口蹄疫防治技术规范
农医发［2007］12号
农业部关于印发《高致病性禽流感防治技术规范》等14个动物疫病防治技术规范的通
知
2007年4月9日
口蹄疫（Foot and Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒引起的以偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物传染病，我国规定为一类动物疫病。
为预防、控制和扑灭口蹄疫，依据《中华人民共和国动物防疫法》、《重大动物疫情应急条例》、《国家突发重大动物疫情应急预案》等法律法规，制定本技术规范。
1 适用范围
本规范规定了口蹄疫疫情确认、疫情处置、疫情监测、免疫、检疫监督的操作程序、技术标准及保障措施。
本规范适用于中华人民共和国境内一切与口蹄疫防治活动有关的单位和个人。
2 诊断
2.1 诊断指标
2.1.1 流行病学特点
2.1.1.1 偶蹄动物，包括牛科动物（牛、瘤牛、水牛、牦牛）、绵羊、山羊、猪及所有野生反刍和猪科动物均易感，驼科动物（骆驼、单峰骆驼、美洲驼、美洲骆马）易感性较低。
2.1.1.2 传染源主要为潜伏期感染及临床发病动物。感染动物呼出物、唾液、粪便、尿液、乳、精液及肉和副产品均可带毒。康复期动物可带毒。
2.1.1.3 易感动物可通过呼吸道、消化道、生殖道和伤口感染病毒，通常以直接或间接接触（飞沫等）方式传播，或通过人或犬、蝇、蜱、鸟等动物媒介，或经车辆、器具等被污染物传播。如果环境气候适宜，病毒可随风远距离传播。
2.1.2 临床症状
2.1.2.1 牛呆立流涎，猪卧地不起，羊跛行；
2.1.2.2 唇部、舌面、齿龈、鼻镜、蹄踵、蹄叉、乳房等部位出现水泡；
2.1.2.3 发病后期，水泡破溃、结痂，严重者蹄壳脱落，恢复期可见瘢痕、新生蹄甲； 2.1.2.4 传播速度快，发病率高；成年动物死亡率低，幼畜常突然死亡且死亡率高，仔猪常成窝死亡。
2.1.3 病理变化
2.1.3.1消化道可见水泡、溃疡；
2.1.3.2幼畜可见骨骼肌、心肌表面出现灰白色条纹，形色酷似虎斑。 2.1.4 病原学检测
2.1.4.1 间接夹心酶联免疫吸附试验，检测阳性（ELISA OIE 标准方法 附件一）； 2.1.4.2 RT-PCR试验，检测阳性（采用国家确认的方法）； 2.1.4.3 反向间接血凝试验（RIHA），检测阳性（附件二）； 2.1.4.4 病毒分离，鉴定阳性。 2.1.5 血清学检测
2.1.5.1中和试验，抗体阳性；
2.1.5.2液相阻断酶联免疫吸附试验，抗体阳性；
2.1.5.3非结构蛋白ELISA检测感染抗体阳性； 2.1.5.4 正向间接血凝试验（IHA），抗体阳性（附件三）。 2.2 结果判定
2.2.1 疑似口蹄疫病例
符合该病的流行病学特点和临床诊断或病理诊断指标之一，即可定为疑似口蹄疫病例。 2.2.2 确诊口蹄疫病例
疑似口蹄疫病例，病原学检测方法任何一项阳性，可判定为确诊口蹄疫病例； 疑似口蹄疫病例，在不能获得病原学检测样本的情况下，未免疫家畜血清抗体检测阳性或免疫家畜非结构蛋白抗体ELISA检测阳性，可判定为确诊口蹄疫病例。
2.3疫情报告
任何单位和个人发现家畜上述临床异常情况的，应及时向当地动物防疫监督机构报告。动物防疫监督机构应立即按照有关规定赴现场进行核实。
2.3.1 疑似疫情的报告
县级动物防疫监督机构接到报告后，立即派出2名以上具有相关资格的防疫人员到现场进行临床和病理诊断。确认为疑似口蹄疫疫情的，应在2小时内报告同级兽医行政管理部门，并逐级上报至省级动物防疫监督机构。省级动物防疫监督机构在接到报告后，1小时内向省级兽医行政管理部门和国家动物防疫监督机构报告。
诊断为疑似口蹄疫病例时，采集病料（附件四），并将病料送省级动物防疫监督机构，必要时送国家口蹄疫参考实验室。
2.3.2 确诊疫情的报告
省级动物防疫监督机构确诊为口蹄疫疫情时，应立即报告省级兽医行政管理部门和国家动物防疫监督机构；省级兽医管理部门在1小时内报省级人民政府和国务院兽医行政管理部门。
国家参考实验室确诊为口蹄疫疫情时，应立即通知疫情发生地省级动物防疫监督机构和兽医行政管理部门，同时报国家动物防疫监督机构和国务院兽医行政管理部门。
省级动物防疫监督机构诊断新血清型口蹄疫疫情时，将样本送至国家口蹄疫参考实验室。
2.4 疫情确认
国务院兽医行政管理部门根据省级动物防疫监督机构或国家口蹄疫参考实验室确诊结果，确认口蹄疫疫情。
3 疫情处置
3.1疫点、疫区、受威胁区的划分
3.1.1疫点 为发病畜所在的地点。相对独立的规模化养殖场/户，以病畜所在的养殖场/户为疫点；散养畜以病畜所在的自然村为疫点；放牧畜以病畜所在的牧场及其活动场地为疫点；病畜在运输过程中发生疫情，以运载病畜的车、船、飞机等为疫点；在市场发生疫情，以病畜所在市场为疫点；在屠宰加工过程中发生疫情，以屠宰加工厂（场）为疫点。
3.1.2 疫区 由疫点边缘向外延伸3公里内的区域。 3.1.3 受威胁区 由疫区边缘向外延伸10公里的区域。
在疫区、受威胁区划分时，应考虑所在地的饲养环境和天然屏障（河流、山脉等）。 3.2 疑似疫情的处置
对疫点实施隔离、监控，禁止家畜、畜产品及有关物品移动，并对其内、外环境实施严格的消毒措施。
必要时采取封锁、扑杀等措施。
3.3 确诊疫情处置
疫情确诊后，立即启动相应级别的应急预案。 3.3.1 封锁
疫情发生所在地县级以上兽医行政管理部门报请同级人民政府对疫区实行封锁，人民政府在接到报告后，应在24小时内发布封锁令。
跨行政区域发生疫情的，由共同上级兽医行政管理部门报请同级人民政府对疫区发布封锁令。
3.3.2 对疫点采取的措施
3.3.2.1 扑杀疫点内所有病畜及同群易感畜，并对病死畜、被扑杀畜及其产品进行无害化处理（附件五）；
3.3.2.2对排泄物、被污染饲料、垫料、污水等进行无害化处理（附件六）；
3.3.2.3对被污染或可疑污染的物品、交通工具、用具、畜舍、场地进行严格彻底消毒（附件七）；
3.3.2.4 对发病前14天售出的家畜及其产品进行追踪，并做扑杀和无害化处理。 3.3.3 对疫区采取的措施
3.3.3.1在疫区周围设置警示标志，在出入疫区的交通路口设置动物检疫消毒站，执行监督检查任务，对出入的车辆和有关物品进行消毒；
3.3.3.2 所有易感畜进行紧急强制免疫，建立完整的免疫档案；
3.3.3.3 关闭家畜产品交易市场，禁止活畜进出疫区及产品运出疫区； 3.3.3.4对交通工具、畜舍及用具、场地进行彻底消毒； 3.3.3.5对易感家畜进行疫情监测，及时掌握疫情动态;
3.3.3.6 必要时，可对疫区内所有易感动物进行扑杀和无害化处理。 3.3.4对受威胁区采取的措施
3.3.4.1 最后一次免疫超过一个月的所有易感畜，进行一次紧急强化免疫； 3.3.4.2 加强疫情监测，掌握疫情动态。 3.3.5 疫源分析与追踪调查
按照口蹄疫流行病学调查规范，对疫情进行追踪溯源、扩散风险分析（附件八）。 3.3.6解除封锁
3.3.6.1封锁解除的条件
口蹄疫疫情解除的条件：疫点内最后1头病畜死亡或扑杀后连续观察至少14天，没有新发病例；疫区、受威胁区紧急免疫接种完成；疫点经终末消毒；疫情监测阴性。
新血清型口蹄疫疫情解除的条件：疫点内最后1头病畜死亡或扑杀后连续观察至少14天没有新发病例；疫区、受威胁区紧急免疫接种完成；疫点经终末消毒；对疫区和受威胁区的易感动物进行疫情监测，结果为阴性。
3.3.6.2解除封锁的程序：动物防疫监督机构按照上述条件审验合格后，由兽医行政管理部门向原发布封锁令的人民政府申请解除封锁，由该人民政府发布解除封锁令。
必要时由上级动物防疫监督机构组织验收。
4 疫情监测
4.1 监测主体：县级以上动物防疫监督机构。
4.2 监测方法：临床观察、实验室检测及流行病学调查。 4.3 监测对象：以牛、羊、猪为主，必要时对其他动物监测。 4.4 监测的范围
4.4.1 养殖场户、散养畜，交易市场、屠宰厂（场）、异地调入的活畜及产品。
4.4.2对种畜场、边境、隔离场、近期发生疫情及疫情频发等高风险区域的家畜进行重点监测。
监测方案按照当年兽医行政管理部门工作安排执行。
4.5疫区和受威胁区解除封锁后的监测 临床监测持续一年，反刍动物病原学检测连续2次，每次间隔1个月，必要时对重点区域加大监测的强度。
4.6在监测过程中，对分离到的毒株进行生物学和分子生物学特性分析与评价，密切注意病毒的变异动态，及时向国务院兽医行政管理部门报告。
4.7 各级动物防疫监督机构对监测结果及相关信息进行风险分析，做好预警预报。 4.8监测结果处理
监测结果逐级汇总上报至国家动物防疫监督机构，按照有关规定进行处理。
5 免疫
5.1 国家对口蹄疫实行强制免疫，各级政府负责组织实施，当地动物防疫监督机构进行监督指导。免疫密度必须达到100%。
5.2 预防免疫，按农业部制定的免疫方案规定的程序进行。 5.3 突发疫情时的紧急免疫按本规范有关条款进行。
5.4 所用疫苗必须采用农业部批准使用的产品，并由动物防疫监督机构统一组织、逐级供应。
5.5 所有养殖场/户必须按科学合理的免疫程序做好免疫接种，建立完整免疫档案（包括免疫登记表、免疫证、免疫标识等）。
5.6 各级动物防疫监督机构定期对免疫畜群进行免疫水平监测，根据群体抗体水平及时加强免疫。
6 检疫监督
6.1 产地检疫
猪、牛、羊等偶蹄动物在离开饲养地之前，养殖场/户必须向当地动物防疫监督机构报检，接到报检后，动物防疫监督机构必须及时到场、到户实施检疫。检查合格后，收回动物免疫证，出具检疫合格证明；对运载工具进行消毒，出具消毒证明，对检疫不合格的按照有关规定处理。
6.2 屠宰检疫
动物防疫监督机构的检疫人员对猪、牛、羊等偶蹄动物进行验证查物，证物相符检疫合格后方可入厂（场）屠宰。宰后检疫合格，出具检疫合格证明。对检疫不合格的按照有关规定处理。
6.3 种畜、非屠宰畜异地调运检疫
国内跨省调运包括种畜、乳用畜、非屠宰畜时，应当先到调入地省级动物防疫监督机构办理检疫审批手续，经调出地按规定检疫合格，方可调运。起运前两周，进行一次口蹄疫强化免疫，到达后须隔离饲养14天以上，由动物防疫监督机构检疫检验合格后方可进场饲养。
6.4 监督管理
6.4.1动物防疫监督机构应加强流通环节的监督检查，严防疫情扩散。猪、牛、羊等偶蹄动物及产品凭检疫合格证（章）和动物标识运输、销售。
6.4.2生产、经营动物及动物产品的场所，必须符合动物防疫条件，取得动物防疫合格证，当地动物防疫监督机构应加强日常监督检查。
6.4.3 各地根据防控家畜口蹄疫的需要建立动物防疫监督检查站，对家畜及产品进行监督检查，对运输工具进行消毒。发现疫情，按照《动物防疫监督检查站口蹄疫疫情认定和
处置办法》相关规定处置。
6.4.4 由新血清型引发疫情时，加大监管力度，严禁疫区所在县及疫区周围50公里范围内的家畜及产品流动。在与新发疫情省份接壤的路口设置动物防疫监督检查站、卡实行24小时值班检查；对来自疫区运输工具进行彻底消毒，对非法运输的家畜及产品进行无害化处理。
6.4.5任何单位和个人不得随意处置及转运、屠宰、加工、经营、食用口蹄疫病（死）畜及产品；未经动物防疫监督机构允许，不得随意采样；不得在未经国家确认的实验室剖检分离、鉴定、保存病毒。
7 保障措施
7.1各级政府应加强机构、队伍建设，确保各项防治技术落实到位。
7.2各级财政和发改部门应加强基础设施建设，确保免疫、监测、诊断、扑杀、无害化处理、消毒等防治技术工作经费落实。
7.3各级兽医行政部门动物防疫监督机构应按本技术规范，加强应急物资储备，及时培训和演练应急队伍。
7.4发生口蹄疫疫情时，在封锁、采样、诊断、流行病学调查、无害化处理等过程中，要采取有效措施做好个人防护和消毒工作，防止人为扩散。
附件1：间接夹心酶联免疫吸附试验（I-ELISA）
1 试验程序和原理
1.1利用包被于固相（I，96孔平底ELISA专用微量板）的FMDV型特异性抗体（AB，包被抗体，又称为捕获抗体），捕获待检样品中相应型的FMDV抗原（Ag）。再加入与捕获抗体同一血清型，但用另一种动物制备的抗血清（Ab，检测抗体）。如果有相应型的病毒抗原存在，则形成“夹心”式结合，并被随后加入的酶结合物/显色系统（*E/S）检出。
1.2由于FMDV的多型性，和可能并发临床上难以区分的水泡性疾病，在检测病料时必然包括几个血清型（如O、A、亚洲-1型）；及临床症状相同的某些疾病，如猪水泡病（SVD）。
2 材料
2.1 样品的采集和处理 见附件四
2.2 主要试剂 2.2.1 抗体
2.2.1.1包被抗体：兔抗FMDV-“O”、“A”、“亚洲-I”型146S血清；及兔抗SVDV-160S血清。
2.2.1.2检测抗体：豚鼠抗FMDV-“O”、“A”、“亚洲-I”型146S血清；及豚鼠抗SVDV-160S血清。
2.2.2 酶结合物
兔抗豚鼠Ig抗体(Ig)-辣根过氧化物酶(HRP)结合物。
2.2.3 对照抗原 灭活的FMDV-“O”“A”“亚洲-I”各型及SVDV细胞病毒液。
2.2.4 底物溶液（底物/显色剂）
3％过氧化氢/3.3mmol/L邻苯二胺(OPD)。
2.2.5 终止液 1.25mol/L 硫酸。
2.2.6 缓冲液
2.2.6.1包被缓冲液 0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3，pH9.6。
2.2.6.2稀释液A 0.01mol/L PBS - 0.05％(v/v)Tween-20，pH7.2～7.4。 2.2.6.3稀释液B 5％脱脂奶粉（w/v）- 稀释液A 。
2.2.6.4洗涤缓冲液 0.002mol/L PBS - 0.01％(v/v)Tween-20。 2.3 主要器材设备 2.3.1 固相
96孔平底聚苯乙烯ELISA专用板。
2.3.2 移液器、尖头及贮液槽
微量可调移液器一套，可调范围0.5～5000μL(5～6支)；多（4、8、12）孔道微量可调移液器（25～250μL）；微量可调连续加样移液器（10～100μL）；与各移液器匹配的各种尖头，及配套使用的贮液槽。
2.3.3 振荡器
与96孔微量板配套的旋转振荡器。
2.3.4 酶标仪,492nm波长滤光片。 2.3.5 洗板机或洗涤瓶,吸水纸巾。 2.3.6 37℃恒温温室或温箱。 3 操作方法 3.1 预备试验
为了确保检测结果准确可靠，必须最优化组合该ELISA，即试验所涉及的各种试剂，包括包被抗体、检测抗体、酶结合物、阳性对照抗原都要预先测定，计算出它们的最适稀释度，既保证试验结果在设定的最佳数据范围内，又不浪费试剂。使用诊断试剂盒时，可按说明书指定用量和用法。如试验结果不理想，重新滴定各种试剂后再检测。
3.2 包被固相
3.2.1 FMDV各血清型及SVDV兔抗血清分别以包被缓冲液稀释至工作浓度，然后按图3-1所示布局加入微量板各行。每孔50μL。加盖后37℃振荡2h。或室温（20～25℃）振荡30min，然后置湿盒中4℃过夜（可以保存1周左右）。
3.2.2 一般情况下,牛病料鉴定“O”和“A”两个型，某些地区的病料要加上“亚洲-I”型；猪病料要加上SVDV。
图3-1：定型ELISA微量板包被血清布局 、对照和被检样品布局
则根据需要取出几条。在试验台上放置20min，再洗涤5次，扣干。
3.3 加对照抗原和待检样品 3.3.1 布局
空白和各阳性对照、待检样品在 ELISA 板上的分布位置如图3-1所示。 3.3.2 加样
3.3.2.1第5和第6列为空白对照（C-），每孔加50μL稀释液A。 3.3.2.2先将各型阳性对照抗原分别以稀释液A适当稀释，然后加入与包被抗体同型的各行孔中，C++为强阳性，C+为阳性，可以用同一对照抗原的不同稀释度。每一对照2孔，每孔50μL。
3.3.2.3按待检样品的序号（S1、S2 ...）逐个加入，每份样品每个血清型加2孔，每孔50μL。 37℃ 振荡1h，洗涤5次，扣干。
3.4 加检测抗体
各血清型豚鼠抗血清以稀释液A稀释至工作浓度，然后加入与包被抗体同型各行孔中，每孔50μL。37℃振荡1h。洗涤5次，扣干。
3.5 加酶结合物
酶结合物以稀释液B稀释至工作浓度，每孔50μL。 37℃振荡40min。洗涤5次，扣干。
3.6 加底物溶液 试验开始时，按当天需要量从冰箱暗盒中取出OPD，放在温箱中融化并使之升温至37℃。临加样前，按每6mL OPD加3％双氧水30μL（一块微量板用量），混匀后每孔加50μL。37℃振荡15min。
3.7 加终止液
显色反应15分钟，准时加终止液1.25mol/L H2SO4。50μL/孔。
3.8 观察和判读结果
终止反应后,先用肉眼观察全部反应孔。如空白对照和阳性对照孔的显色基本正常,再用酶标仪(492nm)判读OD值。
4 结果判定 4.1 数据计算
为了便于说明，假设表3-1所列数据为检测结果（OD值）。
利用表3-1所列数据,计算平均OD值和平均修正OD值（表3-2）
4.1.1各行2孔空白对照（C-）平均OD值；
4.1.2各行（各血清型）抗原对照（C++、C+）平均OD值； 4.1.3各待检样品各血清型（2孔）平均OD值；
4.1.4计算出各平均修正OD值（＝［每个(2)或(3)值］－［同一行的(1)值］。
表3-1. 定型ELISA结果(OD值)
C++ C+ C- S1 S2 S3
C++ C+ C- S1 S2 S3
4.2 结果判定 4.2.1 试验不成立
如果空白对照(C-)平均OD值＞0.10，则试验不成立，本试验结果无效。
4.2.2 试验基本成立
如果空白对照(C-)平均OD值≤0.10，则试验基本成立。
4.2.3 试验绝对成立
如果空白对照(C-)平均OD值≤0.10，C+ 平均修正OD值＞0.10，C++ 平均修正OD值＞1.00, 试验绝对成立。如表2中A、B、C、D行所列数据。
4.2.3.1如果某一待检样品某一型的平均修正OD值≤0.10，则该血清型为阴性。 如S1的“A”、“Asia-1”型和“SVDV”。
4.2.3.2如果某一待检样品某一型的平均修正OD值＞0.10，而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，则该样品为该最高平均修正OD值所在的血清型。如S1为“O”型；S3为“Asia-I”型。
4.2.3.3虽然某一待检样品某一型的平均修正OD值＞0.10，但不大于其他型的平均修正OD值的2倍，则该样品只能判定为可疑。该样品应接种乳鼠或细胞，并盲传数代增毒后再作检测。如S2“A”型。
4.2.4 试验部分成立
如果空白对照(C-)平均OD值≤0.10，C+ 平均修正OD值≤0.10，C++ 平均修正OD值≤1.00, 试验部分成立。如表2中E、F、G、H行所列数据。
4.2.4.1如果某一待检样品某一型的平均修正OD值≥0.10，而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，则该样品为该最高平均修正OD值所在的血清型。 例如S4判定为“O”型。
4.2.4.2如果某一待检样品某一型的平均修正OD值介于0.10～1.00之间,而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，该样品可以判定为该最高OD值所在血清型。例如S5判定为“A”型。
4.2.4.3如果某一待检样品某一型的平均修正OD值介于0.10～1.00之间,但不比其他型的平均修正OD值大2倍，该样品应增毒后重检。如S6“亚洲-I”型。
注意：重复试验时，首先考虑调整对照抗原的工作浓度。如调整后再次试验结果仍不合格，应更换对照抗原或其他试剂。
附件2：反向间接血凝试验（RIHA）
1 材料准备
1.1 96孔微型聚乙烯血凝滴定板（110度），微量振荡器或微型混合器，0.025 mL、0.05mL稀释用滴管、乳胶吸头或25μL、50μL移液加样器。
1.2 pH7.6、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.6、0.05mol/L PB），pH7.6、50%丙三醇磷酸缓冲液（GPB），pH7.2、0.11mol/L磷酸缓冲液（pH7.2、0.11mol/L PB），配制方法见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）《猪水泡病诊断技术》附录A（规范性附录）。
1.3 稀释液I、稀释液II，配制方法见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）《猪水泡病诊断技术》附录B（规范性附录）。
1.4 标准抗原、阳性血清，由指定单位提供，按说明书使用和保存。
1.5敏化红细胞诊断液：由指定单位提供，效价滴定见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）《猪水泡病诊断技术》附录C（规范性附录）。
1.6 被检材料处理方法见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）《猪水泡病诊断技术》附录E（规范性附录）。
2 操作方法
2.1 使用标准抗原进行口蹄疫A、O、C、Asia-I型及与猪水泡病鉴别诊断。
2.1.1被检样品的稀释：把8只试管排列于试管架上，自第1管开始由左至右用稀释液I作二倍连续稀释（即1:6、1:12、1:24„„1:768）,每管容积0.5 mL。
2.1.2按下述滴加被检样品和对照：
2.1.2.1在血凝滴定板上的第一至五排，每排的第8孔滴加第8管稀释被检样品0.05 mL，每排的第7孔滴加第7管稀释被检样品0.05 mL，以此类推至第1孔。
2.1.2.2每排的第9 孔滴加稀释液I 0.05 mL,作为稀释液对照。
2.1.2.3每排的第10孔按顺序分别滴加口蹄疫A、O、C、Asia-I型和猪水泡病标准抗原（1：30稀释）各0.05 mL，作为阳性对照。
2.1.3 滴加敏化红细胞诊断液：先将敏化红细胞诊断液摇匀，于滴定板第一至五排的第1～10孔分别滴加口蹄疫A、O、C、Asia-I型和猪水泡病敏化红细胞诊断液，每孔0.025 mL，置微量振荡器上振荡1分钟～2分钟,20℃～35℃放置1.5小时～2小时后判定结果。
2.2使用标准阳性血清进行口蹄疫O型及与猪水泡病鉴别诊断。 2.2.1每份被检样品作四排、每孔先各加入25μL稀释液II。 2.2.2每排第1孔各加被检样品25μL，然后分别由左至右作二倍连续稀释至第7孔（竖板）或第11孔（横板）。每排最后孔留作稀释液对照。
2.2.3滴加标准阳性血清：在第一、三排每孔加入25μL稀释液II；第二排每孔加入25μL稀释至1:20的口蹄疫O型标准阳性血清；第四排每孔加入25μL稀释至1:100的猪水泡病标准阳性血清；置微型混合器上振荡1分钟～2分钟，加盖置37℃作用30分钟。
2.2.4滴加敏化红细胞诊断液：在第一和第二排每孔加入口蹄疫O型敏化红细胞诊断液25μL；第三和第四排每孔加入猪水泡病敏化红细胞诊断液25μL；置微型混合器上振荡1分钟～2分钟，加盖20℃～35℃放置2小时后判定结果。
3 结果判定
3.1按以下标准判定红细胞凝集程度：“++++”—100%完全凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围；“+++”—75%凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围，但孔底中心有红细胞形成的针尖大的小点；“++”—50%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，孔底有一红细胞沉下的小点；“+”—25%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，但大部分红细胞已沉积于孔底；“－”—不凝集，红细胞完全沉积于孔底成一圆点。
3.2操作方法2.1的结果判定：稀释液I对照孔不凝集、标准抗原阳性孔凝集试验方成
立。
3.2.1若只第一排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫A型；若只第二排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫O型；以此类推。若只第五排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为猪水泡病
3.2.2致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。 3.2.3如出现2排以上孔的凝集，以某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价2个对数（以2为底）浓度以上者即可判为阳性，其余判为阴性。
3.3操作方法2.2的结果判定：稀释液II对照孔不凝集试验方可成立。 3.3.3.1若第一排出现2孔以上的凝集（++以上），且第二排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第三、四排不出现凝集判为口蹄疫O型阳性。若第三排出现2孔以上的凝集（++以上），且第四排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第一、二排不出现凝集则判为猪水泡病阳性。
3.3.3.2致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。
附件3：正向间接血凝试验（IHA）
1 原理
用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）。 抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。
2 适用范围
主要用于检测O型口蹄疫免疫动物血清抗体效价。
3 试验器材和试剂
3.1 96孔110°V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板 3.2 微量移液器（50μL 25μL）取液塑咀 3.3 微量振荡器
3.4 O型口蹄疫血凝抗原 3.5 O型口蹄疫阴性对照血清 3.6 O型口蹄疫阳性对照血清 3.7 稀释液
3.8 待检血清（每头约0.5ml血清即可）56℃水浴灭活30分钟 4 试验方法 4.1 加稀释液
在血凝板上1-6排的1-9孔；第7排的1-4孔第6-7孔；第8排的1-12孔各加稀释液50μL。
4.2 稀释待检血清
取1号待检血清50μL加入第1排第1孔，并将塑咀插入孔底，右手拇指轻压弹簧1-2次混匀（避免产生过多的气泡），从该孔取出50μL移入第2孔，混匀后取出50μL移入第3 孔„„直至第9孔混匀后取出50μL丢弃。此时第1排1-9孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：1:2⑴、1:4⑵、1:8⑶、1:16⑷、1:32⑸、1:64⑹、1:128⑺、1:256⑻、1:512⑼。
取2号待检血清加入第2排；取3号待检血清加入第3排„„均按上法稀释，注意！每取一份血清时，必须更换塑咀一个。
4.3 稀释阴性对照血清
在血凝板的第7排第1孔加阴性血清50μL，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2⑴、1:4⑵、1:8⑶、1:16⑷。第6-7孔为稀释液对照。
4.4 稀释阳性对照血清
在血凝板的第8排第1孔加阳性血清50μL，对倍数稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。此时阳性血清的稀释倍数依次为1：2-1：4096。
4.5 加血凝抗原
被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加O型血凝抗原（充分摇匀，瓶底应无血球沉淀）25μL。
4.6 振荡混匀
将血凝板置于微量振荡器上1-2分钟，如无振荡器，用手轻拍混匀亦可，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或37℃下静置1.5-2小时判定结果，也可延至翌日判定。
4.7 判定标准
移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:16孔，稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点），或仅出现“+”凝集（血球大部沉于孔底，边缘稍有少量血球悬浮）。
阳性血清对照1:2-1:256各孔应出现“++”—“+++”凝集为合格（少量血球沉入孔底，大部血球悬浮于孔内）。
在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1-5孔呈现“++”—“+++”凝集，6-7孔呈现“++”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的口蹄疫抗体效价为1:128。
接种口蹄疫疫苗的猪群免疫抗体效价达到1:128（即第7孔）牛群、羊群免疫抗体效价达到1:256（第8孔）呈现“++”凝集为免疫合格。
5 检测试剂的性状、规格 5.1 性状
5.1.1 液体血凝抗原：摇匀呈棕红色（或咖啡色），静置后，血球逐渐沉入瓶底。 5.1.2 阴性对照血清：淡黄色清亮稍带粘性的液体。 5.1.3 阳性对照血清：微红或淡色稍混浊带粘性的液体。
5.1.4 稀释液：淡黄或无色透明液体，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶，不影响使用。
5.2 包装
5.2.1 液体血凝抗原：摇匀后即可使用，5ml/瓶。 5.2.2 阴性血清：1ml/瓶，直接稀释使用。 5.2.3 阳性血清：1ml/瓶，直接稀释使用。
5.2.4 稀释液：100 ml/瓶，直接使用，4-8℃保存。 5.2.5 保存条件及保存期
5.2.5.1 液体血凝抗原：4-8℃保存（切勿冻结），保存期3个月。 5.2.5.2 阴性对照血清：-15~-20℃保存，有效期1年。 5.2.5.3 阳性对照血清：-15~-20℃保存，有效期1年。 6 注意事项
6.1 为使检测获得正确结果，请在检测前仔细阅读说明书。
6.2 严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。 6.3 勿用90°和130°血凝板，严禁使用一次性血凝板，以免误判结果。
6.4 用过的血凝板应及时在水龙头冲净血球。再用蒸馏水或去离子水冲洗2次，甩干水份放37℃恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，37℃干燥备用。血凝板应浸泡在洗液中（浓硫酸与重铬酸钾按1：1混合），48小时捞出后清水冲净。
6.5 每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照。 “-”表示完全不凝集或0-10%血球凝集。
“+”表示10-25%血球凝集 “+++”表示75%血球凝集。 “++”表示50%血球凝集 “++++”表示90-100%血球凝集。
6.6 用不同批次的血凝抗原检测同一份血清时，应事先用阳性血清准确测定各批次血凝抗原的效价，取抗原效价相同或相近的血凝抗原检测待检血清抗体水平的结果是基本一致的，如果血凝抗原效价差别很大用来检测同一血清样品，肯定会出现检测结果不一致。
6.7 收到本试剂盒时，应立即打开包装，取出血凝抗原瓶，用力摇动，使粘附在瓶盖上的红细胞摇下，否则易出现沉渣，影响使用效果。
附件4：口蹄疫病料的采集、保存与运送
采集、保存和运输样品须符合下列要求，并填写样品采集登记表。 1 样品的采集和保存 1.1 组织样品 1.1.1 样品的选择 用于病毒分离、鉴定的样品以发病动物(牛、羊或猪)未破裂的舌面或蹄部,鼻镜,乳头等部位的水泡皮和水泡液最好。对临床健康但怀疑带毒的动物可在扑杀后采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品作为检测材料。
1.1.2 样品的采集和保存
水泡样品采集部位可用清水清洗，切忌使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭。 1.1.2.1 未破裂水泡中的水泡液用灭菌注射器采集至少1毫升，装入灭菌小瓶中(可加适量抗菌素)，加盖密封；尽快冷冻保存。
1.1.2.2 剪取新鲜水泡皮3～5克放入灭菌小瓶中,加适量（2倍体积）50％甘油/磷酸盐缓冲液(pH7.4), 加盖密封；尽快冷冻保存。
1.1.2.3 在无法采集水泡皮和水泡液时，可采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品3～5克装入洁净的小瓶内, 加盖密封；尽快冷冻保存。
每份样品的包装瓶上均要贴上标签，写明采样地点、动物种类、编号、时间等。 1.2 牛、羊食道-咽部分泌物(O-P液)样品 1.2.1 样品采集
被检动物在采样前禁食(可饮水)12小时，以免反刍胃内容物严重污染O-P液。采样探杯在使用前经0.2％柠檬酸或2％氢氧化钠浸泡5分钟，再用自来水冲洗。每采完一头动物,探杯要重复进行消毒和清洗。采样时动物站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部10～15cm处，轻轻来回移动2～3次，然后将探杯拉出。如采集的O-P液被反刍胃内容物严重污染，要用生理盐水或自来水冲洗口腔后重新采样。
1.2.2 样品保存
将探杯采集到的8～10mL O-P液倒入25 mL以上的灭菌玻璃容器中, 容器中应事先加有8～10mL细胞培养液或磷酸盐缓冲液（0.04mol/L 、pH7.4），加盖密封后充分摇匀，贴上防水标签,并写明样品编号、采集地点、动物种类、时间等，尽快放入装有冰块的冷藏箱内，然后转往-60℃冰箱冻存。通过病原检测，做出追溯性诊断。
1.3 血清
怀疑曾有疫情发生的畜群，错过组织样品采集时机时，可无菌操作采集动物血液，每头不少于10mL。自然凝固后无菌分离血清装入灭菌小瓶中，可加适量抗菌素，加盖密封后冷藏保存。每瓶贴标签并写明样品编号，采集地点，动物种类，时间等。通过抗体检测，做出追溯性诊断。
1.4 采集样品时要填写样品采集登记表 2 样品运送
运送前将封装和贴上标签，已预冷或冰冻的样品玻璃容器装入金属套筒中，套筒应填充防震材料，加盖密封，与采样记录一同装入专用运输容器中。专用运输容器应隔热坚固，内装适当冷冻剂和防震材料。外包装上要加贴生物安全警示标志。以最快方式，运送到检测单位。为了能及时准确地告知检测结果，请写明送样单位名称和联系人姓名、联系地址、邮编、电话、传真等。
送检材料必须附有详细说明，包括采样时间、地点、动物种类、样品名称、数量、保存方式及有关疫病发生流行情况、临床症状等。
附件5：口蹄疫扑杀技术规范
1 扑杀范围：病畜及规定扑杀的易感动物。 2 使用无出血方法扑杀：电击、药物注射。 3 将动物尸体用密闭车运往处理场地予以销毁。 4 扑杀工作人员防护技术要求 4.1 穿戴合适的防护衣服
4.1.1 穿防护服或穿长袖手术衣加防水围裙。 4.1.2 戴可消毒的橡胶手套。
4.1.3 戴N95口罩或标准手术用口罩。 4.1.4 戴护目镜。
4.1.5 穿可消毒的胶靴，或者一次性的鞋套。 4.2 洗手和消毒
4.2.1 密切接触感染牲畜的人员,用无腐蚀性消毒液浸泡手后，在用肥皂清洗2次以上。
4.2.2 牲畜扑杀和运送人员在操作完毕后，要用消毒水洗手，有条件的地方要洗澡。 4.3 防护服、手套、口罩、护目镜、胶鞋、鞋套等使用后在指定地点消毒或销毁。
附件6：口蹄疫无害化处理技术规范
所有病死牲畜、被扑杀牲畜及其产品、排泄物以及被污染或可能被污染的垫料、饲料和其他物品应当进行无害化处理。无害化处理可以选择深埋、焚烧等方法，饲料、粪便也可以堆积发酵或焚烧处理。
1 深埋
1.1 选址：掩埋地应选择远离学校、公共场所、居民住宅区、动物饲养和屠宰场所、村庄、饮用水源地、河流等。避免公共视线。
1.2 深度：坑的深度应保证动物尸体、产品、饲料、污染物等被掩埋物的上层距地表1.5米以上。坑的位置和类型应有利于防洪。
1.3 焚烧：掩埋前，要对需掩埋的动物尸体、产品、饲料、污染物等实施焚烧处理。 1.4 消毒：掩埋坑底铺2CM厚生石灰；焚烧后的动物尸体、产品、饲料、污染物等表面，以及掩埋后的地表环境应使用有效消毒药品喷洒消毒。
1.5 填土：用土掩埋后，应与周围持平。填土不要太实，以免尸腐产气造成气泡冒出和液体渗漏。
1.6 掩埋后应设立明显标记。 2 焚化
疫区附近有大型焚尸炉的，可采用焚化的方式。 3 发酵
饲料、粪便可在指定地点堆积，密封发酵，表面应进行消毒。
以上处理应符合环保要求，所涉及到的运输、装卸等环节要避免洒漏，运输装卸工具要彻底消毒后清洗。
附件7：口蹄疫疫点、疫区清洗消毒技术规范
1 成立清洗消毒队
清洗消毒队应至少配备一名专业技术人员负责技术指导。 2 设备和必需品
2.1 清洗工具：扫帚、叉子、铲子、锹和冲洗用水管。
2.2 消毒工具：喷雾器、火焰喷射枪、消毒车辆、消毒容器等。 2.3 消毒剂：醛类、氧化剂类、氯制剂类等合适的消毒剂。 2.4 防护装备：防护服、口罩、胶靴、手套、护目镜等。 3 疫点内饲养圈舍清理、清洗和消毒 3.1 对圈舍内外消毒后再行清理和清洗。 3.2 首先清理污物、粪便、饲料等。
3.3 对地面和各种用具等彻底冲洗，并用水洗刷圈舍、车辆等，对所产生的污水进行无害化处理。
3.4 对金属设施设备，可采取火焰、熏蒸等方式消毒。
3.5 对饲养圈舍、场地、车辆等采用消毒液喷洒的方式消毒。 3.6 饲养圈舍的饲料、垫料等作深埋、发酵或焚烧处理。 3.7 粪便等污物作深埋、堆积密封或焚烧处理。 4 交通工具清洗消毒
4.1 出入疫点、疫区的交通要道设立临时性消毒点，对出入人员、运输工具及有关物品进行消毒。
4.2 疫区内所有可能被污染的运载工具应严格消毒，车辆内、外及所有角落和缝隙都要用消毒剂消毒后再用清水冲洗，不留死角。
4.3 车辆上的物品也要做好消毒。
4.4 从车辆上清理下来的垃圾和粪便要作无害化处理。 5 牲畜市场消毒清洗
5.1 用消毒剂喷洒所有区域。
5.2 饲料和粪便等要深埋、发酵或焚烧。 6 屠宰加工、储藏等场所的清洗消毒 6.1 所有牲畜及其产品都要深埋或焚烧。
6.2 圈舍、过道和舍外区域用消毒剂喷洒消毒后清洗。
6.3 所有设备、桌子、冰箱、地板、墙壁等用消毒剂喷洒消毒后冲洗干净。 6.4 所有衣服用消毒剂浸泡后清洗干净，其他物品都要用适当的方式进行消毒。 6.5 以上所产生的污水要经过处理,达到环保排放标准。
7 疫点每天消毒1次连续1周,1周后每两天消毒1次.疫区内疫点以外的区域每两天
消毒1次。
附件8：口蹄疫流行病学调查规范
1 范围
本规范规定了暴发疫情时和平时开展的口蹄疫流行病学调查工作。 本规范适用于口蹄疫暴发后的跟踪调查和平时现况调查的技术要求。 2 引用文件
下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单位（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，根据本规范达成协议的各方研究可以使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
NY×××× \ \ 口蹄疫疫样品采集、保存和运输技术规范 NY×××× \ \ 口蹄疫人员防护技术规范
NY×××× \ \ 口蹄疫疫情判定与扑灭技术规范 3 术语与定义
NY×××× 的定义适用于本规范。
3.1 跟踪调查 Tracing investigation 当一个畜群单位暴发口蹄疫时，兽医技术人员或动物流行病学专家在接到怀疑发生口蹄疫的报告后通过亲自现场察看、现场采访，追溯最原始的发病患畜 、查明疫点的疫病传播扩散情况以及采取扑灭措施后跟踪被消灭疫病的情况。
3.2 现况调查 cross-sectional survey
现况调查是一项在全国范围内有组织的关于口蹄疫流行病学资料和数据的收集整理工作，调查的对象包括被选择的养殖场、屠宰场或实验室，这些选择的普查单位充当着疾病监视器的作用，对口蹄疫病毒易感的一些物种（如野猪）可以作为主要动物群感染的指示物种。现况调查同时是口蹄疫防制计划的组成部分。
4 跟踪调查
4.1 目的 核实疫情并追溯最原始的发病地点和患畜 、查明疫点的疫病传播扩散情况以及采取扑灭措施后跟踪被消灭疫病的情况。
4.2 组织与要求
4.2.1 动物防疫监督机构接到养殖单位怀疑发病的报告后，立即指派2名以上兽医技术人员，在24小时以内尽快赶赴现场，采取现场亲自察看和现场采访相结合的方式对疾病暴发事件开展跟踪调查；
4.2.2 被派兽医技术人员至少3天内没有接触过口蹄疫病畜及其污染物，按《口蹄疫人员防护技术规范》做好个人防护；
4.2.3 备有必要的器械、用品和采样用的容器。 4.3 内容与方法
4.3.1 核实诊断方法及定义“患畜” 调查的目的之一是诊断患畜，因此需要归纳出发病患畜的临床症状和用恰当的临床术语定义患畜，这样可以排除其他疾病的患畜而只保留所研究的患畜，做出是否发生疑似口蹄疫的判断；
4.3.2 采集病料样品、送检与确诊 对疑似患畜，按照《口蹄疫样品采集、保存和运输技术规范》的要求送指定实验室确诊。 4.3.3实施对疫点的初步控制措施，严禁从疑似发病场/户运出家畜、家畜产品和可疑污染物品，并限制人员流动；
4.3.4 计算特定因素袭击率，确定畜间型
袭击率是衡量疾病暴发和疾病流行严重程度的指标，疾病暴发时的袭击率与日常发病率或预测发病率比较能够反映出疾病暴发的严重程度。另外，通过计算不同畜群的袭击率和不同动物种别、年龄和性别的特定因素袭击率有助于发现病因或与疾病有关的某些因素；
4.3.5 确定时间型
根据单位时间内患畜的发病频率，绘制一个或是多个流行曲线，以检验新患畜的时间分布。在制作流行曲线时，应选择有利于疾病研究的各种时间间隔（在x轴），如小时、天或周，和表示疾病发生的新患畜数或百分率（在y轴）；
4.3.6 确定空间型 为检验患畜的空间分布，调查者首先需要描绘出发病地区的地形图，和该地区内的和畜舍的位置及所出现的新患畜。然后仔细审察地形图与畜群和新患畜的分布特点，以发现患畜间的内在联系和地区特性，和动物本身因素与疾病的内在联系，如性别、品种和年龄。划图标出可疑发病畜周围20公里以内分布的有关养畜场、道路、河流、山岭、树林、人工屏障等，连同最初调查表一同报告当地动物防疫监督机构；
4.3.7 计算归因袭击率，分析传染来源
根据计算出的各种特定因素袭击率，如年龄、性别、品种、饲料、饮水等，建立起一个有关这些特定因素袭击率的分类排列表，根据最高袭击率、最低袭击率、归因袭击率（即两组动物分别接触和不接触同一因素的两个袭击率之差）以进一步分析比较各种因素与疾病的关系，追踪可能的传染来源；
4.3.8 追踪出入发病养殖场/户的有关工作人员和所有家畜、畜产品及有关物品的流动情况，并对其作适当的隔离观察和控制措施，严防疫情扩散；
4.3.9 对疫点、疫区的猪、牛、羊、野猪等重要疫源宿主进行发病情况调查，追踪病毒变异情况。
4.3.10 完成跟踪调查表（见附录A），并提交跟踪调查报告。 待全部工作完成以后，将调查结果总结归纳以调查报告的形式形成报告，并逐级上报到国家动物防疫监督机构和国家动物流行病学中心。
形成假设
根据以上资料和数据分析，调查者应该得出一个或两个以上的假设：①疾病流行类型，点流行和增殖流行；②传染源种类，同源传染和多源传染；③传播方式，接触传染，机械传染和生物性传染。调查者需要检查所形成的假设是否符合实际情况，并对假设进行修改。在假设形成的同时，调查者还应能够提出合理的建议方案以保护未感染动物和制止患畜继续出现，如改变饲料、动物隔离等；
检验假设
假设形成后要进行直观的分析和检验，必要时还要进行实验检验和统计分析。假设的形成和检验过程是循环往复的，应用这种连续的近似值方法而最终建立起确切的病因来源假设。
5 现况调查
5.1 目的 广泛收集与口蹄疫发生有关的各种资料和数据，根据医学理论得出有关口蹄疫分布、发生频率及其影响因素的合乎逻辑的正确结论。
5.2 组织与要求
5.2.1 现况调查是一项由国家兽医行政主管部门统一组织的全国范围内有关口蹄疫流行病学资料和数据的收集整理工作，需要国家兽医行政主管部门、国家动物防疫监督机构、国家动物流行病学中心、地方动物防疫监督机构多方面合作；
5.2.2 所有参与实验的人员明确普查的内容和目的，数据收集的方法应尽可能的简单，
并设法得到数据提供者的合作和保持他们的积极性；
5.2.3 被派兽医技术人员要遵照4.2.2 和4.2.3的要求。 5.3 内容
5.3.1估计疾病流行情况 调查动物群体存在或不存在疾病。患病和死亡情况分别用患病率和死亡率表示。
5.3.2 动物群体及其环境条件的调查 包括动物群体的品种、性别、年龄、营养、免疫等；环境条件、气候、地区、畜牧制度、饲养管理（饲料、饮水、畜舍）等。
5.3.3 传染源调查 包括带毒野生动物、带毒牛羊等的调查。
5.3.4 其他调查 包括其他动物或人类患病情况及媒介昆虫或中间宿主，如种类、分布、生活习性等的调查。
5.3.4 完成现况调查表（见附录B），并提交现况调查报告。 5.4 方法
5.4.1 现场观察、临床检查 5.4.2 访问调查或通信调查
5.4.3 查阅诊疗记录、疾病报告登记、诊断实验室记录、检疫记录及其他现成记录和统计资料。流行病学普查的数据都是与疾病和致病因素有关的数据以及与生产和畜群体积有关的数据。获得的已经记录的数据，可用于回顾性实验研究；收集未来的数据用于前瞻性实验研究。
一些数据属于观察资料；一些数据属于观察现象的解释；一些数据是数量性的，由各种测量方法而获得，如体重、产乳量、死亡率和发病率，这类数据通常比较准确。数据资料来源如下。
5.4.3.1 政府兽医机构 国家及各省、市、县动物防疫监督机构以及乡级的兽医站负责调查和防治全国范围内一些重要的疾病。许多政府机构还建立了诊断室开展一些常规的实验室诊断工作，保持完整的实验记录，经常报导诊断结果和疾病的流行情况。由各级政府机构编辑和出版的各种兽医刊物也是常规的资料来源。
5.4.3.2 屠宰场
大牲畜屠宰场都要进行宰前和宰后检验以发现和鉴定某些疾病。通常只有临床上健康的牲畜才供屠宰食用，因此屠宰中发现的病例一般都是亚临床症状的。
屠宰检验的第二个目的是记录所见异常现象，有助于流行性动物疾病的早期发现和人畜共患性疾病的预防和治疗。由于屠宰场的动物是来自于不同地区或不同的牧场，如果屠宰检验所发现的疾病关系到患畜的原始牧场或地区，则必须追查动物的来源。
5.4.3.3 血清库
血清样品能够提供免疫特性方面有价值的流行病学资料，如流行的周期性，传染的空间分布和新发生口蹄疫的起源。因此建立血清库有助于研究与传染病有关的许多问题：①鉴定主要的健康标准；②建立免疫接种程序；③确定疾病的分布；④调查新发生口蹄疫的传染来源；⑤确定流行的周期性；⑥增加病因学方面的知识；⑦评价免疫接种效果或程序；⑧评价疾病造成的损失。
5.4.3.4 动物注册
动物登记注册是流行病学数据的又一个来源。
根据某地区动物注册或免疫接种数量估测该地区的易感动物数，一般是趋于下线估测。 5.4.3.5 畜牧机构
许多畜牧机构记录和保存动物群体结构、分布和动物生产方面的资料，如增重、饲料转化率和产乳量等。这对某些实验研究也同样具有着流行病学方面的意义。
5.4.3.6畜牧场
大型的现代化饲养场都有自己独立的经营和管理体制；完善的资料和数据记录系统，许多数据资料具有较高的可靠性。这些资料对疾病普查是很有价值的。
5.4.3.7畜主日记
饲养人员（如猪的饲养者）经常记录生产数据和一些疾病资料。但记录者的兴趣和背景不同，所记录的数据类别和精确程度也不同。
5.4.3.8 兽医院门诊 兽医院开设兽医门诊，并建立患畜病志以描述发病情况和记录诊断结果。门诊患畜中诊断兽医感兴趣的疾病比例通常高于其他疾病。这可能是由于该兽医为某种疾病的研究专家而吸引该种疾病的患畜的原故。
5.4.3.9 其他资料来源
野生动物是家畜口蹄疫的重要传染源。野生动物保护组织和害虫防制中心记录和保存关于国家野生动物地区分布和种类数量方面的数据。这对调查实际存在的和即将发生的口蹄疫的感染和传播具有价值。
表A 口蹄疫暴发的跟踪调查表
1 可疑发病场/户基本状况与初步诊断结果 2 疫点易感畜与发病畜现场调查
2.1 最早出现发病时间: 年 月 日 时，
发病数： 头，死亡数： 头，圈舍（户）编号: 。 2.2 畜群发病情况
2.3 袭击率
计算公式:袭击率=（疫情暴发以来发病畜数÷疫情暴发开始时易感畜数）×100% 3 可能的传染来源调查
3.1 发病前15天内，发病畜舍是否新引进了畜？
场（村）隔离场，隔离场（舍）人员单独隔离
3.2 发病前15天内发病畜场/户是否有野猪、啮齿动物等出没？ （1）否 （2）是
注：※与畜接触地点包括进入场/户场内、畜栏舍四周、存料处及料槽等；
＃接触频率指野生动物与畜接触地点的接触情况，分为每天、数次、仅一次。 3.3 发病前15天内是否运入可疑的被污染物品（药品）？ （1）是 （2）否
3.4 最近30天内的是否有场外有关业务人员来场？（1）无 （2）有，请写出访问者
3.5 发病场（户）是否靠近其他养畜场及动物集散地？ （1）是 （2）否
3.5.1 与发病场的相对地理位置 。 3.5.2 与发病场的距离 。 3.5.3 其大致情况 。
3.6 发病场周围20公里以内是否有下列动物群？ 3.6.1 猪 。 3.6.2 野猪 。 3.6.3 牛群 。 3.6.4 羊群 。
3.6.5 田鼠、家鼠 。 3.6.6 其它易感动物 。
3.7 在最近25-30天内本场周围20公里有无畜群发病？（1）无 （2）有，请回答： 3.7.1 发病日期：
3.7.2 病畜数量和品种： 3.7.3 确诊/疑似诊断疾病： 3.7.4 场主姓名：
3.7.5 发病地点与本场相对位置、距离： 3.7.6 投药情况： 3.7.6 疫苗接种情况：
3.8 场内是否有职员住在其他养畜场/养畜村？（1）无 （2）有，请回答： 3.8.1该场所处的位置：
3.8.2该场养畜的数量和品种：
3.8.3该场畜的来源及去向： 3.8.4职员拜访和接触他人地点：
4 在发病前15天是否有更换饲料来源等饲养方式/管理的改变？ （1）无 （2）有， 。
5 发病场（户）周围环境情况
5.1 静止水源——沼泽、池塘或湖泊：（1）是 （2）否 5.2 流动水源——灌溉用水、运河水、河水：（1）是 （2）否 5.3 断续灌溉区——方圆三公里内无水面：（1）是 （2）否 5.4 最近发生过洪水：（1）是 （2）否 5.5 靠近公路干线：（1）是 （2）否 5.6 靠近山溪或森（树）林：（1）是 （2）否 6 该养畜场/户地势类型属于：
（1）盆地（2）山谷（3）高原（4）丘陵（5）平原（6）山区 （7）其他（请注明） 。 7 饮用水及冲洗用水情况 7.1 饮水类型：
（1）自来水 （2）浅井水 （3）深井水（4）河塘水 （5）其他 7.2 冲洗水类型：
（1）自来水 （2）浅井水 （3）深井水 （4）河塘水（5）其他 8 发病养畜场/户口蹄疫疫苗免疫情况： （1）不免疫 （2）免疫 8.1 免疫生产厂家 。 8.2 疫苗品种、批号 。 8.3 被免疫畜数量 。 9 受威胁区免疫畜群情况
9.1 免疫接种一个月内畜群发病情况： （1）未见发病（2）发病，发病率 。 9.2 血清学检测和病原学检测
10 解除封锁后30天后是否使用岗哨动物
（1）否 （2）是，简述岗哨动物名称、数量及结果 。 11 最后诊断情况
11.1 确诊口蹄疫，确诊单位 ，病毒亚型 。 11.2 排除，其他疫病名称 。 12 疫情处理情况
12.1 发病畜及其同群畜全部扑杀： （1）是 （2）否，扑杀范围： 。
12.2 疫点周围受威胁区内的所有易感畜全部接种疫苗 （1）是 （2）否
所用疫苗的病毒亚型： ，厂家： 。
13 在发病养畜场/户出现第1个病例前15天至该场被控制期间出场的（A）有关人员，（B）动物/产品/排泄废弃物，（C）运输工具/物品/饲料/原料，（D）其他(请标出) ，养畜
14 在发病养畜场/户出现第1个病例前15天至该场被控制期间，是否有家畜、车辆和人员进出家畜集散地？（1
）无 （2）有，请填写下表，追踪可能污染物，做限制或消毒处15
列举在发病养畜场/户出现第1个病例前15天至该场被控制期间出场的工作人员16 疫点或疫区家畜
16.1在发病后一个月发病情况
（1）未见发病 （2）发病，发病率 。 16.2 血清学检测和病原学检测
17.1 在发病后一个月发病情况
（1）未见发病 （2）发病，发病率 。 17.2 血清学检测和病原学检测
18 在该疫点疫病传染期内密切接触人员的发病情况 。 （1）未见发病
注：※接触方式：（1）本舍（户）饲养员（2）非本舍饲养员（3）本场兽医（4）收购与运输（5）屠宰加工（6）处理疫情的场外兽医（7）其他接触
表B 口蹄疫暴发的现况调查表
1 某调查单位（省、地区、畜场、屠宰场或实验室等）家畜及野生动物口蹄疫的流行率
2 某调查单位（省、地区、畜场、屠宰场或实验室等）家畜及野生动物口蹄疫的抗体
炭疽防治技术规范
农医发［2007］12号
农业部关于印发《高致病性禽流感防治技术规范》等14个动物疫病防治技术规范的通
知
2007年4月9日
炭疽（Anthrax）是由炭疽芽胞杆菌引起的一种人畜共患传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。
为预防和控制炭疽，依据《中华人民共和国动物防疫法》和其它相关法律法规，制定本规范。
1 适用范围
本规范规定了炭疽的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施和控制标准。 本规范适用于中华人民共和国境内一切从事动物饲养、经营及其产品的生产、经营的单位和个人，以及从事动物防疫活动的单位和个人。
2 诊断
依据本病流行病学调查、临床症状，结合实验室诊断结果做出综合判定。 2.1 流行特点
本病为人畜共患传染病，各种家畜、野生动物及人对本病都有不同程度的易感性。草食动物最易感，其次是杂食动物，再次是肉食动物，家禽一般不感染。人也易感。
患病动物和因炭疽而死亡的动物尸体以及污染的土壤、草地、水、饲料都是本病的主要传染源，炭疽芽胞对环境具有很强的抵抗力，其污染的土壤、水源及场地可形成持久的疫源地。本病主要经消化道、呼吸道和皮肤感染。
本病呈地方性流行。有一定的季节性，多发生在吸血昆虫多、雨水多、洪水泛滥的季节。 2.2 临床症状
2.2.1 本规范规定本病的潜伏期为20天。 2.2.2 典型症状
本病主要呈急性经过，多以突然死亡、天然孔出血、尸僵不全为特征。
牛：体温升高常达41℃以上，可视黏膜呈暗紫色，心动过速、呼吸困难。呈慢性经过的病牛，在颈、胸前、肩胛、腹下或外阴部常见水肿；皮肤病灶温度增高，坚硬，有压痛，也可发生坏死，有时形成溃疡；颈部水肿常与咽炎和喉头水肿相伴发生，致使呼吸困难加重。急性病例一般经24～36小时后死亡，亚急性病例一般经2～5天后死亡。
马：体温升高，腹下、乳房、肩及咽喉部常见水肿。舌炭疽多见呼吸困难、发绀；肠炭疽腹痛明显。急性病例一般经24～36小时后死亡，有炭疽痈时，病程可达3～8天。
羊：多表现为最急性（猝死）病症，摇摆、磨牙、抽搐，挣扎、突然倒毙，有的可见从天然孔流出带气泡的黑红色血液。病程稍长者也只持续数小时后死亡。
猪：多为局限性变化，呈慢性经过，临床症状不明显，常在宰后见病变。 犬和其它肉食动物临床症状不明显。 2.3 病理变化
死亡患病动物可视黏膜发绀、出血。血液呈暗紫红色，凝固不良，粘稠似煤焦油状。皮下、肌间、咽喉等部位有浆液性渗出及出血。淋巴结肿大、充血，切面潮红。脾脏高度肿胀，达正常数倍，脾髓呈黑紫色。
严禁在非生物安全条件下进行疑似患病动物、患病动物的尸体剖检。 2.4 实验室诊断
实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行。 2.4.1 病原鉴定
2.4.1.1 样品采集、包装与运输
按照NY／T561 2.1.2、4.1、5.1执行。 2.4.1.2 病原学诊断
炭疽的病原分离及鉴定（见NY/T561）。 2.4.2 血清学诊断
炭疽沉淀反应（见NY/T561）。 2.4.3 分子生物学诊断 聚合酶链式反应（PCR）（见附件1）。 3 疫情报告
3.1 任何单位和个人发现患有本病或者疑似本病的动物，都应立即向当地动物防疫监督机构报告。
3.2 当地动物防疫监督机构接到疫情报告后，按国家动物疫情报告管理的有关规定执行。
4 疫情处理
依据本病流行病学调查、临床症状，结合实验室诊断做出的综合判定结果可做为疫情处理依据。
4.1 当地动物防疫监督机构接到疑似炭疽疫情报告后，应及时派员到现场进行流行病学调查和临床检查，采集病料送符合规定的实验室诊断，并立即隔离疑似患病动物及同群动物，限制移动。
对病死动物尸体，严禁进行开放式解剖检查，采样时必须按规定进行，防止病原污染环境，形成永久性疫源地。
4.2 确诊为炭疽后，必须按下列要求处理。
4.2.1 由所在地县级以上兽医主管部门划定疫点、疫区、受威胁区。
疫 点：指患病动物所在地点。一般是指患病动物及同群动物所在畜场（户组）或其它有关屠宰、经营单位。
疫 区：指由疫点边缘外延3公里范围内的区域。在实际划分疫区时，应考虑当地饲养环境和自然屏障（如河流、山脉等）以及气象因素，科学确定疫区范围。
受威胁区：指疫区外延5公里范围内的区域。
4.2.2 本病呈零星散发时，应对患病动物作无血扑杀处理，对同群动物立即进行强制免疫接种，并隔离观察20天。对病死动物及排泄物、可能被污染饲料、污水等按附件2的要求进行无害化处理；对可能被污染的物品、交通工具、用具、动物舍进行严格彻底消毒（见附件2）。疫区、受威胁区所有易感动物进行紧急免疫接种。对病死动物尸体严禁进行开放式解剖检查，采样必须按规定进行，防止病原污染环境，形成永久性疫源地。
4.2.3 本病呈暴发流行时（1个县10天内发现5头以上的患病动物），要报请同级人民政府对疫区实行封锁；人民政府在接到封锁报告后，应立即发布封锁令，并对疫区实施封锁。
疫点、疫区和受威胁区采取的处理措施如下： 4.2.3.1 疫点
出入口必须设立消毒设施。限制人、易感动物、车辆进出和动物产品及可能受污染的物品运出。对疫点内动物舍、场地以及所有运载工具、饮水用具等必须进行严格彻底地消毒。
患病动物和同群动物全部进行无血扑杀处理。其它易感动物紧急免疫接种。
对所有病死动物、被扑杀动物，以及排泄物和可能被污染的垫料、饲料等物品产品按附件2要求进行无害化处理。
动物尸体需要运送时，应使用防漏容器，须有明显标志，并在动物防疫监督机构的监督下实施。
4.2.3.2 疫区：交通要道建立动物防疫监督检查站，派专人监管动物及其产品的流动，对进出人员、车辆须进行消毒。停止疫区内动物及其产品的交易、移动。所有易感动物必须圈养，或在指定地点放养；对动物舍、道路等可能污染的场所进行消毒。
对疫区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。
4.2.3.3 受威胁区：对受威胁区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。 4.2.3.4 进行疫源分析与流行病学调查 4.2.3.5 封锁令的解除
最后1头患病动物死亡或患病动物和同群动物扑杀处理后20天内不再出现新的病例，进行终末消毒后，经动物防疫监督机构审验合格后，由当地兽医主管部门向原发布封锁令的机关申请发布解除封锁令。
4.2.4 处理记录
对处理疫情的全过程必须做好完整的详细记录，建立档案。
5 预防与控制
5.1 环境控制 饲养、生产、经营场所和屠宰场必须符合《动物防疫条件审核管理办法》（农业部[2002]15号令）规定的动物防疫条件，建立严格的卫生（消毒）管理制度。
5.2 免疫接种
5.2.1 各省根据当地疫情流行情况，按农业部制定的免疫方案，确定免疫接种对象、范围。
5.2.2 使用国家批准的炭疽疫苗，并按免疫程序进行适时免疫接种，建立免疫档案。 5.3 检疫
5.3.1 产地检疫
按GB16549和《动物检疫管理办法》实施检疫。检出炭疽阳性动物时，按本规范4.2.2规定处理。
5.3.2 屠宰检疫
按NY467和《动物检疫管理办法》对屠宰的动物实施检疫。 5.4 消毒
对新老疫区进行经常性消毒，雨季要重点消毒。皮张、毛等按照附件2实施消毒。 5.5 人员防护 动物防疫检疫、实验室诊断及饲养场、畜产品及皮张加工企业工作人员要注意个人防护，参与疫情处理的有关人员，应穿防护服、戴口罩和手套，做好自身防护。
附件1：聚合酶链式反应（PCR）技术
1 试剂
1.1 消化液
1.1.1 1M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0) 三羟甲基氨基甲烷 12.11g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100mL
1.1.2 0.5M 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0) 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g 灭菌双蒸水 80mL
氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100mL
1.1.3 20% 十二烷基磺酸钠(SDS)溶液 (pH7.2) 十二烷基磺酸钠 20g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸 调pH至7.2 灭菌双蒸水 加至100mL 1.1.4 消化液配制
1M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0) 2mL 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0) 0.4mL
20% 十二烷基磺酸钠溶液(pH7.2) 5mL 5M 氯化钠 4mL
灭菌双蒸水 加至200mL 1.2 蛋白酶K溶液 蛋白酶K 5g
灭菌双蒸水 加至250mL 1.3 酚/氯仿/异戊醇混合液 碱性酚 25mL 氯仿 24mL 异戊醇 1mL
1.4 2.5mmol/LdNTP dATP(100mmol/L) 20µL dTTP(100mmol/L) 20µL dGTP(100mmol/L) 20µL dCTP(100mmol/L) 20µL 灭菌双蒸水 加至800µL 1.5 8pmol/µL PCR引物 上游引物ATXU（2 OD）加入701µl灭菌双蒸水溶解，下游引物ATXD（2 OD）加入697µL灭菌双蒸水溶解，分别取ATXU、ATXD溶液各300µL，混匀即为8pmol/µL 扩增引物。
1.6 0.5单位Taq DNA聚合酶 5单位Taq DNA聚合酶 1µL 灭菌双蒸水 加至10µL 现用现配。
1.7 10×PCR缓冲液
1.7.1 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0) 三羟基甲基氨基甲烷 15.8g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸 调pH至9.0 灭菌双蒸水 加至100mL 1.7.2 10倍PCR缓冲液
1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0) 1mL 氯化钾 0.373g
曲拉通X-100 0.1mL 灭菌双蒸水 加至100mL 1.8 溴化乙锭(EB)溶液 溴化乙锭 0.2g
灭菌双蒸水 加至20mL 1.9 电泳缓冲液(50倍)
1.9.1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0) 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g 灭菌双蒸水 80mL
氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100mL
1.9.2 TAE电泳缓冲液(50倍) 三羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242g 冰乙酸 57.1mlL
0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0) 100mL 灭菌双蒸水 加至1 000mL 用时用灭菌双蒸水稀释使用 1.10 1.5％琼脂糖凝胶 琼脂糖 3g
TAE电泳缓冲液(50倍) 4mL 灭菌双蒸水 196mL
微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液20µL。 1.11 上样缓冲液
溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50ml水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至100mL。
1.12 其它试剂 异丙醇(分析纯) 70%乙醇
15mmoL/L氯化镁 灭菌双蒸水 2 器材 2.1 仪器
分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2µL 、20µL、200µL、1000µL）。
2.2 耗材
眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL一次性注射器、1.5 mL灭菌离心管、0.2 mL薄壁PCR管、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL锥形瓶、吸头(10µL、200µL、1000µL)、灭菌双蒸水。
2.3 引物设计
根据GenBank上已发表的炭疽杆菌POX1质粒序列，设计并合成了以下两条引物： ATXU：5’-AGAATGTATCACCAGAGGC-3’ ATXD：5’-GTTGTAGATTGGAGC CGTC-3’，此对引物扩增片段为394bp。
2.4 样品的采集与处理 2.4.1 样品的采集
病死或扑杀的动物取肝脏或脾；待检的活动物，用注射器取血5～10mL，2～8℃保存，送实验室检测。
2.4.2 样品的处理 每份样品分别处理。 2.4.2.1 组织样品处理
称取待检病料0.2g，置研磨器中剪碎并研磨，加入2mL消化液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清100µL加入1.5 mL灭菌离心管中，再加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中4～16h。
2.4.2.2 待检菌的处理
取培养获得的菌落，重悬于生理盐水中。取其悬液100µL加入1.5mL灭菌离心管中，再加入500µL 消化液和10µL 蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.4.2.3 全血样品处理
待血凝后取上清放于离心管中，4℃ 8000 g离心5 分钟，取上清100µL，加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.4.2.4 阳性对照处理
取培养的炭疽杆菌，重悬于生理盐水中。取其悬液100µL，置1.5 mL灭菌离心管中，加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.4.2.5 阴性对照处理
取灭菌双蒸水100µL，置1.5 mL灭菌离心管中，加入500µL 消化液10µl蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.5 DNA模板的提取
2.5.1 取出已处理的样品及阴、阳对照，加入600µL酚/氯仿/异戊醇混合液，用力颠倒10次混匀，12000g离心10分钟。
2.5.2 取上清置1.5mL灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置液氮中3分钟。取出样品管，室温融化，15000rpm离心15分钟。
2.5.3 弃上清，沿管壁缓缓滴入1ml 70%乙醇，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1分钟，真空抽干15分钟(以无乙醇味为准)。
2.5.4 取出样品管，用50µL灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。 2.6 PCR扩增
总体积20µl，取灭菌双蒸水8µl,2.5mmol/L dNTP、8pmol/µL扩增引物、15mmol/L氯化镁、10×PCR缓冲液、0.5单位TaqDNA聚合酶各2µL，2µL模板DNA。混匀，作好标记，加入矿物油20µL覆盖(有热盖的自动DNA热循环仪不用加矿物油)。扩增条件为94℃ 3分钟后，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s循环35次，72℃延伸 5分钟。
2.7 电泳
将PCR扩增产物15µL混合3µL上样缓冲液，点样于1.5%琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于1×TAE缓冲液中电泳，紫外凝胶成像仪下观察结果。
2.8 结果判定
在阳性对照出现394bp扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时，试验结果成立。被检样品出现394bp扩增带为炭疽杆菌阳性，否则为阴性。
附件2：无害化处理
1 炭疽动物尸体处理 应结合远离人们生活、水源等因素考虑，因地制宜，就地焚烧。如需移动尸体，先用5％福尔马林消毒尸体表面，然后搬运，并将原放置尸地及尸体天然孔出血及渗出物用5%福尔马林浸渍消毒数次，在搬运过程中避免污染沿途路段。焚烧时将尸体垫起，用油或木柴焚烧，要求燃烧彻底。无条件进行焚烧处理时，也可按规定进行深埋处理。
2 粪肥、垫料、饲料的处理
被污染的粪肥、垫料、饲料等，应混以适量干碎草，在远离建筑物和易燃品处堆积彻底焚烧，然后取样检验，确认无害后，方可用作肥料。
3 房屋、厩舍处理
开放式房屋、厩舍可用5%福尔马林喷洒消毒三遍，每次浸渍2小时。也可用20％漂白
2
粉液喷雾，200mL/m作用2小时。对砖墙、土墙、地面污染严重处，在离开易燃品条件下，亦可先用酒精或汽油喷灯地毯式喷烧一遍，然后再用5％福尔马林喷洒消毒三遍。
对可密闭房屋及室内橱柜、用具消毒，可用福尔马林熏蒸。在室温18℃条件下，对每3
25～30m空间，用10％浓甲醛液（内含37％甲醛气体）约4000mL，用电煮锅蒸4小时。蒸前先将门窗关闭，通风孔隙用高粘胶纸封严，工作人员戴专用防毒面具操作。密封8～12小时后，打开门窗换气，然后使用。
熏蒸消毒效果测定，可用浸有炭疽弱毒菌芽孢的纸片，放在含组氨酸的琼脂平皿上，待熏后取出置37℃培养24小时，如无细菌生长即认为消毒有效。
也可选择其它消毒液进行喷洒消毒，如4％戊二醛（pH8.0～8.5）2小时浸洗、5％甲醛（约15％福尔马林）2小时、3％ H2O22小时或过氧乙酸2小时。其中，H2O2和过氧乙酸不宜用于有血液存在的环境消毒；过氧乙酸不宜用于金属器械消毒。
4 泥浆、粪汤处理
猪、牛等动物死亡污染的泥浆、粪汤，可用20％漂白粉液1份（处理物2份），作用2
3
小时；或甲醛溶液50～100ml/m比例加入，每天搅拌1～2次，消毒4天，即可撒到野外或田里，或掩埋处理(即作深埋处理)。
5 污水处理
按水容量加入甲醛溶液，使其含甲醛液量达到5％，处理10小时；或用3％过氧乙酸处理4小时；或用氯胺或液态氯加入污水，于pH4.0时加入有效氯量为4mg/L，30分钟可杀灭芽孢，一般加氯后作用2小时流放一次。
6 土壤处理
2
炭疽动物倒毙处的土壤消毒，可用5％甲醛溶液500mL/m消毒三次，每次2小时，间隔1小时。亦可用氯胺或10％漂白粉乳剂浸渍2小时，处理2次，间隔1小时。亦可先用酒精或柴油喷灯喷烧污染土地表面，然后再用5％甲醛溶液或漂白粉乳剂浸渍消毒。
7 衣物、工具及其它器具处理
耐高温的衣物、工具、器具等可用高压蒸汽灭菌器在121℃高压蒸汽灭菌1小时；不耐高温的器具可用甲醛熏蒸，或用5％甲醛溶液浸渍消毒。运输工具、家具可用10％漂白粉液或1％过氧乙酸喷雾或擦拭，作用1～2小时。凡无使用价值的严重污染物品可用火彻底焚毁消毒。
8 皮、毛处理
皮毛、猪鬃、马尾的消毒，采用97～98％的环氧乙烷、2％的CO2、1％的十二氟混合液体，加热后输入消毒容器内，经48小时渗透消毒，启开容器换气，检测消毒效果。但须注意，环氧乙烷的熔点很低（＜0℃），在空气中浓度超过3％，遇明火即易燃烧发生爆炸，必须低温保存运输，使用时应注意安全。
骨、角、蹄在制作肥料或其它原料前，均应彻底消毒。如采用121℃高压蒸汽灭菌；或5％甲醛溶液浸泡；或用火焚烧。
猪伪狂犬病防治技术规范
农医发［2007］12号
农业部关于印发《高致病性禽流感防治技术规范》等14个动物疫病防治技术规范的通
知
2007年4月9日
猪伪狂犬病(Pseudorabies,Pr)，是由疱疹病毒科猪疱疹病毒I型伪狂犬病毒引起的传染病。我国将其列为二类动物疫病。
为了预防、控制猪伪狂犬病，依据《中华人民共和国动物防疫法》和其他有关法律法规，制定本规范。
1 适用范围
本规范规定了猪伪狂犬病的诊断、监测、疫情报告、疫情处理、预防与控制。
本规范适用于中华人民共和国境内从事饲养、加工、经营猪及其产品，以及从事相关动物防疫活动的单位和个人。
2 诊断
2.1 流行特点
本病各种家畜和野生动物（除无尾猿外）均可感染，猪、牛、羊、犬、猫等易感。本病寒冷季节多发。病猪是主要传染源，隐性感染猪和康复猪可以长期带毒。病毒在猪群中主要通过空气传播，经呼吸道和消化道感染，也可经胎盘感染胎儿。
2.2 临床特征
潜伏期一般为3～6天。
母猪感染伪狂犬病病毒后常发生流产、产死胎、弱仔、木乃伊胎等症状。青年母猪和空怀母猪常出现返情而屡配不孕或不发情；公猪常出现睾丸肿胀、萎缩、性功能下降、失去种用能力；新生仔猪大量死亡，15日龄内死亡率可达100%；断奶仔猪发病20～30%，死亡率为10～20%。育肥猪表现为呼吸道症状和增重滞缓。
2.3 病理变化
大体剖检特征不明显，剖检脑膜瘀血、出血。病理组织学呈现非化脓性脑炎变化。 2.4 实验室诊断 2.4.1病原学诊断
2.4.1.1病毒分离鉴定（见 GB/T 18641—2002）
2.4.1.2聚合酶链式反应诊断(见GB/T 18641—2002)
2.4.1.3 动物接种：采取病猪扁桃体、嗅球、脑桥和肺脏，用生理盐水或PBS液（磷酸盐缓冲液）制成10%悬液，反复冻融3次后离心取上清液接种于家兔皮下或者小鼠脑内，（用于接种的家兔和小白鼠必须事先用ELISA检测伪狂犬病病毒抗体阴性者才能使用）家兔经2～5天或者小鼠经2～10天发病死亡，死亡前注射部位出现奇痒和四肢麻痹。家兔发病时先用舌舔接种部位，以后用力撕咬接种部位，使接种部位被撕咬伤、鲜红、出血，持续4～6小时，病兔衰竭，痉挛，呼吸困难而死亡。小鼠不如家兔敏感，但明显表现兴奋不安，神经症状，奇痒和四肢麻痹而死亡。
2.4.2 血清学诊断
2.4.2.1 微量病毒中和试验（见GB/T 18641-2002）
2.4.2.2 鉴别ELISA（见GB/T 18641-2002）
2.5 结果判定
根据本病的流行特点、临床特征和病理变化可作出初步诊断，确诊需进一步做病原分离鉴定及血清学试验。
2.5.1 符合2.4.1.1或2.4.1.2或2.4.2.1或2.4.2.2阳性的，判定为病猪。
2.5.2 2.4.2.2可疑结果的，按2.4.1之一或2.4.2.1所规定的方法进行确诊，阳性的判定为病猪。
3 疫情报告
3.1 任何单位和个人发现患有本病或者怀疑本病的动物，都应当及时向当地动物防疫监督机构报告。
3.2 当地动物防疫监督机构接到疫情报告并确认后，按《动物疫情报告管理办法》及有关规定及时上报。
4 疫情处理
4.1 发现疑似疫情，畜主应立即限制动物移动，并对疑似患病动物进行隔离。
4.2 当地动物防疫监督机构要及时派员到现场进行调查核实，开展实验室诊断。确诊后，当地人民政府组织有关部门按下列要求处理：
4.2.1 扑杀
对病猪全部扑杀。
4.2.2 隔离
对受威胁的猪群（病猪的同群猪）实施隔离。
4.2.3 无害化处理
患病猪及其产品按照GB16548-1996《畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程》进行无害化处理。
4.2.4 流行病学调查及检测
开展流行病学调查和疫源追踪；对同群猪进行检测。
4.2.5紧急免疫接种
对同群猪进行紧急免疫接种。
4.2.6 消毒
对病猪污染的场所、用具、物品严格进行消毒。
4.2.7 发生重大猪伪狂犬病疫情时，当地县级以上人民政府应按照《重大动物疫情应急条例》有关规定，采取相应的疫情扑灭措施。
5 预防与控制
5.1 免疫接种
对猪用猪伪狂犬病疫苗，按农业部推荐的免疫程序进行免疫。
5.2 监测
对猪场定期进行监测。监测方法采用鉴别ELISA诊断技术，种猪场每年监测2次，监测时种公猪（含后备种公猪）应100%、种母猪（含后备种母猪）按20%的比例抽检；商品猪不定期进行抽检；对有流产、产死胎、产木乃伊胎等症状的种母猪100%进行检测。
5.3 引种检疫
对出场（厂、户）种猪由当地动物防疫监督机构进行检疫，伪狂犬病病毒感染抗体监测为阴性的猪，方出具检疫合格证明，准予出场（厂、户）。
种猪进场后，须隔离饲养30天后，经实验室检查确认为猪伪狂犬病病毒感染阴性的，方可混群。
5.4 净化
5.4.1 对种猪场实施猪伪狂犬病净化，净化方案见附件。
5.4.2 种猪场净化标准
必须符合以下两个条件：
5.4.2.1 种猪场停止注苗后（或没有注苗）连续二年无临床病例。
5.4.2.2 种猪场连续两年随机抽血样检测伪狂犬病毒抗体或野毒感染抗体监测，全部阴性。
附件：种猪场猪伪狂犬病净化方案
一、轻度污染场的净化
猪场不使用疫苗免疫接种，采取血清学普查，如果发现血清学阳性，进行确诊，扑杀患病猪。
二、中度污染场的净化
（一）采取免疫净化措施。免疫程序按每4个月注射一次。对猪只每年进行两次病原学抽样监测，结果为阳性者按病畜淘汰。
（二）经免疫的种猪所生仔猪，留作种用的在100日龄时作一次血清学检查，免疫前抗体阴性者留作种用，阳性者淘汰。
（三）后备种猪在配种前后1个月各免疫接种一次，以后按种猪的免疫程序进行免疫。同时每6个月抽血样作一次血清学鉴别检查，如发现野毒感染猪只及时淘汰处理。
（四）引进的猪只隔离饲养7天以上，经检疫合格（血清学检测为阴性）后方可与本场猪混群饲养。每半年作一次血清学检查。对于检测出的野毒感染阳性猪实施淘汰。
三、重度污染场的净化
（一）暂停向外供应种猪。
（二）免疫程序按每4个月免疫接种一次。每次免疫接种后对猪只抽样进行免疫抗体监测，对免疫抗体水平不达标者，立即补免。持续两年。
（三）在上述措施的基础上，按轻度感染场净化方案操作处理。
四、综合措施
（一）猪场要对猪舍及周边环境定期消毒。
（二）禁止在猪场内饲养其它动物。
（三）在猪场内实施灭鼠措施。
猪瘟防治技术规范
农医发［2007］12号
农业部关于印发《高致病性禽流感防治技术规范》等14个动物疫病防治技术规范的通
知
2007年4月9日
猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由黄病毒科瘟病毒属猪瘟病毒引起的一种高度接触性、出血性和致死性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
为及时、有效地预防、控制和扑灭猪瘟，依据《中华人民共和国动物防疫法》、《重大动物疫情应急条例》和《国家突发重大动物疫情应急预案》及有关法律法规，制定本规范。
1 适用范围
本规范规定了猪瘟的诊断、疫情报告、疫情处置、疫情监测、预防措施、控制和消灭标准等。
本规范适用于中华人民共和国境内一切从事猪（含驯养的野猪）的饲养、经营及其产品生产、经营，以及从事动物防疫活动的单位和个人。
2 诊断
依据本病流行病学特点、临床症状、病理变化可作出初步诊断，确诊需做病原分离与鉴定。
2.1 流行特点
猪是本病唯一的自然宿主，发病猪和带毒猪是本病的传染源，不同年龄、性别、品种的猪均易感。一年四季均可发生。感染猪在发病前即能通过分泌物和排泄物排毒，并持续整个病程。与感染猪直接接触是本病传播的主要方式，病毒也可通过精液、胚胎、猪肉和泔水等传播，人、其它动物如鼠类和昆虫、器具等均可成为重要传播媒介。感染和带毒母猪在怀孕期可通过胎盘将病毒传播给胎儿，导致新生仔猪发病或产生免疫耐受。
2.2 临床症状
2.2.1 本规范规定本病潜伏期为3-10天，隐性感染可长期带毒。
根据临床症状可将本病分为急性、亚急性、慢性和隐性感染四种类型。
2.2.2 典型症状
2.2.2.1 发病急、死亡率高；
2.2.2.2 体温通常升至41℃以上、厌食、畏寒；
2.2.2.3 先便秘后腹泻，或便秘和腹泻交替出现；
2.2.2.4 腹部皮下、鼻镜、耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑点，指压不褪色，眼结膜和口腔黏膜可见出血点。
2.3 病理变化
2.3.1 淋巴结水肿、出血，呈现大理石样变；
2.3.2 肾脏呈土黄色，表面可见针尖状出血点；
2.3.3 全身浆膜、黏膜和心脏、膀胱、胆囊、扁桃体均可见出血点和出血斑，脾脏边缘出现梗死灶；
2.3.4 脾不肿大，边缘有暗紫色突出表面的出血性梗死；
2.3.5 慢性猪瘟在回肠末端、盲肠和结肠常见“钮扣状”溃疡。
2.4 实验室诊断
实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行。
2.4.1 病原分离与鉴定
2.4.1.1 病原分离、鉴定可用细胞培养法（见附件1）；
2.4.1.2 病原鉴定也可采用猪瘟荧光抗体染色法，细胞浆出现特异性的荧光（见附件
2）；
2.4.1.3 兔体交互免疫试验（附件3）；
2.4.1.4 猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）：主要用于临床诊断与病原监测（见附件4）。
2.4.1.5 猪瘟抗原双抗体夹心ELISA检测法：主要用于临床诊断与病原监测（见附件
5）。
2.4.2 血清学检测
2.4.2.1 猪瘟病毒抗体阻断ELISA检测法（见附件6）；
2.4.2.2 猪瘟荧光抗体病毒中和试验（见附件7）：
2.4.2.3 猪瘟中和试验方法（见附件8）。
2.5 结果判定
2.5.1 疑似猪瘟
符合猪瘟流行病学特点、临床症状和病理变化。
2.5.2 确诊
非免疫猪符合结果判定2.5.1，且符合血清学诊断2.4.2.1、2.4.2.2、2.4.2.3之一，或符合病原学诊断2.4.1.1、2.4.1.2、2.4.1.3、2.4.1.4、2.4.1.5之一的；
免疫猪符合结果2.5.1，且符合病原学诊断2.4.1.1、2.4.1.2、2.4.1.3、2.4.1.4、
2.4.1.5之一的。
3 疫情报告
3.1 任何单位和个人发现患有本病或疑似本病的猪，都应当立即向当地动物防疫监督机构报告。
3.2 当地动物防疫监督机构接到报告后，按国家动物疫情报告管理的有关规定执行。 4 疫情处理
根据流行病学、临床症状、剖检病变，结合血清学检测做出的临床诊断结果可作为疫情处理的依据。
4.1 当地县级以上动物防疫监督机构接到可疑猪瘟疫情报告后，应及时派员到现场诊断，根据流行病学调查、临床症状和病理变化等初步诊断为疑似猪瘟时，应立即对病猪及同群猪采取隔离、消毒、限制移动等临时性措施。同时采集病料送省级动物防疫监督机构实验室确诊，必要时将样品送国家猪瘟参考实验室确诊。
4.2 确诊为猪瘟后，当地县级以上人民政府兽医主管部门应当立即划定疫点、疫区、受威胁区，并采取相应措施；同时，及时报请同级人民政府对疫区实行封锁，逐级上报至国务院兽医主管部门，并通报毗邻地区。国务院兽医行政管理部门根据确诊结果，确认猪瘟疫情。
4.2.1 划定疫点、疫区和受威胁区
疫点：为病猪和带毒猪所在的地点。一般指病猪或带毒猪所在的猪场、屠宰厂或经营单位，如为农村散养，应将自然村划为疫点。
疫区：是指疫点边缘外延3公里范围内区域。疫区划分时，应注意考虑当地的饲养环境和天然屏障（如河流、山脉等）等因素。
受威胁区：是指疫区外延5公里范围内的区域。
4.2.2 封锁
由县级以上兽医行政管理部门向本级人民政府提出启动重大动物疫情应急指挥系统、应急预案和对疫区实行封锁的建议，有关人民政府应当立即做出决定。
4.2.3 对疫点、疫区、受威胁区采取的措施
疫点：扑杀所有的病猪和带毒猪，并对所有病死猪、被扑杀猪及其产品按照GB16548规定进行无害化处理；对排泄物、被污染或可能污染饲料和垫料、污水等均需进行无害化处理；对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行严格彻底消毒（见附件9）；限制人员出入，严禁车辆进出，严禁猪只及其产品及可能污染的物品运出。
疫区：对疫区进行封锁，在疫区周围设置警示标志，在出入疫区的交通路口设置动物检
疫消毒站(临时动物防疫监督检查站)，对出入的人员和车辆进行消毒；对易感猪只实施紧急强制免疫，确保达到免疫保护水平；停止疫区内猪及其产品的交易活动，禁止易感猪只及其产品运出；对猪只排泄物、被污染饲料、垫料、污水等按国家规定标准进行无害化处理；对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行严格彻底消毒。
受威胁区：对易感猪只(未免或免疫未达到免疫保护水平)实施紧急强制免疫，确保达到免疫保护水平；对猪只实行疫情监测和免疫效果监测。
4.2.4 紧急监测
对疫区、受威胁区内的猪群必须进行临床检查和病原学监测。
4.2.5 疫源分析与追踪调查
根据流行病学调查结果，分析疫源及其可能扩散、流行的情况。对可能存在的传染源，以及在疫情潜伏期和发病期间售(／运)出的猪只及其产品、可疑污染物（包括粪便、垫料、饲料等）等应当立即开展追踪调查，一经查明立即按照GB16548规定进行无害化处理。
4.2.6 封锁令的解除
疫点内所有病死猪、被扑杀的猪按规定进行处理，疫区内没有新的病例发生，彻底消毒10天后，经当地动物防疫监督机构审验合格，当地兽医主管部门提出申请，由原封锁令发布机关解除封锁。
4.2.7 疫情处理记录
对处理疫情的全过程必须做好详细的记录（包括文字、图片和影像等），并归档。 5 预防与控制
以免疫为主，采取“扑杀和免疫相结合”的综合性防治措施。
5.1 饲养管理与环境控制
饲养、生产、经营等场所必须符合《动物防疫条件审核管理办法》（农业部[2002]15号令）规定的动物防疫条件，并加强种猪调运检疫管理。
5.2 消毒
各饲养场、屠宰厂（场）、动物防疫监督检查站等要建立严格的卫生（消毒）管理制度，做好杀虫、灭鼠工作（见附件9）。
5.3 免疫和净化
5.3.1 免疫
国家对猪瘟实行全面免疫政策。
预防免疫按农业部制定的免疫方案规定的免疫程序进行。
所用疫苗必须是经国务院兽医主管部门批准使用的猪瘟疫苗。
5.3.2 净化
对种猪场和规模养殖场的种猪定期采样进行病原学检测，对检测阳性猪及时进行扑杀和无害化处理，以逐步净化猪瘟。
5.4 监测和预警
5.4.1 监测方法
非免疫区域：以流行病学调查、血清学监测为主，结合病原鉴定。
免疫区域：以病原监测为主，结合流行病学调查、血清学监测。
5.4.2 监测范围、数量和时间
对于各类种猪场每年要逐头监测两次；商品猪场每年监测两次，抽查比例不低于0.1%，最低不少于20头；散养猪不定期抽查。或按照农业部年度监测计划执行。
5.4.3 监测报告
监测结果要及时汇总，由省级动物防疫监督机构定期上报中国动物疫病预防控制中心。
5.4.4 预警
各级动物防疫监督机构对监测结果及相关信息进行风险分析，做好预警预报。
5.5 消毒
饲养场、屠宰厂（场）、交易市场、运输工具等要建立并实施严格的消毒制度。
5.6 检疫
5.6.1 产地检疫
生猪在离开饲养地之前，养殖场/户必须向当地动物防疫监督机构报检。动物防疫监督机构接到报检后必须及时派员到场/户实施检疫。检疫合格后，出具合格证明；对运载工具进行消毒，出具消毒证明，对检疫不合格的按照有关规定处理。
5.6.2 屠宰检疫
动物防疫监督机构的检疫人员对生猪进行验证查物，合格后方可入厂/场屠宰。检疫合格并加盖（封）检疫标志后方可出厂/场，不合格的按有关规定处理。
5.6.3 种猪异地调运检疫
跨省调运种猪时，应先到调入地省级动物防疫监督机构办理检疫审批手续，调出地进行检疫，检疫合格方可调运。到达后须隔离饲养10天以上，由当地动物防疫监督机构检疫合格后方可投入使用。
6 控制和消灭标准
6.1 免疫无猪瘟区
6.1.1 该区域首先要达到国家无规定疫病区基本条件。
6.1.2 有定期、快速的动物疫情报告记录。
6.1.3 该区域在过去3年内未发生过猪瘟。
6.1.4 该区域和缓冲带实施强制免疫，免疫密度100%，所用疫苗必须符合国家兽医主管部门规定。
6.1.5 该区域和缓冲带须具有运行有效的监测体系，过去2年内实施疫病和免疫效果监测，未检出病原，免疫效果确实。
6.1.6 所有的报告，免疫、监测记录等有关材料详实、准确、齐全。
若免疫无猪瘟区内发生猪瘟时，最后一例病猪扑杀后12个月，经实施有效的疫情监测，确认后方可重新申请免疫无猪瘟区。
6.2 非免疫无猪瘟区
6.2.1 该区域首先要达到国家无规定疫病区基本条件。
6.2.2 有定期、快速的动物疫情报告记录。
6.2.3 在过去2年内没有发生过猪瘟，并且在过去12个月内，没有进行过免疫接种；另外，该地区在停止免疫接种后，没有引进免疫接种过的猪。
6.2.4 在该区具有有效的监测体系和监测区，过去2年内实施疫病监测，未检出病原。
6.2.5 所有的报告、监测记录等有关材料详实、准确、齐全。
若非免疫无猪瘟区发生猪瘟后，在采取扑杀措施及血清学监测的情况下，最后一例病猪扑杀后6个月；或在采取扑杀措施、血清学监测及紧急免疫的情况下，最后一例免疫猪被屠宰后6个月，经实施有效的疫情监测和血清学检测确认后，方可重新申请非免疫无猪瘟区。
附件1：病毒分离鉴定
采用细胞培养法分离病毒是诊断猪瘟的一种灵敏方法。通常使用对猪瘟病毒敏感的细胞系如PK-15细胞等，加入2%扁桃体、肾脏、脾脏或淋巴结等待检组织悬液于培养液中。37℃培养48～72小时后用荧光抗体染色法检测细胞培养物中的猪瘟病毒。
步骤如下：
1. 制备抗生素浓缩液（青霉素10000IU/mL、链霉素10000IU/mL、卡那霉素和制霉菌素5000IU/mL），小瓶分装，-20℃保存。用时融化。
2. 取1～2g待检病料组织放入灭菌研钵中，剪刀剪碎，加入少量无菌生理盐水，将其研磨匀浆；再加入Hank’S平衡盐溶液或细胞培养液，制成20%(w/v)组织悬液；最后按1/10的比例加入抗生素浓缩液，混匀后室温作用1小时；以1000g离心15分钟，取上清液备用。
3. 用胰酶消化处于对数生长期的PK-15细胞单层，将所得细胞悬液以1000g离心10分钟，再用一定量EMEM生长液[含5%胎牛血清(无BVDV抗体)，56℃灭活30分钟]、0.3％
6谷氨酰胺、青霉素100I U/mL、链霉素100I U/mL)悬浮，使细胞浓度为2×10/mL。
4. 9份细胞悬液与1份上清液混合，接种6～8支含细胞玻片的莱顿氏管(leighton’s)(或其它适宜的细胞培养瓶),每管0.2mL；同时设3支莱顿氏管接种细胞悬液作阴性对照；
另设3支莱顿氏管接种猪瘟病毒作阳性对照。
5. 经培养24、48、72小时，分别取2管组织上清培养物及1管阴性对照培养物、1管阳性对照培养物，取出细胞玻片，以磷酸缓冲盐水（PBS液，pH7.2，0.01M）或生理盐水洗涤2次，每次5分钟，用冷丙酮(分析纯)固定10分钟，晾干，采用猪瘟病毒荧光抗体染色法进行检测（见附件2）。
6. 根据细胞玻片猪瘟荧光抗体染色强度，判定病毒在细胞中的增殖情况，若荧光较弱或为阴性，应按步骤4将组织上清细胞培养物进行病毒盲传。
临床发病猪或疑似病猪的全血样是猪瘟早期诊断样品。接种细胞时操作程序如下：取-20℃冻存全血样品置37℃水浴融化；向24孔板每孔加300微升血样以覆盖对数生长期的PK-15单层细胞；37℃吸附2小时。弃去接种液，用细胞培养液洗涤细胞二次，然后加入EMEM维持液，37℃培养24至48小时后，采用猪瘟病毒荧光抗体染色法检测（见附件2）。
附件2：猪瘟荧光抗体染色法
荧光抗体染色法快速、特异，可用于检测扁桃体等组织样品以及细胞培养中的病毒抗原。操作程序如下：
1 样品的采集和选择
1.1 活体采样：利用扁桃体采样器（鼻捻子、开口器和采样枪）。采样器使用前均须用3%氢氧化钠溶液消毒后经清水冲洗。首先固定活猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至灭菌离心管并作标记。
1.2 其它样品：剖检时采取的病死猪脏器，如扁桃体、肾脏、脾脏、淋巴结、肝脏和肺等，或病毒分离时待检的细胞玻片。
1.3 样品采集、包装与运输按农业部相关要求执行。
2 检测方法与判定
2.1 方法：将上述组织制成冰冻切片，或待检的细胞培养片（见附件1），将液体吸干后经冷丙酮固定5～10分钟，晾干。滴加猪瘟荧光抗体覆盖于切片或细胞片表面，置湿盒中37℃作用30分钟。然后用PBS液洗涤，自然干燥。用碳酸缓冲甘油（pH9.0～9.5，0.5 M）封片，置荧光显微镜下观察。必要时设立抑制试验染色片，以鉴定荧光的特异性。
2.2 判定：在荧光显微镜下，见切片或细胞培养物（细胞盖片）中有胞浆荧光，并由抑制试验证明为特异的荧光，判猪瘟阳性；无荧光判为阴性。
2.3 荧光抑制试验：将两组猪瘟病毒感染猪的扁桃体冰冻切片，分别滴加猪瘟高免血清和健康猪血清（猪瘟中和抗体阴性），在湿盒中37℃作用30分钟，用生理盐水或PBS(pH7.2)漂洗2次，然后进行荧光抗体染色。经用猪瘟高免血清处理的扁桃体切片，隐窝上皮细胞不应出现荧光，或荧光显著减弱；而用阴性血清处理的切片，隐窝上皮细胞仍出现明亮的黄绿色荧光。
附件3：兔体交互免疫试验
本方法用于检测疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒。
1 试验动物
家兔 1.5～2kg、体温波动不大的大耳白兔，并在试验前1天测基础体温。
2 试验操作方法
将病猪的淋巴结和脾脏，磨碎后用生理盐水作1：10稀释，对3只健康家兔作肌肉注射，5mL/只，另设3只不注射病料的对照兔，间隔5天对所有家兔静脉注射1:20的猪瘟兔化病毒（淋巴脾脏毒），1mL/只，24h后，每隔6小时测体温一次，连续测96小时，对照组2/3出现定型热或轻型热，试验成立。
注：“+”表示多于或等于三分之二的动物有反应。
附件4：猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
RT-PCR方法通过检测病毒核酸而确定病毒存在，是一种特异、敏感、快速的方法。在RT-PCR扩增的特定基因片段的基础上，进行基因序列测定，将获得的基因信息与我国猪瘟分子流行病学数据库进行比较分析，可进一步鉴定流行毒株的基因型，从而追踪流行毒株的传播来源或预测预报新的流行毒株。
1 材料与样品准备
1.1 材料准备：本试验所用试剂需用无RNA酶污染的容器分装；各种离心管和带滤芯吸头需无RNA酶污染；剪刀、镊子和研钵器须经干烤灭菌。
1.2 样品制备：按1：5（W/V）比例，取待检组织和PBS液于研钵中充分研磨，4℃，1000g离心15分钟，取上清液转入无RNA酶污染的离心管中，备用；全血采用脱纤抗凝备用；细胞培养物冻融3次备用；其它样品酌情处理。制备的样品在2～8℃保存不应超过24小时，长期保存应小分装后置-70℃以下，避免反复冻融。
2 RNA提取
2.1 取1.5mL离心管，每管加入800μL RNA提取液（通用Trizol）和被检样品200μL，充分混匀，静置5分钟。同时设阳性和阴性对照管，每份样品换一个吸头。
2.2 加入200μL氯仿，充分混匀，静置5分钟，4℃、12000g离心15分钟。
2.3 取上清约500μL（注意不要吸出中间层）移至新离心管中，加等量异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟，4℃、12000g离心10分钟。
2.4 小心弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入1000μL 75%乙醇，颠倒洗涤，4℃、12000g离心10分钟。
2.5 小心弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；4000 g离心10分钟，将管壁上残余液体甩到管底部，小心吸干上清，吸头不要碰到有沉淀的一面，每份样品换一个吸头，室温干燥。
2.6 加入10μL DEPC水和10U RNasin,轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，4000 g离心10分钟，尽快进行试验。长期保存应置-70℃以下。
3 cDNA合成
取200μL PCR专用管，连同阳性对照管和阴性对照管，每管加10μL RNA和50 pM下游引物P2 (5’-CACAG（CT）CC（AG）AA（TC）CC（AG）AAGTCATC -3’)，按反转录试剂盒说明书进行。
4 PCR
4.1 取200μLPCR专用管，连同阳性对照管和阴性对照管，每管加上述10μL cDNA和适量水，95℃预变性5分钟。
4.2 每管加入10倍稀释缓冲液5μL，上游引物P1（5’-TC（GA）（AT）CAACCAA（TC）GAGATAGGG-3’）和下游引物P2各50pM，10 mol/L dNTP 2μL，Taq酶2.5U，补水至50μL。
4.3 置PCR仪，循环条件为95C 50sec，58C 60sec，72C 35sec，共40个循环，72C延伸5分钟。
5 结果判定
取RT-PCR产物5μL，于1%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中含0.5μL /mL溴化乙锭，电泳缓冲液为0.5×TBE，80V 30分钟，电泳完后于长波紫外灯下观察拍照。阳性对照管和样品检测管出现251nt的特异条带判为阳性；阴性管和样品检测管未出现特异条带判为阴性。
附件5：猪瘟抗原双抗体夹心ELISA检测方法
本方法通过形成的多克隆抗体-样品-单克隆抗体夹心，并采用辣根过氧化物酶标记物检测，对外周血白细胞、全血、细胞培养物以及组织样本中的猪瘟病毒抗原进行检测的一种双抗体夹心ELISA方法。具体如下：
1 试剂盒组成
1.1 多克隆羊抗血清包被板条 8孔×12条（96孔）
1.2 CSFV阳性对照，含有防腐剂 1.5mL
1.3 CSFV阴性对照，含有防腐剂 1.5mL
1.4 100倍浓缩辣根过氧化物酶标记物（100×）
辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG，含防腐剂 200uL
1.5 10倍浓缩样品稀释液（10×） 55mL
1.6 底物液，TMB/H2O2溶液 12mL
1.7 终止液，1M HCL（小心，强酸） 12mL
1.8 10倍浓缩洗涤液（10×） 125mL
1.9 CSFV单克隆抗体，含防腐剂 4mL
1.10 酶标抗体稀释液 15 mL
2 样品制备
注意：制备好的样品或组织可以在2～7℃保存7天，或-20℃冷冻保存6个月以上。但这些样品在应用前应该再次以1500g离心10分钟或10000g离心2～5分钟。
2.1 外周血白细胞
2.1.1 取10mL肝素或EDTA抗凝血样品，1500g离心15～20分钟。
2.1.2 再用移液器小心吸出血沉棕黄层，加入500uL样品稀释液（1×）,在旋涡振荡器上混匀，室温下放置1小时，期间不时旋涡混合。然后直接进行步骤2.1.6操作。
2.1.3 假如样品的棕黄层压积细胞体积非常少，那么就用整个细胞团（包括红细胞）。将细胞加进10mL的离心管，并加入5mL预冷（2～7℃，下同）的0.17M NH4Cl。混匀，静置10分钟。
2.1.4 用冷（2～7℃）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1500g离心5分钟。
2.1.5 弃去上清，向细胞团中加入500uL样品稀释液（1×）,用洁净的吸头悬起细胞，在旋涡振荡器上混匀，室温放置1小时。期间不时旋涡混合。
2.1.6 1500g离心5分钟,取上清液按操作步骤进行检测。
注意：处理好的的样品可以在2～7℃保存7天，或-20℃冷冻保存6个月以上。但这些样品在使用前必须再次离心。
2.2 外周血白细胞（简化方法）
2.2.1 取0.5～2mL肝素或EDTA抗凝血与等体积冷0.17 M NH4Cl加入离心管混合。室温放置10分钟。
2.2.2 1500g离心10分钟（或10000g离心2－3分钟），弃上清。
2.2.3 用冷（2～7℃）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1500g离心5分钟。
2.2.4 弃去上清，向细胞团加入500ul样本稀释液（1×）。旋涡振荡充分混匀，室温放置1小时。期间不时旋涡混匀。取75ul按照“操作步骤”进行检测。
2.3 全血（肝素或EDTA抗凝）
2.3.1 取25uL 10倍浓缩样品稀释液（10×）和475uL全血加入微量离心管，在旋涡振荡器上混匀。
2.3.2 室温下孵育1小时，期间不时旋涡混合。此样品可以直接按照“操作步骤”进行检测。
或：直接将75uL全血加入酶标板孔中，再加入10uL 5倍浓缩样品稀释液（5×）。晃动酶标板／板条，使样品混合均匀。再按照“操作步骤”进行检测。
2.4 细胞培养物
2.4.1 移去细胞培养液，收集培养瓶中的细胞加入离心管中。
2.4.2 2500g离心5分钟，弃上清。
2.4.3 向细胞团中加入500uL样品稀释液（1×）。旋涡振荡充分混匀，室温孵育1小时。期间不时旋涡混合。取此样品75uL按照“操作步骤”进行检测。
2.5 组织
最好用新鲜的组织。如果有必要，组织可以在处理前于2～7℃冷藏保存1个月。每只动物检测1～2种组织，最好选取扁桃体、脾、肠、肠系膜淋巴结或肺。
2.5.1 取1～2g组织用剪刀剪成小碎块（2～5mm大小）。
2.5.2 将组织碎块加入10mL离心管，加入5mL样品稀释液（1×）,旋涡振荡混匀，室温下孵育1～21小时，期间不时旋涡混合。
2.5.3 1500g离心5分钟，取75uL上清液按照“操作步骤”进行检测。
3 操作步骤
注意：所有试剂在使用前应该恢复至室温18～22℃；使用前试剂应在室温条件下至少放置1小时。
3.1 每孔加入25uLCSFV特异性单克隆抗体。此步骤可以用多道加样器操作。
3.2 在相应孔中分别加入75uL阳性对照、阴性对照，各加2孔。注意更换吸头。
3.3 在其余孔中分别加入75uL制备好的样品，注意更换吸头。轻轻拍打酶标板，使样品混合均匀。
3.4 置湿盒中或用胶条密封后室温（18～22℃）孵育过夜。也可以孵育4个小时，但是这样会降低检测灵敏度。
3.5 甩掉孔中液体，用洗涤液（1×）洗涤5次，每次洗涤都要将孔中的所有液体倒空，用力拍打酶标板，以使所有液体拍出。或者，每孔加入洗涤液250～300uL用自动洗板机洗涤5次。注意:洗涤酶标板要仔细。
3.6 每孔加入100uL稀释好的辣根过氧化物酶标记物，在湿盒或密封后置室温孵育1小时。
3.7 重复操作步骤3.5；每孔加入100uL底物液，在暗处室温孵育10分钟。第1孔加入底物液开始计时。
3.8 每孔加入100uL终止液终止反应。加入终止液的顺序与上述加入底物液的顺序一致。
3.9 在酶标仪上测量样品与对照孔在450nm处的吸光值，或测量在450nm和620nm双波长的吸光值（空气调零）。
3.10 计算每个样品和阳性对照孔的矫正OD值的平均值（参见“计算方法”）。 4 计算方法
首先计算样品和对照孔的OD平均值，在判定结果之前，所有样品和阳性对照孔的OD平均值必须进行矫正，矫正的OD值等于样本或阳性对照值减去阴性对照值。
矫正OD值＝样本OD值－阴性对照OD值
5 试验有效性判定
阳性对照OD平均值应该大于0.500，阴性对照OD平均值应小于阳性对照平均值的20％，试验结果方能有效。否则，应仔细检查实验操作并进行重测。如果阴性对照的OD值始终很高，将阴性对照在微量离心机中10000g离心3～5分钟，重新检测。
6 结果判定
被检样品的矫正OD值大于或等于0.300，则为阳性；
被检样品的矫正OD值小于0.200，则为阴性；
被检样品的矫正OD值大于0.200，小于0.300，则为可疑。
附件6：猪瘟病毒抗体阻断ELISA检测方法
本方法是用于检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体的一种阻断ELISA方法，通过待测抗体和单克隆抗体与猪瘟病毒抗原的竞争结合，采用辣根过氧化物酶与底物的显色程度来进行判定。
1 操作步骤
在使用时，所有的试剂盒组分都必须恢复到室温18～25℃。使用前应将各组分放置于室温至少1小时。
1.1 分别将50uL样品稀释液加入每个检测孔和对照孔中。
1.2 分别将50uL的阳性对照和阴性对照加入相应的对照孔中，注意不同对照的吸头要更换，以防污染。
1.3 分别将50uL的被检样品加入剩下的检测孔中，注意不同检样的吸头要分开，以防污染。
1.4 轻弹微量反应板或用振荡器振荡，使反应板中的溶液混匀。
1.5 将微量反应板用封条封闭置于湿箱中（18～25℃）孵育2小时，也可以将微量反应板用封条置于湿箱中孵育过夜。
1.6 吸出反应孔中的液体，并用稀释好的洗涤液洗涤3次，注意每次洗涤时都要将洗涤液加满反应孔。
1.7 分别将100uL的抗CSFV酶标二抗（即取即用）加入反应孔中，用封条封闭反应板并于室温下或湿箱中孵育30分钟。
1.8 洗板（见1.6）后，分别将100uL的底物溶液加入反应孔中，于避光、室温条件下放置10分钟。加完第一孔后即可计时。
1.9 在每个反应孔中加入100uL终止液终止反应。注意要按加酶标二抗的顺序加终止液。
1.10 在450nm处测定样本以及对照的吸光值，也可用双波长(450nm和620nm)测定样本以及对照的吸光度值，空气调零。
1.11 计算样本和对照的平均吸光度值。计算方法如下：
计算被检样本的平均值OD450（＝ODTEST）、阳性对照的平均值（＝ODPOS）、阴性对照的平均值（＝ODNEG）。
根据以下公式计算被检样本和阳性对照的阻断率；
ODNEG- ODTEST
阻断率＝———————×100%
ODNEG
2 试验有效性
阴性对照的平均OD450应大于0.50。阳性对照的阻断率应大于50%。
3 结果判定
如果被检样本的阻断率大于或等于40％，该样本被判定为阳性（有CSFV抗体存在）。如果被检样本的阻断率小于或等于30％，该样本被判定为阴性（无CSFV抗体存在）。如果被检样本阻断率在30～40％之间，应在数日后再对该动物进行重测。
附件7：荧光抗体病毒中和试验
本方法是国际贸易指定的猪瘟抗体检测方法。 该试验是采用固定病毒稀释血清的方法。测定的结果表示待检血清中抗体的中和效价。具体操作如下：
5将浓度为2×10细胞/mL的PK-15细胞悬液接种到带有细胞玻片的5cm平皿或莱顿氏管
（leighton’s），也可接种到平底微量培养板中；
细胞培养箱中37℃培养至汇合率为70%～80%的细胞单层（1～2天）。
将待检血清56℃灭活30分钟，用无血清EMEM培养液作2倍系列稀释；
将稀释的待检血清与含200TCID50/0.1mL的猪瘟病毒悬液等体积混合，置37℃孵育1～2小时；
用无血清EMEM培养液漂洗细胞单层。然后，加入血清病毒混合物，每个稀释度加2个莱顿氏管或培养板上的2个孔，37℃孵育1小时；
吸出反应物，加入EMEM维持液[含2%胎牛血清(无BVDV抗体)，56℃灭活30分钟]、0.3％谷氨酰胺、青霉素100IU/mL、链霉素100IU/mL)，37℃继续培养48～72小时；最终用荧光抗体染色法进行检测（见附件2）。
根据特异荧光的有无来计算中和效价。
(中和效价值达到多少表示抗体阳性或抗体达到保护)
附件8：猪瘟中和试验方法
本试验采用固定抗原稀释血清的方法，利用家兔来检测猪体的抗体。
1 操作程序
1.1 先测定猪瘟兔化弱毒（抗原）对家兔的最小感染量。试验时，将抗原用生理盐水稀释，使每1mL含有100个兔的最小感染量，为工作抗原（如抗原对兔的最小感染量为10-5/mL，则将抗原稀释成1000倍使用）。
1.2 将被检猪血清分别用生理盐水作2倍稀释，与含有100个兔的最小感染量工作抗原等量混合，摇匀后，置10～15℃中和2小时，其间振摇2～3次。同时设含有相同工作抗原量加等量生理盐水（不加血清）的对照组，与被检组在同样条件下处理。
1.3 中和完毕，被检组各注射家兔1～2只，对照组注射家兔2只，每只耳静脉注射1mL，观察体温反应，并判定结果。
2 结果判定
2.1 当对照组2只家兔均呈定型热反应（++），或1只兔呈定型热反应（++），另一只兔呈轻热反应时，方能判定结果。被检组如用1只家兔，须呈定型热反应；如用2只家兔，每只家兔应呈定型热反应或轻热反应，被检血清判为阴性。
2.2 兔体体温反应标准如下：
2.2.1 热反应（+）:潜伏期24～72小时，体温上升呈明显曲线，超过常温1℃以上，稽留12～36小时。
2.2.2 可疑反应（±）:潜伏期不到24小时或72小时以上，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时或超过36小时而不下降。
2.2.3 无反应（—）:体温正常。
附件9：消毒
1 药品种类
消毒药品必须选用对猪瘟病毒有效的，如烧碱、醛类、氧化剂类、氯制剂类、双季胺盐类等。
2 消毒范围
猪舍地面及内外墙壁，舍外环境，饲养、饮水等用具，运输等设施设备以及其它一切可能被污染的场所和设施设备。
3 消毒前的准备
3.1 消毒前必须清除有机物、污物、粪便、饲料、垫料等；
3.2 消毒药品必须选用对猪瘟病毒有效的；
3.3 备有喷雾器、火焰喷射枪、消毒车辆、消毒防护用具（如口罩、手套、防护靴等）、消毒容器等。
4 消毒方法
4.1 金属设施设备的消毒，可采取火焰、熏蒸等方式消毒；
4.2 猪舍、场地、车辆等，可采用消毒液清洗、喷洒等方式消毒；
4.3 养猪场的饲料、垫料等，可采取堆积发酵或焚烧等方式处理；
4.4 粪便等可采取堆积密封发酵或焚烧等方式处理；
4.5 饲养、管理等人员可采取淋浴消毒；
4.6 衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取消毒液浸泡、高压灭菌等方式消毒；
4.7 疫区范围内办公、饲养人员的宿舍、公共食堂等场所，可采用喷洒的方式消毒；
4.8 屠宰加工、贮藏等场所以及区域内池塘等水域的消毒可采取相应的方式进行，避免造成污染。
高致病性猪蓝耳病防治技术规范
农医发［2007］10号
农业部关于做好2007年猪病防控工作的通知
2007年3月28日
高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征（俗称蓝耳病）病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病。仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡是其特征。
为及时、有效地预防、控制和扑灭高致病性猪蓝耳病疫情，依据《中华人民共和国动物防疫法》、《重大动物疫情应急条例》和《国家突发重大动物疫情应急预案》及有关的法律法规，制定本规范。
1 适用范围
本规范规定了高致病性猪蓝耳病诊断、疫情报告、疫情处置、预防控制、检疫监督的操作程序与技术标准。
本规范适用于中华人民共和国境内一切与高致病性猪蓝耳病防治活动有关的单位和个人。
2 诊断
2.1 诊断指标
2.1.1 临床指标
体温明显升高，可达41℃以上；眼结膜炎、眼睑水肿；咳嗽、气喘等呼吸道症状；部分猪后躯无力、不能站立或共济失调等神经症状；仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，成年猪也可发病死亡。
2.1.2 病理指标
可见脾脏边缘或表面出现梗死灶，显微镜下见出血性梗死；肾脏呈土黄色，表面可见针尖至小米粒大出血点斑，皮下、扁桃体、心脏、膀胱、肝脏和肠道均可见出血点和出血斑。显微镜下见肾间质性炎，心脏、肝脏和膀胱出血性、渗出性炎等病变；部分病例可见胃肠道出血、溃疡、坏死。
2.1.3 病原学指标
2.1.3.1 高致病性猪蓝耳病病毒分离鉴定阳性。
2.1.3.2 高致病性猪蓝耳病病毒反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测阳性。
2.2结果判定
2.2.1 疑似结果
符合2.1.1和2.1.2，判定为疑似高致病性猪蓝耳病。
2.2.2 确诊
符合2.2.1，且符合2.1.3.1和2.1.3.2之一的，判定为高致病性猪蓝耳病。
3 疫情报告
3.1 任何单位和个人发现猪出现急性发病死亡情况，应及时向当地动物疫控机构报告。
3.2 当地动物疫控机构在接到报告或了解临床怀疑疫情后，应立即派员到现场进行初步调查核实，符合2.2.1规定的，判定为疑似疫情。
3.3 判定为疑似疫情时，应采集样品进行实验室诊断，必要时送省级动物疫控机构或国家指定实验室。
3.4 确认为高致病性猪蓝耳病疫情时，应在2个小时内将情况逐级报至省级动物疫控机构和同级兽医行政管理部门。省级兽医行政管理部门和动物疫控机构按有关规定向农业部报告疫情。
3.5 国务院兽医行政管理部门根据确诊结果，按规定公布疫情。
4 疫情处置
4.1 疑似疫情的处置
对发病场/户实施隔离、监控，禁止生猪及其产品和有关物品移动，并对其内、外环境实施严格的消毒措施。对病死猪、污染物或可疑污染物进行无害化处理。必要时，对发病猪和同群猪进行扑杀并无害化处理。
4.2 确认疫情的处置
4.2.1 划定疫点、疫区、受威胁区
由所在地县级以上兽医行政管理部门划定疫点、疫区、受威胁区。
疫点：为发病猪所在的地点。规模化养殖场/户，以病猪所在的相对独立的养殖圈舍为疫点；散养猪以病猪所在的自然村为疫点；在运输过程中，以运载工具为疫点；在市场发现疫情，以市场为疫点；在屠宰加工过程中发现疫情，以屠宰加工厂/场为疫点。
疫区：指疫点边缘向外延3公里范围内的区域。根据疫情的流行病学调查、免疫状况、疫点周边的饲养环境、天然屏障（如河流、山脉等）等因素综合评估后划定。
受威胁区：由疫区边缘向外延伸5公里的区域划为受威胁区。
4.2.2 封锁疫区
由当地兽医行政管理部门向当地县级以上人民政府申请发布封锁令，对疫区实施封锁：在疫区周围设置警示标志；在出入疫区的交通路口设置动物检疫消毒站，对出入的车辆和有关物品进行消毒；关闭生猪交易市场，禁止生猪及其产品运出疫区。必要时，经省级人民政府批准，可设立临时监督检查站，执行监督检查任务。
4.2.3 疫点应采取的措施
扑杀所有病猪和同群猪；对病死猪、排泄物、被污染饲料、垫料、污水等进行无害化处理；对被污染的物品、交通工具、用具、猪舍、场地等进行彻底消毒。
4.2.4 疫区应采取的措施
对被污染的物品、交通工具、用具、猪舍、场地等进行彻底消毒；对所有生猪用高致病性猪蓝耳病灭活疫苗进行紧急强化免疫，并加强疫情监测。
4.2.2.5 受威胁区应采取的措施
对受威胁区所有生猪用高致病性猪蓝耳病灭活疫苗进行紧急强化免疫，并加强疫情监测。
4.2.2.6 疫源分析与追踪调查
开展流行病学调查，对病原进行分子流行病学分析，对疫情进行溯源和扩散风险评估。
4.2.2.7 解除封锁
疫区内最后一头病猪扑杀或死亡后14天以上，未出现新的疫情；在当地动物疫控机构的监督指导下，对相关场所和物品实施终末消毒。经当地动物疫控机构审验合格，由当地兽医行政管理部门提出申请，由原发布封锁令的人民政府宣布解除封锁。
4.3 疫情记录
对处理疫情的全过程必须做好完整详实的记录（包括文字、图片和影像等），并归档。 5 预防控制
5.1 监测
5.1.1 监测主体
县级以上动物疫控机构。
5.1.2 监测方法
流行病学调查、临床观察、病原学检测。
5.1.3 监测范围
5.1.3.1 养殖场/户，交易市场、屠宰厂/场、跨县调运的生猪。
5.1.3.2 对种猪场、隔离场、边境、近期发生疫情及疫情频发等高风险区域的生猪进行重点监测。
5.1.4监测预警
各级动物疫控机构对监测结果及相关信息进行风险分析，做好预警预报。
农业部指定的实验室对分离到的毒株进行生物学和分子生物学特性分析与评价，及时向国务院兽医行政管理部门报告。
5.1.5 监测结果处理
按照《国家动物疫情报告管理办法》的有关规定将监测结果逐级汇总上报至国家动物疫控机构。
5.2 免疫
5.2.1 对所有生猪用高致病性猪蓝耳病灭活疫苗进行免疫，免疫方案见《猪病免疫推荐方案（试行）》。发生高致病性猪蓝耳病疫情时，用高致病性猪蓝耳病灭活疫苗进行紧急强化免疫。
5.2.2 养殖场/户必须按规定建立完整免疫档案，包括免疫登记表、免疫证、畜禽标识等。
5.2.3 各级动物疫控机构定期对免疫猪群进行免疫抗体水平监测，根据群体抗体水平消长情况及时加强免疫。
5.3 加强饲养管理，实行封闭饲养，建立健全各项防疫制度，做好消毒、杀虫灭鼠等工作。
6 检疫监督
6.1 产地检疫
生猪在离开饲养地之前，养殖场/户必须向当地动物卫生监督机构报检。动物卫生监督机构接到报检后必须及时派员到场/户实施检疫。检疫合格后，出具合格证明；对运载工具进行消毒，出具消毒证明，对检疫不合格的按照有关规定处理。
6.2 屠宰检疫
动物卫生监督机构的检疫人员对生猪进行验证查物，合格后方可入厂/场屠宰。检疫合格并加盖（封）检疫标志后方可出厂/场，不合格的按有关规定处理。
6.3 种猪异地调运检疫
跨省调运种猪时，应先到调入地省级动物卫生监督机构办理检疫审批手续，调出地按照规范进行检疫，检疫合格方可调运。到达后须隔离饲养14天以上，由当地动物卫生监督机构检疫合格后方可投入使用。
6.4 监督管理
6.4.1 动物卫生监督机构应加强流通环节的监督检查，严防疫情扩散。生猪及产品凭检疫合格证（章）和畜禽标识运输、销售。
6.4.2 生产、经营动物及动物产品的场所，必须符合动物防疫条件，取得动物防疫合格证。当地动物卫生监督机构应加强日常监督检查。
6.4.3 任何单位和个人不得随意处置及转运、屠宰、加工、经营、食用病（死）猪及其产品。
口蹄疫防治技术规范
农医发［2007］12号
农业部关于印发《高致病性禽流感防治技术规范》等14个动物疫病防治技术规范的通
知
2007年4月9日
口蹄疫（Foot and Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒引起的以偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物传染病，我国规定为一类动物疫病。
为预防、控制和扑灭口蹄疫，依据《中华人民共和国动物防疫法》、《重大动物疫情应急条例》、《国家突发重大动物疫情应急预案》等法律法规，制定本技术规范。
1 适用范围
本规范规定了口蹄疫疫情确认、疫情处置、疫情监测、免疫、检疫监督的操作程序、技术标准及保障措施。
本规范适用于中华人民共和国境内一切与口蹄疫防治活动有关的单位和个人。
2 诊断
2.1 诊断指标
2.1.1 流行病学特点
2.1.1.1 偶蹄动物，包括牛科动物（牛、瘤牛、水牛、牦牛）、绵羊、山羊、猪及所有野生反刍和猪科动物均易感，驼科动物（骆驼、单峰骆驼、美洲驼、美洲骆马）易感性较低。
2.1.1.2 传染源主要为潜伏期感染及临床发病动物。感染动物呼出物、唾液、粪便、尿液、乳、精液及肉和副产品均可带毒。康复期动物可带毒。
2.1.1.3 易感动物可通过呼吸道、消化道、生殖道和伤口感染病毒，通常以直接或间接接触（飞沫等）方式传播，或通过人或犬、蝇、蜱、鸟等动物媒介，或经车辆、器具等被污染物传播。如果环境气候适宜，病毒可随风远距离传播。
2.1.2 临床症状
2.1.2.1 牛呆立流涎，猪卧地不起，羊跛行；
2.1.2.2 唇部、舌面、齿龈、鼻镜、蹄踵、蹄叉、乳房等部位出现水泡；
2.1.2.3 发病后期，水泡破溃、结痂，严重者蹄壳脱落，恢复期可见瘢痕、新生蹄甲； 2.1.2.4 传播速度快，发病率高；成年动物死亡率低，幼畜常突然死亡且死亡率高，仔猪常成窝死亡。
2.1.3 病理变化
2.1.3.1消化道可见水泡、溃疡；
2.1.3.2幼畜可见骨骼肌、心肌表面出现灰白色条纹，形色酷似虎斑。 2.1.4 病原学检测
2.1.4.1 间接夹心酶联免疫吸附试验，检测阳性（ELISA OIE 标准方法 附件一）； 2.1.4.2 RT-PCR试验，检测阳性（采用国家确认的方法）； 2.1.4.3 反向间接血凝试验（RIHA），检测阳性（附件二）； 2.1.4.4 病毒分离，鉴定阳性。 2.1.5 血清学检测
2.1.5.1中和试验，抗体阳性；
2.1.5.2液相阻断酶联免疫吸附试验，抗体阳性；
2.1.5.3非结构蛋白ELISA检测感染抗体阳性； 2.1.5.4 正向间接血凝试验（IHA），抗体阳性（附件三）。 2.2 结果判定
2.2.1 疑似口蹄疫病例
符合该病的流行病学特点和临床诊断或病理诊断指标之一，即可定为疑似口蹄疫病例。 2.2.2 确诊口蹄疫病例
疑似口蹄疫病例，病原学检测方法任何一项阳性，可判定为确诊口蹄疫病例； 疑似口蹄疫病例，在不能获得病原学检测样本的情况下，未免疫家畜血清抗体检测阳性或免疫家畜非结构蛋白抗体ELISA检测阳性，可判定为确诊口蹄疫病例。
2.3疫情报告
任何单位和个人发现家畜上述临床异常情况的，应及时向当地动物防疫监督机构报告。动物防疫监督机构应立即按照有关规定赴现场进行核实。
2.3.1 疑似疫情的报告
县级动物防疫监督机构接到报告后，立即派出2名以上具有相关资格的防疫人员到现场进行临床和病理诊断。确认为疑似口蹄疫疫情的，应在2小时内报告同级兽医行政管理部门，并逐级上报至省级动物防疫监督机构。省级动物防疫监督机构在接到报告后，1小时内向省级兽医行政管理部门和国家动物防疫监督机构报告。
诊断为疑似口蹄疫病例时，采集病料（附件四），并将病料送省级动物防疫监督机构，必要时送国家口蹄疫参考实验室。
2.3.2 确诊疫情的报告
省级动物防疫监督机构确诊为口蹄疫疫情时，应立即报告省级兽医行政管理部门和国家动物防疫监督机构；省级兽医管理部门在1小时内报省级人民政府和国务院兽医行政管理部门。
国家参考实验室确诊为口蹄疫疫情时，应立即通知疫情发生地省级动物防疫监督机构和兽医行政管理部门，同时报国家动物防疫监督机构和国务院兽医行政管理部门。
省级动物防疫监督机构诊断新血清型口蹄疫疫情时，将样本送至国家口蹄疫参考实验室。
2.4 疫情确认
国务院兽医行政管理部门根据省级动物防疫监督机构或国家口蹄疫参考实验室确诊结果，确认口蹄疫疫情。
3 疫情处置
3.1疫点、疫区、受威胁区的划分
3.1.1疫点 为发病畜所在的地点。相对独立的规模化养殖场/户，以病畜所在的养殖场/户为疫点；散养畜以病畜所在的自然村为疫点；放牧畜以病畜所在的牧场及其活动场地为疫点；病畜在运输过程中发生疫情，以运载病畜的车、船、飞机等为疫点；在市场发生疫情，以病畜所在市场为疫点；在屠宰加工过程中发生疫情，以屠宰加工厂（场）为疫点。
3.1.2 疫区 由疫点边缘向外延伸3公里内的区域。 3.1.3 受威胁区 由疫区边缘向外延伸10公里的区域。
在疫区、受威胁区划分时，应考虑所在地的饲养环境和天然屏障（河流、山脉等）。 3.2 疑似疫情的处置
对疫点实施隔离、监控，禁止家畜、畜产品及有关物品移动，并对其内、外环境实施严格的消毒措施。
必要时采取封锁、扑杀等措施。
3.3 确诊疫情处置
疫情确诊后，立即启动相应级别的应急预案。 3.3.1 封锁
疫情发生所在地县级以上兽医行政管理部门报请同级人民政府对疫区实行封锁，人民政府在接到报告后，应在24小时内发布封锁令。
跨行政区域发生疫情的，由共同上级兽医行政管理部门报请同级人民政府对疫区发布封锁令。
3.3.2 对疫点采取的措施
3.3.2.1 扑杀疫点内所有病畜及同群易感畜，并对病死畜、被扑杀畜及其产品进行无害化处理（附件五）；
3.3.2.2对排泄物、被污染饲料、垫料、污水等进行无害化处理（附件六）；
3.3.2.3对被污染或可疑污染的物品、交通工具、用具、畜舍、场地进行严格彻底消毒（附件七）；
3.3.2.4 对发病前14天售出的家畜及其产品进行追踪，并做扑杀和无害化处理。 3.3.3 对疫区采取的措施
3.3.3.1在疫区周围设置警示标志，在出入疫区的交通路口设置动物检疫消毒站，执行监督检查任务，对出入的车辆和有关物品进行消毒；
3.3.3.2 所有易感畜进行紧急强制免疫，建立完整的免疫档案；
3.3.3.3 关闭家畜产品交易市场，禁止活畜进出疫区及产品运出疫区； 3.3.3.4对交通工具、畜舍及用具、场地进行彻底消毒； 3.3.3.5对易感家畜进行疫情监测，及时掌握疫情动态;
3.3.3.6 必要时，可对疫区内所有易感动物进行扑杀和无害化处理。 3.3.4对受威胁区采取的措施
3.3.4.1 最后一次免疫超过一个月的所有易感畜，进行一次紧急强化免疫； 3.3.4.2 加强疫情监测，掌握疫情动态。 3.3.5 疫源分析与追踪调查
按照口蹄疫流行病学调查规范，对疫情进行追踪溯源、扩散风险分析（附件八）。 3.3.6解除封锁
3.3.6.1封锁解除的条件
口蹄疫疫情解除的条件：疫点内最后1头病畜死亡或扑杀后连续观察至少14天，没有新发病例；疫区、受威胁区紧急免疫接种完成；疫点经终末消毒；疫情监测阴性。
新血清型口蹄疫疫情解除的条件：疫点内最后1头病畜死亡或扑杀后连续观察至少14天没有新发病例；疫区、受威胁区紧急免疫接种完成；疫点经终末消毒；对疫区和受威胁区的易感动物进行疫情监测，结果为阴性。
3.3.6.2解除封锁的程序：动物防疫监督机构按照上述条件审验合格后，由兽医行政管理部门向原发布封锁令的人民政府申请解除封锁，由该人民政府发布解除封锁令。
必要时由上级动物防疫监督机构组织验收。
4 疫情监测
4.1 监测主体：县级以上动物防疫监督机构。
4.2 监测方法：临床观察、实验室检测及流行病学调查。 4.3 监测对象：以牛、羊、猪为主，必要时对其他动物监测。 4.4 监测的范围
4.4.1 养殖场户、散养畜，交易市场、屠宰厂（场）、异地调入的活畜及产品。
4.4.2对种畜场、边境、隔离场、近期发生疫情及疫情频发等高风险区域的家畜进行重点监测。
监测方案按照当年兽医行政管理部门工作安排执行。
4.5疫区和受威胁区解除封锁后的监测 临床监测持续一年，反刍动物病原学检测连续2次，每次间隔1个月，必要时对重点区域加大监测的强度。
4.6在监测过程中，对分离到的毒株进行生物学和分子生物学特性分析与评价，密切注意病毒的变异动态，及时向国务院兽医行政管理部门报告。
4.7 各级动物防疫监督机构对监测结果及相关信息进行风险分析，做好预警预报。 4.8监测结果处理
监测结果逐级汇总上报至国家动物防疫监督机构，按照有关规定进行处理。
5 免疫
5.1 国家对口蹄疫实行强制免疫，各级政府负责组织实施，当地动物防疫监督机构进行监督指导。免疫密度必须达到100%。
5.2 预防免疫，按农业部制定的免疫方案规定的程序进行。 5.3 突发疫情时的紧急免疫按本规范有关条款进行。
5.4 所用疫苗必须采用农业部批准使用的产品，并由动物防疫监督机构统一组织、逐级供应。
5.5 所有养殖场/户必须按科学合理的免疫程序做好免疫接种，建立完整免疫档案（包括免疫登记表、免疫证、免疫标识等）。
5.6 各级动物防疫监督机构定期对免疫畜群进行免疫水平监测，根据群体抗体水平及时加强免疫。
6 检疫监督
6.1 产地检疫
猪、牛、羊等偶蹄动物在离开饲养地之前，养殖场/户必须向当地动物防疫监督机构报检，接到报检后，动物防疫监督机构必须及时到场、到户实施检疫。检查合格后，收回动物免疫证，出具检疫合格证明；对运载工具进行消毒，出具消毒证明，对检疫不合格的按照有关规定处理。
6.2 屠宰检疫
动物防疫监督机构的检疫人员对猪、牛、羊等偶蹄动物进行验证查物，证物相符检疫合格后方可入厂（场）屠宰。宰后检疫合格，出具检疫合格证明。对检疫不合格的按照有关规定处理。
6.3 种畜、非屠宰畜异地调运检疫
国内跨省调运包括种畜、乳用畜、非屠宰畜时，应当先到调入地省级动物防疫监督机构办理检疫审批手续，经调出地按规定检疫合格，方可调运。起运前两周，进行一次口蹄疫强化免疫，到达后须隔离饲养14天以上，由动物防疫监督机构检疫检验合格后方可进场饲养。
6.4 监督管理
6.4.1动物防疫监督机构应加强流通环节的监督检查，严防疫情扩散。猪、牛、羊等偶蹄动物及产品凭检疫合格证（章）和动物标识运输、销售。
6.4.2生产、经营动物及动物产品的场所，必须符合动物防疫条件，取得动物防疫合格证，当地动物防疫监督机构应加强日常监督检查。
6.4.3 各地根据防控家畜口蹄疫的需要建立动物防疫监督检查站，对家畜及产品进行监督检查，对运输工具进行消毒。发现疫情，按照《动物防疫监督检查站口蹄疫疫情认定和
处置办法》相关规定处置。
6.4.4 由新血清型引发疫情时，加大监管力度，严禁疫区所在县及疫区周围50公里范围内的家畜及产品流动。在与新发疫情省份接壤的路口设置动物防疫监督检查站、卡实行24小时值班检查；对来自疫区运输工具进行彻底消毒，对非法运输的家畜及产品进行无害化处理。
6.4.5任何单位和个人不得随意处置及转运、屠宰、加工、经营、食用口蹄疫病（死）畜及产品；未经动物防疫监督机构允许，不得随意采样；不得在未经国家确认的实验室剖检分离、鉴定、保存病毒。
7 保障措施
7.1各级政府应加强机构、队伍建设，确保各项防治技术落实到位。
7.2各级财政和发改部门应加强基础设施建设，确保免疫、监测、诊断、扑杀、无害化处理、消毒等防治技术工作经费落实。
7.3各级兽医行政部门动物防疫监督机构应按本技术规范，加强应急物资储备，及时培训和演练应急队伍。
7.4发生口蹄疫疫情时，在封锁、采样、诊断、流行病学调查、无害化处理等过程中，要采取有效措施做好个人防护和消毒工作，防止人为扩散。
附件1：间接夹心酶联免疫吸附试验（I-ELISA）
1 试验程序和原理
1.1利用包被于固相（I，96孔平底ELISA专用微量板）的FMDV型特异性抗体（AB，包被抗体，又称为捕获抗体），捕获待检样品中相应型的FMDV抗原（Ag）。再加入与捕获抗体同一血清型，但用另一种动物制备的抗血清（Ab，检测抗体）。如果有相应型的病毒抗原存在，则形成“夹心”式结合，并被随后加入的酶结合物/显色系统（*E/S）检出。
1.2由于FMDV的多型性，和可能并发临床上难以区分的水泡性疾病，在检测病料时必然包括几个血清型（如O、A、亚洲-1型）；及临床症状相同的某些疾病，如猪水泡病（SVD）。
2 材料
2.1 样品的采集和处理 见附件四
2.2 主要试剂 2.2.1 抗体
2.2.1.1包被抗体：兔抗FMDV-“O”、“A”、“亚洲-I”型146S血清；及兔抗SVDV-160S血清。
2.2.1.2检测抗体：豚鼠抗FMDV-“O”、“A”、“亚洲-I”型146S血清；及豚鼠抗SVDV-160S血清。
2.2.2 酶结合物
兔抗豚鼠Ig抗体(Ig)-辣根过氧化物酶(HRP)结合物。
2.2.3 对照抗原 灭活的FMDV-“O”“A”“亚洲-I”各型及SVDV细胞病毒液。
2.2.4 底物溶液（底物/显色剂）
3％过氧化氢/3.3mmol/L邻苯二胺(OPD)。
2.2.5 终止液 1.25mol/L 硫酸。
2.2.6 缓冲液
2.2.6.1包被缓冲液 0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3，pH9.6。
2.2.6.2稀释液A 0.01mol/L PBS - 0.05％(v/v)Tween-20，pH7.2～7.4。 2.2.6.3稀释液B 5％脱脂奶粉（w/v）- 稀释液A 。
2.2.6.4洗涤缓冲液 0.002mol/L PBS - 0.01％(v/v)Tween-20。 2.3 主要器材设备 2.3.1 固相
96孔平底聚苯乙烯ELISA专用板。
2.3.2 移液器、尖头及贮液槽
微量可调移液器一套，可调范围0.5～5000μL(5～6支)；多（4、8、12）孔道微量可调移液器（25～250μL）；微量可调连续加样移液器（10～100μL）；与各移液器匹配的各种尖头，及配套使用的贮液槽。
2.3.3 振荡器
与96孔微量板配套的旋转振荡器。
2.3.4 酶标仪,492nm波长滤光片。 2.3.5 洗板机或洗涤瓶,吸水纸巾。 2.3.6 37℃恒温温室或温箱。 3 操作方法 3.1 预备试验
为了确保检测结果准确可靠，必须最优化组合该ELISA，即试验所涉及的各种试剂，包括包被抗体、检测抗体、酶结合物、阳性对照抗原都要预先测定，计算出它们的最适稀释度，既保证试验结果在设定的最佳数据范围内，又不浪费试剂。使用诊断试剂盒时，可按说明书指定用量和用法。如试验结果不理想，重新滴定各种试剂后再检测。
3.2 包被固相
3.2.1 FMDV各血清型及SVDV兔抗血清分别以包被缓冲液稀释至工作浓度，然后按图3-1所示布局加入微量板各行。每孔50μL。加盖后37℃振荡2h。或室温（20～25℃）振荡30min，然后置湿盒中4℃过夜（可以保存1周左右）。
3.2.2 一般情况下,牛病料鉴定“O”和“A”两个型，某些地区的病料要加上“亚洲-I”型；猪病料要加上SVDV。
图3-1：定型ELISA微量板包被血清布局 、对照和被检样品布局
则根据需要取出几条。在试验台上放置20min，再洗涤5次，扣干。
3.3 加对照抗原和待检样品 3.3.1 布局
空白和各阳性对照、待检样品在 ELISA 板上的分布位置如图3-1所示。 3.3.2 加样
3.3.2.1第5和第6列为空白对照（C-），每孔加50μL稀释液A。 3.3.2.2先将各型阳性对照抗原分别以稀释液A适当稀释，然后加入与包被抗体同型的各行孔中，C++为强阳性，C+为阳性，可以用同一对照抗原的不同稀释度。每一对照2孔，每孔50μL。
3.3.2.3按待检样品的序号（S1、S2 ...）逐个加入，每份样品每个血清型加2孔，每孔50μL。 37℃ 振荡1h，洗涤5次，扣干。
3.4 加检测抗体
各血清型豚鼠抗血清以稀释液A稀释至工作浓度，然后加入与包被抗体同型各行孔中，每孔50μL。37℃振荡1h。洗涤5次，扣干。
3.5 加酶结合物
酶结合物以稀释液B稀释至工作浓度，每孔50μL。 37℃振荡40min。洗涤5次，扣干。
3.6 加底物溶液 试验开始时，按当天需要量从冰箱暗盒中取出OPD，放在温箱中融化并使之升温至37℃。临加样前，按每6mL OPD加3％双氧水30μL（一块微量板用量），混匀后每孔加50μL。37℃振荡15min。
3.7 加终止液
显色反应15分钟，准时加终止液1.25mol/L H2SO4。50μL/孔。
3.8 观察和判读结果
终止反应后,先用肉眼观察全部反应孔。如空白对照和阳性对照孔的显色基本正常,再用酶标仪(492nm)判读OD值。
4 结果判定 4.1 数据计算
为了便于说明，假设表3-1所列数据为检测结果（OD值）。
利用表3-1所列数据,计算平均OD值和平均修正OD值（表3-2）
4.1.1各行2孔空白对照（C-）平均OD值；
4.1.2各行（各血清型）抗原对照（C++、C+）平均OD值； 4.1.3各待检样品各血清型（2孔）平均OD值；
4.1.4计算出各平均修正OD值（＝［每个(2)或(3)值］－［同一行的(1)值］。
表3-1. 定型ELISA结果(OD值)
C++ C+ C- S1 S2 S3
C++ C+ C- S1 S2 S3
4.2 结果判定 4.2.1 试验不成立
如果空白对照(C-)平均OD值＞0.10，则试验不成立，本试验结果无效。
4.2.2 试验基本成立
如果空白对照(C-)平均OD值≤0.10，则试验基本成立。
4.2.3 试验绝对成立
如果空白对照(C-)平均OD值≤0.10，C+ 平均修正OD值＞0.10，C++ 平均修正OD值＞1.00, 试验绝对成立。如表2中A、B、C、D行所列数据。
4.2.3.1如果某一待检样品某一型的平均修正OD值≤0.10，则该血清型为阴性。 如S1的“A”、“Asia-1”型和“SVDV”。
4.2.3.2如果某一待检样品某一型的平均修正OD值＞0.10，而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，则该样品为该最高平均修正OD值所在的血清型。如S1为“O”型；S3为“Asia-I”型。
4.2.3.3虽然某一待检样品某一型的平均修正OD值＞0.10，但不大于其他型的平均修正OD值的2倍，则该样品只能判定为可疑。该样品应接种乳鼠或细胞，并盲传数代增毒后再作检测。如S2“A”型。
4.2.4 试验部分成立
如果空白对照(C-)平均OD值≤0.10，C+ 平均修正OD值≤0.10，C++ 平均修正OD值≤1.00, 试验部分成立。如表2中E、F、G、H行所列数据。
4.2.4.1如果某一待检样品某一型的平均修正OD值≥0.10，而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，则该样品为该最高平均修正OD值所在的血清型。 例如S4判定为“O”型。
4.2.4.2如果某一待检样品某一型的平均修正OD值介于0.10～1.00之间,而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，该样品可以判定为该最高OD值所在血清型。例如S5判定为“A”型。
4.2.4.3如果某一待检样品某一型的平均修正OD值介于0.10～1.00之间,但不比其他型的平均修正OD值大2倍，该样品应增毒后重检。如S6“亚洲-I”型。
注意：重复试验时，首先考虑调整对照抗原的工作浓度。如调整后再次试验结果仍不合格，应更换对照抗原或其他试剂。
附件2：反向间接血凝试验（RIHA）
1 材料准备
1.1 96孔微型聚乙烯血凝滴定板（110度），微量振荡器或微型混合器，0.025 mL、0.05mL稀释用滴管、乳胶吸头或25μL、50μL移液加样器。
1.2 pH7.6、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.6、0.05mol/L PB），pH7.6、50%丙三醇磷酸缓冲液（GPB），pH7.2、0.11mol/L磷酸缓冲液（pH7.2、0.11mol/L PB），配制方法见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）《猪水泡病诊断技术》附录A（规范性附录）。
1.3 稀释液I、稀释液II，配制方法见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）《猪水泡病诊断技术》附录B（规范性附录）。
1.4 标准抗原、阳性血清，由指定单位提供，按说明书使用和保存。
1.5敏化红细胞诊断液：由指定单位提供，效价滴定见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）《猪水泡病诊断技术》附录C（规范性附录）。
1.6 被检材料处理方法见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）《猪水泡病诊断技术》附录E（规范性附录）。
2 操作方法
2.1 使用标准抗原进行口蹄疫A、O、C、Asia-I型及与猪水泡病鉴别诊断。
2.1.1被检样品的稀释：把8只试管排列于试管架上，自第1管开始由左至右用稀释液I作二倍连续稀释（即1:6、1:12、1:24„„1:768）,每管容积0.5 mL。
2.1.2按下述滴加被检样品和对照：
2.1.2.1在血凝滴定板上的第一至五排，每排的第8孔滴加第8管稀释被检样品0.05 mL，每排的第7孔滴加第7管稀释被检样品0.05 mL，以此类推至第1孔。
2.1.2.2每排的第9 孔滴加稀释液I 0.05 mL,作为稀释液对照。
2.1.2.3每排的第10孔按顺序分别滴加口蹄疫A、O、C、Asia-I型和猪水泡病标准抗原（1：30稀释）各0.05 mL，作为阳性对照。
2.1.3 滴加敏化红细胞诊断液：先将敏化红细胞诊断液摇匀，于滴定板第一至五排的第1～10孔分别滴加口蹄疫A、O、C、Asia-I型和猪水泡病敏化红细胞诊断液，每孔0.025 mL，置微量振荡器上振荡1分钟～2分钟,20℃～35℃放置1.5小时～2小时后判定结果。
2.2使用标准阳性血清进行口蹄疫O型及与猪水泡病鉴别诊断。 2.2.1每份被检样品作四排、每孔先各加入25μL稀释液II。 2.2.2每排第1孔各加被检样品25μL，然后分别由左至右作二倍连续稀释至第7孔（竖板）或第11孔（横板）。每排最后孔留作稀释液对照。
2.2.3滴加标准阳性血清：在第一、三排每孔加入25μL稀释液II；第二排每孔加入25μL稀释至1:20的口蹄疫O型标准阳性血清；第四排每孔加入25μL稀释至1:100的猪水泡病标准阳性血清；置微型混合器上振荡1分钟～2分钟，加盖置37℃作用30分钟。
2.2.4滴加敏化红细胞诊断液：在第一和第二排每孔加入口蹄疫O型敏化红细胞诊断液25μL；第三和第四排每孔加入猪水泡病敏化红细胞诊断液25μL；置微型混合器上振荡1分钟～2分钟，加盖20℃～35℃放置2小时后判定结果。
3 结果判定
3.1按以下标准判定红细胞凝集程度：“++++”—100%完全凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围；“+++”—75%凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围，但孔底中心有红细胞形成的针尖大的小点；“++”—50%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，孔底有一红细胞沉下的小点；“+”—25%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，但大部分红细胞已沉积于孔底；“－”—不凝集，红细胞完全沉积于孔底成一圆点。
3.2操作方法2.1的结果判定：稀释液I对照孔不凝集、标准抗原阳性孔凝集试验方成
立。
3.2.1若只第一排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫A型；若只第二排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫O型；以此类推。若只第五排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为猪水泡病
3.2.2致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。 3.2.3如出现2排以上孔的凝集，以某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价2个对数（以2为底）浓度以上者即可判为阳性，其余判为阴性。
3.3操作方法2.2的结果判定：稀释液II对照孔不凝集试验方可成立。 3.3.3.1若第一排出现2孔以上的凝集（++以上），且第二排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第三、四排不出现凝集判为口蹄疫O型阳性。若第三排出现2孔以上的凝集（++以上），且第四排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第一、二排不出现凝集则判为猪水泡病阳性。
3.3.3.2致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。
附件3：正向间接血凝试验（IHA）
1 原理
用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）。 抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。
2 适用范围
主要用于检测O型口蹄疫免疫动物血清抗体效价。
3 试验器材和试剂
3.1 96孔110°V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板 3.2 微量移液器（50μL 25μL）取液塑咀 3.3 微量振荡器
3.4 O型口蹄疫血凝抗原 3.5 O型口蹄疫阴性对照血清 3.6 O型口蹄疫阳性对照血清 3.7 稀释液
3.8 待检血清（每头约0.5ml血清即可）56℃水浴灭活30分钟 4 试验方法 4.1 加稀释液
在血凝板上1-6排的1-9孔；第7排的1-4孔第6-7孔；第8排的1-12孔各加稀释液50μL。
4.2 稀释待检血清
取1号待检血清50μL加入第1排第1孔，并将塑咀插入孔底，右手拇指轻压弹簧1-2次混匀（避免产生过多的气泡），从该孔取出50μL移入第2孔，混匀后取出50μL移入第3 孔„„直至第9孔混匀后取出50μL丢弃。此时第1排1-9孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：1:2⑴、1:4⑵、1:8⑶、1:16⑷、1:32⑸、1:64⑹、1:128⑺、1:256⑻、1:512⑼。
取2号待检血清加入第2排；取3号待检血清加入第3排„„均按上法稀释，注意！每取一份血清时，必须更换塑咀一个。
4.3 稀释阴性对照血清
在血凝板的第7排第1孔加阴性血清50μL，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2⑴、1:4⑵、1:8⑶、1:16⑷。第6-7孔为稀释液对照。
4.4 稀释阳性对照血清
在血凝板的第8排第1孔加阳性血清50μL，对倍数稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。此时阳性血清的稀释倍数依次为1：2-1：4096。
4.5 加血凝抗原
被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加O型血凝抗原（充分摇匀，瓶底应无血球沉淀）25μL。
4.6 振荡混匀
将血凝板置于微量振荡器上1-2分钟，如无振荡器，用手轻拍混匀亦可，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或37℃下静置1.5-2小时判定结果，也可延至翌日判定。
4.7 判定标准
移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:16孔，稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点），或仅出现“+”凝集（血球大部沉于孔底，边缘稍有少量血球悬浮）。
阳性血清对照1:2-1:256各孔应出现“++”—“+++”凝集为合格（少量血球沉入孔底，大部血球悬浮于孔内）。
在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1-5孔呈现“++”—“+++”凝集，6-7孔呈现“++”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的口蹄疫抗体效价为1:128。
接种口蹄疫疫苗的猪群免疫抗体效价达到1:128（即第7孔）牛群、羊群免疫抗体效价达到1:256（第8孔）呈现“++”凝集为免疫合格。
5 检测试剂的性状、规格 5.1 性状
5.1.1 液体血凝抗原：摇匀呈棕红色（或咖啡色），静置后，血球逐渐沉入瓶底。 5.1.2 阴性对照血清：淡黄色清亮稍带粘性的液体。 5.1.3 阳性对照血清：微红或淡色稍混浊带粘性的液体。
5.1.4 稀释液：淡黄或无色透明液体，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶，不影响使用。
5.2 包装
5.2.1 液体血凝抗原：摇匀后即可使用，5ml/瓶。 5.2.2 阴性血清：1ml/瓶，直接稀释使用。 5.2.3 阳性血清：1ml/瓶，直接稀释使用。
5.2.4 稀释液：100 ml/瓶，直接使用，4-8℃保存。 5.2.5 保存条件及保存期
5.2.5.1 液体血凝抗原：4-8℃保存（切勿冻结），保存期3个月。 5.2.5.2 阴性对照血清：-15~-20℃保存，有效期1年。 5.2.5.3 阳性对照血清：-15~-20℃保存，有效期1年。 6 注意事项
6.1 为使检测获得正确结果，请在检测前仔细阅读说明书。
6.2 严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。 6.3 勿用90°和130°血凝板，严禁使用一次性血凝板，以免误判结果。
6.4 用过的血凝板应及时在水龙头冲净血球。再用蒸馏水或去离子水冲洗2次，甩干水份放37℃恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，37℃干燥备用。血凝板应浸泡在洗液中（浓硫酸与重铬酸钾按1：1混合），48小时捞出后清水冲净。
6.5 每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照。 “-”表示完全不凝集或0-10%血球凝集。
“+”表示10-25%血球凝集 “+++”表示75%血球凝集。 “++”表示50%血球凝集 “++++”表示90-100%血球凝集。
6.6 用不同批次的血凝抗原检测同一份血清时，应事先用阳性血清准确测定各批次血凝抗原的效价，取抗原效价相同或相近的血凝抗原检测待检血清抗体水平的结果是基本一致的，如果血凝抗原效价差别很大用来检测同一血清样品，肯定会出现检测结果不一致。
6.7 收到本试剂盒时，应立即打开包装，取出血凝抗原瓶，用力摇动，使粘附在瓶盖上的红细胞摇下，否则易出现沉渣，影响使用效果。
附件4：口蹄疫病料的采集、保存与运送
采集、保存和运输样品须符合下列要求，并填写样品采集登记表。 1 样品的采集和保存 1.1 组织样品 1.1.1 样品的选择 用于病毒分离、鉴定的样品以发病动物(牛、羊或猪)未破裂的舌面或蹄部,鼻镜,乳头等部位的水泡皮和水泡液最好。对临床健康但怀疑带毒的动物可在扑杀后采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品作为检测材料。
1.1.2 样品的采集和保存
水泡样品采集部位可用清水清洗，切忌使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭。 1.1.2.1 未破裂水泡中的水泡液用灭菌注射器采集至少1毫升，装入灭菌小瓶中(可加适量抗菌素)，加盖密封；尽快冷冻保存。
1.1.2.2 剪取新鲜水泡皮3～5克放入灭菌小瓶中,加适量（2倍体积）50％甘油/磷酸盐缓冲液(pH7.4), 加盖密封；尽快冷冻保存。
1.1.2.3 在无法采集水泡皮和水泡液时，可采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品3～5克装入洁净的小瓶内, 加盖密封；尽快冷冻保存。
每份样品的包装瓶上均要贴上标签，写明采样地点、动物种类、编号、时间等。 1.2 牛、羊食道-咽部分泌物(O-P液)样品 1.2.1 样品采集
被检动物在采样前禁食(可饮水)12小时，以免反刍胃内容物严重污染O-P液。采样探杯在使用前经0.2％柠檬酸或2％氢氧化钠浸泡5分钟，再用自来水冲洗。每采完一头动物,探杯要重复进行消毒和清洗。采样时动物站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部10～15cm处，轻轻来回移动2～3次，然后将探杯拉出。如采集的O-P液被反刍胃内容物严重污染，要用生理盐水或自来水冲洗口腔后重新采样。
1.2.2 样品保存
将探杯采集到的8～10mL O-P液倒入25 mL以上的灭菌玻璃容器中, 容器中应事先加有8～10mL细胞培养液或磷酸盐缓冲液（0.04mol/L 、pH7.4），加盖密封后充分摇匀，贴上防水标签,并写明样品编号、采集地点、动物种类、时间等，尽快放入装有冰块的冷藏箱内，然后转往-60℃冰箱冻存。通过病原检测，做出追溯性诊断。
1.3 血清
怀疑曾有疫情发生的畜群，错过组织样品采集时机时，可无菌操作采集动物血液，每头不少于10mL。自然凝固后无菌分离血清装入灭菌小瓶中，可加适量抗菌素，加盖密封后冷藏保存。每瓶贴标签并写明样品编号，采集地点，动物种类，时间等。通过抗体检测，做出追溯性诊断。
1.4 采集样品时要填写样品采集登记表 2 样品运送
运送前将封装和贴上标签，已预冷或冰冻的样品玻璃容器装入金属套筒中，套筒应填充防震材料，加盖密封，与采样记录一同装入专用运输容器中。专用运输容器应隔热坚固，内装适当冷冻剂和防震材料。外包装上要加贴生物安全警示标志。以最快方式，运送到检测单位。为了能及时准确地告知检测结果，请写明送样单位名称和联系人姓名、联系地址、邮编、电话、传真等。
送检材料必须附有详细说明，包括采样时间、地点、动物种类、样品名称、数量、保存方式及有关疫病发生流行情况、临床症状等。
附件5：口蹄疫扑杀技术规范
1 扑杀范围：病畜及规定扑杀的易感动物。 2 使用无出血方法扑杀：电击、药物注射。 3 将动物尸体用密闭车运往处理场地予以销毁。 4 扑杀工作人员防护技术要求 4.1 穿戴合适的防护衣服
4.1.1 穿防护服或穿长袖手术衣加防水围裙。 4.1.2 戴可消毒的橡胶手套。
4.1.3 戴N95口罩或标准手术用口罩。 4.1.4 戴护目镜。
4.1.5 穿可消毒的胶靴，或者一次性的鞋套。 4.2 洗手和消毒
4.2.1 密切接触感染牲畜的人员,用无腐蚀性消毒液浸泡手后，在用肥皂清洗2次以上。
4.2.2 牲畜扑杀和运送人员在操作完毕后，要用消毒水洗手，有条件的地方要洗澡。 4.3 防护服、手套、口罩、护目镜、胶鞋、鞋套等使用后在指定地点消毒或销毁。
附件6：口蹄疫无害化处理技术规范
所有病死牲畜、被扑杀牲畜及其产品、排泄物以及被污染或可能被污染的垫料、饲料和其他物品应当进行无害化处理。无害化处理可以选择深埋、焚烧等方法，饲料、粪便也可以堆积发酵或焚烧处理。
1 深埋
1.1 选址：掩埋地应选择远离学校、公共场所、居民住宅区、动物饲养和屠宰场所、村庄、饮用水源地、河流等。避免公共视线。
1.2 深度：坑的深度应保证动物尸体、产品、饲料、污染物等被掩埋物的上层距地表1.5米以上。坑的位置和类型应有利于防洪。
1.3 焚烧：掩埋前，要对需掩埋的动物尸体、产品、饲料、污染物等实施焚烧处理。 1.4 消毒：掩埋坑底铺2CM厚生石灰；焚烧后的动物尸体、产品、饲料、污染物等表面，以及掩埋后的地表环境应使用有效消毒药品喷洒消毒。
1.5 填土：用土掩埋后，应与周围持平。填土不要太实，以免尸腐产气造成气泡冒出和液体渗漏。
1.6 掩埋后应设立明显标记。 2 焚化
疫区附近有大型焚尸炉的，可采用焚化的方式。 3 发酵
饲料、粪便可在指定地点堆积，密封发酵，表面应进行消毒。
以上处理应符合环保要求，所涉及到的运输、装卸等环节要避免洒漏，运输装卸工具要彻底消毒后清洗。
附件7：口蹄疫疫点、疫区清洗消毒技术规范
1 成立清洗消毒队
清洗消毒队应至少配备一名专业技术人员负责技术指导。 2 设备和必需品
2.1 清洗工具：扫帚、叉子、铲子、锹和冲洗用水管。
2.2 消毒工具：喷雾器、火焰喷射枪、消毒车辆、消毒容器等。 2.3 消毒剂：醛类、氧化剂类、氯制剂类等合适的消毒剂。 2.4 防护装备：防护服、口罩、胶靴、手套、护目镜等。 3 疫点内饲养圈舍清理、清洗和消毒 3.1 对圈舍内外消毒后再行清理和清洗。 3.2 首先清理污物、粪便、饲料等。
3.3 对地面和各种用具等彻底冲洗，并用水洗刷圈舍、车辆等，对所产生的污水进行无害化处理。
3.4 对金属设施设备，可采取火焰、熏蒸等方式消毒。
3.5 对饲养圈舍、场地、车辆等采用消毒液喷洒的方式消毒。 3.6 饲养圈舍的饲料、垫料等作深埋、发酵或焚烧处理。 3.7 粪便等污物作深埋、堆积密封或焚烧处理。 4 交通工具清洗消毒
4.1 出入疫点、疫区的交通要道设立临时性消毒点，对出入人员、运输工具及有关物品进行消毒。
4.2 疫区内所有可能被污染的运载工具应严格消毒，车辆内、外及所有角落和缝隙都要用消毒剂消毒后再用清水冲洗，不留死角。
4.3 车辆上的物品也要做好消毒。
4.4 从车辆上清理下来的垃圾和粪便要作无害化处理。 5 牲畜市场消毒清洗
5.1 用消毒剂喷洒所有区域。
5.2 饲料和粪便等要深埋、发酵或焚烧。 6 屠宰加工、储藏等场所的清洗消毒 6.1 所有牲畜及其产品都要深埋或焚烧。
6.2 圈舍、过道和舍外区域用消毒剂喷洒消毒后清洗。
6.3 所有设备、桌子、冰箱、地板、墙壁等用消毒剂喷洒消毒后冲洗干净。 6.4 所有衣服用消毒剂浸泡后清洗干净，其他物品都要用适当的方式进行消毒。 6.5 以上所产生的污水要经过处理,达到环保排放标准。
7 疫点每天消毒1次连续1周,1周后每两天消毒1次.疫区内疫点以外的区域每两天
消毒1次。
附件8：口蹄疫流行病学调查规范
1 范围
本规范规定了暴发疫情时和平时开展的口蹄疫流行病学调查工作。 本规范适用于口蹄疫暴发后的跟踪调查和平时现况调查的技术要求。 2 引用文件
下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单位（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，根据本规范达成协议的各方研究可以使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
NY×××× \ \ 口蹄疫疫样品采集、保存和运输技术规范 NY×××× \ \ 口蹄疫人员防护技术规范
NY×××× \ \ 口蹄疫疫情判定与扑灭技术规范 3 术语与定义
NY×××× 的定义适用于本规范。
3.1 跟踪调查 Tracing investigation 当一个畜群单位暴发口蹄疫时，兽医技术人员或动物流行病学专家在接到怀疑发生口蹄疫的报告后通过亲自现场察看、现场采访，追溯最原始的发病患畜 、查明疫点的疫病传播扩散情况以及采取扑灭措施后跟踪被消灭疫病的情况。
3.2 现况调查 cross-sectional survey
现况调查是一项在全国范围内有组织的关于口蹄疫流行病学资料和数据的收集整理工作，调查的对象包括被选择的养殖场、屠宰场或实验室，这些选择的普查单位充当着疾病监视器的作用，对口蹄疫病毒易感的一些物种（如野猪）可以作为主要动物群感染的指示物种。现况调查同时是口蹄疫防制计划的组成部分。
4 跟踪调查
4.1 目的 核实疫情并追溯最原始的发病地点和患畜 、查明疫点的疫病传播扩散情况以及采取扑灭措施后跟踪被消灭疫病的情况。
4.2 组织与要求
4.2.1 动物防疫监督机构接到养殖单位怀疑发病的报告后，立即指派2名以上兽医技术人员，在24小时以内尽快赶赴现场，采取现场亲自察看和现场采访相结合的方式对疾病暴发事件开展跟踪调查；
4.2.2 被派兽医技术人员至少3天内没有接触过口蹄疫病畜及其污染物，按《口蹄疫人员防护技术规范》做好个人防护；
4.2.3 备有必要的器械、用品和采样用的容器。 4.3 内容与方法
4.3.1 核实诊断方法及定义“患畜” 调查的目的之一是诊断患畜，因此需要归纳出发病患畜的临床症状和用恰当的临床术语定义患畜，这样可以排除其他疾病的患畜而只保留所研究的患畜，做出是否发生疑似口蹄疫的判断；
4.3.2 采集病料样品、送检与确诊 对疑似患畜，按照《口蹄疫样品采集、保存和运输技术规范》的要求送指定实验室确诊。 4.3.3实施对疫点的初步控制措施，严禁从疑似发病场/户运出家畜、家畜产品和可疑污染物品，并限制人员流动；
4.3.4 计算特定因素袭击率，确定畜间型
袭击率是衡量疾病暴发和疾病流行严重程度的指标，疾病暴发时的袭击率与日常发病率或预测发病率比较能够反映出疾病暴发的严重程度。另外，通过计算不同畜群的袭击率和不同动物种别、年龄和性别的特定因素袭击率有助于发现病因或与疾病有关的某些因素；
4.3.5 确定时间型
根据单位时间内患畜的发病频率，绘制一个或是多个流行曲线，以检验新患畜的时间分布。在制作流行曲线时，应选择有利于疾病研究的各种时间间隔（在x轴），如小时、天或周，和表示疾病发生的新患畜数或百分率（在y轴）；
4.3.6 确定空间型 为检验患畜的空间分布，调查者首先需要描绘出发病地区的地形图，和该地区内的和畜舍的位置及所出现的新患畜。然后仔细审察地形图与畜群和新患畜的分布特点，以发现患畜间的内在联系和地区特性，和动物本身因素与疾病的内在联系，如性别、品种和年龄。划图标出可疑发病畜周围20公里以内分布的有关养畜场、道路、河流、山岭、树林、人工屏障等，连同最初调查表一同报告当地动物防疫监督机构；
4.3.7 计算归因袭击率，分析传染来源
根据计算出的各种特定因素袭击率，如年龄、性别、品种、饲料、饮水等，建立起一个有关这些特定因素袭击率的分类排列表，根据最高袭击率、最低袭击率、归因袭击率（即两组动物分别接触和不接触同一因素的两个袭击率之差）以进一步分析比较各种因素与疾病的关系，追踪可能的传染来源；
4.3.8 追踪出入发病养殖场/户的有关工作人员和所有家畜、畜产品及有关物品的流动情况，并对其作适当的隔离观察和控制措施，严防疫情扩散；
4.3.9 对疫点、疫区的猪、牛、羊、野猪等重要疫源宿主进行发病情况调查，追踪病毒变异情况。
4.3.10 完成跟踪调查表（见附录A），并提交跟踪调查报告。 待全部工作完成以后，将调查结果总结归纳以调查报告的形式形成报告，并逐级上报到国家动物防疫监督机构和国家动物流行病学中心。
形成假设
根据以上资料和数据分析，调查者应该得出一个或两个以上的假设：①疾病流行类型，点流行和增殖流行；②传染源种类，同源传染和多源传染；③传播方式，接触传染，机械传染和生物性传染。调查者需要检查所形成的假设是否符合实际情况，并对假设进行修改。在假设形成的同时，调查者还应能够提出合理的建议方案以保护未感染动物和制止患畜继续出现，如改变饲料、动物隔离等；
检验假设
假设形成后要进行直观的分析和检验，必要时还要进行实验检验和统计分析。假设的形成和检验过程是循环往复的，应用这种连续的近似值方法而最终建立起确切的病因来源假设。
5 现况调查
5.1 目的 广泛收集与口蹄疫发生有关的各种资料和数据，根据医学理论得出有关口蹄疫分布、发生频率及其影响因素的合乎逻辑的正确结论。
5.2 组织与要求
5.2.1 现况调查是一项由国家兽医行政主管部门统一组织的全国范围内有关口蹄疫流行病学资料和数据的收集整理工作，需要国家兽医行政主管部门、国家动物防疫监督机构、国家动物流行病学中心、地方动物防疫监督机构多方面合作；
5.2.2 所有参与实验的人员明确普查的内容和目的，数据收集的方法应尽可能的简单，
并设法得到数据提供者的合作和保持他们的积极性；
5.2.3 被派兽医技术人员要遵照4.2.2 和4.2.3的要求。 5.3 内容
5.3.1估计疾病流行情况 调查动物群体存在或不存在疾病。患病和死亡情况分别用患病率和死亡率表示。
5.3.2 动物群体及其环境条件的调查 包括动物群体的品种、性别、年龄、营养、免疫等；环境条件、气候、地区、畜牧制度、饲养管理（饲料、饮水、畜舍）等。
5.3.3 传染源调查 包括带毒野生动物、带毒牛羊等的调查。
5.3.4 其他调查 包括其他动物或人类患病情况及媒介昆虫或中间宿主，如种类、分布、生活习性等的调查。
5.3.4 完成现况调查表（见附录B），并提交现况调查报告。 5.4 方法
5.4.1 现场观察、临床检查 5.4.2 访问调查或通信调查
5.4.3 查阅诊疗记录、疾病报告登记、诊断实验室记录、检疫记录及其他现成记录和统计资料。流行病学普查的数据都是与疾病和致病因素有关的数据以及与生产和畜群体积有关的数据。获得的已经记录的数据，可用于回顾性实验研究；收集未来的数据用于前瞻性实验研究。
一些数据属于观察资料；一些数据属于观察现象的解释；一些数据是数量性的，由各种测量方法而获得，如体重、产乳量、死亡率和发病率，这类数据通常比较准确。数据资料来源如下。
5.4.3.1 政府兽医机构 国家及各省、市、县动物防疫监督机构以及乡级的兽医站负责调查和防治全国范围内一些重要的疾病。许多政府机构还建立了诊断室开展一些常规的实验室诊断工作，保持完整的实验记录，经常报导诊断结果和疾病的流行情况。由各级政府机构编辑和出版的各种兽医刊物也是常规的资料来源。
5.4.3.2 屠宰场
大牲畜屠宰场都要进行宰前和宰后检验以发现和鉴定某些疾病。通常只有临床上健康的牲畜才供屠宰食用，因此屠宰中发现的病例一般都是亚临床症状的。
屠宰检验的第二个目的是记录所见异常现象，有助于流行性动物疾病的早期发现和人畜共患性疾病的预防和治疗。由于屠宰场的动物是来自于不同地区或不同的牧场，如果屠宰检验所发现的疾病关系到患畜的原始牧场或地区，则必须追查动物的来源。
5.4.3.3 血清库
血清样品能够提供免疫特性方面有价值的流行病学资料，如流行的周期性，传染的空间分布和新发生口蹄疫的起源。因此建立血清库有助于研究与传染病有关的许多问题：①鉴定主要的健康标准；②建立免疫接种程序；③确定疾病的分布；④调查新发生口蹄疫的传染来源；⑤确定流行的周期性；⑥增加病因学方面的知识；⑦评价免疫接种效果或程序；⑧评价疾病造成的损失。
5.4.3.4 动物注册
动物登记注册是流行病学数据的又一个来源。
根据某地区动物注册或免疫接种数量估测该地区的易感动物数，一般是趋于下线估测。 5.4.3.5 畜牧机构
许多畜牧机构记录和保存动物群体结构、分布和动物生产方面的资料，如增重、饲料转化率和产乳量等。这对某些实验研究也同样具有着流行病学方面的意义。
5.4.3.6畜牧场
大型的现代化饲养场都有自己独立的经营和管理体制；完善的资料和数据记录系统，许多数据资料具有较高的可靠性。这些资料对疾病普查是很有价值的。
5.4.3.7畜主日记
饲养人员（如猪的饲养者）经常记录生产数据和一些疾病资料。但记录者的兴趣和背景不同，所记录的数据类别和精确程度也不同。
5.4.3.8 兽医院门诊 兽医院开设兽医门诊，并建立患畜病志以描述发病情况和记录诊断结果。门诊患畜中诊断兽医感兴趣的疾病比例通常高于其他疾病。这可能是由于该兽医为某种疾病的研究专家而吸引该种疾病的患畜的原故。
5.4.3.9 其他资料来源
野生动物是家畜口蹄疫的重要传染源。野生动物保护组织和害虫防制中心记录和保存关于国家野生动物地区分布和种类数量方面的数据。这对调查实际存在的和即将发生的口蹄疫的感染和传播具有价值。
表A 口蹄疫暴发的跟踪调查表
1 可疑发病场/户基本状况与初步诊断结果 2 疫点易感畜与发病畜现场调查
2.1 最早出现发病时间: 年 月 日 时，
发病数： 头，死亡数： 头，圈舍（户）编号: 。 2.2 畜群发病情况
2.3 袭击率
计算公式:袭击率=（疫情暴发以来发病畜数÷疫情暴发开始时易感畜数）×100% 3 可能的传染来源调查
3.1 发病前15天内，发病畜舍是否新引进了畜？
场（村）隔离场，隔离场（舍）人员单独隔离
3.2 发病前15天内发病畜场/户是否有野猪、啮齿动物等出没？ （1）否 （2）是
注：※与畜接触地点包括进入场/户场内、畜栏舍四周、存料处及料槽等；
＃接触频率指野生动物与畜接触地点的接触情况，分为每天、数次、仅一次。 3.3 发病前15天内是否运入可疑的被污染物品（药品）？ （1）是 （2）否
3.4 最近30天内的是否有场外有关业务人员来场？（1）无 （2）有，请写出访问者
3.5 发病场（户）是否靠近其他养畜场及动物集散地？ （1）是 （2）否
3.5.1 与发病场的相对地理位置 。 3.5.2 与发病场的距离 。 3.5.3 其大致情况 。
3.6 发病场周围20公里以内是否有下列动物群？ 3.6.1 猪 。 3.6.2 野猪 。 3.6.3 牛群 。 3.6.4 羊群 。
3.6.5 田鼠、家鼠 。 3.6.6 其它易感动物 。
3.7 在最近25-30天内本场周围20公里有无畜群发病？（1）无 （2）有，请回答： 3.7.1 发病日期：
3.7.2 病畜数量和品种： 3.7.3 确诊/疑似诊断疾病： 3.7.4 场主姓名：
3.7.5 发病地点与本场相对位置、距离： 3.7.6 投药情况： 3.7.6 疫苗接种情况：
3.8 场内是否有职员住在其他养畜场/养畜村？（1）无 （2）有，请回答： 3.8.1该场所处的位置：
3.8.2该场养畜的数量和品种：
3.8.3该场畜的来源及去向： 3.8.4职员拜访和接触他人地点：
4 在发病前15天是否有更换饲料来源等饲养方式/管理的改变？ （1）无 （2）有， 。
5 发病场（户）周围环境情况
5.1 静止水源——沼泽、池塘或湖泊：（1）是 （2）否 5.2 流动水源——灌溉用水、运河水、河水：（1）是 （2）否 5.3 断续灌溉区——方圆三公里内无水面：（1）是 （2）否 5.4 最近发生过洪水：（1）是 （2）否 5.5 靠近公路干线：（1）是 （2）否 5.6 靠近山溪或森（树）林：（1）是 （2）否 6 该养畜场/户地势类型属于：
（1）盆地（2）山谷（3）高原（4）丘陵（5）平原（6）山区 （7）其他（请注明） 。 7 饮用水及冲洗用水情况 7.1 饮水类型：
（1）自来水 （2）浅井水 （3）深井水（4）河塘水 （5）其他 7.2 冲洗水类型：
（1）自来水 （2）浅井水 （3）深井水 （4）河塘水（5）其他 8 发病养畜场/户口蹄疫疫苗免疫情况： （1）不免疫 （2）免疫 8.1 免疫生产厂家 。 8.2 疫苗品种、批号 。 8.3 被免疫畜数量 。 9 受威胁区免疫畜群情况
9.1 免疫接种一个月内畜群发病情况： （1）未见发病（2）发病，发病率 。 9.2 血清学检测和病原学检测
10 解除封锁后30天后是否使用岗哨动物
（1）否 （2）是，简述岗哨动物名称、数量及结果 。 11 最后诊断情况
11.1 确诊口蹄疫，确诊单位 ，病毒亚型 。 11.2 排除，其他疫病名称 。 12 疫情处理情况
12.1 发病畜及其同群畜全部扑杀： （1）是 （2）否，扑杀范围： 。
12.2 疫点周围受威胁区内的所有易感畜全部接种疫苗 （1）是 （2）否
所用疫苗的病毒亚型： ，厂家： 。
13 在发病养畜场/户出现第1个病例前15天至该场被控制期间出场的（A）有关人员，（B）动物/产品/排泄废弃物，（C）运输工具/物品/饲料/原料，（D）其他(请标出) ，养畜
14 在发病养畜场/户出现第1个病例前15天至该场被控制期间，是否有家畜、车辆和人员进出家畜集散地？（1
）无 （2）有，请填写下表，追踪可能污染物，做限制或消毒处15
列举在发病养畜场/户出现第1个病例前15天至该场被控制期间出场的工作人员16 疫点或疫区家畜
16.1在发病后一个月发病情况
（1）未见发病 （2）发病，发病率 。 16.2 血清学检测和病原学检测
17.1 在发病后一个月发病情况
（1）未见发病 （2）发病，发病率 。 17.2 血清学检测和病原学检测
18 在该疫点疫病传染期内密切接触人员的发病情况 。 （1）未见发病
注：※接触方式：（1）本舍（户）饲养员（2）非本舍饲养员（3）本场兽医（4）收购与运输（5）屠宰加工（6）处理疫情的场外兽医（7）其他接触
表B 口蹄疫暴发的现况调查表
1 某调查单位（省、地区、畜场、屠宰场或实验室等）家畜及野生动物口蹄疫的流行率
2 某调查单位（省、地区、畜场、屠宰场或实验室等）家畜及野生动物口蹄疫的抗体
炭疽防治技术规范
农医发［2007］12号
农业部关于印发《高致病性禽流感防治技术规范》等14个动物疫病防治技术规范的通
知
2007年4月9日
炭疽（Anthrax）是由炭疽芽胞杆菌引起的一种人畜共患传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。
为预防和控制炭疽，依据《中华人民共和国动物防疫法》和其它相关法律法规，制定本规范。
1 适用范围
本规范规定了炭疽的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施和控制标准。 本规范适用于中华人民共和国境内一切从事动物饲养、经营及其产品的生产、经营的单位和个人，以及从事动物防疫活动的单位和个人。
2 诊断
依据本病流行病学调查、临床症状，结合实验室诊断结果做出综合判定。 2.1 流行特点
本病为人畜共患传染病，各种家畜、野生动物及人对本病都有不同程度的易感性。草食动物最易感，其次是杂食动物，再次是肉食动物，家禽一般不感染。人也易感。
患病动物和因炭疽而死亡的动物尸体以及污染的土壤、草地、水、饲料都是本病的主要传染源，炭疽芽胞对环境具有很强的抵抗力，其污染的土壤、水源及场地可形成持久的疫源地。本病主要经消化道、呼吸道和皮肤感染。
本病呈地方性流行。有一定的季节性，多发生在吸血昆虫多、雨水多、洪水泛滥的季节。 2.2 临床症状
2.2.1 本规范规定本病的潜伏期为20天。 2.2.2 典型症状
本病主要呈急性经过，多以突然死亡、天然孔出血、尸僵不全为特征。
牛：体温升高常达41℃以上，可视黏膜呈暗紫色，心动过速、呼吸困难。呈慢性经过的病牛，在颈、胸前、肩胛、腹下或外阴部常见水肿；皮肤病灶温度增高，坚硬，有压痛，也可发生坏死，有时形成溃疡；颈部水肿常与咽炎和喉头水肿相伴发生，致使呼吸困难加重。急性病例一般经24～36小时后死亡，亚急性病例一般经2～5天后死亡。
马：体温升高，腹下、乳房、肩及咽喉部常见水肿。舌炭疽多见呼吸困难、发绀；肠炭疽腹痛明显。急性病例一般经24～36小时后死亡，有炭疽痈时，病程可达3～8天。
羊：多表现为最急性（猝死）病症，摇摆、磨牙、抽搐，挣扎、突然倒毙，有的可见从天然孔流出带气泡的黑红色血液。病程稍长者也只持续数小时后死亡。
猪：多为局限性变化，呈慢性经过，临床症状不明显，常在宰后见病变。 犬和其它肉食动物临床症状不明显。 2.3 病理变化
死亡患病动物可视黏膜发绀、出血。血液呈暗紫红色，凝固不良，粘稠似煤焦油状。皮下、肌间、咽喉等部位有浆液性渗出及出血。淋巴结肿大、充血，切面潮红。脾脏高度肿胀，达正常数倍，脾髓呈黑紫色。
严禁在非生物安全条件下进行疑似患病动物、患病动物的尸体剖检。 2.4 实验室诊断
实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行。 2.4.1 病原鉴定
2.4.1.1 样品采集、包装与运输
按照NY／T561 2.1.2、4.1、5.1执行。 2.4.1.2 病原学诊断
炭疽的病原分离及鉴定（见NY/T561）。 2.4.2 血清学诊断
炭疽沉淀反应（见NY/T561）。 2.4.3 分子生物学诊断 聚合酶链式反应（PCR）（见附件1）。 3 疫情报告
3.1 任何单位和个人发现患有本病或者疑似本病的动物，都应立即向当地动物防疫监督机构报告。
3.2 当地动物防疫监督机构接到疫情报告后，按国家动物疫情报告管理的有关规定执行。
4 疫情处理
依据本病流行病学调查、临床症状，结合实验室诊断做出的综合判定结果可做为疫情处理依据。
4.1 当地动物防疫监督机构接到疑似炭疽疫情报告后，应及时派员到现场进行流行病学调查和临床检查，采集病料送符合规定的实验室诊断，并立即隔离疑似患病动物及同群动物，限制移动。
对病死动物尸体，严禁进行开放式解剖检查，采样时必须按规定进行，防止病原污染环境，形成永久性疫源地。
4.2 确诊为炭疽后，必须按下列要求处理。
4.2.1 由所在地县级以上兽医主管部门划定疫点、疫区、受威胁区。
疫 点：指患病动物所在地点。一般是指患病动物及同群动物所在畜场（户组）或其它有关屠宰、经营单位。
疫 区：指由疫点边缘外延3公里范围内的区域。在实际划分疫区时，应考虑当地饲养环境和自然屏障（如河流、山脉等）以及气象因素，科学确定疫区范围。
受威胁区：指疫区外延5公里范围内的区域。
4.2.2 本病呈零星散发时，应对患病动物作无血扑杀处理，对同群动物立即进行强制免疫接种，并隔离观察20天。对病死动物及排泄物、可能被污染饲料、污水等按附件2的要求进行无害化处理；对可能被污染的物品、交通工具、用具、动物舍进行严格彻底消毒（见附件2）。疫区、受威胁区所有易感动物进行紧急免疫接种。对病死动物尸体严禁进行开放式解剖检查，采样必须按规定进行，防止病原污染环境，形成永久性疫源地。
4.2.3 本病呈暴发流行时（1个县10天内发现5头以上的患病动物），要报请同级人民政府对疫区实行封锁；人民政府在接到封锁报告后，应立即发布封锁令，并对疫区实施封锁。
疫点、疫区和受威胁区采取的处理措施如下： 4.2.3.1 疫点
出入口必须设立消毒设施。限制人、易感动物、车辆进出和动物产品及可能受污染的物品运出。对疫点内动物舍、场地以及所有运载工具、饮水用具等必须进行严格彻底地消毒。
患病动物和同群动物全部进行无血扑杀处理。其它易感动物紧急免疫接种。
对所有病死动物、被扑杀动物，以及排泄物和可能被污染的垫料、饲料等物品产品按附件2要求进行无害化处理。
动物尸体需要运送时，应使用防漏容器，须有明显标志，并在动物防疫监督机构的监督下实施。
4.2.3.2 疫区：交通要道建立动物防疫监督检查站，派专人监管动物及其产品的流动，对进出人员、车辆须进行消毒。停止疫区内动物及其产品的交易、移动。所有易感动物必须圈养，或在指定地点放养；对动物舍、道路等可能污染的场所进行消毒。
对疫区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。
4.2.3.3 受威胁区：对受威胁区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。 4.2.3.4 进行疫源分析与流行病学调查 4.2.3.5 封锁令的解除
最后1头患病动物死亡或患病动物和同群动物扑杀处理后20天内不再出现新的病例，进行终末消毒后，经动物防疫监督机构审验合格后，由当地兽医主管部门向原发布封锁令的机关申请发布解除封锁令。
4.2.4 处理记录
对处理疫情的全过程必须做好完整的详细记录，建立档案。
5 预防与控制
5.1 环境控制 饲养、生产、经营场所和屠宰场必须符合《动物防疫条件审核管理办法》（农业部[2002]15号令）规定的动物防疫条件，建立严格的卫生（消毒）管理制度。
5.2 免疫接种
5.2.1 各省根据当地疫情流行情况，按农业部制定的免疫方案，确定免疫接种对象、范围。
5.2.2 使用国家批准的炭疽疫苗，并按免疫程序进行适时免疫接种，建立免疫档案。 5.3 检疫
5.3.1 产地检疫
按GB16549和《动物检疫管理办法》实施检疫。检出炭疽阳性动物时，按本规范4.2.2规定处理。
5.3.2 屠宰检疫
按NY467和《动物检疫管理办法》对屠宰的动物实施检疫。 5.4 消毒
对新老疫区进行经常性消毒，雨季要重点消毒。皮张、毛等按照附件2实施消毒。 5.5 人员防护 动物防疫检疫、实验室诊断及饲养场、畜产品及皮张加工企业工作人员要注意个人防护，参与疫情处理的有关人员，应穿防护服、戴口罩和手套，做好自身防护。
附件1：聚合酶链式反应（PCR）技术
1 试剂
1.1 消化液
1.1.1 1M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0) 三羟甲基氨基甲烷 12.11g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100mL
1.1.2 0.5M 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0) 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g 灭菌双蒸水 80mL
氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100mL
1.1.3 20% 十二烷基磺酸钠(SDS)溶液 (pH7.2) 十二烷基磺酸钠 20g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸 调pH至7.2 灭菌双蒸水 加至100mL 1.1.4 消化液配制
1M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0) 2mL 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0) 0.4mL
20% 十二烷基磺酸钠溶液(pH7.2) 5mL 5M 氯化钠 4mL
灭菌双蒸水 加至200mL 1.2 蛋白酶K溶液 蛋白酶K 5g
灭菌双蒸水 加至250mL 1.3 酚/氯仿/异戊醇混合液 碱性酚 25mL 氯仿 24mL 异戊醇 1mL
1.4 2.5mmol/LdNTP dATP(100mmol/L) 20µL dTTP(100mmol/L) 20µL dGTP(100mmol/L) 20µL dCTP(100mmol/L) 20µL 灭菌双蒸水 加至800µL 1.5 8pmol/µL PCR引物 上游引物ATXU（2 OD）加入701µl灭菌双蒸水溶解，下游引物ATXD（2 OD）加入697µL灭菌双蒸水溶解，分别取ATXU、ATXD溶液各300µL，混匀即为8pmol/µL 扩增引物。
1.6 0.5单位Taq DNA聚合酶 5单位Taq DNA聚合酶 1µL 灭菌双蒸水 加至10µL 现用现配。
1.7 10×PCR缓冲液
1.7.1 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0) 三羟基甲基氨基甲烷 15.8g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸 调pH至9.0 灭菌双蒸水 加至100mL 1.7.2 10倍PCR缓冲液
1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0) 1mL 氯化钾 0.373g
曲拉通X-100 0.1mL 灭菌双蒸水 加至100mL 1.8 溴化乙锭(EB)溶液 溴化乙锭 0.2g
灭菌双蒸水 加至20mL 1.9 电泳缓冲液(50倍)
1.9.1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0) 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g 灭菌双蒸水 80mL
氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100mL
1.9.2 TAE电泳缓冲液(50倍) 三羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242g 冰乙酸 57.1mlL
0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0) 100mL 灭菌双蒸水 加至1 000mL 用时用灭菌双蒸水稀释使用 1.10 1.5％琼脂糖凝胶 琼脂糖 3g
TAE电泳缓冲液(50倍) 4mL 灭菌双蒸水 196mL
微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液20µL。 1.11 上样缓冲液
溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50ml水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至100mL。
1.12 其它试剂 异丙醇(分析纯) 70%乙醇
15mmoL/L氯化镁 灭菌双蒸水 2 器材 2.1 仪器
分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2µL 、20µL、200µL、1000µL）。
2.2 耗材
眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL一次性注射器、1.5 mL灭菌离心管、0.2 mL薄壁PCR管、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL锥形瓶、吸头(10µL、200µL、1000µL)、灭菌双蒸水。
2.3 引物设计
根据GenBank上已发表的炭疽杆菌POX1质粒序列，设计并合成了以下两条引物： ATXU：5’-AGAATGTATCACCAGAGGC-3’ ATXD：5’-GTTGTAGATTGGAGC CGTC-3’，此对引物扩增片段为394bp。
2.4 样品的采集与处理 2.4.1 样品的采集
病死或扑杀的动物取肝脏或脾；待检的活动物，用注射器取血5～10mL，2～8℃保存，送实验室检测。
2.4.2 样品的处理 每份样品分别处理。 2.4.2.1 组织样品处理
称取待检病料0.2g，置研磨器中剪碎并研磨，加入2mL消化液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清100µL加入1.5 mL灭菌离心管中，再加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中4～16h。
2.4.2.2 待检菌的处理
取培养获得的菌落，重悬于生理盐水中。取其悬液100µL加入1.5mL灭菌离心管中，再加入500µL 消化液和10µL 蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.4.2.3 全血样品处理
待血凝后取上清放于离心管中，4℃ 8000 g离心5 分钟，取上清100µL，加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.4.2.4 阳性对照处理
取培养的炭疽杆菌，重悬于生理盐水中。取其悬液100µL，置1.5 mL灭菌离心管中，加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.4.2.5 阴性对照处理
取灭菌双蒸水100µL，置1.5 mL灭菌离心管中，加入500µL 消化液10µl蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.5 DNA模板的提取
2.5.1 取出已处理的样品及阴、阳对照，加入600µL酚/氯仿/异戊醇混合液，用力颠倒10次混匀，12000g离心10分钟。
2.5.2 取上清置1.5mL灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置液氮中3分钟。取出样品管，室温融化，15000rpm离心15分钟。
2.5.3 弃上清，沿管壁缓缓滴入1ml 70%乙醇，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1分钟，真空抽干15分钟(以无乙醇味为准)。
2.5.4 取出样品管，用50µL灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。 2.6 PCR扩增
总体积20µl，取灭菌双蒸水8µl,2.5mmol/L dNTP、8pmol/µL扩增引物、15mmol/L氯化镁、10×PCR缓冲液、0.5单位TaqDNA聚合酶各2µL，2µL模板DNA。混匀，作好标记，加入矿物油20µL覆盖(有热盖的自动DNA热循环仪不用加矿物油)。扩增条件为94℃ 3分钟后，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s循环35次，72℃延伸 5分钟。
2.7 电泳
将PCR扩增产物15µL混合3µL上样缓冲液，点样于1.5%琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于1×TAE缓冲液中电泳，紫外凝胶成像仪下观察结果。
2.8 结果判定
在阳性对照出现394bp扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时，试验结果成立。被检样品出现394bp扩增带为炭疽杆菌阳性，否则为阴性。
附件2：无害化处理
1 炭疽动物尸体处理 应结合远离人们生活、水源等因素考虑，因地制宜，就地焚烧。如需移动尸体，先用5％福尔马林消毒尸体表面，然后搬运，并将原放置尸地及尸体天然孔出血及渗出物用5%福尔马林浸渍消毒数次，在搬运过程中避免污染沿途路段。焚烧时将尸体垫起，用油或木柴焚烧，要求燃烧彻底。无条件进行焚烧处理时，也可按规定进行深埋处理。
2 粪肥、垫料、饲料的处理
被污染的粪肥、垫料、饲料等，应混以适量干碎草，在远离建筑物和易燃品处堆积彻底焚烧，然后取样检验，确认无害后，方可用作肥料。
3 房屋、厩舍处理
开放式房屋、厩舍可用5%福尔马林喷洒消毒三遍，每次浸渍2小时。也可用20％漂白
2
粉液喷雾，200mL/m作用2小时。对砖墙、土墙、地面污染严重处，在离开易燃品条件下，亦可先用酒精或汽油喷灯地毯式喷烧一遍，然后再用5％福尔马林喷洒消毒三遍。
对可密闭房屋及室内橱柜、用具消毒，可用福尔马林熏蒸。在室温18℃条件下，对每3
25～30m空间，用10％浓甲醛液（内含37％甲醛气体）约4000mL，用电煮锅蒸4小时。蒸前先将门窗关闭，通风孔隙用高粘胶纸封严，工作人员戴专用防毒面具操作。密封8～12小时后，打开门窗换气，然后使用。
熏蒸消毒效果测定，可用浸有炭疽弱毒菌芽孢的纸片，放在含组氨酸的琼脂平皿上，待熏后取出置37℃培养24小时，如无细菌生长即认为消毒有效。
也可选择其它消毒液进行喷洒消毒，如4％戊二醛（pH8.0～8.5）2小时浸洗、5％甲醛（约15％福尔马林）2小时、3％ H2O22小时或过氧乙酸2小时。其中，H2O2和过氧乙酸不宜用于有血液存在的环境消毒；过氧乙酸不宜用于金属器械消毒。
4 泥浆、粪汤处理
猪、牛等动物死亡污染的泥浆、粪汤，可用20％漂白粉液1份（处理物2份），作用2
3
小时；或甲醛溶液50～100ml/m比例加入，每天搅拌1～2次，消毒4天，即可撒到野外或田里，或掩埋处理(即作深埋处理)。
5 污水处理
按水容量加入甲醛溶液，使其含甲醛液量达到5％，处理10小时；或用3％过氧乙酸处理4小时；或用氯胺或液态氯加入污水，于pH4.0时加入有效氯量为4mg/L，30分钟可杀灭芽孢，一般加氯后作用2小时流放一次。
6 土壤处理
2
炭疽动物倒毙处的土壤消毒，可用5％甲醛溶液500mL/m消毒三次，每次2小时，间隔1小时。亦可用氯胺或10％漂白粉乳剂浸渍2小时，处理2次，间隔1小时。亦可先用酒精或柴油喷灯喷烧污染土地表面，然后再用5％甲醛溶液或漂白粉乳剂浸渍消毒。
7 衣物、工具及其它器具处理
耐高温的衣物、工具、器具等可用高压蒸汽灭菌器在121℃高压蒸汽灭菌1小时；不耐高温的器具可用甲醛熏蒸，或用5％甲醛溶液浸渍消毒。运输工具、家具可用10％漂白粉液或1％过氧乙酸喷雾或擦拭，作用1～2小时。凡无使用价值的严重污染物品可用火彻底焚毁消毒。
8 皮、毛处理
皮毛、猪鬃、马尾的消毒，采用97～98％的环氧乙烷、2％的CO2、1％的十二氟混合液体，加热后输入消毒容器内，经48小时渗透消毒，启开容器换气，检测消毒效果。但须注意，环氧乙烷的熔点很低（＜0℃），在空气中浓度超过3％，遇明火即易燃烧发生爆炸，必须低温保存运输，使用时应注意安全。
骨、角、蹄在制作肥料或其它原料前，均应彻底消毒。如采用121℃高压蒸汽灭菌；或5％甲醛溶液浸泡；或用火焚烧。
猪伪狂犬病防治技术规范
农医发［2007］12号
农业部关于印发《高致病性禽流感防治技术规范》等14个动物疫病防治技术规范的通
知
2007年4月9日
猪伪狂犬病(Pseudorabies,Pr)，是由疱疹病毒科猪疱疹病毒I型伪狂犬病毒引起的传染病。我国将其列为二类动物疫病。
为了预防、控制猪伪狂犬病，依据《中华人民共和国动物防疫法》和其他有关法律法规，制定本规范。
1 适用范围
本规范规定了猪伪狂犬病的诊断、监测、疫情报告、疫情处理、预防与控制。
本规范适用于中华人民共和国境内从事饲养、加工、经营猪及其产品，以及从事相关动物防疫活动的单位和个人。
2 诊断
2.1 流行特点
本病各种家畜和野生动物（除无尾猿外）均可感染，猪、牛、羊、犬、猫等易感。本病寒冷季节多发。病猪是主要传染源，隐性感染猪和康复猪可以长期带毒。病毒在猪群中主要通过空气传播，经呼吸道和消化道感染，也可经胎盘感染胎儿。
2.2 临床特征
潜伏期一般为3～6天。
母猪感染伪狂犬病病毒后常发生流产、产死胎、弱仔、木乃伊胎等症状。青年母猪和空怀母猪常出现返情而屡配不孕或不发情；公猪常出现睾丸肿胀、萎缩、性功能下降、失去种用能力；新生仔猪大量死亡，15日龄内死亡率可达100%；断奶仔猪发病20～30%，死亡率为10～20%。育肥猪表现为呼吸道症状和增重滞缓。
2.3 病理变化
大体剖检特征不明显，剖检脑膜瘀血、出血。病理组织学呈现非化脓性脑炎变化。 2.4 实验室诊断 2.4.1病原学诊断
2.4.1.1病毒分离鉴定（见 GB/T 18641—2002）
2.4.1.2聚合酶链式反应诊断(见GB/T 18641—2002)
2.4.1.3 动物接种：采取病猪扁桃体、嗅球、脑桥和肺脏，用生理盐水或PBS液（磷酸盐缓冲液）制成10%悬液，反复冻融3次后离心取上清液接种于家兔皮下或者小鼠脑内，（用于接种的家兔和小白鼠必须事先用ELISA检测伪狂犬病病毒抗体阴性者才能使用）家兔经2～5天或者小鼠经2～10天发病死亡，死亡前注射部位出现奇痒和四肢麻痹。家兔发病时先用舌舔接种部位，以后用力撕咬接种部位，使接种部位被撕咬伤、鲜红、出血，持续4～6小时，病兔衰竭，痉挛，呼吸困难而死亡。小鼠不如家兔敏感，但明显表现兴奋不安，神经症状，奇痒和四肢麻痹而死亡。
2.4.2 血清学诊断
2.4.2.1 微量病毒中和试验（见GB/T 18641-2002）
2.4.2.2 鉴别ELISA（见GB/T 18641-2002）
2.5 结果判定
根据本病的流行特点、临床特征和病理变化可作出初步诊断，确诊需进一步做病原分离鉴定及血清学试验。
2.5.1 符合2.4.1.1或2.4.1.2或2.4.2.1或2.4.2.2阳性的，判定为病猪。
2.5.2 2.4.2.2可疑结果的，按2.4.1之一或2.4.2.1所规定的方法进行确诊，阳性的判定为病猪。
3 疫情报告
3.1 任何单位和个人发现患有本病或者怀疑本病的动物，都应当及时向当地动物防疫监督机构报告。
3.2 当地动物防疫监督机构接到疫情报告并确认后，按《动物疫情报告管理办法》及有关规定及时上报。
4 疫情处理
4.1 发现疑似疫情，畜主应立即限制动物移动，并对疑似患病动物进行隔离。
4.2 当地动物防疫监督机构要及时派员到现场进行调查核实，开展实验室诊断。确诊后，当地人民政府组织有关部门按下列要求处理：
4.2.1 扑杀
对病猪全部扑杀。
4.2.2 隔离
对受威胁的猪群（病猪的同群猪）实施隔离。
4.2.3 无害化处理
患病猪及其产品按照GB16548-1996《畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程》进行无害化处理。
4.2.4 流行病学调查及检测
开展流行病学调查和疫源追踪；对同群猪进行检测。
4.2.5紧急免疫接种
对同群猪进行紧急免疫接种。
4.2.6 消毒
对病猪污染的场所、用具、物品严格进行消毒。
4.2.7 发生重大猪伪狂犬病疫情时，当地县级以上人民政府应按照《重大动物疫情应急条例》有关规定，采取相应的疫情扑灭措施。
5 预防与控制
5.1 免疫接种
对猪用猪伪狂犬病疫苗，按农业部推荐的免疫程序进行免疫。
5.2 监测
对猪场定期进行监测。监测方法采用鉴别ELISA诊断技术，种猪场每年监测2次，监测时种公猪（含后备种公猪）应100%、种母猪（含后备种母猪）按20%的比例抽检；商品猪不定期进行抽检；对有流产、产死胎、产木乃伊胎等症状的种母猪100%进行检测。
5.3 引种检疫
对出场（厂、户）种猪由当地动物防疫监督机构进行检疫，伪狂犬病病毒感染抗体监测为阴性的猪，方出具检疫合格证明，准予出场（厂、户）。
种猪进场后，须隔离饲养30天后，经实验室检查确认为猪伪狂犬病病毒感染阴性的，方可混群。
5.4 净化
5.4.1 对种猪场实施猪伪狂犬病净化，净化方案见附件。
5.4.2 种猪场净化标准
必须符合以下两个条件：
5.4.2.1 种猪场停止注苗后（或没有注苗）连续二年无临床病例。
5.4.2.2 种猪场连续两年随机抽血样检测伪狂犬病毒抗体或野毒感染抗体监测，全部阴性。
附件：种猪场猪伪狂犬病净化方案
一、轻度污染场的净化
猪场不使用疫苗免疫接种，采取血清学普查，如果发现血清学阳性，进行确诊，扑杀患病猪。
二、中度污染场的净化
（一）采取免疫净化措施。免疫程序按每4个月注射一次。对猪只每年进行两次病原学抽样监测，结果为阳性者按病畜淘汰。
（二）经免疫的种猪所生仔猪，留作种用的在100日龄时作一次血清学检查，免疫前抗体阴性者留作种用，阳性者淘汰。
（三）后备种猪在配种前后1个月各免疫接种一次，以后按种猪的免疫程序进行免疫。同时每6个月抽血样作一次血清学鉴别检查，如发现野毒感染猪只及时淘汰处理。
（四）引进的猪只隔离饲养7天以上，经检疫合格（血清学检测为阴性）后方可与本场猪混群饲养。每半年作一次血清学检查。对于检测出的野毒感染阳性猪实施淘汰。
三、重度污染场的净化
（一）暂停向外供应种猪。
（二）免疫程序按每4个月免疫接种一次。每次免疫接种后对猪只抽样进行免疫抗体监测，对免疫抗体水平不达标者，立即补免。持续两年。
（三）在上述措施的基础上，按轻度感染场净化方案操作处理。
四、综合措施
（一）猪场要对猪舍及周边环境定期消毒。
（二）禁止在猪场内饲养其它动物。
（三）在猪场内实施灭鼠措施。
猪瘟防治技术规范
农医发［2007］12号
农业部关于印发《高致病性禽流感防治技术规范》等14个动物疫病防治技术规范的通
知
2007年4月9日
猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由黄病毒科瘟病毒属猪瘟病毒引起的一种高度接触性、出血性和致死性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
为及时、有效地预防、控制和扑灭猪瘟，依据《中华人民共和国动物防疫法》、《重大动物疫情应急条例》和《国家突发重大动物疫情应急预案》及有关法律法规，制定本规范。
1 适用范围
本规范规定了猪瘟的诊断、疫情报告、疫情处置、疫情监测、预防措施、控制和消灭标准等。
本规范适用于中华人民共和国境内一切从事猪（含驯养的野猪）的饲养、经营及其产品生产、经营，以及从事动物防疫活动的单位和个人。
2 诊断
依据本病流行病学特点、临床症状、病理变化可作出初步诊断，确诊需做病原分离与鉴定。
2.1 流行特点
猪是本病唯一的自然宿主，发病猪和带毒猪是本病的传染源，不同年龄、性别、品种的猪均易感。一年四季均可发生。感染猪在发病前即能通过分泌物和排泄物排毒，并持续整个病程。与感染猪直接接触是本病传播的主要方式，病毒也可通过精液、胚胎、猪肉和泔水等传播，人、其它动物如鼠类和昆虫、器具等均可成为重要传播媒介。感染和带毒母猪在怀孕期可通过胎盘将病毒传播给胎儿，导致新生仔猪发病或产生免疫耐受。
2.2 临床症状
2.2.1 本规范规定本病潜伏期为3-10天，隐性感染可长期带毒。
根据临床症状可将本病分为急性、亚急性、慢性和隐性感染四种类型。
2.2.2 典型症状
2.2.2.1 发病急、死亡率高；
2.2.2.2 体温通常升至41℃以上、厌食、畏寒；
2.2.2.3 先便秘后腹泻，或便秘和腹泻交替出现；
2.2.2.4 腹部皮下、鼻镜、耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑点，指压不褪色，眼结膜和口腔黏膜可见出血点。
2.3 病理变化
2.3.1 淋巴结水肿、出血，呈现大理石样变；
2.3.2 肾脏呈土黄色，表面可见针尖状出血点；
2.3.3 全身浆膜、黏膜和心脏、膀胱、胆囊、扁桃体均可见出血点和出血斑，脾脏边缘出现梗死灶；
2.3.4 脾不肿大，边缘有暗紫色突出表面的出血性梗死；
2.3.5 慢性猪瘟在回肠末端、盲肠和结肠常见“钮扣状”溃疡。
2.4 实验室诊断
实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行。
2.4.1 病原分离与鉴定
2.4.1.1 病原分离、鉴定可用细胞培养法（见附件1）；
2.4.1.2 病原鉴定也可采用猪瘟荧光抗体染色法，细胞浆出现特异性的荧光（见附件
2）；
2.4.1.3 兔体交互免疫试验（附件3）；
2.4.1.4 猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）：主要用于临床诊断与病原监测（见附件4）。
2.4.1.5 猪瘟抗原双抗体夹心ELISA检测法：主要用于临床诊断与病原监测（见附件
5）。
2.4.2 血清学检测
2.4.2.1 猪瘟病毒抗体阻断ELISA检测法（见附件6）；
2.4.2.2 猪瘟荧光抗体病毒中和试验（见附件7）：
2.4.2.3 猪瘟中和试验方法（见附件8）。
2.5 结果判定
2.5.1 疑似猪瘟
符合猪瘟流行病学特点、临床症状和病理变化。
2.5.2 确诊
非免疫猪符合结果判定2.5.1，且符合血清学诊断2.4.2.1、2.4.2.2、2.4.2.3之一，或符合病原学诊断2.4.1.1、2.4.1.2、2.4.1.3、2.4.1.4、2.4.1.5之一的；
免疫猪符合结果2.5.1，且符合病原学诊断2.4.1.1、2.4.1.2、2.4.1.3、2.4.1.4、
2.4.1.5之一的。
3 疫情报告
3.1 任何单位和个人发现患有本病或疑似本病的猪，都应当立即向当地动物防疫监督机构报告。
3.2 当地动物防疫监督机构接到报告后，按国家动物疫情报告管理的有关规定执行。 4 疫情处理
根据流行病学、临床症状、剖检病变，结合血清学检测做出的临床诊断结果可作为疫情处理的依据。
4.1 当地县级以上动物防疫监督机构接到可疑猪瘟疫情报告后，应及时派员到现场诊断，根据流行病学调查、临床症状和病理变化等初步诊断为疑似猪瘟时，应立即对病猪及同群猪采取隔离、消毒、限制移动等临时性措施。同时采集病料送省级动物防疫监督机构实验室确诊，必要时将样品送国家猪瘟参考实验室确诊。
4.2 确诊为猪瘟后，当地县级以上人民政府兽医主管部门应当立即划定疫点、疫区、受威胁区，并采取相应措施；同时，及时报请同级人民政府对疫区实行封锁，逐级上报至国务院兽医主管部门，并通报毗邻地区。国务院兽医行政管理部门根据确诊结果，确认猪瘟疫情。
4.2.1 划定疫点、疫区和受威胁区
疫点：为病猪和带毒猪所在的地点。一般指病猪或带毒猪所在的猪场、屠宰厂或经营单位，如为农村散养，应将自然村划为疫点。
疫区：是指疫点边缘外延3公里范围内区域。疫区划分时，应注意考虑当地的饲养环境和天然屏障（如河流、山脉等）等因素。
受威胁区：是指疫区外延5公里范围内的区域。
4.2.2 封锁
由县级以上兽医行政管理部门向本级人民政府提出启动重大动物疫情应急指挥系统、应急预案和对疫区实行封锁的建议，有关人民政府应当立即做出决定。
4.2.3 对疫点、疫区、受威胁区采取的措施
疫点：扑杀所有的病猪和带毒猪，并对所有病死猪、被扑杀猪及其产品按照GB16548规定进行无害化处理；对排泄物、被污染或可能污染饲料和垫料、污水等均需进行无害化处理；对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行严格彻底消毒（见附件9）；限制人员出入，严禁车辆进出，严禁猪只及其产品及可能污染的物品运出。
疫区：对疫区进行封锁，在疫区周围设置警示标志，在出入疫区的交通路口设置动物检
疫消毒站(临时动物防疫监督检查站)，对出入的人员和车辆进行消毒；对易感猪只实施紧急强制免疫，确保达到免疫保护水平；停止疫区内猪及其产品的交易活动，禁止易感猪只及其产品运出；对猪只排泄物、被污染饲料、垫料、污水等按国家规定标准进行无害化处理；对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行严格彻底消毒。
受威胁区：对易感猪只(未免或免疫未达到免疫保护水平)实施紧急强制免疫，确保达到免疫保护水平；对猪只实行疫情监测和免疫效果监测。
4.2.4 紧急监测
对疫区、受威胁区内的猪群必须进行临床检查和病原学监测。
4.2.5 疫源分析与追踪调查
根据流行病学调查结果，分析疫源及其可能扩散、流行的情况。对可能存在的传染源，以及在疫情潜伏期和发病期间售(／运)出的猪只及其产品、可疑污染物（包括粪便、垫料、饲料等）等应当立即开展追踪调查，一经查明立即按照GB16548规定进行无害化处理。
4.2.6 封锁令的解除
疫点内所有病死猪、被扑杀的猪按规定进行处理，疫区内没有新的病例发生，彻底消毒10天后，经当地动物防疫监督机构审验合格，当地兽医主管部门提出申请，由原封锁令发布机关解除封锁。
4.2.7 疫情处理记录
对处理疫情的全过程必须做好详细的记录（包括文字、图片和影像等），并归档。 5 预防与控制
以免疫为主，采取“扑杀和免疫相结合”的综合性防治措施。
5.1 饲养管理与环境控制
饲养、生产、经营等场所必须符合《动物防疫条件审核管理办法》（农业部[2002]15号令）规定的动物防疫条件，并加强种猪调运检疫管理。
5.2 消毒
各饲养场、屠宰厂（场）、动物防疫监督检查站等要建立严格的卫生（消毒）管理制度，做好杀虫、灭鼠工作（见附件9）。
5.3 免疫和净化
5.3.1 免疫
国家对猪瘟实行全面免疫政策。
预防免疫按农业部制定的免疫方案规定的免疫程序进行。
所用疫苗必须是经国务院兽医主管部门批准使用的猪瘟疫苗。
5.3.2 净化
对种猪场和规模养殖场的种猪定期采样进行病原学检测，对检测阳性猪及时进行扑杀和无害化处理，以逐步净化猪瘟。
5.4 监测和预警
5.4.1 监测方法
非免疫区域：以流行病学调查、血清学监测为主，结合病原鉴定。
免疫区域：以病原监测为主，结合流行病学调查、血清学监测。
5.4.2 监测范围、数量和时间
对于各类种猪场每年要逐头监测两次；商品猪场每年监测两次，抽查比例不低于0.1%，最低不少于20头；散养猪不定期抽查。或按照农业部年度监测计划执行。
5.4.3 监测报告
监测结果要及时汇总，由省级动物防疫监督机构定期上报中国动物疫病预防控制中心。
5.4.4 预警
各级动物防疫监督机构对监测结果及相关信息进行风险分析，做好预警预报。
5.5 消毒
饲养场、屠宰厂（场）、交易市场、运输工具等要建立并实施严格的消毒制度。
5.6 检疫
5.6.1 产地检疫
生猪在离开饲养地之前，养殖场/户必须向当地动物防疫监督机构报检。动物防疫监督机构接到报检后必须及时派员到场/户实施检疫。检疫合格后，出具合格证明；对运载工具进行消毒，出具消毒证明，对检疫不合格的按照有关规定处理。
5.6.2 屠宰检疫
动物防疫监督机构的检疫人员对生猪进行验证查物，合格后方可入厂/场屠宰。检疫合格并加盖（封）检疫标志后方可出厂/场，不合格的按有关规定处理。
5.6.3 种猪异地调运检疫
跨省调运种猪时，应先到调入地省级动物防疫监督机构办理检疫审批手续，调出地进行检疫，检疫合格方可调运。到达后须隔离饲养10天以上，由当地动物防疫监督机构检疫合格后方可投入使用。
6 控制和消灭标准
6.1 免疫无猪瘟区
6.1.1 该区域首先要达到国家无规定疫病区基本条件。
6.1.2 有定期、快速的动物疫情报告记录。
6.1.3 该区域在过去3年内未发生过猪瘟。
6.1.4 该区域和缓冲带实施强制免疫，免疫密度100%，所用疫苗必须符合国家兽医主管部门规定。
6.1.5 该区域和缓冲带须具有运行有效的监测体系，过去2年内实施疫病和免疫效果监测，未检出病原，免疫效果确实。
6.1.6 所有的报告，免疫、监测记录等有关材料详实、准确、齐全。
若免疫无猪瘟区内发生猪瘟时，最后一例病猪扑杀后12个月，经实施有效的疫情监测，确认后方可重新申请免疫无猪瘟区。
6.2 非免疫无猪瘟区
6.2.1 该区域首先要达到国家无规定疫病区基本条件。
6.2.2 有定期、快速的动物疫情报告记录。
6.2.3 在过去2年内没有发生过猪瘟，并且在过去12个月内，没有进行过免疫接种；另外，该地区在停止免疫接种后，没有引进免疫接种过的猪。
6.2.4 在该区具有有效的监测体系和监测区，过去2年内实施疫病监测，未检出病原。
6.2.5 所有的报告、监测记录等有关材料详实、准确、齐全。
若非免疫无猪瘟区发生猪瘟后，在采取扑杀措施及血清学监测的情况下，最后一例病猪扑杀后6个月；或在采取扑杀措施、血清学监测及紧急免疫的情况下，最后一例免疫猪被屠宰后6个月，经实施有效的疫情监测和血清学检测确认后，方可重新申请非免疫无猪瘟区。
附件1：病毒分离鉴定
采用细胞培养法分离病毒是诊断猪瘟的一种灵敏方法。通常使用对猪瘟病毒敏感的细胞系如PK-15细胞等，加入2%扁桃体、肾脏、脾脏或淋巴结等待检组织悬液于培养液中。37℃培养48～72小时后用荧光抗体染色法检测细胞培养物中的猪瘟病毒。
步骤如下：
1. 制备抗生素浓缩液（青霉素10000IU/mL、链霉素10000IU/mL、卡那霉素和制霉菌素5000IU/mL），小瓶分装，-20℃保存。用时融化。
2. 取1～2g待检病料组织放入灭菌研钵中，剪刀剪碎，加入少量无菌生理盐水，将其研磨匀浆；再加入Hank’S平衡盐溶液或细胞培养液，制成20%(w/v)组织悬液；最后按1/10的比例加入抗生素浓缩液，混匀后室温作用1小时；以1000g离心15分钟，取上清液备用。
3. 用胰酶消化处于对数生长期的PK-15细胞单层，将所得细胞悬液以1000g离心10分钟，再用一定量EMEM生长液[含5%胎牛血清(无BVDV抗体)，56℃灭活30分钟]、0.3％
6谷氨酰胺、青霉素100I U/mL、链霉素100I U/mL)悬浮，使细胞浓度为2×10/mL。
4. 9份细胞悬液与1份上清液混合，接种6～8支含细胞玻片的莱顿氏管(leighton’s)(或其它适宜的细胞培养瓶),每管0.2mL；同时设3支莱顿氏管接种细胞悬液作阴性对照；
另设3支莱顿氏管接种猪瘟病毒作阳性对照。
5. 经培养24、48、72小时，分别取2管组织上清培养物及1管阴性对照培养物、1管阳性对照培养物，取出细胞玻片，以磷酸缓冲盐水（PBS液，pH7.2，0.01M）或生理盐水洗涤2次，每次5分钟，用冷丙酮(分析纯)固定10分钟，晾干，采用猪瘟病毒荧光抗体染色法进行检测（见附件2）。
6. 根据细胞玻片猪瘟荧光抗体染色强度，判定病毒在细胞中的增殖情况，若荧光较弱或为阴性，应按步骤4将组织上清细胞培养物进行病毒盲传。
临床发病猪或疑似病猪的全血样是猪瘟早期诊断样品。接种细胞时操作程序如下：取-20℃冻存全血样品置37℃水浴融化；向24孔板每孔加300微升血样以覆盖对数生长期的PK-15单层细胞；37℃吸附2小时。弃去接种液，用细胞培养液洗涤细胞二次，然后加入EMEM维持液，37℃培养24至48小时后，采用猪瘟病毒荧光抗体染色法检测（见附件2）。
附件2：猪瘟荧光抗体染色法
荧光抗体染色法快速、特异，可用于检测扁桃体等组织样品以及细胞培养中的病毒抗原。操作程序如下：
1 样品的采集和选择
1.1 活体采样：利用扁桃体采样器（鼻捻子、开口器和采样枪）。采样器使用前均须用3%氢氧化钠溶液消毒后经清水冲洗。首先固定活猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至灭菌离心管并作标记。
1.2 其它样品：剖检时采取的病死猪脏器，如扁桃体、肾脏、脾脏、淋巴结、肝脏和肺等，或病毒分离时待检的细胞玻片。
1.3 样品采集、包装与运输按农业部相关要求执行。
2 检测方法与判定
2.1 方法：将上述组织制成冰冻切片，或待检的细胞培养片（见附件1），将液体吸干后经冷丙酮固定5～10分钟，晾干。滴加猪瘟荧光抗体覆盖于切片或细胞片表面，置湿盒中37℃作用30分钟。然后用PBS液洗涤，自然干燥。用碳酸缓冲甘油（pH9.0～9.5，0.5 M）封片，置荧光显微镜下观察。必要时设立抑制试验染色片，以鉴定荧光的特异性。
2.2 判定：在荧光显微镜下，见切片或细胞培养物（细胞盖片）中有胞浆荧光，并由抑制试验证明为特异的荧光，判猪瘟阳性；无荧光判为阴性。
2.3 荧光抑制试验：将两组猪瘟病毒感染猪的扁桃体冰冻切片，分别滴加猪瘟高免血清和健康猪血清（猪瘟中和抗体阴性），在湿盒中37℃作用30分钟，用生理盐水或PBS(pH7.2)漂洗2次，然后进行荧光抗体染色。经用猪瘟高免血清处理的扁桃体切片，隐窝上皮细胞不应出现荧光，或荧光显著减弱；而用阴性血清处理的切片，隐窝上皮细胞仍出现明亮的黄绿色荧光。
附件3：兔体交互免疫试验
本方法用于检测疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒。
1 试验动物
家兔 1.5～2kg、体温波动不大的大耳白兔，并在试验前1天测基础体温。
2 试验操作方法
将病猪的淋巴结和脾脏，磨碎后用生理盐水作1：10稀释，对3只健康家兔作肌肉注射，5mL/只，另设3只不注射病料的对照兔，间隔5天对所有家兔静脉注射1:20的猪瘟兔化病毒（淋巴脾脏毒），1mL/只，24h后，每隔6小时测体温一次，连续测96小时，对照组2/3出现定型热或轻型热，试验成立。
注：“+”表示多于或等于三分之二的动物有反应。
附件4：猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
RT-PCR方法通过检测病毒核酸而确定病毒存在，是一种特异、敏感、快速的方法。在RT-PCR扩增的特定基因片段的基础上，进行基因序列测定，将获得的基因信息与我国猪瘟分子流行病学数据库进行比较分析，可进一步鉴定流行毒株的基因型，从而追踪流行毒株的传播来源或预测预报新的流行毒株。
1 材料与样品准备
1.1 材料准备：本试验所用试剂需用无RNA酶污染的容器分装；各种离心管和带滤芯吸头需无RNA酶污染；剪刀、镊子和研钵器须经干烤灭菌。
1.2 样品制备：按1：5（W/V）比例，取待检组织和PBS液于研钵中充分研磨，4℃，1000g离心15分钟，取上清液转入无RNA酶污染的离心管中，备用；全血采用脱纤抗凝备用；细胞培养物冻融3次备用；其它样品酌情处理。制备的样品在2～8℃保存不应超过24小时，长期保存应小分装后置-70℃以下，避免反复冻融。
2 RNA提取
2.1 取1.5mL离心管，每管加入800μL RNA提取液（通用Trizol）和被检样品200μL，充分混匀，静置5分钟。同时设阳性和阴性对照管，每份样品换一个吸头。
2.2 加入200μL氯仿，充分混匀，静置5分钟，4℃、12000g离心15分钟。
2.3 取上清约500μL（注意不要吸出中间层）移至新离心管中，加等量异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟，4℃、12000g离心10分钟。
2.4 小心弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入1000μL 75%乙醇，颠倒洗涤，4℃、12000g离心10分钟。
2.5 小心弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；4000 g离心10分钟，将管壁上残余液体甩到管底部，小心吸干上清，吸头不要碰到有沉淀的一面，每份样品换一个吸头，室温干燥。
2.6 加入10μL DEPC水和10U RNasin,轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，4000 g离心10分钟，尽快进行试验。长期保存应置-70℃以下。
3 cDNA合成
取200μL PCR专用管，连同阳性对照管和阴性对照管，每管加10μL RNA和50 pM下游引物P2 (5’-CACAG（CT）CC（AG）AA（TC）CC（AG）AAGTCATC -3’)，按反转录试剂盒说明书进行。
4 PCR
4.1 取200μLPCR专用管，连同阳性对照管和阴性对照管，每管加上述10μL cDNA和适量水，95℃预变性5分钟。
4.2 每管加入10倍稀释缓冲液5μL，上游引物P1（5’-TC（GA）（AT）CAACCAA（TC）GAGATAGGG-3’）和下游引物P2各50pM，10 mol/L dNTP 2μL，Taq酶2.5U，补水至50μL。
4.3 置PCR仪，循环条件为95C 50sec，58C 60sec，72C 35sec，共40个循环，72C延伸5分钟。
5 结果判定
取RT-PCR产物5μL，于1%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中含0.5μL /mL溴化乙锭，电泳缓冲液为0.5×TBE，80V 30分钟，电泳完后于长波紫外灯下观察拍照。阳性对照管和样品检测管出现251nt的特异条带判为阳性；阴性管和样品检测管未出现特异条带判为阴性。
附件5：猪瘟抗原双抗体夹心ELISA检测方法
本方法通过形成的多克隆抗体-样品-单克隆抗体夹心，并采用辣根过氧化物酶标记物检测，对外周血白细胞、全血、细胞培养物以及组织样本中的猪瘟病毒抗原进行检测的一种双抗体夹心ELISA方法。具体如下：
1 试剂盒组成
1.1 多克隆羊抗血清包被板条 8孔×12条（96孔）
1.2 CSFV阳性对照，含有防腐剂 1.5mL
1.3 CSFV阴性对照，含有防腐剂 1.5mL
1.4 100倍浓缩辣根过氧化物酶标记物（100×）
辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG，含防腐剂 200uL
1.5 10倍浓缩样品稀释液（10×） 55mL
1.6 底物液，TMB/H2O2溶液 12mL
1.7 终止液，1M HCL（小心，强酸） 12mL
1.8 10倍浓缩洗涤液（10×） 125mL
1.9 CSFV单克隆抗体，含防腐剂 4mL
1.10 酶标抗体稀释液 15 mL
2 样品制备
注意：制备好的样品或组织可以在2～7℃保存7天，或-20℃冷冻保存6个月以上。但这些样品在应用前应该再次以1500g离心10分钟或10000g离心2～5分钟。
2.1 外周血白细胞
2.1.1 取10mL肝素或EDTA抗凝血样品，1500g离心15～20分钟。
2.1.2 再用移液器小心吸出血沉棕黄层，加入500uL样品稀释液（1×）,在旋涡振荡器上混匀，室温下放置1小时，期间不时旋涡混合。然后直接进行步骤2.1.6操作。
2.1.3 假如样品的棕黄层压积细胞体积非常少，那么就用整个细胞团（包括红细胞）。将细胞加进10mL的离心管，并加入5mL预冷（2～7℃，下同）的0.17M NH4Cl。混匀，静置10分钟。
2.1.4 用冷（2～7℃）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1500g离心5分钟。
2.1.5 弃去上清，向细胞团中加入500uL样品稀释液（1×）,用洁净的吸头悬起细胞，在旋涡振荡器上混匀，室温放置1小时。期间不时旋涡混合。
2.1.6 1500g离心5分钟,取上清液按操作步骤进行检测。
注意：处理好的的样品可以在2～7℃保存7天，或-20℃冷冻保存6个月以上。但这些样品在使用前必须再次离心。
2.2 外周血白细胞（简化方法）
2.2.1 取0.5～2mL肝素或EDTA抗凝血与等体积冷0.17 M NH4Cl加入离心管混合。室温放置10分钟。
2.2.2 1500g离心10分钟（或10000g离心2－3分钟），弃上清。
2.2.3 用冷（2～7℃）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1500g离心5分钟。
2.2.4 弃去上清，向细胞团加入500ul样本稀释液（1×）。旋涡振荡充分混匀，室温放置1小时。期间不时旋涡混匀。取75ul按照“操作步骤”进行检测。
2.3 全血（肝素或EDTA抗凝）
2.3.1 取25uL 10倍浓缩样品稀释液（10×）和475uL全血加入微量离心管，在旋涡振荡器上混匀。
2.3.2 室温下孵育1小时，期间不时旋涡混合。此样品可以直接按照“操作步骤”进行检测。
或：直接将75uL全血加入酶标板孔中，再加入10uL 5倍浓缩样品稀释液（5×）。晃动酶标板／板条，使样品混合均匀。再按照“操作步骤”进行检测。
2.4 细胞培养物
2.4.1 移去细胞培养液，收集培养瓶中的细胞加入离心管中。
2.4.2 2500g离心5分钟，弃上清。
2.4.3 向细胞团中加入500uL样品稀释液（1×）。旋涡振荡充分混匀，室温孵育1小时。期间不时旋涡混合。取此样品75uL按照“操作步骤”进行检测。
2.5 组织
最好用新鲜的组织。如果有必要，组织可以在处理前于2～7℃冷藏保存1个月。每只动物检测1～2种组织，最好选取扁桃体、脾、肠、肠系膜淋巴结或肺。
2.5.1 取1～2g组织用剪刀剪成小碎块（2～5mm大小）。
2.5.2 将组织碎块加入10mL离心管，加入5mL样品稀释液（1×）,旋涡振荡混匀，室温下孵育1～21小时，期间不时旋涡混合。
2.5.3 1500g离心5分钟，取75uL上清液按照“操作步骤”进行检测。
3 操作步骤
注意：所有试剂在使用前应该恢复至室温18～22℃；使用前试剂应在室温条件下至少放置1小时。
3.1 每孔加入25uLCSFV特异性单克隆抗体。此步骤可以用多道加样器操作。
3.2 在相应孔中分别加入75uL阳性对照、阴性对照，各加2孔。注意更换吸头。
3.3 在其余孔中分别加入75uL制备好的样品，注意更换吸头。轻轻拍打酶标板，使样品混合均匀。
3.4 置湿盒中或用胶条密封后室温（18～22℃）孵育过夜。也可以孵育4个小时，但是这样会降低检测灵敏度。
3.5 甩掉孔中液体，用洗涤液（1×）洗涤5次，每次洗涤都要将孔中的所有液体倒空，用力拍打酶标板，以使所有液体拍出。或者，每孔加入洗涤液250～300uL用自动洗板机洗涤5次。注意:洗涤酶标板要仔细。
3.6 每孔加入100uL稀释好的辣根过氧化物酶标记物，在湿盒或密封后置室温孵育1小时。
3.7 重复操作步骤3.5；每孔加入100uL底物液，在暗处室温孵育10分钟。第1孔加入底物液开始计时。
3.8 每孔加入100uL终止液终止反应。加入终止液的顺序与上述加入底物液的顺序一致。
3.9 在酶标仪上测量样品与对照孔在450nm处的吸光值，或测量在450nm和620nm双波长的吸光值（空气调零）。
3.10 计算每个样品和阳性对照孔的矫正OD值的平均值（参见“计算方法”）。 4 计算方法
首先计算样品和对照孔的OD平均值，在判定结果之前，所有样品和阳性对照孔的OD平均值必须进行矫正，矫正的OD值等于样本或阳性对照值减去阴性对照值。
矫正OD值＝样本OD值－阴性对照OD值
5 试验有效性判定
阳性对照OD平均值应该大于0.500，阴性对照OD平均值应小于阳性对照平均值的20％，试验结果方能有效。否则，应仔细检查实验操作并进行重测。如果阴性对照的OD值始终很高，将阴性对照在微量离心机中10000g离心3～5分钟，重新检测。
6 结果判定
被检样品的矫正OD值大于或等于0.300，则为阳性；
被检样品的矫正OD值小于0.200，则为阴性；
被检样品的矫正OD值大于0.200，小于0.300，则为可疑。
附件6：猪瘟病毒抗体阻断ELISA检测方法
本方法是用于检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体的一种阻断ELISA方法，通过待测抗体和单克隆抗体与猪瘟病毒抗原的竞争结合，采用辣根过氧化物酶与底物的显色程度来进行判定。
1 操作步骤
在使用时，所有的试剂盒组分都必须恢复到室温18～25℃。使用前应将各组分放置于室温至少1小时。
1.1 分别将50uL样品稀释液加入每个检测孔和对照孔中。
1.2 分别将50uL的阳性对照和阴性对照加入相应的对照孔中，注意不同对照的吸头要更换，以防污染。
1.3 分别将50uL的被检样品加入剩下的检测孔中，注意不同检样的吸头要分开，以防污染。
1.4 轻弹微量反应板或用振荡器振荡，使反应板中的溶液混匀。
1.5 将微量反应板用封条封闭置于湿箱中（18～25℃）孵育2小时，也可以将微量反应板用封条置于湿箱中孵育过夜。
1.6 吸出反应孔中的液体，并用稀释好的洗涤液洗涤3次，注意每次洗涤时都要将洗涤液加满反应孔。
1.7 分别将100uL的抗CSFV酶标二抗（即取即用）加入反应孔中，用封条封闭反应板并于室温下或湿箱中孵育30分钟。
1.8 洗板（见1.6）后，分别将100uL的底物溶液加入反应孔中，于避光、室温条件下放置10分钟。加完第一孔后即可计时。
1.9 在每个反应孔中加入100uL终止液终止反应。注意要按加酶标二抗的顺序加终止液。
1.10 在450nm处测定样本以及对照的吸光值，也可用双波长(450nm和620nm)测定样本以及对照的吸光度值，空气调零。
1.11 计算样本和对照的平均吸光度值。计算方法如下：
计算被检样本的平均值OD450（＝ODTEST）、阳性对照的平均值（＝ODPOS）、阴性对照的平均值（＝ODNEG）。
根据以下公式计算被检样本和阳性对照的阻断率；
ODNEG- ODTEST
阻断率＝———————×100%
ODNEG
2 试验有效性
阴性对照的平均OD450应大于0.50。阳性对照的阻断率应大于50%。
3 结果判定
如果被检样本的阻断率大于或等于40％，该样本被判定为阳性（有CSFV抗体存在）。如果被检样本的阻断率小于或等于30％，该样本被判定为阴性（无CSFV抗体存在）。如果被检样本阻断率在30～40％之间，应在数日后再对该动物进行重测。
附件7：荧光抗体病毒中和试验
本方法是国际贸易指定的猪瘟抗体检测方法。 该试验是采用固定病毒稀释血清的方法。测定的结果表示待检血清中抗体的中和效价。具体操作如下：
5将浓度为2×10细胞/mL的PK-15细胞悬液接种到带有细胞玻片的5cm平皿或莱顿氏管
（leighton’s），也可接种到平底微量培养板中；
细胞培养箱中37℃培养至汇合率为70%～80%的细胞单层（1～2天）。
将待检血清56℃灭活30分钟，用无血清EMEM培养液作2倍系列稀释；
将稀释的待检血清与含200TCID50/0.1mL的猪瘟病毒悬液等体积混合，置37℃孵育1～2小时；
用无血清EMEM培养液漂洗细胞单层。然后，加入血清病毒混合物，每个稀释度加2个莱顿氏管或培养板上的2个孔，37℃孵育1小时；
吸出反应物，加入EMEM维持液[含2%胎牛血清(无BVDV抗体)，56℃灭活30分钟]、0.3％谷氨酰胺、青霉素100IU/mL、链霉素100IU/mL)，37℃继续培养48～72小时；最终用荧光抗体染色法进行检测（见附件2）。
根据特异荧光的有无来计算中和效价。
(中和效价值达到多少表示抗体阳性或抗体达到保护)
附件8：猪瘟中和试验方法
本试验采用固定抗原稀释血清的方法，利用家兔来检测猪体的抗体。
1 操作程序
1.1 先测定猪瘟兔化弱毒（抗原）对家兔的最小感染量。试验时，将抗原用生理盐水稀释，使每1mL含有100个兔的最小感染量，为工作抗原（如抗原对兔的最小感染量为10-5/mL，则将抗原稀释成1000倍使用）。
1.2 将被检猪血清分别用生理盐水作2倍稀释，与含有100个兔的最小感染量工作抗原等量混合，摇匀后，置10～15℃中和2小时，其间振摇2～3次。同时设含有相同工作抗原量加等量生理盐水（不加血清）的对照组，与被检组在同样条件下处理。
1.3 中和完毕，被检组各注射家兔1～2只，对照组注射家兔2只，每只耳静脉注射1mL，观察体温反应，并判定结果。
2 结果判定
2.1 当对照组2只家兔均呈定型热反应（++），或1只兔呈定型热反应（++），另一只兔呈轻热反应时，方能判定结果。被检组如用1只家兔，须呈定型热反应；如用2只家兔，每只家兔应呈定型热反应或轻热反应，被检血清判为阴性。
2.2 兔体体温反应标准如下：
2.2.1 热反应（+）:潜伏期24～72小时，体温上升呈明显曲线，超过常温1℃以上，稽留12～36小时。
2.2.2 可疑反应（±）:潜伏期不到24小时或72小时以上，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时或超过36小时而不下降。
2.2.3 无反应（—）:体温正常。
附件9：消毒
1 药品种类
消毒药品必须选用对猪瘟病毒有效的，如烧碱、醛类、氧化剂类、氯制剂类、双季胺盐类等。
2 消毒范围
猪舍地面及内外墙壁，舍外环境，饲养、饮水等用具，运输等设施设备以及其它一切可能被污染的场所和设施设备。
3 消毒前的准备
3.1 消毒前必须清除有机物、污物、粪便、饲料、垫料等；
3.2 消毒药品必须选用对猪瘟病毒有效的；
3.3 备有喷雾器、火焰喷射枪、消毒车辆、消毒防护用具（如口罩、手套、防护靴等）、消毒容器等。
4 消毒方法
4.1 金属设施设备的消毒，可采取火焰、熏蒸等方式消毒；
4.2 猪舍、场地、车辆等，可采用消毒液清洗、喷洒等方式消毒；
4.3 养猪场的饲料、垫料等，可采取堆积发酵或焚烧等方式处理；
4.4 粪便等可采取堆积密封发酵或焚烧等方式处理；
4.5 饲养、管理等人员可采取淋浴消毒；
4.6 衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取消毒液浸泡、高压灭菌等方式消毒；
4.7 疫区范围内办公、饲养人员的宿舍、公共食堂等场所，可采用喷洒的方式消毒；
4.8 屠宰加工、贮藏等场所以及区域内池塘等水域的消毒可采取相应的方式进行，避免造成污染。
高致病性猪蓝耳病防治技术规范
农医发［2007］10号
农业部关于做好2007年猪病防控工作的通知
2007年3月28日
高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征（俗称蓝耳病）病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病。仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡是其特征。
为及时、有效地预防、控制和扑灭高致病性猪蓝耳病疫情，依据《中华人民共和国动物防疫法》、《重大动物疫情应急条例》和《国家突发重大动物疫情应急预案》及有关的法律法规，制定本规范。
1 适用范围
本规范规定了高致病性猪蓝耳病诊断、疫情报告、疫情处置、预防控制、检疫监督的操作程序与技术标准。
本规范适用于中华人民共和国境内一切与高致病性猪蓝耳病防治活动有关的单位和个人。
2 诊断
2.1 诊断指标
2.1.1 临床指标
体温明显升高，可达41℃以上；眼结膜炎、眼睑水肿；咳嗽、气喘等呼吸道症状；部分猪后躯无力、不能站立或共济失调等神经症状；仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，成年猪也可发病死亡。
2.1.2 病理指标
可见脾脏边缘或表面出现梗死灶，显微镜下见出血性梗死；肾脏呈土黄色，表面可见针尖至小米粒大出血点斑，皮下、扁桃体、心脏、膀胱、肝脏和肠道均可见出血点和出血斑。显微镜下见肾间质性炎，心脏、肝脏和膀胱出血性、渗出性炎等病变；部分病例可见胃肠道出血、溃疡、坏死。
2.1.3 病原学指标
2.1.3.1 高致病性猪蓝耳病病毒分离鉴定阳性。
2.1.3.2 高致病性猪蓝耳病病毒反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测阳性。
2.2结果判定
2.2.1 疑似结果
符合2.1.1和2.1.2，判定为疑似高致病性猪蓝耳病。
2.2.2 确诊
符合2.2.1，且符合2.1.3.1和2.1.3.2之一的，判定为高致病性猪蓝耳病。
3 疫情报告
3.1 任何单位和个人发现猪出现急性发病死亡情况，应及时向当地动物疫控机构报告。
3.2 当地动物疫控机构在接到报告或了解临床怀疑疫情后，应立即派员到现场进行初步调查核实，符合2.2.1规定的，判定为疑似疫情。
3.3 判定为疑似疫情时，应采集样品进行实验室诊断，必要时送省级动物疫控机构或国家指定实验室。
3.4 确认为高致病性猪蓝耳病疫情时，应在2个小时内将情况逐级报至省级动物疫控机构和同级兽医行政管理部门。省级兽医行政管理部门和动物疫控机构按有关规定向农业部报告疫情。
3.5 国务院兽医行政管理部门根据确诊结果，按规定公布疫情。
4 疫情处置
4.1 疑似疫情的处置
对发病场/户实施隔离、监控，禁止生猪及其产品和有关物品移动，并对其内、外环境实施严格的消毒措施。对病死猪、污染物或可疑污染物进行无害化处理。必要时，对发病猪和同群猪进行扑杀并无害化处理。
4.2 确认疫情的处置
4.2.1 划定疫点、疫区、受威胁区
由所在地县级以上兽医行政管理部门划定疫点、疫区、受威胁区。
疫点：为发病猪所在的地点。规模化养殖场/户，以病猪所在的相对独立的养殖圈舍为疫点；散养猪以病猪所在的自然村为疫点；在运输过程中，以运载工具为疫点；在市场发现疫情，以市场为疫点；在屠宰加工过程中发现疫情，以屠宰加工厂/场为疫点。
疫区：指疫点边缘向外延3公里范围内的区域。根据疫情的流行病学调查、免疫状况、疫点周边的饲养环境、天然屏障（如河流、山脉等）等因素综合评估后划定。
受威胁区：由疫区边缘向外延伸5公里的区域划为受威胁区。
4.2.2 封锁疫区
由当地兽医行政管理部门向当地县级以上人民政府申请发布封锁令，对疫区实施封锁：在疫区周围设置警示标志；在出入疫区的交通路口设置动物检疫消毒站，对出入的车辆和有关物品进行消毒；关闭生猪交易市场，禁止生猪及其产品运出疫区。必要时，经省级人民政府批准，可设立临时监督检查站，执行监督检查任务。
4.2.3 疫点应采取的措施
扑杀所有病猪和同群猪；对病死猪、排泄物、被污染饲料、垫料、污水等进行无害化处理；对被污染的物品、交通工具、用具、猪舍、场地等进行彻底消毒。
4.2.4 疫区应采取的措施
对被污染的物品、交通工具、用具、猪舍、场地等进行彻底消毒；对所有生猪用高致病性猪蓝耳病灭活疫苗进行紧急强化免疫，并加强疫情监测。
4.2.2.5 受威胁区应采取的措施
对受威胁区所有生猪用高致病性猪蓝耳病灭活疫苗进行紧急强化免疫，并加强疫情监测。
4.2.2.6 疫源分析与追踪调查
开展流行病学调查，对病原进行分子流行病学分析，对疫情进行溯源和扩散风险评估。
4.2.2.7 解除封锁
疫区内最后一头病猪扑杀或死亡后14天以上，未出现新的疫情；在当地动物疫控机构的监督指导下，对相关场所和物品实施终末消毒。经当地动物疫控机构审验合格，由当地兽医行政管理部门提出申请，由原发布封锁令的人民政府宣布解除封锁。
4.3 疫情记录
对处理疫情的全过程必须做好完整详实的记录（包括文字、图片和影像等），并归档。 5 预防控制
5.1 监测
5.1.1 监测主体
县级以上动物疫控机构。
5.1.2 监测方法
流行病学调查、临床观察、病原学检测。
5.1.3 监测范围
5.1.3.1 养殖场/户，交易市场、屠宰厂/场、跨县调运的生猪。
5.1.3.2 对种猪场、隔离场、边境、近期发生疫情及疫情频发等高风险区域的生猪进行重点监测。
5.1.4监测预警
各级动物疫控机构对监测结果及相关信息进行风险分析，做好预警预报。
农业部指定的实验室对分离到的毒株进行生物学和分子生物学特性分析与评价，及时向国务院兽医行政管理部门报告。
5.1.5 监测结果处理
按照《国家动物疫情报告管理办法》的有关规定将监测结果逐级汇总上报至国家动物疫控机构。
5.2 免疫
5.2.1 对所有生猪用高致病性猪蓝耳病灭活疫苗进行免疫，免疫方案见《猪病免疫推荐方案（试行）》。发生高致病性猪蓝耳病疫情时，用高致病性猪蓝耳病灭活疫苗进行紧急强化免疫。
5.2.2 养殖场/户必须按规定建立完整免疫档案，包括免疫登记表、免疫证、畜禽标识等。
5.2.3 各级动物疫控机构定期对免疫猪群进行免疫抗体水平监测，根据群体抗体水平消长情况及时加强免疫。
5.3 加强饲养管理，实行封闭饲养，建立健全各项防疫制度，做好消毒、杀虫灭鼠等工作。
6 检疫监督
6.1 产地检疫
生猪在离开饲养地之前，养殖场/户必须向当地动物卫生监督机构报检。动物卫生监督机构接到报检后必须及时派员到场/户实施检疫。检疫合格后，出具合格证明；对运载工具进行消毒，出具消毒证明，对检疫不合格的按照有关规定处理。
6.2 屠宰检疫
动物卫生监督机构的检疫人员对生猪进行验证查物，合格后方可入厂/场屠宰。检疫合格并加盖（封）检疫标志后方可出厂/场，不合格的按有关规定处理。
6.3 种猪异地调运检疫
跨省调运种猪时，应先到调入地省级动物卫生监督机构办理检疫审批手续，调出地按照规范进行检疫，检疫合格方可调运。到达后须隔离饲养14天以上，由当地动物卫生监督机构检疫合格后方可投入使用。
6.4 监督管理
6.4.1 动物卫生监督机构应加强流通环节的监督检查，严防疫情扩散。生猪及产品凭检疫合格证（章）和畜禽标识运输、销售。
6.4.2 生产、经营动物及动物产品的场所，必须符合动物防疫条件，取得动物防疫合格证。当地动物卫生监督机构应加强日常监督检查。
6.4.3 任何单位和个人不得随意处置及转运、屠宰、加工、经营、食用病（死）猪及其产品。