抗冻活性。２００２年ＦａｎＹ等以胡萝卜幼苗为模板进行ＰＣＲ扩增，克隆到一个１
０９９
ｂｐ的抗冻蛋白基因，连上ＣａＭｖ３５Ｓ启动子，构建到ｐＣＡＭＢＩＡ２３００载体上后转入烟草，０℃条件下，转基因烟草所受的冻害明显低于对照烟草［２引。２．４脯氨酸基因及其转基因植物
冷驯化后脯氨酸含量增加，表明脯氨酸可能与植株抗冻性有关。脯氨酸是水合能力较强的氨基酸，其含量增加有助于细胞持水和生物大分子结构的稳定。Ｗａｎ－
ｎｅｒ
Ｌ
Ａ等报道，低温处理５ｄ的拟南芥植株中脯氨酸含
量比未低温处理的对照拟南芥植株高３～５倍［２“。低温处理条件下，ＣＢＦ３强表达的植株中脯氨酸的含量也
万方数据
・专题综述・
比对照植株高２－－３倍心引。ＰａｒｖａｎｏｖａＤ等于２００４年将脯氨酸基因转入拟南芥，转基因和对照植株经过２２℃处
理１２ｈ，转基因植株存活而对照植株则死亡【２引。Ｇｌｅｅ—
ｓｏｎ
Ｄ等于２００５年利用农杆菌将Ｖｉｇｎａａｅｏｎｉｔｉｆｏｌｉａ基因
转化到落叶松，结果转基因植株的脯氨酸含量比未转基因的对照植株高３０倍，转基因植株的抗冻性得到很大提高‘２引。
未经低温处理ＣＢＦ３强表达的拟南芥植株中脯氨酸的含量比对照植株高５倍，其含量相当于低温处理对照植株的脯氨酸含量。低温处理条件下，ＣＢＦ３强表达的植株中脯氨酸的含量也比对照植株高２～３倍。
Ｐａｒｖａｎｏｖａ
Ｄ等于２００４年将脯氨酸基因转入拟南芥，转
基因和对照植株经过一２＂Ｃ处理１２ｈ，转基因植株存活
而对照植株死亡。ＧｌｅｅｓｏｎＤ等于２００５年利用农杆菌将
Ｖｉｇｎａ
ａｃｏｎｉｔｉｆｏｌｉａ基因转化到落叶松，结果转基因植株的
脯氨酸含量比未转基因的对照植株高３０倍，转基因植株的抗冻性得到很大提高［２
７｜。
２．５
脂肪酸去饱和酶基因及其转基因植物
很多研究表明，低温冻害导致生物膜的透性改变。
低温引起膜脂的物相发生变化，使膜脂由正常的液晶态变为凝胶态，如果在低温下能保持膜脂的液晶状态，则植物的抗冻性提高；而增加膜脂中不饱和脂肪酸的比例即可维持膜的液晶状态，防止膜类固化，即能提高抗冻性。ＭｕｒａｔａＮＬ２８ｊ将南瓜藤和拟南芥中得到的甘油一３２一磷酸酰基转移酶基因导人烟草中，明显改变磷酸酰甘油的脂肪酸组成，并提高其抗冻力。ＰｏｌｓｈｏｃｋＪ等将酵母的△一９脂肪酸去饱和酶基因，ＫｏｄａｍａＨ等将拟南芥的编码ｃｔ广３脂肪酸去饱和酶基因ｆａｄ，ＭａＪ等将菠菜的硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因ＳＡＤ，分别导人烟草中均增强了转基因烟草的抗冻性［２¨引。ＫｏｄａｍａＨ等将拟南芥叶绿体ｏｒ３脂肪酸脱氢酶基因ｆａｄ７导人烟草中增强转基因烟草抗冷性¨¨。刘丹等利用脂肪酸去饱和的关键酶（ＳＡＤ）基因对烟草进行遗传转化，结果表明转基因烟草抗寒性明显增强。ＨａｙａｓｈｉＨ等将编码来自Ａｒ－
ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ或Ａ．ｐａｓｃｅｎｓ的胆碱氧化酶的基
因ｃｏｄＡ导人拟南芥获得抗冻转基因植株。
２．６
ＳＯＤ基因及其转基因植物
低温条件下，细胞内活性氧的产生和消耗平衡遭到
破坏，使膜系统稳定性受到影响，活性氧积累，从而使膜脂发生过氧化和脱脂作用。近而破坏膜结构。研究表明，ＳＯＤ可清除活性氧，维护膜系统稳定性。将含有ｓ（）Ｄ的ｅＤＮＡ转入烟草、番茄等植物中，强表达后都提高了植物的耐氧化能力，这对植物抗冻具有重要意义。
Ｍｃｋｅｒｓｉｅ将从烟草中克隆得到的ＭｎＳＯＤ的ｅＤＮＡ与
３５Ｓ启动子连接后转化苜蓿，结果转基因植株的抗冻性有所提高ｎ副。Ｌｅｅ
Ｈ
Ｓ等于１９９９年从木薯的ｅＤＮＡ中
１２１
・专题综述・
克隆到编码１５２个多肽的ｍＳＯＤＩ，并将ｍＳＯＤＩ基因转入木薯。转基因植株和对照植株相比抗冻性有一定提高¨引。ＢａｇｎｏｌｉＦ等于２００１年从桃树ｃＤＮＡ中克隆到
ＭｎＳＯＤ３“。３
植物抗冻基因研究中存在的问题及发展前景
提高植物的抗冻性，培育抗冻作物品种对于农业具
有十分重要的意义。然而，作物的抗冻性状一般受多基因控制，且与品质低劣性状（如矮化、倒伏、结实率低等）紧密连锁。解决这个问题有两个办法：一是转化那些翻译后修饰的转录因子基因，如非低温胁迫时３５Ｓ：
ＤＲＥＢ２Ａ（ＤＲＥ－ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ）植株只表现轻微的生长
阻碍，在低温时这种转录因子才诱导ＣＯＲ基因表达；二是使用冷诱导型的启动子，如使用冷诱导启动子ｒｄ２９Ａ的ＣＢＲ转基因时．拟南芥的不利性状大大减小。转抗冻基因技术如何达到高效、快速、简便，适用性广，仍然是植物抗冻基因工程的一个重要限制因子。
已研究的绝大多数植物材料中ＡＦＰ活性大大低于鱼类和昆虫，所研究的植物虽多达几十种，但真正被分离纯化出来的ＡＦＰ尚是很多。因此如何从植物中分离出更多的、活性更高的ＡＦＰ，并通过遗传转化将其导入抗冻性弱或不抗冻的植物中进而获得抗冻性强的转基因植株，将是今后植物抗冻性基因工程研究的主要内容
之一。
目前，抗冻蛋白在植物抗寒基因工程中的利用还非常有限，我们还需要分离和克隆更为优良的、能用于植物基因工程的抗冻蛋白基因，同时也需要对目前已获得的抗冻蛋白在结构、功能上进行深入分析。
尽管植物抗冻基因研究中还有许多问题等待解决，但是完整的植物基因工程的理论和技术体系已基本建立，植物基因工程技术已开始走向商业化的发展道路。尽管现在有关抗冻基因及转抗冻基因植物方面的研究不多，但在不远的将来转入抗冻基因的植物一定会得到飞速的发展。
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北方园艺２００９（１）：１２３～１２５・专题综述・
超滤膜技市在香菇萋糖提取巾的应用
李
琚１，钟耀广１，２，刘长江２
（１．上海水产大学食品学院。上海２０００９０；２．沈｜４｛农业大学食品学院．辽宁沈阳１１０１６１）
摘要：采用超滤膜技术提取纯化香菇多糖具有收率高、不易破坏多糖的生物活性、能耗低等特点，适于工业化生产。现就超滤膜分离技术的发展现状及其在香菇多糖提取中的应用进行
了综述。
关键词：香菇多糖；超滤；分离；纯化
中图分类号：Ｓ６４６．１＋２文献标识码：Ａ文章编号：１００ｌ—ｏ００９（２００９）０１一０１２３一０３
香菇是侧耳科的担子菌，世界名贵食药兼用菌之一，它含有多种有效药用组分，主要是香菇多糖（１ｅｎｔｉｎ—ａｎ，简称ＬＮＴ）。研究表明分子量在４０００００～８００
０００
在临床上具有很好的应用前景［２］。具有的生物活性已经引起了人们越来越多的关注。
香菇多糖的功能性与多糖的纯度有很大关系。近年来，有采用超滤法提取香菇多糖的研究，研究表明该方法可以降低成本，提高产率。现简要介绍超滤膜技术在香菇多糖提取、纯化中的应用及研究进展。
的ＬＮＴ具有显著的抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和抗感染活性Ⅲ，还有研究证明其对艾滋病有很好的疗效，
第一作者简介：李瑶（１９８４一）。女．硕士．研究方向为食品安全。
通讯作者：钟耀广。Ｅ－ｍａｒｌ：ｚｈｏｎｇｙａｏｇｕａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ。
１超滤膜分离技术的应用
ｌ－ｌ超滤膜技术的发展现状
膜分离是指以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力（如压差、浓度差、电位差等）时，原料组分可选择透过膜，从而达到分离提纯的过程。人们发现
基金项目：上海水产大学引进优秀人才科研基金资助项目；上海
水产大学研究生科研基金资助项目（Ａ－２５０ｌ＿０８－１９２）。收稿日期：２００８一０８—１０
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１２３
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万方数据
植物抗冻基因最新研究进展
作者：作者单位：
蔺忠龙， 李维薇， 白现广， 吕广磊， 程在全， LIN Zhong-long， LI Wei-wei， BAI Xian-guang ， LV Guang-lei， CHENG Zai-quan
蔺忠龙,白现广,LIN Zhong-long,BAI Xian-guang(云南大学生命科学学院,云南昆明,650091;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南昆明,650223)， 李维薇,LIWei-wei(云南大学生命科学学院,云南昆明,650091)， 吕广磊,LV Guang-lei(云南农业大学农业与生物技术学院,云南昆明,650201;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南昆明,650223)， 程在全,CHENG Zai-quan(云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南昆明,650223)北方园艺
NORTHERN HORTICULTURE2009，""(1)2次
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提高作物的抗冻性对于提高作物产量有着非常重要的意义.目前,对冷诱导基因、CBF、ICE、抗冻蛋白基因、脂肪酸去饱和酶基因、脯氨酸基因、SOD基因与抗冻的关系进行了广泛的研究,研究表明对这些抗冻相关基因进行转基因,可以提高植物的抗冻性.而一些抗冻基因应用到作物上,也可以提高作物的抗冻性.
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