4.1 光度分析法[5] [6]
β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。
4.1.1试剂的配制：
缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc－HAc缓冲溶液
β-氨基丙酸标准溶液的配制：
用电子天平准确称取1.020 gβ-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L标准溶液。
茚三酮试剂的配制：称取0.5g茚三酮溶于100ml蒸馏水中，得到5g/L的茚三酮水溶液。
4.1.2标准曲线的确定
分别准确移取0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml、1.00ml标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml再加入1ml茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。
4.1.3样品的测定
稀释待测液于0.24mg/ml—0.73mg/ml,调pH值到6.00，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。
4.1.4 标准曲线的测定结果
β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml—0.73mg/ml范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1：
吸光度
加入标液体积(ml)
图 1 标准曲线的测定
Fig 1 Determination of the standard curve
注：在沸水中加热10min，β-氨基丙酸标准溶液5ml、茚三酮水溶液1ml、缓冲溶液pH=6.00
4.1.5样品的测定分析
将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的
反应条件下反应，再观察样品的显色程度而确定。取稀释后的产物液1ml,用pH=6.00的缓冲液稀释到5ml再加入1ml茚三酮水溶液，在沸水中加热10min,测得如下数据如表3：
表3 样品的测定
Table 3 Determination of sample
待测液序号
1
2
3
待测液所对应的反应时间 10h 20h 22h 吸光度A 0.320 0.710 0.562
4.1.6 浓度对显色反应的影响:
实验表明，β-氨基丙酸与茚三酮水溶液在表3所注的条件反应的最低浓度为0.24mg/ml，随着β-氨基丙酸的浓度变大显色逐渐变深。当浓度大于0.73mg/ml时，所显颜色过深或生成紫色化合物影响其吸光度。当β-氨基丙酸的浓度在0.24mg/m—0.73mg/ml时，颜色变化明显而且稳定，因此，我选定此浓度范围作为测定范围。得到的数据如表4：
表4 浓度对显色反应的影响
4.1.7 pH值对显色反应的影响[8]
以1.5mg/ ml的标准溶液5ml，加入1ml茚三酮水溶液在沸水中加热10min,观察到的颜色变化如 表5：
表 5 pH值对显色反应的影响
缓冲溶液Ph=6.00
显色反应随着pH值得不同，颜色有着明显的变化。当pH值小于3.42时几乎无色，而在pH值在3.78—7.44时颜色变化明显。pH值为6.00，加热不到二分钟即显色；pH值为9.05，加入茚三酮溶液后不加热30s左右即显红棕色；茚三酮水溶液在强碱的条件下带有明显的淡黄色。因此pH值为6.00左右最好。故我选定pH值为6.00。此时显色明显无干扰且稳定。
4.1.8温度和反应时间的影响：
实验表明：温度和反应时间对此显色反应的影响很大。温度太低，反应太慢导致显色时间长，而且显色效果不好。而温度过高，反应时间长对此反应影响也很大，会生成紫色化合物影响其吸光度。在显色反应中，反应时间主要根据具体的颜色变化而定。一般来说，β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml—0.73mg/ml时，在
沸水中加热10min即可，时间太短，反映不完全颜色梯度不明显。时间过长，溶液挥发严重也影响其吸光度。故我把反应时间定在10min左右。
4.1.9其他因素的影响
不同溶剂的茚三酮溶液对显色反应也有一些影响。为了区别它们对显色反应的影响，我做了如下实验：分别称取0.2002g茚三酮三份，分别溶于乙醇、水、丙酮各100ml中，可以观察到：丙酮溶解茚三酮的速度最快，乙醇次之。移取β-氨基丙酸标准溶液(4.080g/l)1ml三份,用pH值为6.00的NaAc－HAc缓冲溶液稀释到5ml再依次加入1ml茚三酮水溶液、乙醇溶液以及丙酮溶液，在沸水中加热。实验表明：在加热2min时，乙醇溶液开始显色；丙酮溶液的显红棕色；水溶液无色。在加热6min时，丙酮溶液的颜色加深；水溶液显浅蓝色；乙醇溶液的所显颜色最深。
乙醇易挥发，在加热的条件下挥发更严重。基于这一点的考虑，我采用茚三酮水溶液。而茚三酮的用量对此显色反应的影响不大，可以选择5ml的被测液与1ml(5g/l)的茚三酮水溶液反应。测定时，最好选择标样与待测液在同一水浴。这样可以减少误差提高测定的准确度。
另外，当被测液中含有其他的氨基酸或是含氨基的化合物也可以与茚三酮发生显色反应，影响测定结果。总之，茚三酮比色法作为一种β-氨基丙酸的定量检测方法具有操作简单、成本低的优点。只要控制好反应条件就能得到较好的测量结果。
三．茚三酮比色法：
1原理：氨基酸在一定pH范围内，能与茚三酮生成兰紫色化合物。可以用比色
法定量测定。
2试剂：
（1）磷酸缓冲液（pH.8.04）制备方法如下：
称磷酸二氢钾4.5350g。定容500ml
称NAH2PO4·12H2O 11.9380g分别溶解定容500ml
取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液
（2）2%茚三酮溶液：
称茚三酮1g→溶于35ml热水→加入40mg氯化亚锡（SnCl2·H2O）搅拌过
滤（作防腐剂）→于冷暗处过夜→定容50ml
① 氨基酸标液
称干燥氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g→溶解定容100ml→摇匀→吸10ml于
另外100ml容量瓶定容100ml，即得200Ug/ml标液
3操作方法：
（1）绘制标准曲线：
取7个25ml容量瓶，吸取标液 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于
7个25ml容量瓶，加水补充
至容积为4ml，然后加茚三酮和缓冲液各1ml，于水浴加热15分钟，冷却后
定容25ml，静置
15分钟，在570nm下测消光值，绘制标准曲线。
（2）样品测定：
取样品5.00~10.0g（液体样5-10ml）→于烧杯中→加50ml水和活性碳约5
g→加热过滤→用
30—40ml热水洗涤活性炭→吸澄清样液1~4ml→加茚三酮和缓冲液各1ml
水浴加热15分钟，
冷却定容，静置15分钟于570nm下测定消光值，按下式计算氨基酸含量。 氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W×1000）×100
C——从标准曲线上查得得氨基酸的量（Ug）
W——测定得样品溶液相当于样品的量（g）
注意事项：
茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进
行纯化，方法如下：
取10g茚三酮容于40ml热水中，加一克活性炭，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用2ml冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。
茚三酮显色法测定氨基酸含量
一、 目的
学习茚三酮显色法测定氨基酸含量的方法
二、 原理
茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。
三、 试剂与材料
（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L溶液。
（2）pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L乙酸混合而成。用pH检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g茚三酮溶于15～25mL热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻搅拌。加热30min后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取5g茚三酮，用125mL沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将5g维生素C用250mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg氨基酸。
（6）分光光度计。
（7）水浴锅。
四、操作步骤
1．标准曲线的制作
分别取0.3mmol/L的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3mL 60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。
以OD570nm为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
2．氨基酸样品的测定
取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min内稳定）。
将样品测定的OD570nm与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。
五、 结果计算
OD570nm对应标准曲线查得
值 氨基酸含量（mmol/L）=
1 000
4.1 光度分析法[5] [6]
β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。
4.1.1试剂的配制：
缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc－HAc缓冲溶液
β-氨基丙酸标准溶液的配制：
用电子天平准确称取1.020 gβ-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L标准溶液。
茚三酮试剂的配制：称取0.5g茚三酮溶于100ml蒸馏水中，得到5g/L的茚三酮水溶液。
4.1.2标准曲线的确定
分别准确移取0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml、1.00ml标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml再加入1ml茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。
4.1.3样品的测定
稀释待测液于0.24mg/ml—0.73mg/ml,调pH值到6.00，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。
4.1.4 标准曲线的测定结果
β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml—0.73mg/ml范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1：
吸光度
加入标液体积(ml)
图 1 标准曲线的测定
Fig 1 Determination of the standard curve
注：在沸水中加热10min，β-氨基丙酸标准溶液5ml、茚三酮水溶液1ml、缓冲溶液pH=6.00
4.1.5样品的测定分析
将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的
反应条件下反应，再观察样品的显色程度而确定。取稀释后的产物液1ml,用pH=6.00的缓冲液稀释到5ml再加入1ml茚三酮水溶液，在沸水中加热10min,测得如下数据如表3：
表3 样品的测定
Table 3 Determination of sample
待测液序号
1
2
3
待测液所对应的反应时间 10h 20h 22h 吸光度A 0.320 0.710 0.562
4.1.6 浓度对显色反应的影响:
实验表明，β-氨基丙酸与茚三酮水溶液在表3所注的条件反应的最低浓度为0.24mg/ml，随着β-氨基丙酸的浓度变大显色逐渐变深。当浓度大于0.73mg/ml时，所显颜色过深或生成紫色化合物影响其吸光度。当β-氨基丙酸的浓度在0.24mg/m—0.73mg/ml时，颜色变化明显而且稳定，因此，我选定此浓度范围作为测定范围。得到的数据如表4：
表4 浓度对显色反应的影响
4.1.7 pH值对显色反应的影响[8]
以1.5mg/ ml的标准溶液5ml，加入1ml茚三酮水溶液在沸水中加热10min,观察到的颜色变化如 表5：
表 5 pH值对显色反应的影响
缓冲溶液Ph=6.00
显色反应随着pH值得不同，颜色有着明显的变化。当pH值小于3.42时几乎无色，而在pH值在3.78—7.44时颜色变化明显。pH值为6.00，加热不到二分钟即显色；pH值为9.05，加入茚三酮溶液后不加热30s左右即显红棕色；茚三酮水溶液在强碱的条件下带有明显的淡黄色。因此pH值为6.00左右最好。故我选定pH值为6.00。此时显色明显无干扰且稳定。
4.1.8温度和反应时间的影响：
实验表明：温度和反应时间对此显色反应的影响很大。温度太低，反应太慢导致显色时间长，而且显色效果不好。而温度过高，反应时间长对此反应影响也很大，会生成紫色化合物影响其吸光度。在显色反应中，反应时间主要根据具体的颜色变化而定。一般来说，β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml—0.73mg/ml时，在
沸水中加热10min即可，时间太短，反映不完全颜色梯度不明显。时间过长，溶液挥发严重也影响其吸光度。故我把反应时间定在10min左右。
4.1.9其他因素的影响
不同溶剂的茚三酮溶液对显色反应也有一些影响。为了区别它们对显色反应的影响，我做了如下实验：分别称取0.2002g茚三酮三份，分别溶于乙醇、水、丙酮各100ml中，可以观察到：丙酮溶解茚三酮的速度最快，乙醇次之。移取β-氨基丙酸标准溶液(4.080g/l)1ml三份,用pH值为6.00的NaAc－HAc缓冲溶液稀释到5ml再依次加入1ml茚三酮水溶液、乙醇溶液以及丙酮溶液，在沸水中加热。实验表明：在加热2min时，乙醇溶液开始显色；丙酮溶液的显红棕色；水溶液无色。在加热6min时，丙酮溶液的颜色加深；水溶液显浅蓝色；乙醇溶液的所显颜色最深。
乙醇易挥发，在加热的条件下挥发更严重。基于这一点的考虑，我采用茚三酮水溶液。而茚三酮的用量对此显色反应的影响不大，可以选择5ml的被测液与1ml(5g/l)的茚三酮水溶液反应。测定时，最好选择标样与待测液在同一水浴。这样可以减少误差提高测定的准确度。
另外，当被测液中含有其他的氨基酸或是含氨基的化合物也可以与茚三酮发生显色反应，影响测定结果。总之，茚三酮比色法作为一种β-氨基丙酸的定量检测方法具有操作简单、成本低的优点。只要控制好反应条件就能得到较好的测量结果。
三．茚三酮比色法：
1原理：氨基酸在一定pH范围内，能与茚三酮生成兰紫色化合物。可以用比色
法定量测定。
2试剂：
（1）磷酸缓冲液（pH.8.04）制备方法如下：
称磷酸二氢钾4.5350g。定容500ml
称NAH2PO4·12H2O 11.9380g分别溶解定容500ml
取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液
（2）2%茚三酮溶液：
称茚三酮1g→溶于35ml热水→加入40mg氯化亚锡（SnCl2·H2O）搅拌过
滤（作防腐剂）→于冷暗处过夜→定容50ml
① 氨基酸标液
称干燥氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g→溶解定容100ml→摇匀→吸10ml于
另外100ml容量瓶定容100ml，即得200Ug/ml标液
3操作方法：
（1）绘制标准曲线：
取7个25ml容量瓶，吸取标液 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于
7个25ml容量瓶，加水补充
至容积为4ml，然后加茚三酮和缓冲液各1ml，于水浴加热15分钟，冷却后
定容25ml，静置
15分钟，在570nm下测消光值，绘制标准曲线。
（2）样品测定：
取样品5.00~10.0g（液体样5-10ml）→于烧杯中→加50ml水和活性碳约5
g→加热过滤→用
30—40ml热水洗涤活性炭→吸澄清样液1~4ml→加茚三酮和缓冲液各1ml
水浴加热15分钟，
冷却定容，静置15分钟于570nm下测定消光值，按下式计算氨基酸含量。 氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W×1000）×100
C——从标准曲线上查得得氨基酸的量（Ug）
W——测定得样品溶液相当于样品的量（g）
注意事项：
茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进
行纯化，方法如下：
取10g茚三酮容于40ml热水中，加一克活性炭，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用2ml冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。
茚三酮显色法测定氨基酸含量
一、 目的
学习茚三酮显色法测定氨基酸含量的方法
二、 原理
茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。
三、 试剂与材料
（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L溶液。
（2）pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L乙酸混合而成。用pH检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g茚三酮溶于15～25mL热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻搅拌。加热30min后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取5g茚三酮，用125mL沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将5g维生素C用250mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg氨基酸。
（6）分光光度计。
（7）水浴锅。
四、操作步骤
1．标准曲线的制作
分别取0.3mmol/L的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3mL 60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。
以OD570nm为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
2．氨基酸样品的测定
取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min内稳定）。
将样品测定的OD570nm与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。
五、 结果计算
OD570nm对应标准曲线查得
值 氨基酸含量（mmol/L）=
1 000