QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit
Catalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。
在开始之前作如下准备
1）按照说明把RNase A 加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P1
2）pre-chill Buffer P3 4°C存放。
3）检查Buffer P2 是否有SDS 沉淀物，可以放到37℃短暂温热 以便溶解分子沉淀物。
4）准备异丙醇。
5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml 的96-100%的酒精。
大量质粒提取过程
在LB 培养基中种植转化的E.coli 菌。使用100ml （高复制数的质粒）或者250ml （低复制数的质粒）过夜培养。
操作步骤如下
1. 收获LB 培养过夜的细菌，在6000g ，4℃条件下离心15min 。
2. 加入10ml Buffer P1（根据SBI 要求加倍，用20ml ）重悬细菌。
3. 加10ml Buffer P2（根据SBI 要求加倍，用20ml ），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min 。如果使用了LyseBlue 试剂，溶液应该变成均匀蓝色。
4. 在孵育期间，打开针口的密封盖. 并把过滤器放到合适的架子上。
5. 加入10ml 冰浴的Buffer P3（根据SBI 要求加倍，用20ml ）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。如果加入了LyseBlue 试剂，混匀试剂直到没有颜色。
6. 将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min ，不要插入活塞。打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml 离心管中。
7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min 。
8. 将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。
9. 将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip 柱子中让其透过树脂慢慢滴下。
10用2×30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip 柱。
11 再用15ml Buffer QN洗脱DNA ，用离心管收集DNA 洗脱液。
12 加入10.5ml 异丙醇到洗脱液中使DNA 沉淀下来，混匀。大于15000×g ，4℃离心30min ，离心后小心倒出上清液。
13 洗DNA 用5ml 无内毒素-70%乙醇(添加40ml 96%-100%乙醇到试剂盒的无内毒素水中) ，15000g ，4℃离心10min 。小心倒出上清液不要碰到质粒。
14 烘干离心管底部的质粒5-10min 。用合适体积的无内毒素的Buffer TE重新溶解DNA 。 15 检测DNA 质粒的浓度并记录。
QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit
Catalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。
在开始之前作如下准备
1）按照说明把RNase A 加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P1
2）pre-chill Buffer P3 4°C存放。
3）检查Buffer P2 是否有SDS 沉淀物，可以放到37℃短暂温热 以便溶解分子沉淀物。
4）准备异丙醇。
5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml 的96-100%的酒精。
大量质粒提取过程
在LB 培养基中种植转化的E.coli 菌。使用100ml （高复制数的质粒）或者250ml （低复制数的质粒）过夜培养。
操作步骤如下
1. 收获LB 培养过夜的细菌，在6000g ，4℃条件下离心15min 。
2. 加入10ml Buffer P1（根据SBI 要求加倍，用20ml ）重悬细菌。
3. 加10ml Buffer P2（根据SBI 要求加倍，用20ml ），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min 。如果使用了LyseBlue 试剂，溶液应该变成均匀蓝色。
4. 在孵育期间，打开针口的密封盖. 并把过滤器放到合适的架子上。
5. 加入10ml 冰浴的Buffer P3（根据SBI 要求加倍，用20ml ）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。如果加入了LyseBlue 试剂，混匀试剂直到没有颜色。
6. 将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min ，不要插入活塞。打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml 离心管中。
7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min 。
8. 将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。
9. 将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip 柱子中让其透过树脂慢慢滴下。
10用2×30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip 柱。
11 再用15ml Buffer QN洗脱DNA ，用离心管收集DNA 洗脱液。
12 加入10.5ml 异丙醇到洗脱液中使DNA 沉淀下来，混匀。大于15000×g ，4℃离心30min ，离心后小心倒出上清液。
13 洗DNA 用5ml 无内毒素-70%乙醇(添加40ml 96%-100%乙醇到试剂盒的无内毒素水中) ，15000g ，4℃离心10min 。小心倒出上清液不要碰到质粒。
14 烘干离心管底部的质粒5-10min 。用合适体积的无内毒素的Buffer TE重新溶解DNA 。 15 检测DNA 质粒的浓度并记录。