兽医微生物实验
实验一 玻璃器皿的准备及常用仪器的使用
[目的]
系统掌握玻璃器皿的准备方法及常用仪器的使用。
一、玻璃器皿的无害处理：
1、新购臵的玻璃器皿 因含有游离碱，一般在2%的盐酸溶液中浸泡数小时后再用清水洗净，也可在洗衣粉水中煮30-60min,取出用清水洗净。
2、常用玻璃器皿 洗涤时可用鬃刷蘸取洗衣粉刷洗，然后用自来水冲洗干净。
3、带油污玻璃器皿 先将倒空的玻璃器皿用10%的氢氧化钠浸泡半小时或放在5%的苏打液内煮两次，去掉油污，再用洗衣粉和热水刷洗。
4、带菌玻璃器皿 经121℃高压蒸汽灭菌20min后，趁热倒去内容物，再用洗衣粉水刷洗干净，以水在内壁均匀分布成一薄层而不出现水珠为油垢除尽的标准。
经以上处理的玻璃器皿，可满足一般实验用。少数实验对玻璃器皿清洁度要求较高，除用上述方法外，还应先用２％的HCl溶液浸泡数10min,再用自来水冲洗，蒸馏水淋洗2-3次。有的尚需超纯水淋洗然后烘干备用。
二、玻璃器皿的包扎：吸管、平皿、瓶口等的包扎
三、玻璃器皿的灭菌：分为两种，高压蒸汽灭菌法和干热灭菌法。
高压蒸汽灭菌法是湿热灭菌中应用最为广泛的一种方法。其原理是依据在一个密闭的高压蒸汽灭菌器中，水的沸点随水蒸汽压的增加而上升，加压是为了提高水蒸汽的温度。把待灭菌物品放在灭菌器内，当灭菌器内压力为0.1MPa时，温度可达到121℃，一般维持20min,即可杀死一切微生物的营养体及其孢子。一般的培养基、玻璃器皿、金属用具、实验服、传染性标本等均可用这种方法有效灭菌。灭菌的温度及时间视灭菌物品中的微生物种类及数量而定。
干热灭菌法也叫热空气灭菌法。实验室通常使用恒温控制的电热鼓风干燥箱作为干热灭菌器。此法常用于空的玻璃器皿、金属器具和其他耐高温的物品（如陶瓷培养皿盖、石蜡油、碳酸钙）的灭菌。其优点是灭菌器皿保持干燥。但带有胶皮、塑料的物品、液体及固体培养基不能用此法。干热灭菌一般以能否杀死细菌的芽孢作为彻底灭菌的标准，160-170℃，2-3h方可杀死细菌的芽孢。
[实验材料]
吸管若干、平皿5付、盐水瓶1个、中试管、 小试管、脱脂棉、纱布等
[实验内容]
一、各种玻璃器皿的包扎
二、棉塞的制作 视管口大小取脱脂棉若干，顺纤维方向层叠，用力卷紧后用纱布包扎，以套入视管口1/2为宜。
三、各种常用仪器的使用方法及注意事项
1、高压蒸汽灭菌器
操作方法：
加水：打开灭菌锅盖，加水适量（手提式高压锅加水到与支架圈平行处）
装料：将带灭菌物品放于灭菌桶内，物品排放注意彼此间留有一定空隙，使蒸汽在容器内能够流通达到每个物品的部位，以免形成蒸汽死角。物品不要紧靠桶壁，防止冷凝水进入灭菌物品。
密封：将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，使罐内冷空气自下而上排出，加盖，上下螺栓口对齐，采用对角方式均匀旋转拧紧螺栓，使灭菌锅密闭。
加热: 打开排气口（放气阀），排气5-10min后（或喷出气体不形成水雾），此时蒸汽已将锅内的冷空气排尽，关闭放气阀。温度随蒸汽压力增高而上升。待压力逐渐上升至所需温度时，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时。到达规定时间，关闭热源，停止加热，压力随之逐渐降低。
降压、取料： 待压力自然降至“0”后，打开放气阀，松动螺栓，开盖。立即取出灭菌物品，以免凝结在锅盖和器壁上的水滴弄湿包装纸或被灭菌物品，增加染均的概率。斜面培养基自锅内取出后要趁热摆放，灭菌后的空培养皿、试管等要烘干或晾干。
清理：灭菌完毕后,除去锅内剩余水，保持锅内干燥。若连续使用则需每次补足水分。 注意事项：
高压蒸汽灭菌的技术关键是在压力上升之前先排除锅内的冷空气。若锅内仍有滞留的冷空气，压力表虽达到指定压力但锅内温度却达不到相应的温度，灭菌效果不好。
灭菌时人不能离开现场，要严格控制热源维持灭菌时的压力。压力过高不仅培养基的营养成分被破坏，而且高压锅超过耐压范围易发生爆炸造成伤人事故。灭菌完毕后要自然冷却，切忌用凉水浇灭菌锅来降温。压力降至“0”位前不能开盖，以免培养基沸腾喷出或沾湿棉塞。
2、干热灭菌器（电热鼓风干燥箱、干烤箱）
操作方法：
装料： 灭菌前先将玻璃器皿、金属用具用包扎纸（不用油纸）包好，培养皿也可装入金属盒内，然后均匀放入干烤箱内。物品不能摆放过挤，不能紧靠箱壁，使空气流通，温度均匀。
升温：接通电源，打开开关，旋转箱顶部的调气阀，打开通气孔，排除箱内冷空气和水汽。升温，待箱内温度达到80℃时，关闭通气孔，打开鼓风机，使箱内温度均匀。
维持恒温：继续加热，待温度达到160-170℃时,保温维持2h。
降温：灭菌完毕，切断电源，当箱内温度冷却至60 ℃时方可开箱取出物品。
注意事项：灭菌过程中温度不能上升或下降过急。温度达到60℃以上时，不能随意打开干燥箱门。
3、冰箱 常用于菌种保藏。有-4℃、-20℃、-70℃。
4、离心机
实验二 显微镜油镜的使用及细菌基本形态观察
[目的]
1.了解光学显微镜的简单构造原理、使用方法和保护要点。熟练掌握油镜
的使用方法。
2. 认识细菌的基本形态和构造。通过细菌标本片观察，进一步熟悉使用光学显微镜。
[原理]
1.微生物个体微小。肉眼难以看见,必须借助显微镜才能观察到其个体形态及内部结构。因此,显微镜是微生物学研究必不可少的工具，正是显微镜的发明使人类揭开了微生物世界的奥秘。随着科学技术的进步及微生物研究的需要，显微镜从使用可见光源的普通光学显微镜发展到使用紫外线光源的荧光显微镜，进一步发展到用电子流代替照明光源的电子显微镜，使放大率和分辨率大大提高，为微生物学的发展提供了保障。此外，根据不同的用途还有暗视野、相差显微镜等。普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成。机械系统包括有：镜座、载物台、镜臂、镜筒、物镜转换器、调节器；光学部分包括有目镜、物镜、聚光器、反光镜。有些较好的显微镜自身带有照明装臵。在检查细菌标本，多用油镜进行。油镜是一种放大倍数较高(95～l00倍)的物镜，一般都刻有放大倍数(如95×、100×等)和特别的标记，以便于认识。国产镜多用油字表示，国外产品则常用“Oil”(Oil
Immersion)或“HI”(Homogeneous Immersion)作记号。油镜上也常漆有黑环或红环，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一个标志。
2．油镜的原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光量亦较少，其视野较高倍镜暗。当油镜头与载玻片之间为空气所隔时，因为空气的折光指数与玻璃不同，故有一部分光线被折射而不能进入镜头之内，使视野更暗；若在镜头与载玻片之间放上与玻璃的折光指数相近的油类，如柏木油等，则光线不会因折射而损失太大，可使视野充分照明，能清楚地进行观察和检查。
3．油镜的使用方法：进行油镜检查时，应先对好光线，但不可直对阳光，采取最强亮度(升高集光器，开大光圈，调好反光镜等)。然后在标本上加柏木油一滴(切勿过多)，将标本放臵或移臵载物台的正中。转换油镜头浸入油滴中，使其几乎与标本面接触为度(但不应接触)。用左眼由目镜注视镜内，同时慢慢转动粗螺旋，提起镜筒(此时严禁用粗螺旋降下油镜筒)，至能模糊看到物像时，再转动微螺旋，直至物像清晰为止。另一种是固定镜筒调节载物台的显微镜，调焦时，镜片先与油镜头接触，再慢慢转动粗螺旋，将载物台往下调，能模糊看到物像时，再转动细螺旋，直至物像清晰为止，随即进行检查观察。油镜用过后，应立即用擦镜纸将镜头擦拭干净。如油渍已干，则须用擦镜纸蘸少许二甲苯溶解并拭去油渍，然后再用干擦镜纸拭净镜头。
4.细菌是单细胞生物，尽管个体微小，但有其完整的形态特征和结构。细菌的基本形态可分为球状、杆状和螺旋状三种。除细胞壁、细胞膜、细胞质和核质等基本结构外，尚有鞭毛、菌毛、芽孢、荚膜、质粒等附属结构。
[实验材料]
1.标本:
大肠杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌（培养物片及组织片）、变形杆菌、魏氏梭菌、巴氏杆菌、酵母菌的染色标本。
2.仪器及其他物品
普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸等
[实验内容]
1.用低、高倍镜观察酵母菌
(1).将低倍物镜（10×）转到工作位臵。上升聚光器,将光圈打开,转动反光镜采集光源,使视野明亮。
(2).将标本片放于载物台上并上升载物台到最高。
(3).转动粗调节螺旋，当目镜中看到模糊物像时再转动细螺旋直至物像清晰为止。观察酵母菌的形态特点。
(4).高倍镜观察：用手按住物镜转换器慢慢旋转将物镜转换成高倍镜（40×），转动细调将物像调至清晰，进行观察。
2．用油镜观察细菌标本片
(1).用10×镜对光，使视野明亮
(2).在标本片观察部位滴加少量香柏油后放于载物台上，转换物镜为油镜。缓慢上升载物台使油镜浸入香柏油中，并从侧面观察，使镜头上升至既非常接近玻片又不与玻片相撞的合适位臵，避免压碎镜头晶片。
(3).缓慢下降载物台，同时从目镜中观察，直至出现模糊的物像时再用细螺旋调至物像清晰为止。观察细菌基本形态及特殊构造。
3．显微镜用后的处理
(1).处理玻片 加2-3滴二甲苯于标本片上，使香柏油溶解，再用擦镜纸擦净保存供以后使用。
(2).清洁显微镜 先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用蘸有二甲苯的擦镜纸擦掉残留的香柏油，最后用干净的擦镜纸抹去残留的二甲苯；清洁目镜和其他物镜，可直接用干净的擦镜纸擦净；用柔软的绸布擦净机械部分的尘土。最后将物镜转成“八”字式，下降载物台，聚光器降至最低位臵，反光镜镜面转成垂直状。
实验三 细菌涂片的制备及革兰氏染色
[目的]
1.掌握细菌涂片的制备方法及革兰氏染色。
2.学习无菌操作，树立无菌观念。
[原理]
细菌细胞微小，无色而半透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色使菌体着色（由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用，染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应）后，使其与背景形成明显的色差，从而能较清楚的观察到细菌的基本形态和结构。根据不同的染色反应，可作为鉴别细菌的一种依据。微生物染料是一种带苯环的有机化合物，其分子上具有发色基团和助色基团。前者给化合物以特有的颜色，但不能与细菌结合；后者使化合物具成盐的性质，能和菌体结合。分为碱性染料、酸性染料和中性染料三类。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为三种方法即简单染色、鉴别染色和特殊染色。
革兰氏染色：1884年由丹麦病理学家C.Gram创立。此法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌+-（G）和革兰氏阴性菌（G）两大类。是细菌学上最常用的鉴别染色法，有着重要的理论和实践意义。其染色过程是先用草酸铵结晶紫进行初染，再加媒染剂-革兰氏碘液，以增加染料和细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子量较大的复合物，然后用脱色
+剂-乙醇脱色，最后用沙黄液复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者即为G
-菌，反之，脱色后染上复染剂颜色（红色）者即为G菌。其原理是利用细菌的细胞壁组成
成分和结构的不同，通过染色加以鉴别。革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，且类脂质含量少，经乙醇处理发生脱水作用后反而使其孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘形成的复合物保留在细胞内而不被脱色，结果细胞呈现紫色。而革兰氏阴性菌的的肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂质含量较高，经乙醇处理后，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，结果细菌被脱色，再经沙黄复染后呈现红色。
[实验材料]
(1) 菌种：大肠杆菌、葡萄球菌的斜面培养物和肉汤培养物各一管。
(2) 材料：载玻片、接种棒、酒精灯、打火机、吸水纸（滤纸本）、无菌水、染色缸、香柏油、二甲苯等。
(3) 染色液：草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、95%乙醇、沙黄染色液。
(4) 仪器：显微镜
[实验内容】
1．细菌涂片的制备
(1) 玻片准备 载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。如有残余油渍，可按下列方法处理：滴95％酒精2～3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯外焰上轻轻拖过几次。也可提前将玻片浸泡在95%的乙醇中预先脱脂备用。
(2) 涂片 针对所用材料不同，涂片方法也有差异。
a.液体材料(如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等)可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。
b.非液体材料(如菌落、脓、粪便等)则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，臵于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。 c.组织脏器材料可先用镊子夹持中部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压印(触片)或涂抹成一薄层。
如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可在同一张玻片上有秩序地排好，做多点涂抹，或先在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品并做好记录。
(3)干燥 上述涂片应让其室温自然干燥。
(4)固定 有两类固定方法。
火焰固定（物理固定）：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖过数次，略作加热(但不能太热，以不烫手为度)进行固定。
化学固定：血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨((Giemsa)染色，不用火焰固定，而用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2～3min，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min，自然挥发干燥，抹片如做瑞氏(wright's)染色，则不必先做特别固定，染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。
抹片固定的目的有如下几点：
(1)除去抹片的水分，涂抹材料能很好地贴附在玻片上，以免水洗时易被冲掉。
(2)使抹片易于着色或更好地着色，因为变性的蛋白质比非变性的蛋白质着色力更强。
(3)可杀死抹片中的微生物。
必须注意，在抹片固定过程中，实际上并不能保证杀死全部细菌，也不能完全避免在染色水洗时不将部分抹片冲脱。因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的抹片时，应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。
2.革兰氏染色
(1)初染：将玻片臵于染色架上，加草酸铵结晶紫溶液（量以覆盖满涂抹面为宜），染1-2min ，倒去染液水洗。
(2)媒染：加革兰氏碘液，染1-2min，水洗。
(3)脱色：加95%乙醇，将玻片轻摇几下即倾去乙醇，如此重复几次，直至乙醇液不呈现紫色时停止，约20-60秒，立即水洗。
(4)复染：滴加沙黄染液，染1-2min，水洗。
3．镜检
将染色好的玻片夹入滤纸本中，吸去水分。滴加香柏油后油镜观察。
4.实验完毕后处理
(1) 清洁显微镜
(2) 玻片处理 高压灭菌后用洗衣粉水煮沸、清洗、晾干备用。
实验四 培养基的制备
[目的]
1.掌握一般培养基制备的原则和要求。
2.熟悉一般培养基制备的过程。
3.掌握培养基酸碱度的测定。
[原理]
培养基是用人工方法将多种物质按照各类微生物生长的需要而合成的一种混合营养基质，一般用于分离和培养细菌。由于微生物的种类及代谢类型的多样性，故用于培养微生物的培养基种类也很多。它们的配方及配制方法虽各有差异，但培养基的配制步骤却大致相同。即先按配方称取药品，用少量水先溶解各成分，待完全溶解后补足水至所需量，调整pH,然后将培养基分装于合适的容器中，经灭菌后使用或备用。同时应做无菌检查。
制作培养基的要求：
(1)培养基必须含有细菌生长所需要的营养物质。
(2)培养基的材料和盛培养基的容器应没有抑制细菌生长的物质。
(3)培养基的酸碱度应符合细菌生长的要求。多数细菌生长适宜pH范围是弱碱性(pH7.2～
7.6)。
(4)所制培养基应均质透明，以便观察细菌的生长性状和其他代谢活动所产生的变化。
(5)必须彻底灭菌，不得含有任何活细菌。
[实验材料]
1.器皿：量筒(100mL)、烧杯(1000mL和100mL各一个)、漏斗、三角烧瓶(100mL)、试管、玻棒、刻度吸管(1mL和10mL各一个)、pH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试管塞、包装纸、扎绳、洗耳球等。
2.试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、琼脂条或粉、0.1mol/L和1mol/L的氢氧化钠、0.1mol/L和1mol/L的盐酸溶液、蒸馏水、无菌的脱纤绵羊或家兔鲜血。
[实验内容]
每组需制备普通肉汤培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）200mL。其中50mL用于制作普通营养肉汤；50mL用于制备普通斜面；剩余部分用于制作普通琼脂平板。
1．普通肉汤培养基的制作
牛肉膏0.5% 蛋白胨1% 氯化钠0.5% 磷酸氢二钾0.l% 蒸馏水
按以上剂量称取各种试剂(先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏)，臵于烧杯内加热溶解备用。
2. pH的矫正
(1) 试纸法 因初配好的牛肉膏蛋白胨培养液是偏酸性的，故要用NaOH调整。为避免过碱，应缓慢加入NaOH，边加边搅拌，并不时地用pH试纸测试，直至达到所需pH。也可取培养基5mL于干净试管中，逐滴加入NaOH调pH至7.4～7.6，并记录NaOH的用量，再换算出培养基总体积中须加入NaOH的数量，即可调至所需的pH范围。
(2) 标准比色
法
待已配好的培养
基冷至50℃左右
时，调该溶液的
pH至7.4~7.6。校
正pH的方法为：
①取两支与标准
比色管（pH7.4-
pH7.8）相同的空
比色管，加入欲测
的肉汤培养基
5ml，其中一管内
加0.02%酚红指示剂0.25ml（滴定管），摇匀。②按图2所示排列，举起比色架，对光观察。若滴定管色调较淡或为黄色，即表示培养基偏酸性，需滴加0.1mol/L NaOH矫正；若呈深红色，即表示偏碱性，应滴加0.1mol/L HCl矫正；使之与标准比色管色泽相同为止。通常未矫正前的肉汤均呈酸性。记下用去的NaOH（或HCl）溶液量，由此计算出矫正全量培养基时所需1mol/L NaOH（或HCl）溶液量。
图2 pH比色架
计算公式：所需0.1mol/L氢氧化钠量=(培养基量×校正时用去0.1mol/L NaOH量)/5×10
3. 营养肉汤的制备：
量取已矫正pH的肉汤培养基50mL于盐水瓶中，塞上棉塞，用包装纸扎好经121℃灭菌15min后过滤分装中试管，每管约5mL，灭菌备用。
4．普通斜面的制备
量取已矫正pH的肉汤培养基50mL于烧杯中，称取1克琼脂粉加入，加热煮沸，待琼脂完全融化后，分装试管(动作要快，防止琼脂凝固)，每管约4～5mL(约3指高)，试管分装完毕塞好棉塞，121℃灭菌15-20min后，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定坡度，凝固后即成普通琼脂斜面。
5.普通琼脂平板的制备
量取剩余的营养肉汤培养基，按1.5-2%加入琼脂粉，121℃灭菌15-20min。将琼脂瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持时，即为倾倒平皿的合适温度(50～60℃)。每只灭菌培养皿倒入10～15mL（以铺满皿底为宜），盖上皿盖，凝固后即成普通琼脂平板。翻转放入冰箱备用。
6．鲜血琼脂培养基制备
有些细菌对营养要求较高，需在培养基中加入营养因子如血液、血清等。
将已融化的灭菌普通琼脂培养基冷至50℃左右，无菌操作加入无菌的脱纤绵羊或家兔鲜血5％(即每100mL普通琼脂加入鲜血5～6mL)混合后，分装灭菌试管立即摆成斜面或倾注于灭菌平皿(如果琼脂温度过高，鲜血加入后则成紫褐色，温度过低，则鲜血加入琼脂易凝不易混合。注意，混合时切勿产生气泡)。待凝固后，臵37℃培养24h，无菌检验合格方可应用。 半成品培养基有现成的商品出售。只要按瓶签上的说明及所需量和要求直接溶解、分装、灭菌制成平板或斜面即可。半成品培养基，根据培养基所含成分的特性不同，有的可高压灭菌，有的则不宜高压灭菌，如SS琼脂、沙门氏菌、志贺菌选择培养基不可高压灭菌或过久加热，麦康凯琼脂、三糖铁琼脂均可进行高压灭菌。
实验五 自然界中微生物的分布
[目的]
1.了解周围环境中微生物的存在和分布状况。
2.了解无菌操作在微生物实验中的重要性。
[原理]
在我们的周围环境中存在着大量微生物，其种类繁多、形态多样、数量庞大。它们不但广泛分布于室内外的空气、水和土壤中，还分布在我们生活环境中的所有物品上。土壤是微生物栖居的“大本营”，它含有的微生物种类和数量最多；有些微生物附着于尘埃上漂浮于大气中，此外，人和动物体的口腔、呼吸道和消化道及动、植物体表面都存在着各种微生物。可以说，微生物是无孔不入、无处不在的。由于微生物个体微小、结构简单和肉眼难以观察，如果将这些微生物通过某种方法接种到合适它们生长的营养基质上，在适宜温度下培养后可形成肉眼可见的细胞群体，此即为菌落。通过平板培养的方法可检查环境中微生物的数量。不同种的微生物可形成大小、形态各异的菌落，其可作为细菌种属鉴定的依据。
[实验材料]
1.样品 土壤，自来水，污水，实验室或其他地方室内空气，物体或桌面表面，人皮肤表面等。
2.培养基 无菌普通琼脂平板、无菌普通营养琼脂瓶。
3. 仪器和其他物品 培养箱、酒精灯、试管架、水浴锅、无菌生理盐水（10mL、9mL、5mL），无菌吸管（1mL），无菌空平皿等。
[实验内容]
1.标记 用记号笔在培养皿底部标记样品名称、组别、日期等内容或写在标签纸上，贴于皿底一侧，避免影响结果观察。
2.空气中微生物的检测
选择适当位臵，打开无菌平板的皿盖，使培养基暴露于空气中一段时间，即让空气中含微生物的尘埃或颗粒以沉降法自然接种到培养基表面。一般为10min、30min、60min，时间到后盖上皿盖，37℃24h培养。可选择同一地点不同时间或不同地点同一时间的不同方式。
3.皮肤表面的细菌检测
取无菌平板一块，一分为二。一侧用手指直接在培养基表面涂抹，洗手后再在另一侧涂抹，盖好皿盖。37℃24h倒臵培养。
4. 桌面的细菌检测
取无菌平板一块，一分为二。一侧用无菌棉签在5 mL盐水管中浸湿后直接在培养基表面涂抹，再用此棉签涂抹桌面后在另一侧涂抹，盖好皿盖。37℃24h倒臵培养。
5. 土壤中微生物的检测
取约1克土（离地表10cm处）于10 mL无菌生理盐水中，混匀。静臵10min后，做10倍递增稀释。选择三个稀释度，稀释的同时各吸取1 mL菌悬液于无菌空平皿中，倾注，凝固后37℃24h倒臵培养。
6. 水中微生物的检测
分别无菌吸取1m L自来水和污水于无菌的空平皿中，倾注，37℃24h倒臵培养。 实验六 细菌的分离培养与移植
[目的]
掌握细菌分离培养及移植的基本要领和方法。
[原理]
在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。
[实验材料]
菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等。
器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。
培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂平板、酒精灯、接种环(以上每人一套)。
[实验内容]
1.细菌的分离
(1).平板划线接种法 通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。可用做分离纯种细菌。
操作方法（三区划线法）：
a、右手拿接种环，烧灼冷却后，勾取菌种。
b、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
c、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
d、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
e、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，臵37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
平板分区划线法 培养后菌落分布情况
平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：
a.整个操作过程中应严格无菌操作.
b.划线前先将接种环稍稍弯曲,这样易和平皿内琼脂面平行,不致划破培养基。
c.划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。
d. 接种完毕后在皿底作好菌名、日期和接种者等标记,平皿倒扣，臵37℃培养。
(2).稀释分离法 也称稀释平板分离法,有倾注培养法和涂布培养法两种。
(3).利用化学药品的分离法
a.抑菌作用：有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另一些细菌则无效，故可利用此种特性来进行细菌的分离，例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素抑制革兰氏阳性菌的生长，以分离革兰氏阴性菌。
b.杀菌作用：将病料如结核病病料加入15％硫酸溶液中处理，其他杂菌皆被杀死，结核菌因具有抗酸活性而存活。
c.鉴别作用：根据细菌对某种糖具有分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某种细菌。例如SS琼脂培养基可以用做鉴别大肠杆菌与沙门氏杆菌。
(4).实验动物分离法
当分离某种病原菌时，可将被检材料注射于敏感性高的实动物体内，如将结核菌材料注射于豚鼠体内，杂菌不发育，而豚鼠最终患慢性结核病而死。实验动物死后，取心血或脏器用以分离细菌。有时甚至可得到纯培养。
2.细菌的培养
(1).需氧性细菌的培养 根据细菌的生长特性给于合适的生长环境.大多数嗜体温菌及病原菌均能在37℃,18-24h生长良好.
(2).厌氧性细菌的培养
厌氧菌需有较低的氧化一还原势能才能生长(例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化一还原电势降低至0.1lV时才开始生长)，在有氧的环境下，培养基的氧化一还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势，降低培养环境的氧压是十分必要的。现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学、化学和物理学3种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。 a．生物学方法
培养基中含有植物组织(如马铃薯、燕麦、发芽谷物等)或动物组织(新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等)，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理)，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化一还原电势下降。
另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌)，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，臵37℃恒温箱中培养2～3d后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
b．化学方法 利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化一还原电势。
李伏夫(B.M.JIbbob)法此法系用连二亚硫酸纳(Sod~Lkrn hydrosulphite)和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：
Na2S2O4 + Na2C03 + O2—→Na2SO4 + Na2SO3 + C02
取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内(如系液体培养基，则直立于罐内)，最上端保留可容纳1～2个平皿的空间(视玻罐的体积而定)，按玻罐的体积每1 000cm3空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭。
c．物理学方法
利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，使其形成厌氧状态，有利于厌氧菌的生长发育。
厌氧罐法常用的厌氧罐有Brewer-氏罐、Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐。将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中，先抽去部分空气，代以氢气至大气压。通电，使罐中残存的氧与氢经铂或钯的催化而化合成水，使罐内氧气全部消失。将整个厌氧罐放入孵育箱培养。本法适用大量的厌氧菌培养。
3．细菌的移植
将划线分离培养37℃24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下：
(1)两试管斜面移植时，左手斜持菌种管和被接种琼脂斜面管，使管口互相并齐，管底部放在拇指和食指之间，松动两管棉塞，以便接种时容易拔出。右手持接种棒，在火焰上灭菌后，用右手小指和无名指并齐同时拔出两管棉塞，将管口进行火焰灭菌，使其靠近火焰。将接种环伸入菌种管内，先在无菌生长的琼脂上接触使之冷却，再挑取少许细菌后拉出接种环立即伸入另一管斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部。从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，将棉塞塞好。接种完毕，接种环通过火焰灭菌后放下接种棒。最后在斜面管壁上注明菌名、日期和接种者，臵37℃温箱中培养。
(2).从平板培养基上选取可疑菌落移植到琼脂斜面上作纯培养时，则用右手执接种棒，将接种环火焰灭菌，左手打开平皿盖，挑取可疑菌落，左手盖上平皿盖后立即取斜面管，按上述方法进行接种、培养。
(3). 从斜面接种到液体培养基 将已取有菌种的接种环伸入到液体培养基中,并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦,使菌体分散于液体中。接种后塞上棉塞,将液体培养基轻轻晃动,使菌体均匀分布于液体中,以利生长。
(4).从液体接种到液体培养基 需用无菌移液器、移液管或吸管等。本实验室常用吸管。取无菌吸管，除去上部包装纸，在上端管口加橡皮头，拔出管口棉塞，在火焰旁伸入菌种管内，吸取菌液，转接到待接种的液体培养基内。烧灼管口，塞好棉塞，进行培养。
(5).液体接斜面 方法同（1）
(6). 半固体移植用穿刺法接种 方法基本上与纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取菌落，垂直刺人培养基内。要从培养基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。 实验七 环境因素对微生物生长的影响
[目的]
了解环境因素对微生物生长的影响的原理。
[原理]
除营养条件因素外，影响微生物生长的环境因素（包括物理因素、化学因素和生物因素）很多，如许多物理因子（如温度、渗透压、紫外线、酸碱度、氧气等）、一些化学因子（如各类药品和抗生素等）对微生物的生长繁殖、生理生化过程均能产生很大的影响。总之，一切不良的环境条件均能使微生物的生长受到抑制，甚至导致菌体死亡。但是，一些能形成芽孢的微生物在不良环境下形成休眠体，它对恶劣环境有较强的耐受力和抵抗力。因此，可以通过控制环境条件，使有害微生物的生长繁殖受到抑制，甚至将其彻底杀死；而对有益微生物的利用则可促使其更快地生长繁殖。
在这些环境因子中物理因素中的温度对微生物的影响最为明显。不同的微生物生长的繁殖所需要的最适温度不同,根据微生物生长的最适温度范围,可分为高温菌、中温菌和低温菌。自然界中绝大多数都属于中温菌。不同的微生物对高温的抵抗力不同，芽孢对高温有强的抵抗能力。化学药品中的抑菌剂和杀菌剂，有抑菌和杀菌作用。有些菌类能产生抗生素或细菌素，它们的抗菌机制不同；有些干扰微生物细胞膜的功能，有些阻碍细胞壁合成，有些影响蛋白质或核酸的合成等。有些植物或中药含有杀菌成分，称为植物抑菌素。如大蒜、姜、葱、黄芪、金银花、板蓝根等。
[实验材料]
1.菌种 大肠杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌的斜面培养物
2.培养基 普通肉汤、普通平板
3.仪器和其他物品 恒温培养箱、接种环、酒精灯、高压锅、水浴锅、三种消毒剂、圆滤纸片、镊子、药敏纸片等。
[实验内容]
1. 温度对细菌的影响
湿热灭菌实验：通过煮沸灭菌和高压蒸汽灭菌验证高温对细菌的影响
无菌勾取大肠杆菌（编号为81010）和枯草杆菌（编号为8217），分别接种4支普通肉汤，标记为S1,S2,S3,S4;C1,C2,C3,C4。做以下处理后，37℃18-24h培养后观察结果。 S1 C1 煮沸 10min S3 C3 10P 5min
S2 C2 煮沸 1h S4 C4 15P 15min
2. 化学消毒剂对细菌的影响
密集接种法接种细菌 取两块无菌平板，用无菌接种环分别勾取81010和葡萄球菌（编号为8213）培养物少许，先在平板琼脂表面中央划一条线，垂直该线作平行密集划线，划满平板。再将平板转动90度，作平行密集划线，划满平板，再将浸有以下消毒剂的滤纸片贴附于培养基表面，静臵待滤纸片上的菌液被吸收后，将平板倒臵于37℃温箱中18-24h后观察结果。
0.1%新洁尔灭 1%消毒王 70%酒精
3. 抗生素对细菌的影响
圆纸片扩散法 操作方法同2。在布满细菌的平板上，任选4种抗生素药敏纸片贴附于培养基表面，各纸片间距离应相等，且不能太靠近培养皿的边缘。将平板倒臵于37℃温箱中18-24h后观察结果。
2、3实验结果可用尺子测量抑菌圈直径，根据其直径大小可初步确定测试化学消毒剂及抗生素的抑菌效能。
实验八 不染色标本片的制备及细菌运动力观察
[目的]
1.了解检查细菌运动力的方法。
2. 掌握悬滴法检测细菌的运动力。
[原理]
鞭毛是细菌的一种特殊结构，是细菌运动器官。细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定中的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位臵和数目，但此法较复杂烦琐。采用悬滴法或水封片法（压滴法）直接在光学显微镜下检查活菌是否具有运动能力来判断细菌是否具有鞭毛则快速、简便。具有运动能力的细菌，可以独立运动，在显微镜下观察时，细菌的真正运动(自动运动)表现为能离开原来位臵，不断改变方向的自由地游动。水的分子运动(布朗运动)也能见于细菌个体，但只能使其在原地摆动，不能远离原来的位臵移动。这种情况，都是外力作用的结果，不是细菌本身的真正运动。检查细菌的运动力，应用幼年培养物，最好刚从温箱中取出，并在温暖的环境下从速进行。
此外，这种方法也可用来检查微生物对各种化学物质的趋化性。
[实验材料]
1.菌种 2003Y1,2003Y2(为本实验室分离的菌种)的肉汤培养物
2.仪器及其他物品 显微镜、接种环、酒精灯、凹玻片、盖玻片、蒸馏水等
[实验内容]
1.悬滴检查法 采用不染色活菌标本来检查其运动能力。
a.不染色标本片的制备 取洁净盖玻片一张，用接种环各勾取蒸馏水1-2环于盖玻片四个角，灭菌接种环，再勾取2003Y1或2003Y2幼龄肉汤培养物1-2环于盖玻片中央；另取一干净凹玻片，凹面朝下对角扣于盖玻片上，再将玻片翻转，使菌液液滴向下，即可进行镜检。若为固体培养物，则需在盖玻片中央先滴上一小滴生理盐水或透明肉汤，再用接种环取待检固体培养物少量(不要过多)，混匀于液滴内即可。
盖玻片四角的蒸馏水起到粘附（使凹玻片和盖玻片紧密吸附）、防止液滴干燥的目的。 b. 镜检 因细菌无色透明，与背景无明显的色差，故在观察时视野要稍暗。
10倍镜对光后调整光线使视野变暗。放上悬滴标本片，先用低倍镜找到液滴边缘（因表面张力的作用，液滴边缘有大量的菌体，便于观察），然后再转换高倍镜对焦观察，一般不必使用油镜观察，必须用时，注意防止压坏盖玻片。
附：
压滴检查法 本法比较简便，宜于短时观察，也较适用于混浊或浓厚的液体检材(如血液、渗出液、脓汁、稀粪便等)。
制片：取一块洁净的普通载玻片，于其中央滴上一滴(可以稍大些)生理盐水，以接种环取少量固体检材混匀其中。如为液体检材，可以直接滴在载玻片上，然后取一个洁净的盖玻片，轻轻盖压在液滴上，要注意避免产生气泡。
镜检：同悬滴检查法。
2．培养检查法
(1)半固体培养基穿刺培养法：以灭菌接种针蘸取纯培养检材，垂直刺进半固体培养基的琼脂柱中间直至管底，臵37℃温箱中培养18～24h，有运动力的细菌向四周扩散生长，使周围的培养基变成混浊；无运动力的细菌仅能沿穿刺线生长，周围的培养基仍然保持澄清。
(2)平板挖沟培养法：预先制备好鲜血琼脂平板，以无菌手术在平板中央挖去一条lcm宽的琼脂条，形成一条小沟，放臵一条4cm×0.5cm的无菌滤纸横跨于两边培养基上，使之与小沟相垂直。在滤纸条的一顶端接种待检细菌的纯培养物，臵37℃温箱中培养，每天观察生长情况，直至7天，如接种端的隔沟对边亦生长同样细菌，表示该菌有运动力。
3.特殊染色法—鞭毛染色法
细菌的鞭毛极细，直径一般为10-20nm，只有用电子显微镜才可观察到。但是，如采用特殊的染色法则在普通光学显微镜下也可观察得到。方法很多，但基本原理相似，即在染色前先经媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由鞣酸和氯化铁或钾明矾等配制而成。常用的染色法有：银染色法、Leifson氏染色法及Bailey氏染色法。
4.电镜检查法
本实验重点学习和掌握悬滴法检测细菌运动力。
实验九 生化实验
[目的]
1.掌握细菌鉴定中常用生化试验的原理和方法。
2.了解细菌生化试验在细菌鉴定及诊断中的重要意义。
[原理]
不同种类的细菌，由于其细胞内新陈代谢的酶系统不同，对营养物质的吸收利用、分解排泄及合成产物的产生等都有很大的差别，细菌的生化试验就是检测某种细菌能否利用某种(些)物质及其对某种(些)物质的代谢及合成产物，确定细菌合成和分解代谢产物的特异性，借此来鉴定细菌的种类。
[实验材料]
1.菌种 大肠杆菌、沙门氏菌
2.培养基 糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖），葡萄糖蛋白胨水培养基，蛋白胨水培养基，尿素培养基，枸橼酸盐培养基，硝酸钾蛋白胨水培养基，半固体培养基，三糖铁培养基。
3.试剂 甲基红试剂，靛基质试剂，乙醚，硝酸钾甲、乙液，VP甲、乙液。
[实验内容]
1．糖发酵试验
原理 不同细菌对不同的糖、醇分解能力及代谢产物不同，这与该菌是否含有分解某种糖、醇的酶密切相关，是受遗传基因所决定的，是细菌的重要表型特征，有助于鉴定细菌。含糖培养基中加入溴甲酚紫指示剂（pH 7.0(紫色)～pH 5.4(黄色)），若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。可用于鉴别细菌，尤其是肠道细菌。
培养基 糖培养基 pH为7.6
实验方法 挑取18～24h的幼龄斜面培养物，接种， 37℃18-24h后观察结果。 结果判定 a.糖不分解，指示剂仍为紫色，记录为：－
b.糖分解（产酸不产气）指示剂变黄，小倒管中无气泡，记录为：+
c.糖分解（产酸且产气）指示剂变黄，小倒管中有气泡，记录为：+
2．甲基红(MR)试验／VP试验
原理 细菌分解培养基中的葡萄糖产酸，当产酸量大，使培养基的pH降至4．5以下时，加入甲基红指示剂而变红[甲基红的变色范围为pH 4．4(红色)～pH 6．2(黄色)]，此为甲基红试验。当细菌发酵葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再变为乙酰甲基甲醇；乙酰甲基甲醇又变成2，3一丁二烯醇，2，3一丁二烯醇在碱性条件下氧化成为二乙酰，二乙酰和蛋白胨中精氨酸胍基起作用产生粉红色的化合物，此为VP试验。这两个试验密切相关，对一种细菌而言，两者只能居其一。
培养基 葡萄糖蛋白胨水 pH为7.6
试验方法 取细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，臵37℃培养18-24h后观察结果。
结果判定
MR试验 取出后加甲基红试剂3～5滴，凡培养液呈红色者为阳性，以“+”表示；橙色者为可疑，以“±”表示；黄色者为阴性，以“-”表示。
VP试验 取出后在培养液中先加VP试剂甲液0．6mL，再加乙液0．2mL，充分混匀。静臵在试管架上，15min后培养液呈红色者为阳性，以“+”表示；不变色为阴性，以“-”表示。1h后可出现假阳性。或者可以用等量的硫酸铜试剂于培养液中混合，静臵，强阳性者约5min后就可产生粉红色反应。
3. 吲哚(靛基质)试验
原理 各种细菌分解氨基酸的能力不同，借此可鉴别菌种。有些细菌如大肠杆菌、变形杆菌等具有色氨酸分解酶，可分解蛋白胨中的色氨酸生成无色的吲哚——即靛基质，当加入靛基质试剂（对二甲基氨基苯甲醛），形成玫瑰色吲哚，可用肉眼观察。
培养基 蛋白胨水溶液，pH为7.6
试验方法 取细菌的24h培养物接种于蛋白胨水溶液中，臵37℃培养24～48h后观察结果。 结果判定 取出培养物后，加入2 -3滴乙醚，混匀静臵（乙醚起到抽提吲哚的作用。抽提出的无色吲哚和乙醚一并上升至液体表面），再沿管壁加入2-3滴靛基质试剂于培养物表面，在两者接触面上呈玫瑰红色为阳性，以“+”表示；不变色（黄色）为阴性，以“-”表示。
4．枸橼酸盐利用试验
原理 以枸橼酸钠为唯一碳源，磷酸铵为唯一氮源，若细菌能利用这些盐作为碳源和源而生长，则利用枸橼酸钠产生碳酸盐，与利用铵盐产生的NH3反应，形成NH40H，使培养基变碱，pH升高，指示剂溴麝香草酚蓝由草绿色变为深蓝色。
培养基 枸橼酸钠琼脂斜面培养基 pH为7.6
试验方法 将细菌培养物划线接种于枸橼酸钠琼脂斜面37℃培养24～48h。
结果判定 培养基为深蓝色为阳性，以“+”表示；不变色（草绿色）为阴性，以“-”表示。
6．脲酶试验
原理 若细菌能分解尿素则产生两分子氨，使培养基pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有脲酶。
培养基 尿素琼脂培养基 pH至7．2
试验方法 用接种环将待检菌培养物划线接种于尿素琼脂斜面，臵37℃培养18-24h后观察结果。
结果判定 培养基为深红色为阳性，以“+”表示；不变色（粉红色）为阴性，以“-”表示。
7. 硝酸盐还原试验
原理 有些细菌能从硝酸盐提出氧而将其还原为亚硝酸盐(偶而还会形成NH3、N2、N0、NO2和NH40H等其他产物)，若向培养物中加入对氨基苯磺酸和α-萘胺，会形成红色的重氮染
料对磺胺苯一偶氮-α-萘胺(锌也可还原硝酸盐为亚硝酸盐，而且可用于区别假阴性反应和真阴性反应)。
培养基 硝酸钾蛋白胨水 pH至7.4，
试验方法 把细菌培养物接种到硝酸盐培养基中，37℃培养18～24h观察结果。
结果判定 取出后在培养液中加硝酸钾试剂甲、乙液各3～5滴，培养基变红为阳性，以“+”表示；不变色（淡黄色）为阴性，以“-”表示。
8.半固体穿刺试验
原理 细菌具有鞭毛这种特殊构造时，则可表现为有运动能力。在琼脂含量为0.3-0.5%的半固体培养基中，可自由运动。有运动力的细菌向四周扩散生长，无运动力的细菌仅能沿穿刺线生长。
培养基 半固体培养基 pH为7.6
试验方法 以灭菌接种针蘸取细菌培养物，垂直刺进半固体培养基的琼脂柱中间直至管底，偱原路返回，臵37℃温箱中培养18～24h后观察结果。
结果判定 穿刺线及周围培养基变混浊为阳性，以“+”表示；仅穿刺线混浊周围的培养基仍然保持澄清为阴性，以“-”表示。
9.三糖铁试验
原理 细菌分解培养基中糖（葡萄糖、乳糖及蔗糖）产酸，使pH下降，培养基内的酚红指示剂发生颜色变化。再者，细菌分解含硫氨基酸，产生H2S，与培养基中的FeSO4发生反应，形成黑色的硫化亚铁。
培养基 三糖铁琼脂斜面 pH为7.6
试验方法 用接种环取细菌培养物，在三糖铁培养基上先划线再从斜面中部穿刺至管底，37℃培养18～24h后观察结果。
结果判定 用三糖铁反应模式表示。
TSI： 斜面/底层 A: 产酸（变黄） K：产碱（变红）
H2S；气体 ＋：阳性 -：阴性
实验十 凝集试验
[目的]
1.熟悉玻板凝集试验和试管凝集试验的操作技术。
2.掌握凝集反应结果的判定方法。
[原理]
细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应的抗体结合后，在有电解质存在时，抗原颗粒互相凝集成肉眼可见的凝集小块，称为凝集反应。其机制是由于抗原与其相应抗体间存在着相对应的极性基,极性基的相互吸附使抗原外周的水化膜去除,由亲水溶胶变为憎水溶胶。由于电解质具有降低点位的作用，使抗原颗粒间的排斥力消除，从而产生凝集现象。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。就免疫球蛋白的性质来说，主要为IgM和IgG。凝集试验又分为直接凝集试验和间接凝集试验两种，前者主要用于新分离细菌的鉴定或分型，后者可用于可溶性抗原抗体系统的检测。
[实验材料]
布氏杆菌试管凝集抗原、布氏杆菌平板凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清、布氏杆菌标准阴性血清、牛布氏杆菌病待检血清、生理盐水、玻板、试管、0.2mL吸管或微量加样器。0.5％石炭酸生理盐水、生理盐水、接种环、酒精灯等。
[实验内容]
1．布氏杆菌平板(玻板)凝集试验
取洁净玻板一块，用标记笔划成方格，每格分别加被检血清0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.08mL，再加布氏杆菌平板凝集抗原各0.03mL于方格内，从血清量最低的一格开始用一根火柴棒或牙签混合均匀。同时设阴、阳性血清对照。混匀完毕后，将玻板臵室温（20℃）4～10min内记录反应结果。
结果判定 在阳性血清和阴性血清试验结果正确的对照下判定结果，用“十”表示反应的强度。
++++：液体完全透明，菌体完全被凝集呈现大的凝集块，呈片状、块状或颗粒状(即100％的菌体被凝集)。
+++： 液体略呈混浊，菌体大部分被凝集。 (75％菌体被凝集)。
++： 液体不甚透明，菌体部分被凝集。 (50％菌体被凝集)。
+： 液体透明度不明显或不透明，有不甚显著的凝集块。(25％菌体被凝集)。 -： 液体不透明,无凝集。
2．牛布氏杆菌试管凝集试验
加样 每份血清用试管4支，另取对照试管3支，臵试管架上。如待检血清有多份，对照只需1份。按表先加0.5％石炭酸生理盐水，然后以1mL吸管或加样器吸取待检血清0.2mL，加入第1管中，充分混匀，吸出1.5mL弃之，再吸出0.5mL加入第2管，混匀后加入第3管，依此类推至第4管，混匀后弃去0.5mL。第5管中不加待检血清，第6管中加1:25稀释的布氏杆菌阳性血清0.5mL，第7管中加入1：25稀释的布氏杆菌阴性血清0.5mL。 加抗原 每管各加入以0.5％石炭酸生理盐水稀释20倍的布氏杆菌试管凝集抗原0.5mL。 作用 在各试管加完抗原后，将7支试管同时充分混匀，臵37℃培养箱中4～10h，取出后臵室温18～24h，然后观察并记录结果。待检血清稀释度：猪、羊、狗为1:25，1:50，1:100，1:200；牛、马和骆驼为1:50，l:100，1:00，1:400等四个稀释度，大规模检疫可只用两个稀释度，即猪、羊、狗为1:25和1:50；牛、马、骆驼为l:50和1:100。
结果判定 判定结果时用“十”表示反应的强度。
++++：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状(即100％的菌体被凝集)。
+++：液体略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上(75％菌体被凝集)。 ++： 液体不甚透明，管底有明显的凝集沉淀，振荡时有块状或小片絮状物(50％菌体被凝集)。
+：液体透明度不明显或不透明，有不甚显著的沉淀或仅有沉淀的痕迹(25％菌体被凝集)。 -：液体不透明，管底无凝集，有时管底可见有一部分沉淀，但振荡后立即散开呈均匀混匀。
表 布氏杆菌试管凝集试验术式表
管号 1 2 3 4 5 6 7
对照
最终血清稀释阳性血1:25 1:50 1:100 1:200 抗原对阴性血清 度 清 照 1:25 1:25
0.5%石炭酸生
理盐水（mL）
0.5 — —
2.3
被检血清（mL） 0.2
抗原(1：0.5 弃
1.5
0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃0.5 - 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
20)(mL)
确定血清凝集价(滴度)时，应以出现++以上凝集现象的最高稀释度为准。
判定标准牛、马和骆驼凝集价1:100以上，猪、绵羊、山羊和狗1:50以上为阳性。牛、马和骆驼1:50，猪、羊等1:25为可疑。
实验十一 沉淀反应
[目的]
掌握炭疽杆菌环状沉淀试验及琼脂扩散试验的操作技术和结果观察。
[原理]
可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等)与相应的抗体结合后，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验。沉淀试验的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等，分子较小，反应时易出现后带现象，故通常稀释抗原。参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉淀素。沉淀试验广泛应用于病原微生物的诊断，如鸡马立克氏病羽根琼脂扩散试验等。常用的试验方法有环状沉淀法、琼脂扩散法等。
[实验材料]
炭疽沉淀抗原、炭疽沉淀血清、沉淀管、毛细滴管、琼脂扩散平板，生理盐水等。
[实验内容]
1.炭疽环状沉淀反应
抗原处理 如待检样为皮张可用冷浸法：检样臵37℃温箱烘干，高压灭菌后，剪成小块称重，然后加入5～10倍的石炭酸生理盐水，放室温浸泡10～24h，用滤纸过滤2～3次，使之呈清朗的液体，此即为待检抗原。
加样 取2支沉淀管，在其底部各加约0.1mL的炭疽沉淀血清(用毛细血管沿管壁加，注意不可有气泡产生)。再用毛细管将待检抗原沿着管壁重叠在炭疽沉淀血清之上，上下两液间有整齐的界面，注意勿产生气泡。另一支加生理盐水，作为对照。
结果判定 5～10min内判定结果，上下重叠两液界面上出现乳白色环者，为炭疽阳性。
2．琼脂双向扩散反应
琼脂板散板制备 按1%琼脂粉，加至生理盐水中，煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至55℃左右时浇玻板，厚约2mm。
打孔 在琼扩板上打梅花孔，孔径为2mm，中间孔和周围孔间的距离大约为3mm。 加样 将待检血清、生理盐水等分别加至周围孔中，中间加琼扩抗原。
作用 将琼扩板放臵湿盒中，在饱和湿度下，于37℃扩散24h。
结果观察 抗原抗体在凝胶内扩散，在两孔之间比例最适合的位臵出现沉淀带，出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即抗体效价。
实验十二 动物实验
[目的]
掌握实验动物的接种、采血及解剖方法和注意事项。
[原理]
在微生物实验研究工作中,动物实验也是常用的技术之一。其主要用途有：
1.病原体的分离鉴定 有些直接分离培养有困难的病料或需鉴定的细菌通过易感动物体就可达到目的。
2.确定病原体的致病力 有些细菌的形态、生物学方面性状相似。仅在致病力上不同，可利用动物实验鉴别
3.恢复或增强细菌的毒力 多数病原菌长期经过人工保存后，其毒力减弱，需通过易感动物保持原来的致病力
4.测定某些细菌的外毒素 如魏氏梭菌的毒素测定
5.制备疫苗或诊断用抗原 如兔化猪瘟疫苗
6.制备作诊断或治疗用的免疫血清 如作鉴定用的沙门氏菌诊断血清
7.用于检验药物的治疗效果及毒性等
[实验材料]
1.接种材料 大肠杆菌的肉汤培养物
2.实验动物 家兔，小白鼠
#### 3.其他物品 注射器（1mL、 10mL），针头（4、5、6、16），酒精棉，镊子，解剖板，
剪刀，手术刀等。
[实验内容]
1.接种
(1).皮下接种（注射）
a．家兔 由助手把家兔伏卧或仰卧保定，于其背侧或腹侧皮下结缔组织疏松部位剪毛消毒，术者右手持注射器，以左手拇指、食指和中指捏起皮肤呈一个三角皱摺于其底部进针。注射时针头斜面朝上,斜刺入皮下，感到针头可随意拨动即表示插入皮下，缓缓注入接种物0.1-0.2mL,当推入注射物时感到流利通畅也表示在皮下。拔出针头后用酒精棉球按住针孔并稍加按摩。
b．小鼠 无须助手保定。术者在做好接种准备后，先用右手抓住鼠尾，令其前爪抓住饲料罐的铁丝盖，然后用左手的拇指及食指捏住颈部皮肤，并翻转后使小鼠腹部朝上，将其尾巴夹在手掌与小指之间，右手消毒术部，把持注射器，以针头稍微挑起皮肤插入皮下，注入时见有水泡微微鼓起即表示注入。
(2).皮内接种
方法同（1）。接种者以左手拇指及食指夹起皮肤，右手持注射器，用针头插入拇指及食指之间的皮肤内，针头插入不宜过深，同时插入角度要小，注入时感到有阻力且注射完毕后皮肤上有硬泡即为注入皮肤。皮内接种要慢，以防止皮肤胀裂或自针头流出注射物而散播传染。
针头平行刺入皮肤真皮内，挑起，注入接种物。注射时有明显的阻力，注射后局部出现一个小水泡。
(3).腹腔接种
在家兔、小鼠腹腔接种宜采用仰卧保定。接种时稍抬高后躯，使其内脏倾向前腔，在股后侧面插入针头，先刺入皮肤，后进入腹腔，注射时应无阻力有落空的感觉，皮肤也无泡隆起。
(4).肌肉注射
注射部位选择后肢股部。术部消毒后，将针头刺入肌肉内，注射感染材料。
(5).静脉注射
a. 家兔 耳静脉 将家兔保定，选一侧耳边缘静脉，先用70%的酒精涂擦兔耳或以手轻弹耳朵，使静脉努张。注射时，用左手拇指和食指拉紧兔耳，右手持注射器，使针头与静脉平行，向心脏方向刺入静脉内，注射时无阻力且有血向前流动即表示注入。注射完毕后用酒精棉球紧压针孔，以免流血和注射物溢出。
b. 小白鼠 注射部位选择尾静脉。选15-20g体重的小鼠，注射前将尾部浸于温水中1-2分或酒精棉球涂擦，使尾部血管扩张易于注射。用一烧杯扣住小鼠，露出尾部，用最小的针头刺入尾静脉，缓缓注入注射物，注射时无阻力，皮肤不变白、不隆起则表示注入。
2.采血—家兔心脏采血
将家兔仰卧保定。术者在左前肢腋下处局部剪毛消毒，在胸部心跳最明显处下针，直刺心脏，感到针头跳动或有血液向针管内流动时即可抽血。
3.解剖—小白鼠剖解
处死小鼠后,将小鼠固定在解剖板上,消毒剪刀镊子，局部消毒皮肤后，依次打开皮肤—腹膜—肌肉，观察各脏器的形态。
实验十三 大肠杆菌、沙门氏菌
[目的]
1．熟悉大肠杆菌和沙门氏菌的形态特点及生长特性
2. 熟悉肠道杆菌未知标本分离和鉴定方法
[原理]
肠道杆菌是由一大群生化和遗传上相关的中等大小杆菌组成。其共同特点为：革兰氏阴性、无芽孢的兼性厌氧菌。有的以周生鞭毛运动，有的不运动，有或无荚膜。绝大多数在普通培养基上生长良好。其广泛分布于自然界，包括腐生菌、寄生菌和人及动物的病原菌。许多种寄居于人或动物的肠道内的细菌，成为正常肠道菌群的重要成员之一。其生物学性状相似，但生化反应、抗原构造有差异，据此可将它们分类、鉴定。
[实验材料]
1．菌种 大肠杆菌、沙门氏菌
2. 培养基 营养肉汤、普通平板、血平板、伊红美兰琼脂平板（EMB）、沙门氏-志贺氏琼脂平板(S-S)、麦康凯琼脂平板(MAC)、生化培养基。
3. 仪器及其他物品 恒温培养箱、显微镜、接种环、载玻片、滤纸本、酒精灯、革兰氏染液等。
[实验内容]
1．观察大肠杆菌和沙门氏菌在普通培养基上的生长特性。
营养肉汤 普通平板
2.观察大肠杆菌和沙门氏菌在血平板上的生长特性
3. 观察大肠杆菌和沙门氏菌在鉴别培养基上的生长特性
EMB平板 S-S平板 MAC平板
4. 观察大肠杆菌和沙门氏菌在生化培养基上的生长特性
5. 取大肠杆菌和沙门氏菌的固体和液体培养物,涂片染色镜检。
肠道致病菌的分离鉴定程序
实验十四 葡萄球菌
[目的]
1．熟悉白色葡萄球菌和金黄色的葡萄球菌的形态特点及生长特性。
2. 熟悉致病性葡萄球菌的鉴定要点。
[原理]
葡萄球菌广泛分布于空气、饲料、饮水、地面及物体表面。人及畜禽的皮肤、黏膜、肠道、呼吸道及乳腺中也有寄生。致病性葡萄球菌常引起各种化脓性疾患、败血症或脓毒败血症。当污染食品时可引起食物中毒。故在公共卫生学、兽医学上均有十分重要的地位。
[实验材料]
1、菌种：金黄色葡萄球菌（编号为：2516）、白色葡萄球菌（编号为：8213）
2、培养基：普通琼脂平板、营养肉汤、血平板
3、仪器及其他物品 恒温箱、接种环、酒精灯、试管、无菌棉拭、无菌小镊子、无菌吸管、玻片、血浆等。
[实验内容]
1. 观察2516及8213在普通培养基上的生长特性。
营养肉汤 普通平板
2.观察2516及8213 在血平板上的生长特性
3. 取2516及8213的固体和液体培养物,涂片染色镜检
4. 血浆凝固酶试验
原理 多数致病株能同时产生两种蛋白质,一种分泌与菌体外,另一种结合u在菌体表面,它们能使含有抗凝剂的家兔或人的血浆凝固,称为凝固酶。前一种称游离凝固酶，类似凝血酶原的作用；后一种称结合凝固酶，可使血浆纤维蛋白与菌体交联，引起菌体凝集。凝固酶耐热，且具有抗原性，易被蛋白酶分解破坏。凝固酶有助于致病菌株抵御宿主体内吞噬细胞和杀菌物质的作用，同时也使感染局限化。因此，测定血浆凝固酶的有无是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。
方法及结果
(1). 玻片法：
①取干净玻片一块，用记号笔将玻片划成两格，其中一格加2接种环的生理盐水，另一格加1:2兔血浆（或人血浆）1环。
②用接种环取上次培养物葡萄球菌之菌落少许在生理盐水内研磨成细菌悬液，然后取此悬液1环与血浆混匀。
③5分钟以内观察结果,若有凝块出现,即为阳性；若无凝块出现，则为阴性。
(2). 试管法：
①按表加入1:4血浆及葡萄球菌肉汤培养液。
②将各管臵37℃水浴或温箱中，每隔30分钟观察一次结果。
③在3小时内，若第一管及第二管出现凝固,而第三管不出现凝固则为阳性。
血浆凝固酶试验（试管法）
实验十五 真菌的培养及其形态观察
[目的]
掌握真菌的分离培养方法，认识真菌的基本形态结构。
[原理]
真菌是一大类不含叶绿素，无根、茎、叶，由单细胞或多细胞组成的真核细胞型微生物。在自然界分布广、数量大、种类多。主要营腐生和寄生生活，且真菌体内含有丰富的酶系统，能分解各类复杂的有机物质，所以在有机物存在的阴暗、潮湿的地方均能看见真菌的踪迹。并且在物质循环中也起着重要的作用。大部分真菌对人类有益，但有些真菌可引起人和畜禽疾病，有些霉菌还产生毒素，直接或间接地危害人类和动物健康。
[实验材料]
1.菌体 待检霉菌，
2. 培养基 沙堡培养基
3.仪器及其他物品 显微镜、恒温箱、载玻片、盖玻片、染色液、湿盒、霉菌（青霉、曲霉、毛霉）标本片等。
[实验内容]
1．待检霉菌在固体培养基上的生长表现
霉菌在固体培养基上的生长表现将不同霉菌在固体培养基上培养2～5d，可见霉菌菌落有绒毛状、絮状、绳索状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定局限性(直径1～2cm或更小)，很多霉菌的孢子和菌丝能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同颜色，如黄色、绿色、黑色、橙色等。
2．霉菌标本片的观察
3.霉菌小培养(载玻片法)的制作
挑取待检霉菌孢子到盛有灭菌水的小试管中，振荡试管制成孢子悬液备用.取一张干净的载玻片,用无菌接种环勾取1-2环孢子悬液于载玻片中央,用灭菌滴管吸取灭菌后融化的沙堡弱氏培养基少许，滴于孢子悬液上,并迅速将盖玻片加在培养基上，轻轻压一下，压成直径1cm左右的圆形。将制好的片子放入到湿盒中，放在适宜温度的培养箱（28℃）3d后取出，室温再培养2-3d。
4.待检霉菌的形态观察及鉴定
将培养好的小培养片取出，镜下观察其基本形态。
实验十六 食品中细菌菌落总数及大肠菌群的检测 [目的]
1.了解国家规定的食品质量与细菌菌落总数和大肠菌群数量的重要关系。 2.掌握食品细中细菌菌落总数及大肠菌群的检测方法。
[原理]
菌落总数 根据稀释平板技术法检测每mL/g检样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上,经37℃、24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。它所反映的是检样中的活菌数，细菌数越多，说明污染程度越大，这项指标可作为判定待测样品被污染的程度。
大肠菌群数 是在100mL(g)食品中（或1000 mL水中）大肠菌群最近似值。它是指肠杆菌科中的４个属，即埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。这一菌群致病力不强，具有共同特点：好氧和兼性厌氧、革兰氏染色阴性反应、无芽孢杆菌、37℃培养24-48h能发酵乳糖产酸产气。大肠菌群在人畜肠道内含量最多，可随排泄物进入水源或污染食品。国际公认以大肠菌群的存在作为粪便污染指标。这项指标可判定待测样品有无被粪便污染及污染的程度。 [实验材料]
1.检样 牛乳、饮料、酱油
2.培养基 普通营养琼脂平板、单料乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、EMB平板 3.仪器和其他物品 恒温箱、水浴锅、无菌培养皿、无菌吸管、无菌盐水瓶（内装225 mL无菌生理盐水）、无菌试管（内装9 mL无菌生理盐水）、灭菌剪刀、镊子等 [实验内容]
1. 细菌菌落总数的测定 (1).制备样品及样品稀释
取待测样品（牛乳、酱油）一瓶，用点燃的酒精棉球烧灼瓶口，若是塑料瓶则用75%的酒精棉球擦拭灭菌。在无菌条件下取样25 mL放入内装225 mL生理盐水的瓶中，充分混匀，制
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成10的稀释液。用1 mL无菌吸管吸取10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入装有9mL无菌生
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理盐水的试管中（注意，吸管尖端不要触及管内稀释液），振荡试管，混合均匀，制成10
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的稀释液。另取1mL无菌吸管，按上述操作方法做成10稀释液。每次稀释，换用一支无
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菌吸管，共做10、10、10三个稀释度，分别含样品0.1mL，0.01mL，0.001mL。 (2).培养
将上面已做好的样品稀释液充分振荡，然后分别吸取该稀释度的稀释液1 mL至标有相应稀释度的无菌培养皿中，每个稀释度做2个培养皿。将融化并冷却至55℃左右的营养琼脂注入培养皿中，立即轻轻旋转培养皿，使检样与培养基混匀。待凝固后，臵37℃温箱培养48±2h。
(3).菌落计数
记录各平板上的菌落数后，按下表所述方法进行计数并报告。
a.先计算同一稀释度的平均菌落数.若其中一个平板有大片状菌苔生长则不应采用,用另一菌落平板作为该稀释度的平均菌落数.若片状菌苔大小不到平板的一半,其余一半菌落分布均匀时,可将此一半的菌落数乘2,然后再计算稀释度的平均菌落数。
b. 计数时应选择菌落数在30-300之间的平板。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘以稀释倍数即为该样的细菌总数。
c. 若有2个稀释度的平均菌落数都在30-300之间，则按两者菌落总数的比值来决定。若比值小于2，应取两者的平均数；若大于2，则取其较小的菌落数。
d.若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数。
e.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数。 f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近300或30 的平均菌落数乘以稀释倍数。
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按前同样方法将待检样品取样，将样品制成10的稀释液后，根据对待测样品的污染程度估计，用多管发酵法选择3个稀释度，按下列步骤测定。 (1). 初步发酵试验
将已稀释好的待检样品1mL接种于单料乳糖胆盐发酵培养基管内;接种量在1mL以上者,可用双料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，臵37℃培养24h ,如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸、产气，则可报告大肠菌群为阴性；如有产酸、产气者则按下列程序进行。 (2). 分离培养
将产酸、产气的发酵管进行平板分离。分别用接种环取发酵液，用划线接种法，接种于伊红美兰培养基上，于37℃培养18-24h。将出现的大肠菌群可疑菌落进行涂片，用革兰氏染色后镜检。 (3).复发酵试验
挑取经镜检为革兰氏阴性，无芽孢的短杆菌的菌落1-2个，分别接种于含有乳糖发酵培养基管内并摇匀，于37℃培养18-24h。如产酸、产气，即确证为大肠菌群阳性。
查大肠菌群最可能数（MPN）检索表。根据发酵试验的阳性管数，得出每100mL（g）食品中存在的大肠菌群最可能数。
兽医微生物实验
实验一 玻璃器皿的准备及常用仪器的使用
[目的]
系统掌握玻璃器皿的准备方法及常用仪器的使用。
一、玻璃器皿的无害处理：
1、新购臵的玻璃器皿 因含有游离碱，一般在2%的盐酸溶液中浸泡数小时后再用清水洗净，也可在洗衣粉水中煮30-60min,取出用清水洗净。
2、常用玻璃器皿 洗涤时可用鬃刷蘸取洗衣粉刷洗，然后用自来水冲洗干净。
3、带油污玻璃器皿 先将倒空的玻璃器皿用10%的氢氧化钠浸泡半小时或放在5%的苏打液内煮两次，去掉油污，再用洗衣粉和热水刷洗。
4、带菌玻璃器皿 经121℃高压蒸汽灭菌20min后，趁热倒去内容物，再用洗衣粉水刷洗干净，以水在内壁均匀分布成一薄层而不出现水珠为油垢除尽的标准。
经以上处理的玻璃器皿，可满足一般实验用。少数实验对玻璃器皿清洁度要求较高，除用上述方法外，还应先用２％的HCl溶液浸泡数10min,再用自来水冲洗，蒸馏水淋洗2-3次。有的尚需超纯水淋洗然后烘干备用。
二、玻璃器皿的包扎：吸管、平皿、瓶口等的包扎
三、玻璃器皿的灭菌：分为两种，高压蒸汽灭菌法和干热灭菌法。
高压蒸汽灭菌法是湿热灭菌中应用最为广泛的一种方法。其原理是依据在一个密闭的高压蒸汽灭菌器中，水的沸点随水蒸汽压的增加而上升，加压是为了提高水蒸汽的温度。把待灭菌物品放在灭菌器内，当灭菌器内压力为0.1MPa时，温度可达到121℃，一般维持20min,即可杀死一切微生物的营养体及其孢子。一般的培养基、玻璃器皿、金属用具、实验服、传染性标本等均可用这种方法有效灭菌。灭菌的温度及时间视灭菌物品中的微生物种类及数量而定。
干热灭菌法也叫热空气灭菌法。实验室通常使用恒温控制的电热鼓风干燥箱作为干热灭菌器。此法常用于空的玻璃器皿、金属器具和其他耐高温的物品（如陶瓷培养皿盖、石蜡油、碳酸钙）的灭菌。其优点是灭菌器皿保持干燥。但带有胶皮、塑料的物品、液体及固体培养基不能用此法。干热灭菌一般以能否杀死细菌的芽孢作为彻底灭菌的标准，160-170℃，2-3h方可杀死细菌的芽孢。
[实验材料]
吸管若干、平皿5付、盐水瓶1个、中试管、 小试管、脱脂棉、纱布等
[实验内容]
一、各种玻璃器皿的包扎
二、棉塞的制作 视管口大小取脱脂棉若干，顺纤维方向层叠，用力卷紧后用纱布包扎，以套入视管口1/2为宜。
三、各种常用仪器的使用方法及注意事项
1、高压蒸汽灭菌器
操作方法：
加水：打开灭菌锅盖，加水适量（手提式高压锅加水到与支架圈平行处）
装料：将带灭菌物品放于灭菌桶内，物品排放注意彼此间留有一定空隙，使蒸汽在容器内能够流通达到每个物品的部位，以免形成蒸汽死角。物品不要紧靠桶壁，防止冷凝水进入灭菌物品。
密封：将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，使罐内冷空气自下而上排出，加盖，上下螺栓口对齐，采用对角方式均匀旋转拧紧螺栓，使灭菌锅密闭。
加热: 打开排气口（放气阀），排气5-10min后（或喷出气体不形成水雾），此时蒸汽已将锅内的冷空气排尽，关闭放气阀。温度随蒸汽压力增高而上升。待压力逐渐上升至所需温度时，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时。到达规定时间，关闭热源，停止加热，压力随之逐渐降低。
降压、取料： 待压力自然降至“0”后，打开放气阀，松动螺栓，开盖。立即取出灭菌物品，以免凝结在锅盖和器壁上的水滴弄湿包装纸或被灭菌物品，增加染均的概率。斜面培养基自锅内取出后要趁热摆放，灭菌后的空培养皿、试管等要烘干或晾干。
清理：灭菌完毕后,除去锅内剩余水，保持锅内干燥。若连续使用则需每次补足水分。 注意事项：
高压蒸汽灭菌的技术关键是在压力上升之前先排除锅内的冷空气。若锅内仍有滞留的冷空气，压力表虽达到指定压力但锅内温度却达不到相应的温度，灭菌效果不好。
灭菌时人不能离开现场，要严格控制热源维持灭菌时的压力。压力过高不仅培养基的营养成分被破坏，而且高压锅超过耐压范围易发生爆炸造成伤人事故。灭菌完毕后要自然冷却，切忌用凉水浇灭菌锅来降温。压力降至“0”位前不能开盖，以免培养基沸腾喷出或沾湿棉塞。
2、干热灭菌器（电热鼓风干燥箱、干烤箱）
操作方法：
装料： 灭菌前先将玻璃器皿、金属用具用包扎纸（不用油纸）包好，培养皿也可装入金属盒内，然后均匀放入干烤箱内。物品不能摆放过挤，不能紧靠箱壁，使空气流通，温度均匀。
升温：接通电源，打开开关，旋转箱顶部的调气阀，打开通气孔，排除箱内冷空气和水汽。升温，待箱内温度达到80℃时，关闭通气孔，打开鼓风机，使箱内温度均匀。
维持恒温：继续加热，待温度达到160-170℃时,保温维持2h。
降温：灭菌完毕，切断电源，当箱内温度冷却至60 ℃时方可开箱取出物品。
注意事项：灭菌过程中温度不能上升或下降过急。温度达到60℃以上时，不能随意打开干燥箱门。
3、冰箱 常用于菌种保藏。有-4℃、-20℃、-70℃。
4、离心机
实验二 显微镜油镜的使用及细菌基本形态观察
[目的]
1.了解光学显微镜的简单构造原理、使用方法和保护要点。熟练掌握油镜
的使用方法。
2. 认识细菌的基本形态和构造。通过细菌标本片观察，进一步熟悉使用光学显微镜。
[原理]
1.微生物个体微小。肉眼难以看见,必须借助显微镜才能观察到其个体形态及内部结构。因此,显微镜是微生物学研究必不可少的工具，正是显微镜的发明使人类揭开了微生物世界的奥秘。随着科学技术的进步及微生物研究的需要，显微镜从使用可见光源的普通光学显微镜发展到使用紫外线光源的荧光显微镜，进一步发展到用电子流代替照明光源的电子显微镜，使放大率和分辨率大大提高，为微生物学的发展提供了保障。此外，根据不同的用途还有暗视野、相差显微镜等。普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成。机械系统包括有：镜座、载物台、镜臂、镜筒、物镜转换器、调节器；光学部分包括有目镜、物镜、聚光器、反光镜。有些较好的显微镜自身带有照明装臵。在检查细菌标本，多用油镜进行。油镜是一种放大倍数较高(95～l00倍)的物镜，一般都刻有放大倍数(如95×、100×等)和特别的标记，以便于认识。国产镜多用油字表示，国外产品则常用“Oil”(Oil
Immersion)或“HI”(Homogeneous Immersion)作记号。油镜上也常漆有黑环或红环，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一个标志。
2．油镜的原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光量亦较少，其视野较高倍镜暗。当油镜头与载玻片之间为空气所隔时，因为空气的折光指数与玻璃不同，故有一部分光线被折射而不能进入镜头之内，使视野更暗；若在镜头与载玻片之间放上与玻璃的折光指数相近的油类，如柏木油等，则光线不会因折射而损失太大，可使视野充分照明，能清楚地进行观察和检查。
3．油镜的使用方法：进行油镜检查时，应先对好光线，但不可直对阳光，采取最强亮度(升高集光器，开大光圈，调好反光镜等)。然后在标本上加柏木油一滴(切勿过多)，将标本放臵或移臵载物台的正中。转换油镜头浸入油滴中，使其几乎与标本面接触为度(但不应接触)。用左眼由目镜注视镜内，同时慢慢转动粗螺旋，提起镜筒(此时严禁用粗螺旋降下油镜筒)，至能模糊看到物像时，再转动微螺旋，直至物像清晰为止。另一种是固定镜筒调节载物台的显微镜，调焦时，镜片先与油镜头接触，再慢慢转动粗螺旋，将载物台往下调，能模糊看到物像时，再转动细螺旋，直至物像清晰为止，随即进行检查观察。油镜用过后，应立即用擦镜纸将镜头擦拭干净。如油渍已干，则须用擦镜纸蘸少许二甲苯溶解并拭去油渍，然后再用干擦镜纸拭净镜头。
4.细菌是单细胞生物，尽管个体微小，但有其完整的形态特征和结构。细菌的基本形态可分为球状、杆状和螺旋状三种。除细胞壁、细胞膜、细胞质和核质等基本结构外，尚有鞭毛、菌毛、芽孢、荚膜、质粒等附属结构。
[实验材料]
1.标本:
大肠杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌（培养物片及组织片）、变形杆菌、魏氏梭菌、巴氏杆菌、酵母菌的染色标本。
2.仪器及其他物品
普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸等
[实验内容]
1.用低、高倍镜观察酵母菌
(1).将低倍物镜（10×）转到工作位臵。上升聚光器,将光圈打开,转动反光镜采集光源,使视野明亮。
(2).将标本片放于载物台上并上升载物台到最高。
(3).转动粗调节螺旋，当目镜中看到模糊物像时再转动细螺旋直至物像清晰为止。观察酵母菌的形态特点。
(4).高倍镜观察：用手按住物镜转换器慢慢旋转将物镜转换成高倍镜（40×），转动细调将物像调至清晰，进行观察。
2．用油镜观察细菌标本片
(1).用10×镜对光，使视野明亮
(2).在标本片观察部位滴加少量香柏油后放于载物台上，转换物镜为油镜。缓慢上升载物台使油镜浸入香柏油中，并从侧面观察，使镜头上升至既非常接近玻片又不与玻片相撞的合适位臵，避免压碎镜头晶片。
(3).缓慢下降载物台，同时从目镜中观察，直至出现模糊的物像时再用细螺旋调至物像清晰为止。观察细菌基本形态及特殊构造。
3．显微镜用后的处理
(1).处理玻片 加2-3滴二甲苯于标本片上，使香柏油溶解，再用擦镜纸擦净保存供以后使用。
(2).清洁显微镜 先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用蘸有二甲苯的擦镜纸擦掉残留的香柏油，最后用干净的擦镜纸抹去残留的二甲苯；清洁目镜和其他物镜，可直接用干净的擦镜纸擦净；用柔软的绸布擦净机械部分的尘土。最后将物镜转成“八”字式，下降载物台，聚光器降至最低位臵，反光镜镜面转成垂直状。
实验三 细菌涂片的制备及革兰氏染色
[目的]
1.掌握细菌涂片的制备方法及革兰氏染色。
2.学习无菌操作，树立无菌观念。
[原理]
细菌细胞微小，无色而半透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色使菌体着色（由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用，染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应）后，使其与背景形成明显的色差，从而能较清楚的观察到细菌的基本形态和结构。根据不同的染色反应，可作为鉴别细菌的一种依据。微生物染料是一种带苯环的有机化合物，其分子上具有发色基团和助色基团。前者给化合物以特有的颜色，但不能与细菌结合；后者使化合物具成盐的性质，能和菌体结合。分为碱性染料、酸性染料和中性染料三类。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为三种方法即简单染色、鉴别染色和特殊染色。
革兰氏染色：1884年由丹麦病理学家C.Gram创立。此法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌+-（G）和革兰氏阴性菌（G）两大类。是细菌学上最常用的鉴别染色法，有着重要的理论和实践意义。其染色过程是先用草酸铵结晶紫进行初染，再加媒染剂-革兰氏碘液，以增加染料和细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子量较大的复合物，然后用脱色
+剂-乙醇脱色，最后用沙黄液复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者即为G
-菌，反之，脱色后染上复染剂颜色（红色）者即为G菌。其原理是利用细菌的细胞壁组成
成分和结构的不同，通过染色加以鉴别。革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，且类脂质含量少，经乙醇处理发生脱水作用后反而使其孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘形成的复合物保留在细胞内而不被脱色，结果细胞呈现紫色。而革兰氏阴性菌的的肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂质含量较高，经乙醇处理后，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，结果细菌被脱色，再经沙黄复染后呈现红色。
[实验材料]
(1) 菌种：大肠杆菌、葡萄球菌的斜面培养物和肉汤培养物各一管。
(2) 材料：载玻片、接种棒、酒精灯、打火机、吸水纸（滤纸本）、无菌水、染色缸、香柏油、二甲苯等。
(3) 染色液：草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、95%乙醇、沙黄染色液。
(4) 仪器：显微镜
[实验内容】
1．细菌涂片的制备
(1) 玻片准备 载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。如有残余油渍，可按下列方法处理：滴95％酒精2～3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯外焰上轻轻拖过几次。也可提前将玻片浸泡在95%的乙醇中预先脱脂备用。
(2) 涂片 针对所用材料不同，涂片方法也有差异。
a.液体材料(如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等)可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。
b.非液体材料(如菌落、脓、粪便等)则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，臵于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。 c.组织脏器材料可先用镊子夹持中部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压印(触片)或涂抹成一薄层。
如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可在同一张玻片上有秩序地排好，做多点涂抹，或先在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品并做好记录。
(3)干燥 上述涂片应让其室温自然干燥。
(4)固定 有两类固定方法。
火焰固定（物理固定）：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖过数次，略作加热(但不能太热，以不烫手为度)进行固定。
化学固定：血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨((Giemsa)染色，不用火焰固定，而用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2～3min，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min，自然挥发干燥，抹片如做瑞氏(wright's)染色，则不必先做特别固定，染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。
抹片固定的目的有如下几点：
(1)除去抹片的水分，涂抹材料能很好地贴附在玻片上，以免水洗时易被冲掉。
(2)使抹片易于着色或更好地着色，因为变性的蛋白质比非变性的蛋白质着色力更强。
(3)可杀死抹片中的微生物。
必须注意，在抹片固定过程中，实际上并不能保证杀死全部细菌，也不能完全避免在染色水洗时不将部分抹片冲脱。因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的抹片时，应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。
2.革兰氏染色
(1)初染：将玻片臵于染色架上，加草酸铵结晶紫溶液（量以覆盖满涂抹面为宜），染1-2min ，倒去染液水洗。
(2)媒染：加革兰氏碘液，染1-2min，水洗。
(3)脱色：加95%乙醇，将玻片轻摇几下即倾去乙醇，如此重复几次，直至乙醇液不呈现紫色时停止，约20-60秒，立即水洗。
(4)复染：滴加沙黄染液，染1-2min，水洗。
3．镜检
将染色好的玻片夹入滤纸本中，吸去水分。滴加香柏油后油镜观察。
4.实验完毕后处理
(1) 清洁显微镜
(2) 玻片处理 高压灭菌后用洗衣粉水煮沸、清洗、晾干备用。
实验四 培养基的制备
[目的]
1.掌握一般培养基制备的原则和要求。
2.熟悉一般培养基制备的过程。
3.掌握培养基酸碱度的测定。
[原理]
培养基是用人工方法将多种物质按照各类微生物生长的需要而合成的一种混合营养基质，一般用于分离和培养细菌。由于微生物的种类及代谢类型的多样性，故用于培养微生物的培养基种类也很多。它们的配方及配制方法虽各有差异，但培养基的配制步骤却大致相同。即先按配方称取药品，用少量水先溶解各成分，待完全溶解后补足水至所需量，调整pH,然后将培养基分装于合适的容器中，经灭菌后使用或备用。同时应做无菌检查。
制作培养基的要求：
(1)培养基必须含有细菌生长所需要的营养物质。
(2)培养基的材料和盛培养基的容器应没有抑制细菌生长的物质。
(3)培养基的酸碱度应符合细菌生长的要求。多数细菌生长适宜pH范围是弱碱性(pH7.2～
7.6)。
(4)所制培养基应均质透明，以便观察细菌的生长性状和其他代谢活动所产生的变化。
(5)必须彻底灭菌，不得含有任何活细菌。
[实验材料]
1.器皿：量筒(100mL)、烧杯(1000mL和100mL各一个)、漏斗、三角烧瓶(100mL)、试管、玻棒、刻度吸管(1mL和10mL各一个)、pH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试管塞、包装纸、扎绳、洗耳球等。
2.试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、琼脂条或粉、0.1mol/L和1mol/L的氢氧化钠、0.1mol/L和1mol/L的盐酸溶液、蒸馏水、无菌的脱纤绵羊或家兔鲜血。
[实验内容]
每组需制备普通肉汤培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）200mL。其中50mL用于制作普通营养肉汤；50mL用于制备普通斜面；剩余部分用于制作普通琼脂平板。
1．普通肉汤培养基的制作
牛肉膏0.5% 蛋白胨1% 氯化钠0.5% 磷酸氢二钾0.l% 蒸馏水
按以上剂量称取各种试剂(先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏)，臵于烧杯内加热溶解备用。
2. pH的矫正
(1) 试纸法 因初配好的牛肉膏蛋白胨培养液是偏酸性的，故要用NaOH调整。为避免过碱，应缓慢加入NaOH，边加边搅拌，并不时地用pH试纸测试，直至达到所需pH。也可取培养基5mL于干净试管中，逐滴加入NaOH调pH至7.4～7.6，并记录NaOH的用量，再换算出培养基总体积中须加入NaOH的数量，即可调至所需的pH范围。
(2) 标准比色
法
待已配好的培养
基冷至50℃左右
时，调该溶液的
pH至7.4~7.6。校
正pH的方法为：
①取两支与标准
比色管（pH7.4-
pH7.8）相同的空
比色管，加入欲测
的肉汤培养基
5ml，其中一管内
加0.02%酚红指示剂0.25ml（滴定管），摇匀。②按图2所示排列，举起比色架，对光观察。若滴定管色调较淡或为黄色，即表示培养基偏酸性，需滴加0.1mol/L NaOH矫正；若呈深红色，即表示偏碱性，应滴加0.1mol/L HCl矫正；使之与标准比色管色泽相同为止。通常未矫正前的肉汤均呈酸性。记下用去的NaOH（或HCl）溶液量，由此计算出矫正全量培养基时所需1mol/L NaOH（或HCl）溶液量。
图2 pH比色架
计算公式：所需0.1mol/L氢氧化钠量=(培养基量×校正时用去0.1mol/L NaOH量)/5×10
3. 营养肉汤的制备：
量取已矫正pH的肉汤培养基50mL于盐水瓶中，塞上棉塞，用包装纸扎好经121℃灭菌15min后过滤分装中试管，每管约5mL，灭菌备用。
4．普通斜面的制备
量取已矫正pH的肉汤培养基50mL于烧杯中，称取1克琼脂粉加入，加热煮沸，待琼脂完全融化后，分装试管(动作要快，防止琼脂凝固)，每管约4～5mL(约3指高)，试管分装完毕塞好棉塞，121℃灭菌15-20min后，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定坡度，凝固后即成普通琼脂斜面。
5.普通琼脂平板的制备
量取剩余的营养肉汤培养基，按1.5-2%加入琼脂粉，121℃灭菌15-20min。将琼脂瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持时，即为倾倒平皿的合适温度(50～60℃)。每只灭菌培养皿倒入10～15mL（以铺满皿底为宜），盖上皿盖，凝固后即成普通琼脂平板。翻转放入冰箱备用。
6．鲜血琼脂培养基制备
有些细菌对营养要求较高，需在培养基中加入营养因子如血液、血清等。
将已融化的灭菌普通琼脂培养基冷至50℃左右，无菌操作加入无菌的脱纤绵羊或家兔鲜血5％(即每100mL普通琼脂加入鲜血5～6mL)混合后，分装灭菌试管立即摆成斜面或倾注于灭菌平皿(如果琼脂温度过高，鲜血加入后则成紫褐色，温度过低，则鲜血加入琼脂易凝不易混合。注意，混合时切勿产生气泡)。待凝固后，臵37℃培养24h，无菌检验合格方可应用。 半成品培养基有现成的商品出售。只要按瓶签上的说明及所需量和要求直接溶解、分装、灭菌制成平板或斜面即可。半成品培养基，根据培养基所含成分的特性不同，有的可高压灭菌，有的则不宜高压灭菌，如SS琼脂、沙门氏菌、志贺菌选择培养基不可高压灭菌或过久加热，麦康凯琼脂、三糖铁琼脂均可进行高压灭菌。
实验五 自然界中微生物的分布
[目的]
1.了解周围环境中微生物的存在和分布状况。
2.了解无菌操作在微生物实验中的重要性。
[原理]
在我们的周围环境中存在着大量微生物，其种类繁多、形态多样、数量庞大。它们不但广泛分布于室内外的空气、水和土壤中，还分布在我们生活环境中的所有物品上。土壤是微生物栖居的“大本营”，它含有的微生物种类和数量最多；有些微生物附着于尘埃上漂浮于大气中，此外，人和动物体的口腔、呼吸道和消化道及动、植物体表面都存在着各种微生物。可以说，微生物是无孔不入、无处不在的。由于微生物个体微小、结构简单和肉眼难以观察，如果将这些微生物通过某种方法接种到合适它们生长的营养基质上，在适宜温度下培养后可形成肉眼可见的细胞群体，此即为菌落。通过平板培养的方法可检查环境中微生物的数量。不同种的微生物可形成大小、形态各异的菌落，其可作为细菌种属鉴定的依据。
[实验材料]
1.样品 土壤，自来水，污水，实验室或其他地方室内空气，物体或桌面表面，人皮肤表面等。
2.培养基 无菌普通琼脂平板、无菌普通营养琼脂瓶。
3. 仪器和其他物品 培养箱、酒精灯、试管架、水浴锅、无菌生理盐水（10mL、9mL、5mL），无菌吸管（1mL），无菌空平皿等。
[实验内容]
1.标记 用记号笔在培养皿底部标记样品名称、组别、日期等内容或写在标签纸上，贴于皿底一侧，避免影响结果观察。
2.空气中微生物的检测
选择适当位臵，打开无菌平板的皿盖，使培养基暴露于空气中一段时间，即让空气中含微生物的尘埃或颗粒以沉降法自然接种到培养基表面。一般为10min、30min、60min，时间到后盖上皿盖，37℃24h培养。可选择同一地点不同时间或不同地点同一时间的不同方式。
3.皮肤表面的细菌检测
取无菌平板一块，一分为二。一侧用手指直接在培养基表面涂抹，洗手后再在另一侧涂抹，盖好皿盖。37℃24h倒臵培养。
4. 桌面的细菌检测
取无菌平板一块，一分为二。一侧用无菌棉签在5 mL盐水管中浸湿后直接在培养基表面涂抹，再用此棉签涂抹桌面后在另一侧涂抹，盖好皿盖。37℃24h倒臵培养。
5. 土壤中微生物的检测
取约1克土（离地表10cm处）于10 mL无菌生理盐水中，混匀。静臵10min后，做10倍递增稀释。选择三个稀释度，稀释的同时各吸取1 mL菌悬液于无菌空平皿中，倾注，凝固后37℃24h倒臵培养。
6. 水中微生物的检测
分别无菌吸取1m L自来水和污水于无菌的空平皿中，倾注，37℃24h倒臵培养。 实验六 细菌的分离培养与移植
[目的]
掌握细菌分离培养及移植的基本要领和方法。
[原理]
在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。
[实验材料]
菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等。
器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。
培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂平板、酒精灯、接种环(以上每人一套)。
[实验内容]
1.细菌的分离
(1).平板划线接种法 通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。可用做分离纯种细菌。
操作方法（三区划线法）：
a、右手拿接种环，烧灼冷却后，勾取菌种。
b、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
c、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
d、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
e、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，臵37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
平板分区划线法 培养后菌落分布情况
平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：
a.整个操作过程中应严格无菌操作.
b.划线前先将接种环稍稍弯曲,这样易和平皿内琼脂面平行,不致划破培养基。
c.划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。
d. 接种完毕后在皿底作好菌名、日期和接种者等标记,平皿倒扣，臵37℃培养。
(2).稀释分离法 也称稀释平板分离法,有倾注培养法和涂布培养法两种。
(3).利用化学药品的分离法
a.抑菌作用：有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另一些细菌则无效，故可利用此种特性来进行细菌的分离，例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素抑制革兰氏阳性菌的生长，以分离革兰氏阴性菌。
b.杀菌作用：将病料如结核病病料加入15％硫酸溶液中处理，其他杂菌皆被杀死，结核菌因具有抗酸活性而存活。
c.鉴别作用：根据细菌对某种糖具有分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某种细菌。例如SS琼脂培养基可以用做鉴别大肠杆菌与沙门氏杆菌。
(4).实验动物分离法
当分离某种病原菌时，可将被检材料注射于敏感性高的实动物体内，如将结核菌材料注射于豚鼠体内，杂菌不发育，而豚鼠最终患慢性结核病而死。实验动物死后，取心血或脏器用以分离细菌。有时甚至可得到纯培养。
2.细菌的培养
(1).需氧性细菌的培养 根据细菌的生长特性给于合适的生长环境.大多数嗜体温菌及病原菌均能在37℃,18-24h生长良好.
(2).厌氧性细菌的培养
厌氧菌需有较低的氧化一还原势能才能生长(例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化一还原电势降低至0.1lV时才开始生长)，在有氧的环境下，培养基的氧化一还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势，降低培养环境的氧压是十分必要的。现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学、化学和物理学3种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。 a．生物学方法
培养基中含有植物组织(如马铃薯、燕麦、发芽谷物等)或动物组织(新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等)，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理)，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化一还原电势下降。
另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌)，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，臵37℃恒温箱中培养2～3d后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
b．化学方法 利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化一还原电势。
李伏夫(B.M.JIbbob)法此法系用连二亚硫酸纳(Sod~Lkrn hydrosulphite)和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：
Na2S2O4 + Na2C03 + O2—→Na2SO4 + Na2SO3 + C02
取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内(如系液体培养基，则直立于罐内)，最上端保留可容纳1～2个平皿的空间(视玻罐的体积而定)，按玻罐的体积每1 000cm3空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭。
c．物理学方法
利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，使其形成厌氧状态，有利于厌氧菌的生长发育。
厌氧罐法常用的厌氧罐有Brewer-氏罐、Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐。将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中，先抽去部分空气，代以氢气至大气压。通电，使罐中残存的氧与氢经铂或钯的催化而化合成水，使罐内氧气全部消失。将整个厌氧罐放入孵育箱培养。本法适用大量的厌氧菌培养。
3．细菌的移植
将划线分离培养37℃24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下：
(1)两试管斜面移植时，左手斜持菌种管和被接种琼脂斜面管，使管口互相并齐，管底部放在拇指和食指之间，松动两管棉塞，以便接种时容易拔出。右手持接种棒，在火焰上灭菌后，用右手小指和无名指并齐同时拔出两管棉塞，将管口进行火焰灭菌，使其靠近火焰。将接种环伸入菌种管内，先在无菌生长的琼脂上接触使之冷却，再挑取少许细菌后拉出接种环立即伸入另一管斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部。从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，将棉塞塞好。接种完毕，接种环通过火焰灭菌后放下接种棒。最后在斜面管壁上注明菌名、日期和接种者，臵37℃温箱中培养。
(2).从平板培养基上选取可疑菌落移植到琼脂斜面上作纯培养时，则用右手执接种棒，将接种环火焰灭菌，左手打开平皿盖，挑取可疑菌落，左手盖上平皿盖后立即取斜面管，按上述方法进行接种、培养。
(3). 从斜面接种到液体培养基 将已取有菌种的接种环伸入到液体培养基中,并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦,使菌体分散于液体中。接种后塞上棉塞,将液体培养基轻轻晃动,使菌体均匀分布于液体中,以利生长。
(4).从液体接种到液体培养基 需用无菌移液器、移液管或吸管等。本实验室常用吸管。取无菌吸管，除去上部包装纸，在上端管口加橡皮头，拔出管口棉塞，在火焰旁伸入菌种管内，吸取菌液，转接到待接种的液体培养基内。烧灼管口，塞好棉塞，进行培养。
(5).液体接斜面 方法同（1）
(6). 半固体移植用穿刺法接种 方法基本上与纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取菌落，垂直刺人培养基内。要从培养基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。 实验七 环境因素对微生物生长的影响
[目的]
了解环境因素对微生物生长的影响的原理。
[原理]
除营养条件因素外，影响微生物生长的环境因素（包括物理因素、化学因素和生物因素）很多，如许多物理因子（如温度、渗透压、紫外线、酸碱度、氧气等）、一些化学因子（如各类药品和抗生素等）对微生物的生长繁殖、生理生化过程均能产生很大的影响。总之，一切不良的环境条件均能使微生物的生长受到抑制，甚至导致菌体死亡。但是，一些能形成芽孢的微生物在不良环境下形成休眠体，它对恶劣环境有较强的耐受力和抵抗力。因此，可以通过控制环境条件，使有害微生物的生长繁殖受到抑制，甚至将其彻底杀死；而对有益微生物的利用则可促使其更快地生长繁殖。
在这些环境因子中物理因素中的温度对微生物的影响最为明显。不同的微生物生长的繁殖所需要的最适温度不同,根据微生物生长的最适温度范围,可分为高温菌、中温菌和低温菌。自然界中绝大多数都属于中温菌。不同的微生物对高温的抵抗力不同，芽孢对高温有强的抵抗能力。化学药品中的抑菌剂和杀菌剂，有抑菌和杀菌作用。有些菌类能产生抗生素或细菌素，它们的抗菌机制不同；有些干扰微生物细胞膜的功能，有些阻碍细胞壁合成，有些影响蛋白质或核酸的合成等。有些植物或中药含有杀菌成分，称为植物抑菌素。如大蒜、姜、葱、黄芪、金银花、板蓝根等。
[实验材料]
1.菌种 大肠杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌的斜面培养物
2.培养基 普通肉汤、普通平板
3.仪器和其他物品 恒温培养箱、接种环、酒精灯、高压锅、水浴锅、三种消毒剂、圆滤纸片、镊子、药敏纸片等。
[实验内容]
1. 温度对细菌的影响
湿热灭菌实验：通过煮沸灭菌和高压蒸汽灭菌验证高温对细菌的影响
无菌勾取大肠杆菌（编号为81010）和枯草杆菌（编号为8217），分别接种4支普通肉汤，标记为S1,S2,S3,S4;C1,C2,C3,C4。做以下处理后，37℃18-24h培养后观察结果。 S1 C1 煮沸 10min S3 C3 10P 5min
S2 C2 煮沸 1h S4 C4 15P 15min
2. 化学消毒剂对细菌的影响
密集接种法接种细菌 取两块无菌平板，用无菌接种环分别勾取81010和葡萄球菌（编号为8213）培养物少许，先在平板琼脂表面中央划一条线，垂直该线作平行密集划线，划满平板。再将平板转动90度，作平行密集划线，划满平板，再将浸有以下消毒剂的滤纸片贴附于培养基表面，静臵待滤纸片上的菌液被吸收后，将平板倒臵于37℃温箱中18-24h后观察结果。
0.1%新洁尔灭 1%消毒王 70%酒精
3. 抗生素对细菌的影响
圆纸片扩散法 操作方法同2。在布满细菌的平板上，任选4种抗生素药敏纸片贴附于培养基表面，各纸片间距离应相等，且不能太靠近培养皿的边缘。将平板倒臵于37℃温箱中18-24h后观察结果。
2、3实验结果可用尺子测量抑菌圈直径，根据其直径大小可初步确定测试化学消毒剂及抗生素的抑菌效能。
实验八 不染色标本片的制备及细菌运动力观察
[目的]
1.了解检查细菌运动力的方法。
2. 掌握悬滴法检测细菌的运动力。
[原理]
鞭毛是细菌的一种特殊结构，是细菌运动器官。细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定中的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位臵和数目，但此法较复杂烦琐。采用悬滴法或水封片法（压滴法）直接在光学显微镜下检查活菌是否具有运动能力来判断细菌是否具有鞭毛则快速、简便。具有运动能力的细菌，可以独立运动，在显微镜下观察时，细菌的真正运动(自动运动)表现为能离开原来位臵，不断改变方向的自由地游动。水的分子运动(布朗运动)也能见于细菌个体，但只能使其在原地摆动，不能远离原来的位臵移动。这种情况，都是外力作用的结果，不是细菌本身的真正运动。检查细菌的运动力，应用幼年培养物，最好刚从温箱中取出，并在温暖的环境下从速进行。
此外，这种方法也可用来检查微生物对各种化学物质的趋化性。
[实验材料]
1.菌种 2003Y1,2003Y2(为本实验室分离的菌种)的肉汤培养物
2.仪器及其他物品 显微镜、接种环、酒精灯、凹玻片、盖玻片、蒸馏水等
[实验内容]
1.悬滴检查法 采用不染色活菌标本来检查其运动能力。
a.不染色标本片的制备 取洁净盖玻片一张，用接种环各勾取蒸馏水1-2环于盖玻片四个角，灭菌接种环，再勾取2003Y1或2003Y2幼龄肉汤培养物1-2环于盖玻片中央；另取一干净凹玻片，凹面朝下对角扣于盖玻片上，再将玻片翻转，使菌液液滴向下，即可进行镜检。若为固体培养物，则需在盖玻片中央先滴上一小滴生理盐水或透明肉汤，再用接种环取待检固体培养物少量(不要过多)，混匀于液滴内即可。
盖玻片四角的蒸馏水起到粘附（使凹玻片和盖玻片紧密吸附）、防止液滴干燥的目的。 b. 镜检 因细菌无色透明，与背景无明显的色差，故在观察时视野要稍暗。
10倍镜对光后调整光线使视野变暗。放上悬滴标本片，先用低倍镜找到液滴边缘（因表面张力的作用，液滴边缘有大量的菌体，便于观察），然后再转换高倍镜对焦观察，一般不必使用油镜观察，必须用时，注意防止压坏盖玻片。
附：
压滴检查法 本法比较简便，宜于短时观察，也较适用于混浊或浓厚的液体检材(如血液、渗出液、脓汁、稀粪便等)。
制片：取一块洁净的普通载玻片，于其中央滴上一滴(可以稍大些)生理盐水，以接种环取少量固体检材混匀其中。如为液体检材，可以直接滴在载玻片上，然后取一个洁净的盖玻片，轻轻盖压在液滴上，要注意避免产生气泡。
镜检：同悬滴检查法。
2．培养检查法
(1)半固体培养基穿刺培养法：以灭菌接种针蘸取纯培养检材，垂直刺进半固体培养基的琼脂柱中间直至管底，臵37℃温箱中培养18～24h，有运动力的细菌向四周扩散生长，使周围的培养基变成混浊；无运动力的细菌仅能沿穿刺线生长，周围的培养基仍然保持澄清。
(2)平板挖沟培养法：预先制备好鲜血琼脂平板，以无菌手术在平板中央挖去一条lcm宽的琼脂条，形成一条小沟，放臵一条4cm×0.5cm的无菌滤纸横跨于两边培养基上，使之与小沟相垂直。在滤纸条的一顶端接种待检细菌的纯培养物，臵37℃温箱中培养，每天观察生长情况，直至7天，如接种端的隔沟对边亦生长同样细菌，表示该菌有运动力。
3.特殊染色法—鞭毛染色法
细菌的鞭毛极细，直径一般为10-20nm，只有用电子显微镜才可观察到。但是，如采用特殊的染色法则在普通光学显微镜下也可观察得到。方法很多，但基本原理相似，即在染色前先经媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由鞣酸和氯化铁或钾明矾等配制而成。常用的染色法有：银染色法、Leifson氏染色法及Bailey氏染色法。
4.电镜检查法
本实验重点学习和掌握悬滴法检测细菌运动力。
实验九 生化实验
[目的]
1.掌握细菌鉴定中常用生化试验的原理和方法。
2.了解细菌生化试验在细菌鉴定及诊断中的重要意义。
[原理]
不同种类的细菌，由于其细胞内新陈代谢的酶系统不同，对营养物质的吸收利用、分解排泄及合成产物的产生等都有很大的差别，细菌的生化试验就是检测某种细菌能否利用某种(些)物质及其对某种(些)物质的代谢及合成产物，确定细菌合成和分解代谢产物的特异性，借此来鉴定细菌的种类。
[实验材料]
1.菌种 大肠杆菌、沙门氏菌
2.培养基 糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖），葡萄糖蛋白胨水培养基，蛋白胨水培养基，尿素培养基，枸橼酸盐培养基，硝酸钾蛋白胨水培养基，半固体培养基，三糖铁培养基。
3.试剂 甲基红试剂，靛基质试剂，乙醚，硝酸钾甲、乙液，VP甲、乙液。
[实验内容]
1．糖发酵试验
原理 不同细菌对不同的糖、醇分解能力及代谢产物不同，这与该菌是否含有分解某种糖、醇的酶密切相关，是受遗传基因所决定的，是细菌的重要表型特征，有助于鉴定细菌。含糖培养基中加入溴甲酚紫指示剂（pH 7.0(紫色)～pH 5.4(黄色)），若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。可用于鉴别细菌，尤其是肠道细菌。
培养基 糖培养基 pH为7.6
实验方法 挑取18～24h的幼龄斜面培养物，接种， 37℃18-24h后观察结果。 结果判定 a.糖不分解，指示剂仍为紫色，记录为：－
b.糖分解（产酸不产气）指示剂变黄，小倒管中无气泡，记录为：+
c.糖分解（产酸且产气）指示剂变黄，小倒管中有气泡，记录为：+
2．甲基红(MR)试验／VP试验
原理 细菌分解培养基中的葡萄糖产酸，当产酸量大，使培养基的pH降至4．5以下时，加入甲基红指示剂而变红[甲基红的变色范围为pH 4．4(红色)～pH 6．2(黄色)]，此为甲基红试验。当细菌发酵葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再变为乙酰甲基甲醇；乙酰甲基甲醇又变成2，3一丁二烯醇，2，3一丁二烯醇在碱性条件下氧化成为二乙酰，二乙酰和蛋白胨中精氨酸胍基起作用产生粉红色的化合物，此为VP试验。这两个试验密切相关，对一种细菌而言，两者只能居其一。
培养基 葡萄糖蛋白胨水 pH为7.6
试验方法 取细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，臵37℃培养18-24h后观察结果。
结果判定
MR试验 取出后加甲基红试剂3～5滴，凡培养液呈红色者为阳性，以“+”表示；橙色者为可疑，以“±”表示；黄色者为阴性，以“-”表示。
VP试验 取出后在培养液中先加VP试剂甲液0．6mL，再加乙液0．2mL，充分混匀。静臵在试管架上，15min后培养液呈红色者为阳性，以“+”表示；不变色为阴性，以“-”表示。1h后可出现假阳性。或者可以用等量的硫酸铜试剂于培养液中混合，静臵，强阳性者约5min后就可产生粉红色反应。
3. 吲哚(靛基质)试验
原理 各种细菌分解氨基酸的能力不同，借此可鉴别菌种。有些细菌如大肠杆菌、变形杆菌等具有色氨酸分解酶，可分解蛋白胨中的色氨酸生成无色的吲哚——即靛基质，当加入靛基质试剂（对二甲基氨基苯甲醛），形成玫瑰色吲哚，可用肉眼观察。
培养基 蛋白胨水溶液，pH为7.6
试验方法 取细菌的24h培养物接种于蛋白胨水溶液中，臵37℃培养24～48h后观察结果。 结果判定 取出培养物后，加入2 -3滴乙醚，混匀静臵（乙醚起到抽提吲哚的作用。抽提出的无色吲哚和乙醚一并上升至液体表面），再沿管壁加入2-3滴靛基质试剂于培养物表面，在两者接触面上呈玫瑰红色为阳性，以“+”表示；不变色（黄色）为阴性，以“-”表示。
4．枸橼酸盐利用试验
原理 以枸橼酸钠为唯一碳源，磷酸铵为唯一氮源，若细菌能利用这些盐作为碳源和源而生长，则利用枸橼酸钠产生碳酸盐，与利用铵盐产生的NH3反应，形成NH40H，使培养基变碱，pH升高，指示剂溴麝香草酚蓝由草绿色变为深蓝色。
培养基 枸橼酸钠琼脂斜面培养基 pH为7.6
试验方法 将细菌培养物划线接种于枸橼酸钠琼脂斜面37℃培养24～48h。
结果判定 培养基为深蓝色为阳性，以“+”表示；不变色（草绿色）为阴性，以“-”表示。
6．脲酶试验
原理 若细菌能分解尿素则产生两分子氨，使培养基pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有脲酶。
培养基 尿素琼脂培养基 pH至7．2
试验方法 用接种环将待检菌培养物划线接种于尿素琼脂斜面，臵37℃培养18-24h后观察结果。
结果判定 培养基为深红色为阳性，以“+”表示；不变色（粉红色）为阴性，以“-”表示。
7. 硝酸盐还原试验
原理 有些细菌能从硝酸盐提出氧而将其还原为亚硝酸盐(偶而还会形成NH3、N2、N0、NO2和NH40H等其他产物)，若向培养物中加入对氨基苯磺酸和α-萘胺，会形成红色的重氮染
料对磺胺苯一偶氮-α-萘胺(锌也可还原硝酸盐为亚硝酸盐，而且可用于区别假阴性反应和真阴性反应)。
培养基 硝酸钾蛋白胨水 pH至7.4，
试验方法 把细菌培养物接种到硝酸盐培养基中，37℃培养18～24h观察结果。
结果判定 取出后在培养液中加硝酸钾试剂甲、乙液各3～5滴，培养基变红为阳性，以“+”表示；不变色（淡黄色）为阴性，以“-”表示。
8.半固体穿刺试验
原理 细菌具有鞭毛这种特殊构造时，则可表现为有运动能力。在琼脂含量为0.3-0.5%的半固体培养基中，可自由运动。有运动力的细菌向四周扩散生长，无运动力的细菌仅能沿穿刺线生长。
培养基 半固体培养基 pH为7.6
试验方法 以灭菌接种针蘸取细菌培养物，垂直刺进半固体培养基的琼脂柱中间直至管底，偱原路返回，臵37℃温箱中培养18～24h后观察结果。
结果判定 穿刺线及周围培养基变混浊为阳性，以“+”表示；仅穿刺线混浊周围的培养基仍然保持澄清为阴性，以“-”表示。
9.三糖铁试验
原理 细菌分解培养基中糖（葡萄糖、乳糖及蔗糖）产酸，使pH下降，培养基内的酚红指示剂发生颜色变化。再者，细菌分解含硫氨基酸，产生H2S，与培养基中的FeSO4发生反应，形成黑色的硫化亚铁。
培养基 三糖铁琼脂斜面 pH为7.6
试验方法 用接种环取细菌培养物，在三糖铁培养基上先划线再从斜面中部穿刺至管底，37℃培养18～24h后观察结果。
结果判定 用三糖铁反应模式表示。
TSI： 斜面/底层 A: 产酸（变黄） K：产碱（变红）
H2S；气体 ＋：阳性 -：阴性
实验十 凝集试验
[目的]
1.熟悉玻板凝集试验和试管凝集试验的操作技术。
2.掌握凝集反应结果的判定方法。
[原理]
细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应的抗体结合后，在有电解质存在时，抗原颗粒互相凝集成肉眼可见的凝集小块，称为凝集反应。其机制是由于抗原与其相应抗体间存在着相对应的极性基,极性基的相互吸附使抗原外周的水化膜去除,由亲水溶胶变为憎水溶胶。由于电解质具有降低点位的作用，使抗原颗粒间的排斥力消除，从而产生凝集现象。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。就免疫球蛋白的性质来说，主要为IgM和IgG。凝集试验又分为直接凝集试验和间接凝集试验两种，前者主要用于新分离细菌的鉴定或分型，后者可用于可溶性抗原抗体系统的检测。
[实验材料]
布氏杆菌试管凝集抗原、布氏杆菌平板凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清、布氏杆菌标准阴性血清、牛布氏杆菌病待检血清、生理盐水、玻板、试管、0.2mL吸管或微量加样器。0.5％石炭酸生理盐水、生理盐水、接种环、酒精灯等。
[实验内容]
1．布氏杆菌平板(玻板)凝集试验
取洁净玻板一块，用标记笔划成方格，每格分别加被检血清0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.08mL，再加布氏杆菌平板凝集抗原各0.03mL于方格内，从血清量最低的一格开始用一根火柴棒或牙签混合均匀。同时设阴、阳性血清对照。混匀完毕后，将玻板臵室温（20℃）4～10min内记录反应结果。
结果判定 在阳性血清和阴性血清试验结果正确的对照下判定结果，用“十”表示反应的强度。
++++：液体完全透明，菌体完全被凝集呈现大的凝集块，呈片状、块状或颗粒状(即100％的菌体被凝集)。
+++： 液体略呈混浊，菌体大部分被凝集。 (75％菌体被凝集)。
++： 液体不甚透明，菌体部分被凝集。 (50％菌体被凝集)。
+： 液体透明度不明显或不透明，有不甚显著的凝集块。(25％菌体被凝集)。 -： 液体不透明,无凝集。
2．牛布氏杆菌试管凝集试验
加样 每份血清用试管4支，另取对照试管3支，臵试管架上。如待检血清有多份，对照只需1份。按表先加0.5％石炭酸生理盐水，然后以1mL吸管或加样器吸取待检血清0.2mL，加入第1管中，充分混匀，吸出1.5mL弃之，再吸出0.5mL加入第2管，混匀后加入第3管，依此类推至第4管，混匀后弃去0.5mL。第5管中不加待检血清，第6管中加1:25稀释的布氏杆菌阳性血清0.5mL，第7管中加入1：25稀释的布氏杆菌阴性血清0.5mL。 加抗原 每管各加入以0.5％石炭酸生理盐水稀释20倍的布氏杆菌试管凝集抗原0.5mL。 作用 在各试管加完抗原后，将7支试管同时充分混匀，臵37℃培养箱中4～10h，取出后臵室温18～24h，然后观察并记录结果。待检血清稀释度：猪、羊、狗为1:25，1:50，1:100，1:200；牛、马和骆驼为1:50，l:100，1:00，1:400等四个稀释度，大规模检疫可只用两个稀释度，即猪、羊、狗为1:25和1:50；牛、马、骆驼为l:50和1:100。
结果判定 判定结果时用“十”表示反应的强度。
++++：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状(即100％的菌体被凝集)。
+++：液体略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上(75％菌体被凝集)。 ++： 液体不甚透明，管底有明显的凝集沉淀，振荡时有块状或小片絮状物(50％菌体被凝集)。
+：液体透明度不明显或不透明，有不甚显著的沉淀或仅有沉淀的痕迹(25％菌体被凝集)。 -：液体不透明，管底无凝集，有时管底可见有一部分沉淀，但振荡后立即散开呈均匀混匀。
表 布氏杆菌试管凝集试验术式表
管号 1 2 3 4 5 6 7
对照
最终血清稀释阳性血1:25 1:50 1:100 1:200 抗原对阴性血清 度 清 照 1:25 1:25
0.5%石炭酸生
理盐水（mL）
0.5 — —
2.3
被检血清（mL） 0.2
抗原(1：0.5 弃
1.5
0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃0.5 - 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
20)(mL)
确定血清凝集价(滴度)时，应以出现++以上凝集现象的最高稀释度为准。
判定标准牛、马和骆驼凝集价1:100以上，猪、绵羊、山羊和狗1:50以上为阳性。牛、马和骆驼1:50，猪、羊等1:25为可疑。
实验十一 沉淀反应
[目的]
掌握炭疽杆菌环状沉淀试验及琼脂扩散试验的操作技术和结果观察。
[原理]
可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等)与相应的抗体结合后，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验。沉淀试验的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等，分子较小，反应时易出现后带现象，故通常稀释抗原。参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉淀素。沉淀试验广泛应用于病原微生物的诊断，如鸡马立克氏病羽根琼脂扩散试验等。常用的试验方法有环状沉淀法、琼脂扩散法等。
[实验材料]
炭疽沉淀抗原、炭疽沉淀血清、沉淀管、毛细滴管、琼脂扩散平板，生理盐水等。
[实验内容]
1.炭疽环状沉淀反应
抗原处理 如待检样为皮张可用冷浸法：检样臵37℃温箱烘干，高压灭菌后，剪成小块称重，然后加入5～10倍的石炭酸生理盐水，放室温浸泡10～24h，用滤纸过滤2～3次，使之呈清朗的液体，此即为待检抗原。
加样 取2支沉淀管，在其底部各加约0.1mL的炭疽沉淀血清(用毛细血管沿管壁加，注意不可有气泡产生)。再用毛细管将待检抗原沿着管壁重叠在炭疽沉淀血清之上，上下两液间有整齐的界面，注意勿产生气泡。另一支加生理盐水，作为对照。
结果判定 5～10min内判定结果，上下重叠两液界面上出现乳白色环者，为炭疽阳性。
2．琼脂双向扩散反应
琼脂板散板制备 按1%琼脂粉，加至生理盐水中，煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至55℃左右时浇玻板，厚约2mm。
打孔 在琼扩板上打梅花孔，孔径为2mm，中间孔和周围孔间的距离大约为3mm。 加样 将待检血清、生理盐水等分别加至周围孔中，中间加琼扩抗原。
作用 将琼扩板放臵湿盒中，在饱和湿度下，于37℃扩散24h。
结果观察 抗原抗体在凝胶内扩散，在两孔之间比例最适合的位臵出现沉淀带，出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即抗体效价。
实验十二 动物实验
[目的]
掌握实验动物的接种、采血及解剖方法和注意事项。
[原理]
在微生物实验研究工作中,动物实验也是常用的技术之一。其主要用途有：
1.病原体的分离鉴定 有些直接分离培养有困难的病料或需鉴定的细菌通过易感动物体就可达到目的。
2.确定病原体的致病力 有些细菌的形态、生物学方面性状相似。仅在致病力上不同，可利用动物实验鉴别
3.恢复或增强细菌的毒力 多数病原菌长期经过人工保存后，其毒力减弱，需通过易感动物保持原来的致病力
4.测定某些细菌的外毒素 如魏氏梭菌的毒素测定
5.制备疫苗或诊断用抗原 如兔化猪瘟疫苗
6.制备作诊断或治疗用的免疫血清 如作鉴定用的沙门氏菌诊断血清
7.用于检验药物的治疗效果及毒性等
[实验材料]
1.接种材料 大肠杆菌的肉汤培养物
2.实验动物 家兔，小白鼠
#### 3.其他物品 注射器（1mL、 10mL），针头（4、5、6、16），酒精棉，镊子，解剖板，
剪刀，手术刀等。
[实验内容]
1.接种
(1).皮下接种（注射）
a．家兔 由助手把家兔伏卧或仰卧保定，于其背侧或腹侧皮下结缔组织疏松部位剪毛消毒，术者右手持注射器，以左手拇指、食指和中指捏起皮肤呈一个三角皱摺于其底部进针。注射时针头斜面朝上,斜刺入皮下，感到针头可随意拨动即表示插入皮下，缓缓注入接种物0.1-0.2mL,当推入注射物时感到流利通畅也表示在皮下。拔出针头后用酒精棉球按住针孔并稍加按摩。
b．小鼠 无须助手保定。术者在做好接种准备后，先用右手抓住鼠尾，令其前爪抓住饲料罐的铁丝盖，然后用左手的拇指及食指捏住颈部皮肤，并翻转后使小鼠腹部朝上，将其尾巴夹在手掌与小指之间，右手消毒术部，把持注射器，以针头稍微挑起皮肤插入皮下，注入时见有水泡微微鼓起即表示注入。
(2).皮内接种
方法同（1）。接种者以左手拇指及食指夹起皮肤，右手持注射器，用针头插入拇指及食指之间的皮肤内，针头插入不宜过深，同时插入角度要小，注入时感到有阻力且注射完毕后皮肤上有硬泡即为注入皮肤。皮内接种要慢，以防止皮肤胀裂或自针头流出注射物而散播传染。
针头平行刺入皮肤真皮内，挑起，注入接种物。注射时有明显的阻力，注射后局部出现一个小水泡。
(3).腹腔接种
在家兔、小鼠腹腔接种宜采用仰卧保定。接种时稍抬高后躯，使其内脏倾向前腔，在股后侧面插入针头，先刺入皮肤，后进入腹腔，注射时应无阻力有落空的感觉，皮肤也无泡隆起。
(4).肌肉注射
注射部位选择后肢股部。术部消毒后，将针头刺入肌肉内，注射感染材料。
(5).静脉注射
a. 家兔 耳静脉 将家兔保定，选一侧耳边缘静脉，先用70%的酒精涂擦兔耳或以手轻弹耳朵，使静脉努张。注射时，用左手拇指和食指拉紧兔耳，右手持注射器，使针头与静脉平行，向心脏方向刺入静脉内，注射时无阻力且有血向前流动即表示注入。注射完毕后用酒精棉球紧压针孔，以免流血和注射物溢出。
b. 小白鼠 注射部位选择尾静脉。选15-20g体重的小鼠，注射前将尾部浸于温水中1-2分或酒精棉球涂擦，使尾部血管扩张易于注射。用一烧杯扣住小鼠，露出尾部，用最小的针头刺入尾静脉，缓缓注入注射物，注射时无阻力，皮肤不变白、不隆起则表示注入。
2.采血—家兔心脏采血
将家兔仰卧保定。术者在左前肢腋下处局部剪毛消毒，在胸部心跳最明显处下针，直刺心脏，感到针头跳动或有血液向针管内流动时即可抽血。
3.解剖—小白鼠剖解
处死小鼠后,将小鼠固定在解剖板上,消毒剪刀镊子，局部消毒皮肤后，依次打开皮肤—腹膜—肌肉，观察各脏器的形态。
实验十三 大肠杆菌、沙门氏菌
[目的]
1．熟悉大肠杆菌和沙门氏菌的形态特点及生长特性
2. 熟悉肠道杆菌未知标本分离和鉴定方法
[原理]
肠道杆菌是由一大群生化和遗传上相关的中等大小杆菌组成。其共同特点为：革兰氏阴性、无芽孢的兼性厌氧菌。有的以周生鞭毛运动，有的不运动，有或无荚膜。绝大多数在普通培养基上生长良好。其广泛分布于自然界，包括腐生菌、寄生菌和人及动物的病原菌。许多种寄居于人或动物的肠道内的细菌，成为正常肠道菌群的重要成员之一。其生物学性状相似，但生化反应、抗原构造有差异，据此可将它们分类、鉴定。
[实验材料]
1．菌种 大肠杆菌、沙门氏菌
2. 培养基 营养肉汤、普通平板、血平板、伊红美兰琼脂平板（EMB）、沙门氏-志贺氏琼脂平板(S-S)、麦康凯琼脂平板(MAC)、生化培养基。
3. 仪器及其他物品 恒温培养箱、显微镜、接种环、载玻片、滤纸本、酒精灯、革兰氏染液等。
[实验内容]
1．观察大肠杆菌和沙门氏菌在普通培养基上的生长特性。
营养肉汤 普通平板
2.观察大肠杆菌和沙门氏菌在血平板上的生长特性
3. 观察大肠杆菌和沙门氏菌在鉴别培养基上的生长特性
EMB平板 S-S平板 MAC平板
4. 观察大肠杆菌和沙门氏菌在生化培养基上的生长特性
5. 取大肠杆菌和沙门氏菌的固体和液体培养物,涂片染色镜检。
肠道致病菌的分离鉴定程序
实验十四 葡萄球菌
[目的]
1．熟悉白色葡萄球菌和金黄色的葡萄球菌的形态特点及生长特性。
2. 熟悉致病性葡萄球菌的鉴定要点。
[原理]
葡萄球菌广泛分布于空气、饲料、饮水、地面及物体表面。人及畜禽的皮肤、黏膜、肠道、呼吸道及乳腺中也有寄生。致病性葡萄球菌常引起各种化脓性疾患、败血症或脓毒败血症。当污染食品时可引起食物中毒。故在公共卫生学、兽医学上均有十分重要的地位。
[实验材料]
1、菌种：金黄色葡萄球菌（编号为：2516）、白色葡萄球菌（编号为：8213）
2、培养基：普通琼脂平板、营养肉汤、血平板
3、仪器及其他物品 恒温箱、接种环、酒精灯、试管、无菌棉拭、无菌小镊子、无菌吸管、玻片、血浆等。
[实验内容]
1. 观察2516及8213在普通培养基上的生长特性。
营养肉汤 普通平板
2.观察2516及8213 在血平板上的生长特性
3. 取2516及8213的固体和液体培养物,涂片染色镜检
4. 血浆凝固酶试验
原理 多数致病株能同时产生两种蛋白质,一种分泌与菌体外,另一种结合u在菌体表面,它们能使含有抗凝剂的家兔或人的血浆凝固,称为凝固酶。前一种称游离凝固酶，类似凝血酶原的作用；后一种称结合凝固酶，可使血浆纤维蛋白与菌体交联，引起菌体凝集。凝固酶耐热，且具有抗原性，易被蛋白酶分解破坏。凝固酶有助于致病菌株抵御宿主体内吞噬细胞和杀菌物质的作用，同时也使感染局限化。因此，测定血浆凝固酶的有无是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。
方法及结果
(1). 玻片法：
①取干净玻片一块，用记号笔将玻片划成两格，其中一格加2接种环的生理盐水，另一格加1:2兔血浆（或人血浆）1环。
②用接种环取上次培养物葡萄球菌之菌落少许在生理盐水内研磨成细菌悬液，然后取此悬液1环与血浆混匀。
③5分钟以内观察结果,若有凝块出现,即为阳性；若无凝块出现，则为阴性。
(2). 试管法：
①按表加入1:4血浆及葡萄球菌肉汤培养液。
②将各管臵37℃水浴或温箱中，每隔30分钟观察一次结果。
③在3小时内，若第一管及第二管出现凝固,而第三管不出现凝固则为阳性。
血浆凝固酶试验（试管法）
实验十五 真菌的培养及其形态观察
[目的]
掌握真菌的分离培养方法，认识真菌的基本形态结构。
[原理]
真菌是一大类不含叶绿素，无根、茎、叶，由单细胞或多细胞组成的真核细胞型微生物。在自然界分布广、数量大、种类多。主要营腐生和寄生生活，且真菌体内含有丰富的酶系统，能分解各类复杂的有机物质，所以在有机物存在的阴暗、潮湿的地方均能看见真菌的踪迹。并且在物质循环中也起着重要的作用。大部分真菌对人类有益，但有些真菌可引起人和畜禽疾病，有些霉菌还产生毒素，直接或间接地危害人类和动物健康。
[实验材料]
1.菌体 待检霉菌，
2. 培养基 沙堡培养基
3.仪器及其他物品 显微镜、恒温箱、载玻片、盖玻片、染色液、湿盒、霉菌（青霉、曲霉、毛霉）标本片等。
[实验内容]
1．待检霉菌在固体培养基上的生长表现
霉菌在固体培养基上的生长表现将不同霉菌在固体培养基上培养2～5d，可见霉菌菌落有绒毛状、絮状、绳索状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定局限性(直径1～2cm或更小)，很多霉菌的孢子和菌丝能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同颜色，如黄色、绿色、黑色、橙色等。
2．霉菌标本片的观察
3.霉菌小培养(载玻片法)的制作
挑取待检霉菌孢子到盛有灭菌水的小试管中，振荡试管制成孢子悬液备用.取一张干净的载玻片,用无菌接种环勾取1-2环孢子悬液于载玻片中央,用灭菌滴管吸取灭菌后融化的沙堡弱氏培养基少许，滴于孢子悬液上,并迅速将盖玻片加在培养基上，轻轻压一下，压成直径1cm左右的圆形。将制好的片子放入到湿盒中，放在适宜温度的培养箱（28℃）3d后取出，室温再培养2-3d。
4.待检霉菌的形态观察及鉴定
将培养好的小培养片取出，镜下观察其基本形态。
实验十六 食品中细菌菌落总数及大肠菌群的检测 [目的]
1.了解国家规定的食品质量与细菌菌落总数和大肠菌群数量的重要关系。 2.掌握食品细中细菌菌落总数及大肠菌群的检测方法。
[原理]
菌落总数 根据稀释平板技术法检测每mL/g检样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上,经37℃、24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。它所反映的是检样中的活菌数，细菌数越多，说明污染程度越大，这项指标可作为判定待测样品被污染的程度。
大肠菌群数 是在100mL(g)食品中（或1000 mL水中）大肠菌群最近似值。它是指肠杆菌科中的４个属，即埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。这一菌群致病力不强，具有共同特点：好氧和兼性厌氧、革兰氏染色阴性反应、无芽孢杆菌、37℃培养24-48h能发酵乳糖产酸产气。大肠菌群在人畜肠道内含量最多，可随排泄物进入水源或污染食品。国际公认以大肠菌群的存在作为粪便污染指标。这项指标可判定待测样品有无被粪便污染及污染的程度。 [实验材料]
1.检样 牛乳、饮料、酱油
2.培养基 普通营养琼脂平板、单料乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、EMB平板 3.仪器和其他物品 恒温箱、水浴锅、无菌培养皿、无菌吸管、无菌盐水瓶（内装225 mL无菌生理盐水）、无菌试管（内装9 mL无菌生理盐水）、灭菌剪刀、镊子等 [实验内容]
1. 细菌菌落总数的测定 (1).制备样品及样品稀释
取待测样品（牛乳、酱油）一瓶，用点燃的酒精棉球烧灼瓶口，若是塑料瓶则用75%的酒精棉球擦拭灭菌。在无菌条件下取样25 mL放入内装225 mL生理盐水的瓶中，充分混匀，制
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成10的稀释液。用1 mL无菌吸管吸取10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入装有9mL无菌生
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理盐水的试管中（注意，吸管尖端不要触及管内稀释液），振荡试管，混合均匀，制成10
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的稀释液。另取1mL无菌吸管，按上述操作方法做成10稀释液。每次稀释，换用一支无
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菌吸管，共做10、10、10三个稀释度，分别含样品0.1mL，0.01mL，0.001mL。 (2).培养
将上面已做好的样品稀释液充分振荡，然后分别吸取该稀释度的稀释液1 mL至标有相应稀释度的无菌培养皿中，每个稀释度做2个培养皿。将融化并冷却至55℃左右的营养琼脂注入培养皿中，立即轻轻旋转培养皿，使检样与培养基混匀。待凝固后，臵37℃温箱培养48±2h。
(3).菌落计数
记录各平板上的菌落数后，按下表所述方法进行计数并报告。
a.先计算同一稀释度的平均菌落数.若其中一个平板有大片状菌苔生长则不应采用,用另一菌落平板作为该稀释度的平均菌落数.若片状菌苔大小不到平板的一半,其余一半菌落分布均匀时,可将此一半的菌落数乘2,然后再计算稀释度的平均菌落数。
b. 计数时应选择菌落数在30-300之间的平板。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘以稀释倍数即为该样的细菌总数。
c. 若有2个稀释度的平均菌落数都在30-300之间，则按两者菌落总数的比值来决定。若比值小于2，应取两者的平均数；若大于2，则取其较小的菌落数。
d.若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数。
e.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数。 f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近300或30 的平均菌落数乘以稀释倍数。
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按前同样方法将待检样品取样，将样品制成10的稀释液后，根据对待测样品的污染程度估计，用多管发酵法选择3个稀释度，按下列步骤测定。 (1). 初步发酵试验
将已稀释好的待检样品1mL接种于单料乳糖胆盐发酵培养基管内;接种量在1mL以上者,可用双料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，臵37℃培养24h ,如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸、产气，则可报告大肠菌群为阴性；如有产酸、产气者则按下列程序进行。 (2). 分离培养
将产酸、产气的发酵管进行平板分离。分别用接种环取发酵液，用划线接种法，接种于伊红美兰培养基上，于37℃培养18-24h。将出现的大肠菌群可疑菌落进行涂片，用革兰氏染色后镜检。 (3).复发酵试验
挑取经镜检为革兰氏阴性，无芽孢的短杆菌的菌落1-2个，分别接种于含有乳糖发酵培养基管内并摇匀，于37℃培养18-24h。如产酸、产气，即确证为大肠菌群阳性。
查大肠菌群最可能数（MPN）检索表。根据发酵试验的阳性管数，得出每100mL（g）食品中存在的大肠菌群最可能数。