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婴幼儿破骨细胞功能状况的研究
摘要
目的:探讨婴幼儿时期破骨细胞功能状态及其变化规律,并了解各项指标及其与年龄、身长、体重和体块指数之间的关系,为体液(包括血清和尿)分子标志物水平测定,评估婴幼儿生长发育过程奠定基础。
方法:选择2003年8月~10月问,健康查体过程的68例婴幼儿作为研究对象,按照月龄把其分为婴儿组和幼儿组,其中婴儿组31例(男17例,女14例),幼儿组37例(男20例,女17例)。均为无明显代谢性骨病、骨折及肝、肾疾病,近期无糖皮质激素和大量维生素D应用史的婴幼儿。每例儿童留取标本前记录月龄,测量体重、身长,计算体块指数。检测指标为血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate.resistantacidphosphatase,TRAP5b);}II尿脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline,DPD)。血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)由破骨细胞合成和分泌,为反映破骨细胞活性的特异性酶。脱氧吡啶啉(DPD)为纤维胶原在细胞外成熟过程的产物,测定血或尿中的DPD含量可特异性的反映骨吸收的情况。为去除尿浓缩稀释对尿DPD的影响,其中尿脱氧吡啶啉水平通过尿肌酐(creatinine,Cr)校正,以尿脱氧吡啶啉和尿肌酐比值表示,即DPD/Cr。血清TRAP5b测定采用固相免疫固定酶活性测定法(solid
enzymeaphaseimmunofixedctivityassay)。尿DPD测定采用竞争性酶免疫测定法(competitiveenzymeimmunoassay),尿Cr测定采用苦味
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酸法。所得结果用SSPSl0.0统计软件进行统计学处理,各项指标以均数士标准差表示,两两比较用独立样本T检验,各项指标之间相关性用Person相关分析。
结果:共68例健康婴幼儿进入本项研究。婴儿组31例,其中男17例,女14例;幼儿组37例,其中男20例,女17例。婴儿组:月龄x±SD为男7.7±2.6、女7.6±2.5;身长x±SD为男67.2±5.9、女66.7±5.8;体重x±SD为男8.5±1.8、女7.7±1.3;体块指数x±SD男18.8±3.6、女17t4±2.0。婴儿组内男、女两组比较月龄、身长、体重、体块指数均无显著性差异(p>0,05)。幼儿组:月龄X±SD为男19,5±5.7、女21.7±7.0;身长x±SD男80.2±8.4、女83.7±8.0;体重X±SD为男11.2±1.8、女11.2±1.8;体块指数x±SD男17.6±3.3、女16.1±1.6。幼儿组内男、女两组比较月龄、身长、体重、体块指数亦无显著性差异(p>0.05)。血清TRAP5b:婴儿组(5.18±2.12U/L)和幼儿组(3.95±1.33U/L)之间差异有非常显著性(5.18士2.12u/LVS3.95士1.33U/L,p<0.01)。婴儿组男女之间血清TRAP5b水平无显著性差异(4.88士2.17U/LVS5.54士2.06U/L,p>0.05);幼儿组男女之间
VS血清TRAP5b水平无显著性差异(3.81土1.40U/L
4.11士1.27U/L,p>0.05)。婴儿组和幼儿组尿DPD/Cr无显著性差异(44.62士26.00VS35.15土19.35,p>o.05)。婴儿组男女
VS之间尿DPD/Cr无显著性差异(51.91士26.6035.78士23.15,
p>0.05)。幼儿组男女之间尿DPD/Cr无显著性差异(39.95土22.5lVS29.49士13.36,p>0.05)。血清TRAP5b与婴幼儿体重为负相关关系(r=一O.29,p<0.05)。血清TRAP5b与婴幼儿身长为负相关关系(F—O.24,p<0.05)。血清
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TRAP5b与婴幼儿月龄相关系数r=0.22,p>0.05。血清TRAP5b与婴幼儿体块指数相关系数r=一O.035,p>0.05。尿DPD/Cr与月龄为负相关关系(F一0,27,p<0.05)。尿DPD/Cr与体重为负相关关系(F—O.3l,p<0.01)。尿DPD/Cr与身长为负相关关系(F~0.34,p<0.01)。尿DPD/Cr与婴幼儿体块指数相关系数r=0.14,p>0.05。TRAP5b与DPD/Cr两者间为难相关关系(r=0.26,p<0.05)。
结论:1.婴幼儿阶段年龄愈小破骨细胞功能愈活跃,同年龄组不同性另U之间其破骨细胞活性无明显差异。2.同样作为反映破骨细胞功能的指标抗酒石酸酸性磷酸酶5b要敏感于脱氧吡啶啉。3.破骨细胞分子标志物可作为将来小儿生长发育准确评价的指标。
关键词:破骨细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶,脱氧吡啶啉体重,身长,体块指数,婴儿,幼儿
—_——————————————————————————————————————————————————————————————一——
TheFunctionofOsteoclastinInfants
andToddlers英文摘要
ABSTRACT
Objective:Inordertoinvestigatetheosteoclast’Sfunctionlevelsininfantsandtoddlersandtherelationshipbetweentheosteoclastfunctionandsex,age,boaylength,bodyweightandbodymassindexandtoassessinfantsandtoddles’growthstatusbydeterminingthebiochemicalmarkerswhichwerecollectedformhealthychildren’Sbodyliquid(serumandurine).
Methods:We
range
Auguststudied68hadinchildren(37aboysand31girls.age1~36mh、whoand
asmedicalexaminationbetweenfurtherclassifiedtheseOctober2003.Wechildren
toddlersinfantsgroup(31infants,mail:t7;female:14)andtogroup(37toddlers,male:20;female:17)accordingtheirage.Allofthechildrenwereingoodhealthandtheyhadn’treceivedVitaminDandcorticosteroidsandwith
bonedisease,fracture,andliverornometabolicrenaldisease.Justbeforethesampleswerecollected,thechildren’Sbodyweight,bodylengthweremeasuredandthebodymassindexwerecalculated.Wemeasuredtwobiochemical
acidmarkers--serumurinetartrate—resistantphosphatase5b(TRAP5b)and
andsecreteddeoxypyridinoline(DPD).Theserumsynthesizedtartrate—resistantacidphosphatase5bwerebyosteoclastsandmayreflect
osteoclasts’sfunctionlevels.TRAP5bweredeterminedbysolid
荚文摘要
phaseimmunofixedenzymeactivityassay.Thedeoxypyridinoline(DPD)wereformedextracellularlyafterthe
andreflectthematrixintomoleculesofcollagendeposition
itslevelinbonethedeterminingresorptionbyspecifically
serumorurine.Theurinedeoxypyridinoline(DPD)were
todeterminedbycompetitiveenzymeimmunoassay。Inorder
eliminateurineDPDchangeswithamountofurine,urineDPDlevelwaspresentedbycorrectedDPD(DPD/Cr)and
Windowsurinecreatinine(Or)weredataweredeterminedbycarbazoticacidmethod.The10.0statisticanalyzedwithSSPSfor
software.Themean
thedifferenceandstandarddifferencewerecalculatedandbetweengroupswereanalyzedbyindependent-sampleTtest.Thecorrelationshipwasanalyzedbypearsonmethod.
Results:Thirtyoneinfants(male:17;female:14)and37toddlers(male:20;female:l71wereinvolvedinthisstudy.Infantsgroup:ageX4-SDmale7.74-2.6、female7.6士2.5:bodylengthX+SDmale67.24-5.9、female66.7士5.8:bodyweighX4-SDmale8.54-1.8、female7.74-1.3:boaymassindexX+SDmale18.84-3.6、female17.44-2.0.Thedifferenceofage,bodyweight,bodylength,andbodymassindexwasnotsingnificantp>O.05)betweenmaleandfemaleininfants.Toddlersgroup:ageX:t:SDmalel9.5士5.7、female21.7士7.0:
bodylengthX土SDmale80.24-8.4、female83.74-8.O:boayweighX4-SDmale11.24-1.8、female11.24-1.8:bodymassindexX4-SDmale17.64-3.3、female16.14-1.6.Thedifferenceofage.boay
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weight,bodylength,andbodymassindexwasalsonot
toddlers.Theandfemaleinmalesingnificant仞>O.05)between
differenceofserumTRAP5bconcentrationbetweeninfants(5.18±2.12U/L)andtoddlers(3.95±1.33U/L)wassignificant
differenceatthelevelofp<O.0t.andtherewasdifferentsexnosignificantbetweenininfants(male:4.88±2.17U/L;female:5.54±2.06U/L)andintoddlersgroup(male:3.81±1.40U/L;female:4.11±1.27U/L).ThedifferenceofurineDPD/Crbetweeninfants(44.62±26.00)and
femaleintoddlersgroup(35.15±19.35),maleandinfants(male:51.91
±26.60;female:35.78±23.15)andtoddlersgroup(male:39.95±22.51;female:29.49±13.36)wasnotsignificantp>0.05).TheserumTRAP5bhadanegativecorrelationwithbodyweight
P<O.05level.(严一O.29)and
andbodymass
unnebodylength(F—O.24)atthehadnotaTheserumTRAP5bsignificantcorrelationwithageindex(产O.22,p>0.05;F—O.035,p>0.05).TheaDPD/Crhadnegativecorrelationwithagefr=~0.27,
lengthp<0.05),boay、veight(F~O.31,p<O.01)andbodyfF—
O.34,p<O.01).TheurineDPD/Crhadnotsignificantcorrelationwithbodymassindex(F0.14,p>0.0s).ThecorrelationbetweenserumTRAP5bandurineDPD/Crwaspositive(r=0.26,p<0.05).
Conclusions:1、The
infantslevelsofosteoclast’Sfunctioninandtoddlersdecreasedgraduallywithmegrowthinboayweightandbodylenthwhiletherewas
sexnosignificantdifferencebetweendifferentininfantsgroupandintoddlers6
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group.2、Toreflectosteoclast’S
acidfunctionlevelsinisbonemoreresorption,tartrate—resistant
sensitivethanthatofphosphatase5bdeoxypyridinoline.3、Osteoclast’Smoleculemarkerswillbethepromisingmarkersforevaluationinfantsandtoddles’growthstatus.
Keywords:osteoclast;tartrate—resistantacid
deoxypyridinoline;infant;toddler;bodyweight;boaybodymassindexphosphatase;length;
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婴幼儿破骨细胞功能状况的研究
前言
体重、身长以及由此计算所得的体块指数等是评估婴幼儿生长发育是否正常的传统指标。通过对婴幼儿这些物理性参数的测量,对照生长发育曲线,可对婴幼儿生长发育做出基本评价。由于是宏观指标,它们往往难以准确反映婴幼儿生长发育中某一系统的实际状况。如何科学准确的评价和检测婴幼儿生长发育过程,是摆在从事发育儿科学工作者面前的新课题。婴幼儿的生长以骨骼生长为中心环节,因此对其骨骼生长代谢过程的研究,可能为体液(包括血清和尿)分子标志物水平评估婴幼儿生长发育奠定基础。
目前从对抗人口老化,防止骨质疏松的角度出发,对中老年人破骨细胞功能状态已有了较为深入的研究,并广泛应用于代谢性骨病的研究和治疗效果的监测【l。2。3]。而国内外对处于不断生长发育之中婴幼儿破骨细胞的功能状态及其与生长发育指标关系的研究不多。由于近年检测指标方法学的快速发展,为我们研究婴幼儿破骨细胞功能创造了条件。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)有两种同工异构酶,即TRAP5a和TRAP5b,其中TRAP5b由破骨细胞合成和分泌,为反映破骨细胞活性的特异性酶附]。脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline,DPD)为羟基吡啶交连物的衍生物之一,为纤维胶原在细胞外成熟过程的产物,测定血或尿中的DPD含量可特异性的反映骨吸收的情况[们。二者结合可反映破骨细胞的功能状态。本研究旨在通过测定正常婴幼儿体液中反
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映破骨细胞功能状况的分子标志物即血清TRAP5b和尿DPD的水平,了解婴幼儿破骨细胞的功能状态,并探讨二者之间及其各自与性别、年龄、身长、体重、体块指数之间的关系。
材料与方法
1研究对象
选择2003年8月~10月问健康查体的68例婴幼儿作为研究对象,年龄范围在I~36个月。按照月龄把其分为婴儿组和幼儿组,其中婴儿组(1~12月)31例(男17例,女14例),幼儿组(13~36月)37例(男20例,女17例)。均为无佝偻病、骨折、恶性肿瘤及肝、肾疾病,近期未用糖皮质激素、生长激素及治疗剂量的维生索D。
2标本采集方法
2.1血清:采集晨起空腹静脉血2砌,不抗凝。室温下放置2~4小时使其充分凝血以析出血清。然后以3000转/分离心15分钟分离血清。将分离的血清置一70℃冰箱保存待测。2.2尿液:静脉取血同日留取上午10点前尿液10ml,置一70℃低温冰箱保存待测。
3测定方法
3.1身长、体重、体块指数
采血前记录性别、月龄,然后分别测量身长、体重。测量方法见王慕逖主编《儿科学》第4版(pll~12)。计算体块指数,计算公式为:体块指数=体重/身长(cm)2x104。3.2血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)
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3.2.1试剂和仪器:试剂盒为芬兰Suomen
AnthosLabtecBioanalytikkaOY(SBA)公司的BoneTRAP测定试剂盒,仪器为奥地利2010全自动酶标仪。
3.2.2测定原理:采用固相免疫固定酶活性测定法(solidphaseimmunofixedenzymeactivityassay)。其原理是:BoneTRAP采用由人破骨细胞纯化而得的TRAP5b作为抗原制备的高度特异性单克隆抗体。测定时,在抗鼠IgG包被的微量滴定孔中孵育单克隆抗体,冲洗后加入标准液、质控液和待测血
5a灭活,但TRAP5b具有高度活
性的pH值下,加入显色性底物,结合的TRAP5b即与底物反应而显色。色泽的深度与标本中TRAP5b的活性成正比,清孵育。然后在使TRAP冈此可通过微量滴定板读数器测定TRAP5b的活性。3.2.3测定步骤
3.2-3.1将待测标本置室温下复温、溶化。
3.2-3.2将试剂盒置室温下复温,然后按照说明书要求准备试剂。
3.2.3_3将所需数量的微量滴定板置入框架内。
3.2.3.4每--钡,lJ试孔内滴入1001al抗TRAP抗体溶液。
3.2-3.5将微量滴定板置室温下孵育60分钟,同时以950rpm振荡微量滴定板。
3.2.3.6以3009l稀释的冲洗缓冲液洗涤微量滴定板4次。3.2.3.7向相应的测试孔分别加入1009l标准液、质控液和待测标本,向空白孔加入100H1生理盐水。
3,2.3.8向每--N试孔加入509l释放剂溶液。
3.2.3.9将测试板在室温下孵育60分钟。3.2.3.10以3009l稀释的冲洗缓冲液洗涤微量滴定板4次。
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3.2_3.11每孔加入1009l新配制的底物溶液。
32.3.12以试剂盒附带的封存条封闭微量滴定板,置37。C孵育60分钟。
3.2-3.13每--N试孔加入25山终止液,并用力振动使其混合均匀。
3.2.3.14在405nm下读取空白对照、标准液、质控液和待测标本孔的吸收值。按说明书提供的方法即可得出标本的TRAP浓度。
3.3尿脱氧吡啶啉(DPD)
3.3.1试剂和仪器:试剂盒为美国QUIDEL公司的MeSaDPD脱氧吡啶啉测定盒。仪器为奥地利Anthos
动酶标仪。
3.3.2测定原理:采用竞争性酶免疫测定法(competitiveenzymeirnmunoassay)。其原理是:以抗DPD单克隆抗体包Labtec2010全自被酶标板,加入样本和DPD.碱性磷酸酶结合物后,二者与抗DPD单克隆抗体竞争性结合,然后加入底物对硝基苯酚磷酸盐(p-nitrophenolphosphate,pNPP),碱性磷酸酶与pNPP反应使之显色。读取波长450nm下光密度值(opticaldensity,OD),即可计算出标本中DPD含量。
3.3.3测定步骤
3.3_3.1将待测标本置室温下复温,溶化。
3.3.3.2将试剂盒取出,按说明书要求将待测标本、标准液和质控液用测定缓冲液按1:10稀释。
3‘3.3.3每--N定孔分别加入50I.ti稀释后的标准液、质控液和待测标本。此步骤在30分钟内完成。3_3.3.4每--N定孔加入100m冷DPD.碱性磷酸酶结合物溶
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液。
333.5在暗室中以2~8。C孵育2小时。
3.3.3.6用1X洗涤缓冲液洗涤酶标板3次,此过程在2分钟内完成。
3.3.3.7每一测定孔加入1509l室温工作底物溶液。
3.3.3.8置室温下孵育60分钟。
3.3.3.9每一测定孔加入100I_tl终止溶液,并在450nm下读取光密度值。
3.3.3.10按说明书提供方法计算出尿DPD含量。
3.4尿肌酐(creatinine,Cr)
3.4.1试剂和仪器:采用保定长城临床试剂有限公司的血清肌酐测定试剂盒。
3.4.2测定原理:苦味酸不除蛋白法。其原理是:肌酐与碱性苦味酸反应,生成橙红色苦味酸肌酐复合物,然后在波长500nm下比色测定,即可得出样本的肌酐浓度。
3.4.3测定步骤
3.4.3.1将待测标本置室温下复温、溶化。
3.4.3.2取试管3支,作好标记,分别为u、B和s。
3.4.3.3向u管中加入待测标本0.2ml,B管中加入蒸馏水0.2ml,S管中加入标准液0.2ml。
3.4.3.4向3管中分别加入A液、B液各2ml,轻摇使其混合均匀。
3.4.3.5置37。C保温15分钟。
3.4.3.6以B管调零,用500nm、lcm杯及时比色。
3.4.3.7按说明书提供的公式计算肌酐含量。肌酐含量(gmol/L)=垒×132.6
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3.5尿脱氧吡啶啉/肌酐比值(DPD/Cr)
用测得的尿脱氧吡啶啉浓度除以尿肌酐浓度,即得尿脱氧吡啶啉与肌酐的比值(尿DPD/Cr)。
4统计学分析
采用SPSSl0.0统计软件进行统计学分析。所测结果分别分组计算均值(X)和标准差(SD),两两比较用独立样本T检验,相关分析用Pearson相关分析,以p≤0.05为差异有显著性,口≤0.0l为差异有非常显著性。
结
1一般结果果
共68例健康婴幼儿进入本项研究。婴儿组31例,其中男17例,女14例;幼儿组37例,其中男20例,女17例。婴儿组:月龄x±SD为男7.7±2.6、女7.6±2.5;身长x±SD为男67.2±5.9、女66.7±5.8;体重x±SD为男8.5±1.8、女7.7±1.3;体块指数x±SD男18.8±3.6、女17.4±2.0。婴儿组内男、女两组比较月龄、身长、体重、体块指数均无显著性差异(p>0.05)。幼儿组:月龄x±SD为男19.5±5.7、女21.7±7.0;身长x±SD男80.2±8.4、女83.7±8.0;体重x±SD为男11.2±1.8、女11.2±1.8;体块指数X-L-_SD男17.6±3.3、女16.1±1.6。幼儿组内男、女两组比较月龄、身长、体重、体块指数亦无显著性差异(p>0.05)。各组月龄、身长、体重和体块指数见表一l。
2血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)和尿脱氧吡啶啉/肌酐比值(DPD/Crl
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血清TRAP5b:婴儿组(5.18±2.12U/L)和幼儿组(3.95±1.33U/L)之间差异有非常显著性(5.18i2.12U/LVS3.95+1.33U/L,p<0.01)。婴儿组男女之间血清TRAP5b水平无显著性差异(4.88:t:2.17U/LVS5.54+2.06U/L,p>0.05);幼儿组男女之间血清TRAP5b水平无显著性差异(3.81士1.40U/LVS4.11士1.27U/L,p>0.05)。
尿DPD/Cr:婴儿组和幼儿组尿DPD/Cr无显著性差异(44.62+26.00VS35.15土19.35,p>0.05)。婴儿组男女之间尿
VSDPD/Cr无显著性差异(51.91+26.6035.78i23.15,p>0.05)。
VS幼儿组男女之间尿DPD/Cr无显著性差异(39.95+22.5l
29.49+13.36,p>0.05)。各组血清TRAP5b、尿DPD/Cr水平及比较:见表一2、表一3及图I~4。
3血清TRAP、尿DPD/Cr两者之间及其各自与月龄、体重、身长、体块指数之间的直线相关分析
血清TRAP5b与婴幼儿体重为负相关关系(F—O.29,p<0.05)。血清TRAP5b与婴幼儿身长为负相关关系(r=一0.24,p<0.05)。血清TRAP5b与婴幼儿月龄相关系数r=0.22,p>0.05。血清TRAP5b与婴幼儿体块指数相关系数F--0.035,p>0.05。
尿DPD/Cr与月龄为负相关关系(F一0.27,p<0.05)。尿DPD/Cr与体重为负相关关系(r=一0.31,p<0.01)。尿DPD/Cr与身长为负相关关系(F一0.34,p<0.叭)。尿DPD/Cr与婴幼儿体块指数相关系数r=0.14.p>0.05。
TRAP5b与DPD/Cr两者间为正相关关系(r=0。26,p<0.05)。
血清TRAP5b、尿DPD/Cr与月龄、体重、身长、体块指i4
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数之间的相关系数(r)见表一4、图5~10。
讨论
每一组织、器官或系统都有反映自身功能状况的标志物,如对血清有关酶学分析可以了解肝脏功能,对血清或尿液分析可以评估肾脏代谢功能等。对于骨组织,过去人们所关注的是骨胳与附着于它上面的骨骼肌,赋予人体的基本外形并在神经的支配下执行机体的运动功能,没有把骨骼当作一个真正的“活”器官对待,忽视了骨骼本身的代谢功能。伴随分子生物学和方法学的不断进步,人们对骨骼系统的认识越来越深入。对于婴幼儿其身长的改变最为显著,可谓日新月异。身长的增长以骨骼发育为基础。从骨代谢角度看,骨骼发育包括骨合成和骨分解两个方面。骨合成以成骨细胞为基础,骨分解通过破骨细胞介导。骨代谢过程十分活跃。因此了解婴幼儿骨代谢功能指标对评估婴幼儿生长发育可能具有重要理论价值和临床指导意义。本研究立足于骨代谢中的骨分解方面,以介导骨分解的成分细胞.破骨细胞为关注焦点。骨组织中维持骨代谢动态平衡的主要有三类细胞:目口促进骨形成(boneformation)的成骨细胞(osteoblast);镶嵌在骨基质(bonematrix)中的骨细胞(osteocyte);和促进骨吸收(boneresorption)的破骨细胞(osteoclast)。常用以反映破骨细胞活性的有:骨涎蛋白(bonesialoprotein,BSP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant
(hydroxyproline,acidphosphatase,TRAP)、羟脯氨酸OHP)、半乳糖羟赖氨酸(Galactosyhydroxylysine,GHLY)、羟基毗啶交连物及其相关衍
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生物(hydroxypyridiniumcross—linksandrelatedderivatives)。我
acid们以其中的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate—resistant
Dhosphatase.TRAP)矛I羟基吡啶交连物的衍生物脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline,DPD)作为研究观察指标。抗酒石酸酸
5a和TRAP
5b,它们之间的主要区别在于碳水化合物的含量。TRACP5a件磷酸酶(TRAP)有两种同工异构酶,BpTRAP
和TRACP5b的最适PH值是不同的,分别为5.2和5.8[41。在TRAP5b具有高度活性的pH值下检测血清标本,而在IkLPH卜TRACP5a是无活性的。TRAP5b由破骨细胞合成和分泌,为反映破骨细胞活性的特异性酶[4,5,9,10,11,12]。脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline,DPD)为羟基吡啶交连物的衍生物之~,为纤维胶原在细胞外成熟过程的产物,DPD只存在于骨与牙质的1型胶原中,因牙质在整体骨骼所占份额极小,故可认为DPD主要来源于骨骼。在骨胶原中DPD构成全部交联的2l%[61。当赖氨酰氧化酶作用于成熟的胶原时,PYD和DPD即成为降解产物释放到血液循环中,不经肝脏进一步降解而直接排泄到尿中。测定血或尿中的DPD含量可特异性的反映骨吸收的情况[6,7,8,13,14】。二者结合可反映破骨细胞的功能状态。
我们对婴儿和幼儿这两个年龄段的小儿破骨细胞功能标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b和脱氧吡啶啉进行了检测。我们发现,婴儿和幼儿的血清TRAP5b水平有非常显著性差异,婴儿血清TRAP5b水平明显高于幼儿。虽然婴儿尿脱氧吡啶啉(肌酐校正后)均数水平高于幼儿,但脱氧吡啶啉却未得出统计学上的差别。这些结果提示,婴儿和幼儿这两个年龄段的小儿其破骨细胞功能状况存在阶段性差别,年龄愈小,破骨细胞功能愈活跃,这与d,JL实际体格生长发育过程
研究论文
是一致的,年龄愈小生长愈快,而生长以骨代谢为基础,作为骨代谢一个方面的骨分解过程,也必然相匹配的活跃,于是破骨细胞的分子标志物水平必将升高。同时我们还观察到,婴儿和幼儿的血清TRAP5b水平与尿DPD之f=-j存在正相关关系。因此可以认为,同样作为反映破骨细胞功能的指标,二者存在内在联系,但在反映破骨细胞功能程度上二者又存在差别,抗酒石酸酸性磷酸酶5b要敏感于脱氧吡啶啉。国内外尚未发现对婴幼儿阶段破骨细胞功能状况的研究报告。有采用尿羟脯氨酸分析骨分解的报道,但由于羟脯氨酸来源广泛、特异性差,受饮食影响明显,而婴幼儿又无法通过严格控制蛋白质摄入,而排除外源性羟脯氨酸的干扰,因此羟脯氨酸作为反映骨分解代谢的指标特异性很差。另外无论是婴儿阶段还是幼儿阶段,小儿破骨细胞功能标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b和脱氧吡啶啉两种指标都没有性别差异。这与青春发育阶段性别对骨代谢巨大的影响作用形成明显对比。
骨骼的生长发育包括骨骼的延长、塑形及重塑,是一个极其复杂的过程,在这一过程中,骨骼不断的进行骨形成(boneformation)和骨吸收(boneresorption),二者处于动态平衡口邝】。破骨细胞引起的骨吸收贯穿于整个生命的过程。随着近年来对骨和胶原代谢的研究进展,尤其是骨代谢特异性标志物的研究,使我们对成人代谢性骨病有了进一步的认识,这些骨代谢特异性标志物正逐渐地应用于儿科领域。应用这些生化标志物研究成骨细胞和破骨细胞的功能。由于儿童骨骼处于不断的、非匀速的生长发育之中,其破骨细胞功能和骨代谢特异性标志物有不同于成人的特点。目前对儿童
研究论文
破骨细胞功能及其特异性标志物特点的认识尚不完整,且缺乏对不同年龄儿童的系统研究。我们对破骨细胞功能标志物.抗酒石酸酸性磷酸酶5b和脱氧吡啶啉与体格生长发育指标如体重、身长、体块指数进行了相关分析。其中,血清TRAP5b与体重、身长呈现负相关关系。DPD与月龄、体重、身长呈负相关关系。SEHCHIFUJIMOTO等检测了192个年龄为3~14岁健康儿童的尿DPD,3~5岁组小儿尿DPD水平明显高于成年人。因此认为,小儿骨吸收较成人明显活跃【1”。这些都提示抗酒石酸酸性磷酸酶和脱氧吡啶啉作为破骨细胞功能标志物与体格生长指标关系密切。将来是否可以将抗酒石酸酸性磷酸酶5b和脱氧吡啶啉等指标用于,,AJi,生长发育评价,尚需我们今后进一步研究。
另外,已有的研究显示:骨吸收标志物测定是监测早期佝偻病[18,191及激素治疗副作用[15,16刎的较好指标。本研究通过对健康婴幼儿二种骨吸收特异性标志物的测定,了解了婴幼儿破骨细胞的功能状态的变化,也了解了婴幼儿时期骨吸收及破骨细胞功能状态的特点,为进一步研究婴幼儿时期代谢性骨病时破骨细胞功能和骨形成的变化提供了基础。
结论
l婴幼儿阶段年龄愈小破骨细胞功能愈活跃,同年龄组不同性别之间其破骨细胞活性无明显差异。
2同样作为反映破骨细胞功能的指标抗酒石酸酸性磷酸酶
要敏感于脱氧毗啶啉。
3破骨细胞分子标志物可作为将来小儿生长发育准确评价18
研究论文的指标。
研究论文
附表
Table1.Theageinmonth,bodylength,bodyweight,andbody
massindexineachgroup(x±SD)
吗77±19.5±
57672±5.9802±8.485I8
77
13±1I2士1月l88±3.6I76±3,316I±162.6业76±217土7.0667±837±5880±III82±17.4±2025
注:各项指标婴儿及幼儿纲内男、女两组比较均为P>0.05。Table2.TheserumconcentrationsofTRAP5bandurineconcentrationsOfDPD/Crininfantsandtoddlersgroup坜?i蕴一一——丽j五五;1
注:※P‘O.01。3515±1935
Table3.ComparisonofserumTRAP5bandurineDPD/Crconcentrationsbetweenmaleandfemaleininfantsandtoddlers
group
注:☆P>0.05。
Table4.ThecorrelationindexbetweenserumTRAP5bandurineDPD/Crconcentrationsandwithageinmonths,bodyweight,
bodylength,andbodymassindexforeachofthem.
中文摘要
婴幼儿破骨细胞功能状况的研究
摘要
目的:探讨婴幼儿时期破骨细胞功能状态及其变化规律,并了解各项指标及其与年龄、身长、体重和体块指数之间的关系,为体液(包括血清和尿)分子标志物水平测定,评估婴幼儿生长发育过程奠定基础。
方法:选择2003年8月~10月问,健康查体过程的68例婴幼儿作为研究对象,按照月龄把其分为婴儿组和幼儿组,其中婴儿组31例(男17例,女14例),幼儿组37例(男20例,女17例)。均为无明显代谢性骨病、骨折及肝、肾疾病,近期无糖皮质激素和大量维生素D应用史的婴幼儿。每例儿童留取标本前记录月龄,测量体重、身长,计算体块指数。检测指标为血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate.resistantacidphosphatase,TRAP5b);}II尿脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline,DPD)。血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)由破骨细胞合成和分泌,为反映破骨细胞活性的特异性酶。脱氧吡啶啉(DPD)为纤维胶原在细胞外成熟过程的产物,测定血或尿中的DPD含量可特异性的反映骨吸收的情况。为去除尿浓缩稀释对尿DPD的影响,其中尿脱氧吡啶啉水平通过尿肌酐(creatinine,Cr)校正,以尿脱氧吡啶啉和尿肌酐比值表示,即DPD/Cr。血清TRAP5b测定采用固相免疫固定酶活性测定法(solid
enzymeaphaseimmunofixedctivityassay)。尿DPD测定采用竞争性酶免疫测定法(competitiveenzymeimmunoassay),尿Cr测定采用苦味
中文摘要
酸法。所得结果用SSPSl0.0统计软件进行统计学处理,各项指标以均数士标准差表示,两两比较用独立样本T检验,各项指标之间相关性用Person相关分析。
结果:共68例健康婴幼儿进入本项研究。婴儿组31例,其中男17例,女14例;幼儿组37例,其中男20例,女17例。婴儿组:月龄x±SD为男7.7±2.6、女7.6±2.5;身长x±SD为男67.2±5.9、女66.7±5.8;体重x±SD为男8.5±1.8、女7.7±1.3;体块指数x±SD男18.8±3.6、女17t4±2.0。婴儿组内男、女两组比较月龄、身长、体重、体块指数均无显著性差异(p>0,05)。幼儿组:月龄X±SD为男19,5±5.7、女21.7±7.0;身长x±SD男80.2±8.4、女83.7±8.0;体重X±SD为男11.2±1.8、女11.2±1.8;体块指数x±SD男17.6±3.3、女16.1±1.6。幼儿组内男、女两组比较月龄、身长、体重、体块指数亦无显著性差异(p>0.05)。血清TRAP5b:婴儿组(5.18±2.12U/L)和幼儿组(3.95±1.33U/L)之间差异有非常显著性(5.18士2.12u/LVS3.95士1.33U/L,p<0.01)。婴儿组男女之间血清TRAP5b水平无显著性差异(4.88士2.17U/LVS5.54士2.06U/L,p>0.05);幼儿组男女之间
VS血清TRAP5b水平无显著性差异(3.81土1.40U/L
4.11士1.27U/L,p>0.05)。婴儿组和幼儿组尿DPD/Cr无显著性差异(44.62士26.00VS35.15土19.35,p>o.05)。婴儿组男女
VS之间尿DPD/Cr无显著性差异(51.91士26.6035.78士23.15,
p>0.05)。幼儿组男女之间尿DPD/Cr无显著性差异(39.95土22.5lVS29.49士13.36,p>0.05)。血清TRAP5b与婴幼儿体重为负相关关系(r=一O.29,p<0.05)。血清TRAP5b与婴幼儿身长为负相关关系(F—O.24,p<0.05)。血清
中文摘要
TRAP5b与婴幼儿月龄相关系数r=0.22,p>0.05。血清TRAP5b与婴幼儿体块指数相关系数r=一O.035,p>0.05。尿DPD/Cr与月龄为负相关关系(F一0,27,p<0.05)。尿DPD/Cr与体重为负相关关系(F—O.3l,p<0.01)。尿DPD/Cr与身长为负相关关系(F~0.34,p<0.01)。尿DPD/Cr与婴幼儿体块指数相关系数r=0.14,p>0.05。TRAP5b与DPD/Cr两者间为难相关关系(r=0.26,p<0.05)。
结论:1.婴幼儿阶段年龄愈小破骨细胞功能愈活跃,同年龄组不同性另U之间其破骨细胞活性无明显差异。2.同样作为反映破骨细胞功能的指标抗酒石酸酸性磷酸酶5b要敏感于脱氧吡啶啉。3.破骨细胞分子标志物可作为将来小儿生长发育准确评价的指标。
关键词:破骨细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶,脱氧吡啶啉体重,身长,体块指数,婴儿,幼儿
—_——————————————————————————————————————————————————————————————一——
TheFunctionofOsteoclastinInfants
andToddlers英文摘要
ABSTRACT
Objective:Inordertoinvestigatetheosteoclast’Sfunctionlevelsininfantsandtoddlersandtherelationshipbetweentheosteoclastfunctionandsex,age,boaylength,bodyweightandbodymassindexandtoassessinfantsandtoddles’growthstatusbydeterminingthebiochemicalmarkerswhichwerecollectedformhealthychildren’Sbodyliquid(serumandurine).
Methods:We
range
Auguststudied68hadinchildren(37aboysand31girls.age1~36mh、whoand
asmedicalexaminationbetweenfurtherclassifiedtheseOctober2003.Wechildren
toddlersinfantsgroup(31infants,mail:t7;female:14)andtogroup(37toddlers,male:20;female:17)accordingtheirage.Allofthechildrenwereingoodhealthandtheyhadn’treceivedVitaminDandcorticosteroidsandwith
bonedisease,fracture,andliverornometabolicrenaldisease.Justbeforethesampleswerecollected,thechildren’Sbodyweight,bodylengthweremeasuredandthebodymassindexwerecalculated.Wemeasuredtwobiochemical
acidmarkers--serumurinetartrate—resistantphosphatase5b(TRAP5b)and
andsecreteddeoxypyridinoline(DPD).Theserumsynthesizedtartrate—resistantacidphosphatase5bwerebyosteoclastsandmayreflect
osteoclasts’sfunctionlevels.TRAP5bweredeterminedbysolid
荚文摘要
phaseimmunofixedenzymeactivityassay.Thedeoxypyridinoline(DPD)wereformedextracellularlyafterthe
andreflectthematrixintomoleculesofcollagendeposition
itslevelinbonethedeterminingresorptionbyspecifically
serumorurine.Theurinedeoxypyridinoline(DPD)were
todeterminedbycompetitiveenzymeimmunoassay。Inorder
eliminateurineDPDchangeswithamountofurine,urineDPDlevelwaspresentedbycorrectedDPD(DPD/Cr)and
Windowsurinecreatinine(Or)weredataweredeterminedbycarbazoticacidmethod.The10.0statisticanalyzedwithSSPSfor
software.Themean
thedifferenceandstandarddifferencewerecalculatedandbetweengroupswereanalyzedbyindependent-sampleTtest.Thecorrelationshipwasanalyzedbypearsonmethod.
Results:Thirtyoneinfants(male:17;female:14)and37toddlers(male:20;female:l71wereinvolvedinthisstudy.Infantsgroup:ageX4-SDmale7.74-2.6、female7.6士2.5:bodylengthX+SDmale67.24-5.9、female66.7士5.8:bodyweighX4-SDmale8.54-1.8、female7.74-1.3:boaymassindexX+SDmale18.84-3.6、female17.44-2.0.Thedifferenceofage,bodyweight,bodylength,andbodymassindexwasnotsingnificantp>O.05)betweenmaleandfemaleininfants.Toddlersgroup:ageX:t:SDmalel9.5士5.7、female21.7士7.0:
bodylengthX土SDmale80.24-8.4、female83.74-8.O:boayweighX4-SDmale11.24-1.8、female11.24-1.8:bodymassindexX4-SDmale17.64-3.3、female16.14-1.6.Thedifferenceofage.boay
英文摘要
weight,bodylength,andbodymassindexwasalsonot
toddlers.Theandfemaleinmalesingnificant仞>O.05)between
differenceofserumTRAP5bconcentrationbetweeninfants(5.18±2.12U/L)andtoddlers(3.95±1.33U/L)wassignificant
differenceatthelevelofp<O.0t.andtherewasdifferentsexnosignificantbetweenininfants(male:4.88±2.17U/L;female:5.54±2.06U/L)andintoddlersgroup(male:3.81±1.40U/L;female:4.11±1.27U/L).ThedifferenceofurineDPD/Crbetweeninfants(44.62±26.00)and
femaleintoddlersgroup(35.15±19.35),maleandinfants(male:51.91
±26.60;female:35.78±23.15)andtoddlersgroup(male:39.95±22.51;female:29.49±13.36)wasnotsignificantp>0.05).TheserumTRAP5bhadanegativecorrelationwithbodyweight
P<O.05level.(严一O.29)and
andbodymass
unnebodylength(F—O.24)atthehadnotaTheserumTRAP5bsignificantcorrelationwithageindex(产O.22,p>0.05;F—O.035,p>0.05).TheaDPD/Crhadnegativecorrelationwithagefr=~0.27,
lengthp<0.05),boay、veight(F~O.31,p<O.01)andbodyfF—
O.34,p<O.01).TheurineDPD/Crhadnotsignificantcorrelationwithbodymassindex(F0.14,p>0.0s).ThecorrelationbetweenserumTRAP5bandurineDPD/Crwaspositive(r=0.26,p<0.05).
Conclusions:1、The
infantslevelsofosteoclast’Sfunctioninandtoddlersdecreasedgraduallywithmegrowthinboayweightandbodylenthwhiletherewas
sexnosignificantdifferencebetweendifferentininfantsgroupandintoddlers6
英文摘要
group.2、Toreflectosteoclast’S
acidfunctionlevelsinisbonemoreresorption,tartrate—resistant
sensitivethanthatofphosphatase5bdeoxypyridinoline.3、Osteoclast’Smoleculemarkerswillbethepromisingmarkersforevaluationinfantsandtoddles’growthstatus.
Keywords:osteoclast;tartrate—resistantacid
deoxypyridinoline;infant;toddler;bodyweight;boaybodymassindexphosphatase;length;
研究论文
婴幼儿破骨细胞功能状况的研究
前言
体重、身长以及由此计算所得的体块指数等是评估婴幼儿生长发育是否正常的传统指标。通过对婴幼儿这些物理性参数的测量,对照生长发育曲线,可对婴幼儿生长发育做出基本评价。由于是宏观指标,它们往往难以准确反映婴幼儿生长发育中某一系统的实际状况。如何科学准确的评价和检测婴幼儿生长发育过程,是摆在从事发育儿科学工作者面前的新课题。婴幼儿的生长以骨骼生长为中心环节,因此对其骨骼生长代谢过程的研究,可能为体液(包括血清和尿)分子标志物水平评估婴幼儿生长发育奠定基础。
目前从对抗人口老化,防止骨质疏松的角度出发,对中老年人破骨细胞功能状态已有了较为深入的研究,并广泛应用于代谢性骨病的研究和治疗效果的监测【l。2。3]。而国内外对处于不断生长发育之中婴幼儿破骨细胞的功能状态及其与生长发育指标关系的研究不多。由于近年检测指标方法学的快速发展,为我们研究婴幼儿破骨细胞功能创造了条件。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)有两种同工异构酶,即TRAP5a和TRAP5b,其中TRAP5b由破骨细胞合成和分泌,为反映破骨细胞活性的特异性酶附]。脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline,DPD)为羟基吡啶交连物的衍生物之一,为纤维胶原在细胞外成熟过程的产物,测定血或尿中的DPD含量可特异性的反映骨吸收的情况[们。二者结合可反映破骨细胞的功能状态。本研究旨在通过测定正常婴幼儿体液中反
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映破骨细胞功能状况的分子标志物即血清TRAP5b和尿DPD的水平,了解婴幼儿破骨细胞的功能状态,并探讨二者之间及其各自与性别、年龄、身长、体重、体块指数之间的关系。
材料与方法
1研究对象
选择2003年8月~10月问健康查体的68例婴幼儿作为研究对象,年龄范围在I~36个月。按照月龄把其分为婴儿组和幼儿组,其中婴儿组(1~12月)31例(男17例,女14例),幼儿组(13~36月)37例(男20例,女17例)。均为无佝偻病、骨折、恶性肿瘤及肝、肾疾病,近期未用糖皮质激素、生长激素及治疗剂量的维生索D。
2标本采集方法
2.1血清:采集晨起空腹静脉血2砌,不抗凝。室温下放置2~4小时使其充分凝血以析出血清。然后以3000转/分离心15分钟分离血清。将分离的血清置一70℃冰箱保存待测。2.2尿液:静脉取血同日留取上午10点前尿液10ml,置一70℃低温冰箱保存待测。
3测定方法
3.1身长、体重、体块指数
采血前记录性别、月龄,然后分别测量身长、体重。测量方法见王慕逖主编《儿科学》第4版(pll~12)。计算体块指数,计算公式为:体块指数=体重/身长(cm)2x104。3.2血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)
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3.2.1试剂和仪器:试剂盒为芬兰Suomen
AnthosLabtecBioanalytikkaOY(SBA)公司的BoneTRAP测定试剂盒,仪器为奥地利2010全自动酶标仪。
3.2.2测定原理:采用固相免疫固定酶活性测定法(solidphaseimmunofixedenzymeactivityassay)。其原理是:BoneTRAP采用由人破骨细胞纯化而得的TRAP5b作为抗原制备的高度特异性单克隆抗体。测定时,在抗鼠IgG包被的微量滴定孔中孵育单克隆抗体,冲洗后加入标准液、质控液和待测血
5a灭活,但TRAP5b具有高度活
性的pH值下,加入显色性底物,结合的TRAP5b即与底物反应而显色。色泽的深度与标本中TRAP5b的活性成正比,清孵育。然后在使TRAP冈此可通过微量滴定板读数器测定TRAP5b的活性。3.2.3测定步骤
3.2-3.1将待测标本置室温下复温、溶化。
3.2-3.2将试剂盒置室温下复温,然后按照说明书要求准备试剂。
3.2.3_3将所需数量的微量滴定板置入框架内。
3.2.3.4每--钡,lJ试孔内滴入1001al抗TRAP抗体溶液。
3.2-3.5将微量滴定板置室温下孵育60分钟,同时以950rpm振荡微量滴定板。
3.2.3.6以3009l稀释的冲洗缓冲液洗涤微量滴定板4次。3.2.3.7向相应的测试孔分别加入1009l标准液、质控液和待测标本,向空白孔加入100H1生理盐水。
3,2.3.8向每--N试孔加入509l释放剂溶液。
3.2.3.9将测试板在室温下孵育60分钟。3.2.3.10以3009l稀释的冲洗缓冲液洗涤微量滴定板4次。
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3.2_3.11每孔加入1009l新配制的底物溶液。
32.3.12以试剂盒附带的封存条封闭微量滴定板,置37。C孵育60分钟。
3.2-3.13每--N试孔加入25山终止液,并用力振动使其混合均匀。
3.2.3.14在405nm下读取空白对照、标准液、质控液和待测标本孔的吸收值。按说明书提供的方法即可得出标本的TRAP浓度。
3.3尿脱氧吡啶啉(DPD)
3.3.1试剂和仪器:试剂盒为美国QUIDEL公司的MeSaDPD脱氧吡啶啉测定盒。仪器为奥地利Anthos
动酶标仪。
3.3.2测定原理:采用竞争性酶免疫测定法(competitiveenzymeirnmunoassay)。其原理是:以抗DPD单克隆抗体包Labtec2010全自被酶标板,加入样本和DPD.碱性磷酸酶结合物后,二者与抗DPD单克隆抗体竞争性结合,然后加入底物对硝基苯酚磷酸盐(p-nitrophenolphosphate,pNPP),碱性磷酸酶与pNPP反应使之显色。读取波长450nm下光密度值(opticaldensity,OD),即可计算出标本中DPD含量。
3.3.3测定步骤
3.3_3.1将待测标本置室温下复温,溶化。
3.3.3.2将试剂盒取出,按说明书要求将待测标本、标准液和质控液用测定缓冲液按1:10稀释。
3‘3.3.3每--N定孔分别加入50I.ti稀释后的标准液、质控液和待测标本。此步骤在30分钟内完成。3_3.3.4每--N定孔加入100m冷DPD.碱性磷酸酶结合物溶
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液。
333.5在暗室中以2~8。C孵育2小时。
3.3.3.6用1X洗涤缓冲液洗涤酶标板3次,此过程在2分钟内完成。
3.3.3.7每一测定孔加入1509l室温工作底物溶液。
3.3.3.8置室温下孵育60分钟。
3.3.3.9每一测定孔加入100I_tl终止溶液,并在450nm下读取光密度值。
3.3.3.10按说明书提供方法计算出尿DPD含量。
3.4尿肌酐(creatinine,Cr)
3.4.1试剂和仪器:采用保定长城临床试剂有限公司的血清肌酐测定试剂盒。
3.4.2测定原理:苦味酸不除蛋白法。其原理是:肌酐与碱性苦味酸反应,生成橙红色苦味酸肌酐复合物,然后在波长500nm下比色测定,即可得出样本的肌酐浓度。
3.4.3测定步骤
3.4.3.1将待测标本置室温下复温、溶化。
3.4.3.2取试管3支,作好标记,分别为u、B和s。
3.4.3.3向u管中加入待测标本0.2ml,B管中加入蒸馏水0.2ml,S管中加入标准液0.2ml。
3.4.3.4向3管中分别加入A液、B液各2ml,轻摇使其混合均匀。
3.4.3.5置37。C保温15分钟。
3.4.3.6以B管调零,用500nm、lcm杯及时比色。
3.4.3.7按说明书提供的公式计算肌酐含量。肌酐含量(gmol/L)=垒×132.6
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3.5尿脱氧吡啶啉/肌酐比值(DPD/Cr)
用测得的尿脱氧吡啶啉浓度除以尿肌酐浓度,即得尿脱氧吡啶啉与肌酐的比值(尿DPD/Cr)。
4统计学分析
采用SPSSl0.0统计软件进行统计学分析。所测结果分别分组计算均值(X)和标准差(SD),两两比较用独立样本T检验,相关分析用Pearson相关分析,以p≤0.05为差异有显著性,口≤0.0l为差异有非常显著性。
结
1一般结果果
共68例健康婴幼儿进入本项研究。婴儿组31例,其中男17例,女14例;幼儿组37例,其中男20例,女17例。婴儿组:月龄x±SD为男7.7±2.6、女7.6±2.5;身长x±SD为男67.2±5.9、女66.7±5.8;体重x±SD为男8.5±1.8、女7.7±1.3;体块指数x±SD男18.8±3.6、女17.4±2.0。婴儿组内男、女两组比较月龄、身长、体重、体块指数均无显著性差异(p>0.05)。幼儿组:月龄x±SD为男19.5±5.7、女21.7±7.0;身长x±SD男80.2±8.4、女83.7±8.0;体重x±SD为男11.2±1.8、女11.2±1.8;体块指数X-L-_SD男17.6±3.3、女16.1±1.6。幼儿组内男、女两组比较月龄、身长、体重、体块指数亦无显著性差异(p>0.05)。各组月龄、身长、体重和体块指数见表一l。
2血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)和尿脱氧吡啶啉/肌酐比值(DPD/Crl
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血清TRAP5b:婴儿组(5.18±2.12U/L)和幼儿组(3.95±1.33U/L)之间差异有非常显著性(5.18i2.12U/LVS3.95+1.33U/L,p<0.01)。婴儿组男女之间血清TRAP5b水平无显著性差异(4.88:t:2.17U/LVS5.54+2.06U/L,p>0.05);幼儿组男女之间血清TRAP5b水平无显著性差异(3.81士1.40U/LVS4.11士1.27U/L,p>0.05)。
尿DPD/Cr:婴儿组和幼儿组尿DPD/Cr无显著性差异(44.62+26.00VS35.15土19.35,p>0.05)。婴儿组男女之间尿
VSDPD/Cr无显著性差异(51.91+26.6035.78i23.15,p>0.05)。
VS幼儿组男女之间尿DPD/Cr无显著性差异(39.95+22.5l
29.49+13.36,p>0.05)。各组血清TRAP5b、尿DPD/Cr水平及比较:见表一2、表一3及图I~4。
3血清TRAP、尿DPD/Cr两者之间及其各自与月龄、体重、身长、体块指数之间的直线相关分析
血清TRAP5b与婴幼儿体重为负相关关系(F—O.29,p<0.05)。血清TRAP5b与婴幼儿身长为负相关关系(r=一0.24,p<0.05)。血清TRAP5b与婴幼儿月龄相关系数r=0.22,p>0.05。血清TRAP5b与婴幼儿体块指数相关系数F--0.035,p>0.05。
尿DPD/Cr与月龄为负相关关系(F一0.27,p<0.05)。尿DPD/Cr与体重为负相关关系(r=一0.31,p<0.01)。尿DPD/Cr与身长为负相关关系(F一0.34,p<0.叭)。尿DPD/Cr与婴幼儿体块指数相关系数r=0.14.p>0.05。
TRAP5b与DPD/Cr两者间为正相关关系(r=0。26,p<0.05)。
血清TRAP5b、尿DPD/Cr与月龄、体重、身长、体块指i4
研究论文
数之间的相关系数(r)见表一4、图5~10。
讨论
每一组织、器官或系统都有反映自身功能状况的标志物,如对血清有关酶学分析可以了解肝脏功能,对血清或尿液分析可以评估肾脏代谢功能等。对于骨组织,过去人们所关注的是骨胳与附着于它上面的骨骼肌,赋予人体的基本外形并在神经的支配下执行机体的运动功能,没有把骨骼当作一个真正的“活”器官对待,忽视了骨骼本身的代谢功能。伴随分子生物学和方法学的不断进步,人们对骨骼系统的认识越来越深入。对于婴幼儿其身长的改变最为显著,可谓日新月异。身长的增长以骨骼发育为基础。从骨代谢角度看,骨骼发育包括骨合成和骨分解两个方面。骨合成以成骨细胞为基础,骨分解通过破骨细胞介导。骨代谢过程十分活跃。因此了解婴幼儿骨代谢功能指标对评估婴幼儿生长发育可能具有重要理论价值和临床指导意义。本研究立足于骨代谢中的骨分解方面,以介导骨分解的成分细胞.破骨细胞为关注焦点。骨组织中维持骨代谢动态平衡的主要有三类细胞:目口促进骨形成(boneformation)的成骨细胞(osteoblast);镶嵌在骨基质(bonematrix)中的骨细胞(osteocyte);和促进骨吸收(boneresorption)的破骨细胞(osteoclast)。常用以反映破骨细胞活性的有:骨涎蛋白(bonesialoprotein,BSP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant
(hydroxyproline,acidphosphatase,TRAP)、羟脯氨酸OHP)、半乳糖羟赖氨酸(Galactosyhydroxylysine,GHLY)、羟基毗啶交连物及其相关衍
研究论文
生物(hydroxypyridiniumcross—linksandrelatedderivatives)。我
acid们以其中的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate—resistant
Dhosphatase.TRAP)矛I羟基吡啶交连物的衍生物脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline,DPD)作为研究观察指标。抗酒石酸酸
5a和TRAP
5b,它们之间的主要区别在于碳水化合物的含量。TRACP5a件磷酸酶(TRAP)有两种同工异构酶,BpTRAP
和TRACP5b的最适PH值是不同的,分别为5.2和5.8[41。在TRAP5b具有高度活性的pH值下检测血清标本,而在IkLPH卜TRACP5a是无活性的。TRAP5b由破骨细胞合成和分泌,为反映破骨细胞活性的特异性酶[4,5,9,10,11,12]。脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline,DPD)为羟基吡啶交连物的衍生物之~,为纤维胶原在细胞外成熟过程的产物,DPD只存在于骨与牙质的1型胶原中,因牙质在整体骨骼所占份额极小,故可认为DPD主要来源于骨骼。在骨胶原中DPD构成全部交联的2l%[61。当赖氨酰氧化酶作用于成熟的胶原时,PYD和DPD即成为降解产物释放到血液循环中,不经肝脏进一步降解而直接排泄到尿中。测定血或尿中的DPD含量可特异性的反映骨吸收的情况[6,7,8,13,14】。二者结合可反映破骨细胞的功能状态。
我们对婴儿和幼儿这两个年龄段的小儿破骨细胞功能标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b和脱氧吡啶啉进行了检测。我们发现,婴儿和幼儿的血清TRAP5b水平有非常显著性差异,婴儿血清TRAP5b水平明显高于幼儿。虽然婴儿尿脱氧吡啶啉(肌酐校正后)均数水平高于幼儿,但脱氧吡啶啉却未得出统计学上的差别。这些结果提示,婴儿和幼儿这两个年龄段的小儿其破骨细胞功能状况存在阶段性差别,年龄愈小,破骨细胞功能愈活跃,这与d,JL实际体格生长发育过程
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是一致的,年龄愈小生长愈快,而生长以骨代谢为基础,作为骨代谢一个方面的骨分解过程,也必然相匹配的活跃,于是破骨细胞的分子标志物水平必将升高。同时我们还观察到,婴儿和幼儿的血清TRAP5b水平与尿DPD之f=-j存在正相关关系。因此可以认为,同样作为反映破骨细胞功能的指标,二者存在内在联系,但在反映破骨细胞功能程度上二者又存在差别,抗酒石酸酸性磷酸酶5b要敏感于脱氧吡啶啉。国内外尚未发现对婴幼儿阶段破骨细胞功能状况的研究报告。有采用尿羟脯氨酸分析骨分解的报道,但由于羟脯氨酸来源广泛、特异性差,受饮食影响明显,而婴幼儿又无法通过严格控制蛋白质摄入,而排除外源性羟脯氨酸的干扰,因此羟脯氨酸作为反映骨分解代谢的指标特异性很差。另外无论是婴儿阶段还是幼儿阶段,小儿破骨细胞功能标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b和脱氧吡啶啉两种指标都没有性别差异。这与青春发育阶段性别对骨代谢巨大的影响作用形成明显对比。
骨骼的生长发育包括骨骼的延长、塑形及重塑,是一个极其复杂的过程,在这一过程中,骨骼不断的进行骨形成(boneformation)和骨吸收(boneresorption),二者处于动态平衡口邝】。破骨细胞引起的骨吸收贯穿于整个生命的过程。随着近年来对骨和胶原代谢的研究进展,尤其是骨代谢特异性标志物的研究,使我们对成人代谢性骨病有了进一步的认识,这些骨代谢特异性标志物正逐渐地应用于儿科领域。应用这些生化标志物研究成骨细胞和破骨细胞的功能。由于儿童骨骼处于不断的、非匀速的生长发育之中,其破骨细胞功能和骨代谢特异性标志物有不同于成人的特点。目前对儿童
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破骨细胞功能及其特异性标志物特点的认识尚不完整,且缺乏对不同年龄儿童的系统研究。我们对破骨细胞功能标志物.抗酒石酸酸性磷酸酶5b和脱氧吡啶啉与体格生长发育指标如体重、身长、体块指数进行了相关分析。其中,血清TRAP5b与体重、身长呈现负相关关系。DPD与月龄、体重、身长呈负相关关系。SEHCHIFUJIMOTO等检测了192个年龄为3~14岁健康儿童的尿DPD,3~5岁组小儿尿DPD水平明显高于成年人。因此认为,小儿骨吸收较成人明显活跃【1”。这些都提示抗酒石酸酸性磷酸酶和脱氧吡啶啉作为破骨细胞功能标志物与体格生长指标关系密切。将来是否可以将抗酒石酸酸性磷酸酶5b和脱氧吡啶啉等指标用于,,AJi,生长发育评价,尚需我们今后进一步研究。
另外,已有的研究显示:骨吸收标志物测定是监测早期佝偻病[18,191及激素治疗副作用[15,16刎的较好指标。本研究通过对健康婴幼儿二种骨吸收特异性标志物的测定,了解了婴幼儿破骨细胞的功能状态的变化,也了解了婴幼儿时期骨吸收及破骨细胞功能状态的特点,为进一步研究婴幼儿时期代谢性骨病时破骨细胞功能和骨形成的变化提供了基础。
结论
l婴幼儿阶段年龄愈小破骨细胞功能愈活跃,同年龄组不同性别之间其破骨细胞活性无明显差异。
2同样作为反映破骨细胞功能的指标抗酒石酸酸性磷酸酶
要敏感于脱氧毗啶啉。
3破骨细胞分子标志物可作为将来小儿生长发育准确评价18
研究论文的指标。
研究论文
附表
Table1.Theageinmonth,bodylength,bodyweight,andbody
massindexineachgroup(x±SD)
吗77±19.5±
57672±5.9802±8.485I8
77
13±1I2士1月l88±3.6I76±3,316I±162.6业76±217土7.0667±837±5880±III82±17.4±2025
注:各项指标婴儿及幼儿纲内男、女两组比较均为P>0.05。Table2.TheserumconcentrationsofTRAP5bandurineconcentrationsOfDPD/Crininfantsandtoddlersgroup坜?i蕴一一——丽j五五;1
注:※P‘O.01。3515±1935
Table3.ComparisonofserumTRAP5bandurineDPD/Crconcentrationsbetweenmaleandfemaleininfantsandtoddlers
group
注:☆P>0.05。
Table4.ThecorrelationindexbetweenserumTRAP5bandurineDPD/Crconcentrationsandwithageinmonths,bodyweight,
bodylength,andbodymassindexforeachofthem.