（一）重组 T 质粒的构建 一．原理 外源 DNA 与载体分子的连接就是 DNA 重组， 这样重新组合的 DNA 叫做重组体 或重组子。重组的 DNA 分子是在 DNA 连接酶的作用下，有 Mg2 、ATP 存在的 连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源 DNA 分子进行连接。DNA 连接酶有两种：T4 噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。两种 DNA 连 接酶都有将两个带有相同粘性末端的 DNA 分子连在一起的功能，而且 T4 噬菌 体 DNA 连接酶还有一种大肠杆菌 DNA 连接酶没有的特性，即能使两个平末端 的双链 DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可 一般可 通过提高 T4 噬菌体 DNA 连接酶浓度或增加 DNA 浓度来提高平末端的连接效 率。T4 噬菌体 DNA 连接酶催化 DNA 连接反应分为 3 步：首先，T4 DNA 连 接酶与辅因子 ATP 形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP 复合物再结合到具有 5’ 磷酸基和 3’羟基切口的 DNA 上，使 DNA 腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯 键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为 DNA 片断 有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两 种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端 都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了 减少自环的高本底， 可对载体进行 5’除磷酸处理， 除磷酸处理， 除磷酸处理 原理是连接酶只能连接 DNA 一旦有外源片断插入时， 片断的 3’OH 末端与 5’端， 端 所以除磷后载体不会自环。 由外源片断提供 5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的 自 环造成的高本底。 对于双酶切来说， 无论载体与供体同一片段上都有不同的末端， 这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个 特点是能将供体分子定向连接到载体上。 连接反应的温度在 37℃时有利于连接酶的活性 温度在 ℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢 键结合是不稳定的。 因此采取折中的温度， 12-16℃， （过夜） ， 即 ℃ 连接 12-16h 这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA 酶扩增的 PCR 产物，其 DNA 双链前后末端都有一个游离的 A 碱基，可 产物， 碱基， 质粒。 以与 pGEM-T Easy Vector 末端游离的 T 碱基互补形成环状重组 T 质粒。 二．材料与方法 1 材料：外源 DNA 片断 2 仪器、用具：移液枪、碎冰 3 试剂：pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP 4 方法 连接体系如下： 16℃连接过夜。
（二） 重组质粒的转化及阳性克
隆的鉴定 1 材料 E.coli JM109 菌株 2 仪器、用具 超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml 离心管、 电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器 3 试剂 (1) CaCl2、LB 平板（见附录）；SOC 培养基（见附录）；SOB 培养基 (2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；无水乙醇 的 Buffer W2a (3) 1×电泳缓冲液（TAE）；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心]；琼脂糖；6× 加样缓冲液 (4) 酚；氯仿；异戊醇 (5) ddH2O；10×PCR Buffer (Mg2 plus)；dNTP；M13 ；M13-；TaKaRa rTaq 酶
4 方法 1. 大肠杆菌感受态细胞的制备 (1) 取大肠杆菌 JM109 保存液 50µl，接种于 4ml LB（或 SOB）液体培养基 中，37℃，300rpm 振荡培养过夜，第二天取 50µl 转接到新的 4ml LB（或 SOB）液体培养基中扩大培养 3h 至 OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取 1ml 菌液于 1.5ml 离心管中，冰浴 10min。 (2) 4℃，5000rpm 离心 2min，去上清液。 (3) 加入 750µl 预冷的 0.1M CaCl2 重悬菌体，冰浴 30min。 (4) 4℃，5000rpm 离心 2min，弃上清液。 (5) 加入 100µl 冰冷的 0.1M CaCl2 轻轻重悬菌体，冰浴 2h 后，4℃保存备 用。 2. 重组 DNA 的转化 (1) 将含 Amp、X-Gal、IPTG 的 LB 平板 37℃预热。 (2) 于 100µl 感受态细胞中加入 10µl 连接产物，冰浴 30min。 (3) 将离心管转入 42℃水浴，热冲击 90 秒，然后不要摇动离心管，迅速将其 放在冰上 2min。 (4) 在离心管中加入 SOC 培养基 300µl，枪头混匀，37℃、150rpm 温和摇 振 60min。 (5) 将 200µl 转化菌液均匀地涂布于含 50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、 200mg/ml IPTG 的 LB 平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。
注意事项： ① 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止 感受态细胞受杂菌污染。 ② 42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。 ③ 菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化， 过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。 3． 重组质粒的鉴定 方案一 菌落 PCR (1) 制备 PCR 混合液： (2) 用经灭菌的 10µl 枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上 述混合液中。 (3) 盖上离心管得盖子，在沸水上温育 10 min。 (4) 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入 TaKaRa rTaq 酶 0.25ul。 (5) 按以下条件进行 PCR 反应：94℃预变性 3min；然后进行 30 个循环反应， 其温度循环条件为：94℃变性 1min，57℃退火 1min，72 ℃延伸 1min；循 环结束后 72℃再延伸 5min。 (6) 取 5µl PCR 产物在 1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
方案二 质粒 PCR 1. 碱裂解法少量制备质粒 DNA (1) 用离心管收集 4ml 在 LB 培养基 （含 Amp） 中培养过夜
的菌液， 14000rpm 离心 30 秒，弃尽上清。 (2) 用 250µl 已加入 RNase A1 的 Buffer S1 充分悬浮细菌沉淀。 (3) 加入 250µl Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合 4-6 次，此步骤不宜 超过 5min。 *Buffer S2 使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH，降低溶菌效率。 (4) 加入 400µl Buffer S3，温和地上下翻转 8-10 次，室温静置 2min， 14000rpm 离心 10min。
*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g 离心 3min。 (5) 将 DNA-prep Tube 置于 2-ml Microfuge Tube 中，将步⑷中的混合液 移入 DNA-prep Tube 中，5500rpm 离心 1min。 (6) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，加入 500µl Buffer W1，5500rpm 离心 1min。 (7) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，加入 700µl 已加无水乙醇的 Buffer W2，5500rpm 离心 1min，以同样的方法再用 700µl 已加无水乙醇的 Buffer W2 洗涤一次。 (8) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中， 14000rpm 离心 1min。(9) 连滤液一并弃掉收集管，将 DNA-prep Tube 置 于一新的 1.5ml 离心管中，在 silica 膜 中央加入 25-30µl Eluent 或去离子水。 (10) 室温静置 2 min，14000rpm 离心 1min 洗脱 DNA。 (11) 取 5µL 样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。 2. 抽提纯化质粒 DNA 酚、 氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒 DNA 中残留 的蛋白质。 (1) 加 TE 稀释质粒 DNA 溶液至 300µL。 (2) 加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡混匀，静置 3min。 (3) 14000rpm 离心 5min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇 （25:24:1），混匀，静置 3min。 (4) 14000rpm 离心 5min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混 匀，静置 3min。 (5) 14000rpm 离心 5min，吸上清液，加 2.5 倍体积预冷的无水乙醇，混匀 后-20℃放置 15min，沉淀质粒 DNA。 (6) 14000rpm 离心 13min， 弃上清液， 沉淀加入 200µL 70%乙醇洗涤一次， 室温干燥，用 20µL 去离子双蒸水溶解质粒 DNA 沉淀，-20℃保存待用。 (7) 取 5µl 样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。 3. 质粒 PCR (1) PCR 反应体系如下： (2) PCR 扩增反应条件：94℃预变性 3min；然后进行 30 个循环反应，其温 度循环条件为： 94℃变性 1min，57℃退火 1min，72 ℃延伸 1min；循环结束后 72℃再延 伸 5min。 (3) 取 5µl PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。
（一）重组 T 质粒的构建 一．原理 外源 DNA 与载体分子的连接就是 DNA 重组， 这样重新组合的 DNA 叫做重组体 或重组子。重组的 DNA 分子是在 DNA 连接酶的作用下，有 Mg2+、ATP 存在的 连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源 DNA 分子进行连接。DNA 连 接酶有两种
：T4 噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。两种 DNA 连接 酶都有将两个带有相同粘性末端的 DNA 分子连在一起的功能，而且 T4 噬菌体 DNA 连接酶还有一种大肠杆菌 DNA 连接酶没有的特性， 即能使两个平末端的双 链 DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过 提高 T4 噬菌体 DNA 连接酶浓度或增加 DNA 浓度来提高平末端的连接效率。 T4 噬菌体 DNA 连接酶催化 DNA 连接反应分为 3 步： 首先， DNA 连接酶与辅 T4 因子 ATP 形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP 复合物再结合到具有 5’磷酸基和 3’羟基切口的 DNA 上，使 DNA 腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口 封起来。 连接反应通常将两个不同大小的片断相连。 因为 DNA 片断有两个端点， 所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在 基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接 可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高 本底，可对载体进行 5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接 DNA 片断的 3’OH 末端与 5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提 供 5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自 环造成的高本底。 对于双酶切来说， 无论载体与供体同一片段上都有不同的末端， 这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个 特点是能将供体分子定向连接到载体上。 连接反应的温度在 37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢 键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即 12-16℃，连接 12-16h（过夜）， 这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq
DNA 酶扩增的 PCR 产物，其 DNA 双链前后末端都有一个游离的 A 碱基，可以 与 pGEM-T Easy Vector 末端游离的 T 碱基互补形成环状重组 T 质粒。 二．材料与方法 1 材料 外源 DNA 片断 2 仪器、用具 移液枪、碎冰 3 试剂 pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP 4 方法 连接体系如下：
16℃连接过夜。 （二） 重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定 1 材料 E.coli JM109 菌株 2 仪器、用具 超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml 离心管、 电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器 3 试剂 (1) CaCl2、LB 平板（见附录）；SOC 培养基（见附录）；SOB 培养基 (2) RNase A1； Buffer S1； Buffer S2； Buffer S3； Buffer W1； 无水乙醇的 Buffer W2a
(3) 1×电泳缓冲液（TAE）；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心]；琼脂
糖；6×加 样缓冲液 (4) 酚；氯仿；异戊醇 (5) ddH2O；10×PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRa rTaq 酶 4 方法 1. 大肠杆菌感受态细胞的制备 (1) 取大肠杆菌 JM109 保存液 50µl，接种于 4ml LB（或 SOB）液体培养基中， 37℃，300rpm 振荡培养过夜，第二天取 50µl 转接到新的 4ml LB（或 SOB） 液体培养基中扩大培养 3h 至 OD600=0.35～0.4， 在无菌操作台上取 1ml 菌液于 1.5ml 离心管中，冰浴 10min。 (2) 4℃，5000rpm 离心 2min，去上清液。 (3) 加入 750µl 预冷的 0.1M CaCl2 重悬菌体，冰浴 30min。 (4) 4℃，5000rpm 离心 2min，弃上清液。 (5) 加入 100µl 冰冷的 0.1M CaCl2 轻轻重悬菌体，冰浴 2h 后，4℃保存备用。 2. 重组 DNA 的转化 (1) 将含 Amp、X-Gal、IPTG 的 LB 平板 37℃预热。 (2) 于 100µl 感受态细胞中加入 10µl 连接产物，冰浴 30min。 (3) 将离心管转入 42℃水浴，热冲击 90 秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放 在冰上 2min。 (4) 在离心管中加入 SOC 培养基 300µl，枪头混匀，37℃、150rpm 温和摇振 60min。 (5) 将 200µl 转化菌液均匀地涂布于含 50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、 200mg/ml IPTG 的 LB 平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。 注意事项： ① 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止 感受态细胞受杂菌污染。 ② 42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。 ③ 菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，
过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。 3． 重组质粒的鉴定 方案一 菌落 PCR (1) 制备 PCR 混合液：
(2) 用经灭菌的 10µl 枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上 述混合液中。 (3) 盖上离心管得盖子，在沸水上温育 10 min。 (4) 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入 TaKaRa rTaq 酶 0.25ul。 (5) 按以下条件进行 PCR 反应：94℃预变性 3min；然后进行 30 个循环反应， 其温度循环条件为：94℃变性 1min，57℃退火 1min，72 ℃延伸 1min；循环结 束后 72℃再延伸 5min。 (6) 取 5µl PCR 产物在 1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 方案二 质粒 PCR 1. 碱裂解法少量制备质粒 DNA (1) 用离心管收集 4ml 在 LB 培养基（含 Amp）中培养过夜的菌液，14000rpm 离心 30 秒，弃尽上清。 (2) 用 250µl 已加入 RNase A1 的 Buffer S1 充分悬浮细菌沉淀。 (3) 加入 250µl Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合 4-6 次，此步骤不宜超过 5min。 *Buffer S2 使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH，降低溶菌效率。 (4) 加入 400µl Buffer S3， 温和地上下翻转 8-10 次， 室温静置 2min， 14000rpm 离心 10min。 *若离心后凝结块
未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g 离心 3min。 (5) 将 DNA-prep Tube 置于 2-ml Microfuge Tube 中，将步⑷中的混合液移入
DNA-prep Tube 中，5500rpm 离心 1min。 (6) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，加入 500µl Buffer W1，5500rpm 离心 1min。 (7) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，加入 700µl 已加无水乙醇的 Buffer W2，5500rpm 离心 1min，以同样的方法再用 700µl 已 加无水乙醇的 Buffer W2 洗涤一次。 (8) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，14000rpm 离心 1min。 (9) 连滤液一并弃掉收集管，将 DNA-prep Tube 置于一新的 1.5ml 离心管中， 在 silica 膜 中央加入 25-30µl Eluent 或去离子水。 (10) 室温静置 2 min，14000rpm 离心 1min 洗脱 DNA。 (11) 取 5µL 样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。 2. 抽提纯化质粒 DNA 酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒 DNA 中残留 的蛋白质。 (1) 加 TE 稀释质粒 DNA 溶液至 300µL。 ，震荡混匀，静置 3min。 (2) 加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1） (3) 14000rpm 离心 5min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1） ， 混匀，静置 3min。 (4) 14000rpm 离心 5min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1） ，混匀， 静置 3min。 吸上清液， 2.5 倍体积预冷的无水乙醇， 加 混匀后-20℃ (5) 14000rpm 离心 5min， 放置 15min，沉淀质粒 DNA。 (6) 14000rpm 离心 13min，弃上清液，沉淀加入 200µL 70%乙醇洗涤一次，室 温干燥，用 20µL 去离子双蒸水溶解质粒 DNA 沉淀，-20℃保存待用。 (7) 取 5µl 样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。 3. 质粒 PCR (1) PCR 反应体系如下：
(2) PCR 扩增反应条件：94℃预变性 3min；然后进行 30 个循环反应，其温度 循环条件为： 94℃变性 1min， 57℃退火 1min， ℃延伸 1min； 72 循环结束后 72℃再延伸 5min。 (3) 取 5µl PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。
（一）重组 T 质粒的构建 一．原理 外源 DNA 与载体分子的连接就是 DNA 重组， 这样重新组合的 DNA 叫做重组体 或重组子。重组的 DNA 分子是在 DNA 连接酶的作用下，有 Mg2 、ATP 存在的 连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源 DNA 分子进行连接。DNA 连接酶有两种：T4 噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。两种 DNA 连 接酶都有将两个带有相同粘性末端的 DNA 分子连在一起的功能，而且 T4 噬菌 体 DNA 连接酶还有一种大肠杆菌 DNA 连接酶没有的特性，即能使两个平末端 的双链 DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可 一般可 通过提高 T4 噬菌体 DNA 连接酶浓度或增加 DNA 浓度来提高平末端的连接效 率。T4 噬菌体 DNA 连接酶催化 DNA 连接反应分为 3 步：首先，T4 DNA 连 接酶与辅因子 ATP 形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP 复合物再结合到具有 5’ 磷酸基和 3’羟基切口的 DNA 上，使 DNA 腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯 键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为 DNA 片断 有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两 种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端 都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了 减少自环的高本底， 可对载体进行 5’除磷酸处理， 除磷酸处理， 除磷酸处理 原理是连接酶只能连接 DNA 一旦有外源片断插入时， 片断的 3’OH 末端与 5’端， 端 所以除磷后载体不会自环。 由外源片断提供 5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的 自 环造成的高本底。 对于双酶切来说， 无论载体与供体同一片段上都有不同的末端， 这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个 特点是能将供体分子定向连接到载体上。 连接反应的温度在 37℃时有利于连接酶的活性 温度在 ℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢 键结合是不稳定的。 因此采取折中的温度， 12-16℃， （过夜） ， 即 ℃ 连接 12-16h 这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA 酶扩增的 PCR 产物，其 DNA 双链前后末端都有一个游离的 A 碱基，可 产物， 碱基， 质粒。 以与 pGEM-T Easy Vector 末端游离的 T 碱基互补形成环状重组 T 质粒。 二．材料与方法 1 材料：外源 DNA 片断 2 仪器、用具：移液枪、碎冰 3 试剂：pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP 4 方法 连接体系如下： 16℃连接过夜。
（二） 重组质粒的转化及阳性克
隆的鉴定 1 材料 E.coli JM109 菌株 2 仪器、用具 超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml 离心管、 电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器 3 试剂 (1) CaCl2、LB 平板（见附录）；SOC 培养基（见附录）；SOB 培养基 (2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；无水乙醇 的 Buffer W2a (3) 1×电泳缓冲液（TAE）；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心]；琼脂糖；6× 加样缓冲液 (4) 酚；氯仿；异戊醇 (5) ddH2O；10×PCR Buffer (Mg2 plus)；dNTP；M13 ；M13-；TaKaRa rTaq 酶
4 方法 1. 大肠杆菌感受态细胞的制备 (1) 取大肠杆菌 JM109 保存液 50µl，接种于 4ml LB（或 SOB）液体培养基 中，37℃，300rpm 振荡培养过夜，第二天取 50µl 转接到新的 4ml LB（或 SOB）液体培养基中扩大培养 3h 至 OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取 1ml 菌液于 1.5ml 离心管中，冰浴 10min。 (2) 4℃，5000rpm 离心 2min，去上清液。 (3) 加入 750µl 预冷的 0.1M CaCl2 重悬菌体，冰浴 30min。 (4) 4℃，5000rpm 离心 2min，弃上清液。 (5) 加入 100µl 冰冷的 0.1M CaCl2 轻轻重悬菌体，冰浴 2h 后，4℃保存备 用。 2. 重组 DNA 的转化 (1) 将含 Amp、X-Gal、IPTG 的 LB 平板 37℃预热。 (2) 于 100µl 感受态细胞中加入 10µl 连接产物，冰浴 30min。 (3) 将离心管转入 42℃水浴，热冲击 90 秒，然后不要摇动离心管，迅速将其 放在冰上 2min。 (4) 在离心管中加入 SOC 培养基 300µl，枪头混匀，37℃、150rpm 温和摇 振 60min。 (5) 将 200µl 转化菌液均匀地涂布于含 50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、 200mg/ml IPTG 的 LB 平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。
注意事项： ① 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止 感受态细胞受杂菌污染。 ② 42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。 ③ 菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化， 过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。 3． 重组质粒的鉴定 方案一 菌落 PCR (1) 制备 PCR 混合液： (2) 用经灭菌的 10µl 枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上 述混合液中。 (3) 盖上离心管得盖子，在沸水上温育 10 min。 (4) 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入 TaKaRa rTaq 酶 0.25ul。 (5) 按以下条件进行 PCR 反应：94℃预变性 3min；然后进行 30 个循环反应， 其温度循环条件为：94℃变性 1min，57℃退火 1min，72 ℃延伸 1min；循 环结束后 72℃再延伸 5min。 (6) 取 5µl PCR 产物在 1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
方案二 质粒 PCR 1. 碱裂解法少量制备质粒 DNA (1) 用离心管收集 4ml 在 LB 培养基 （含 Amp） 中培养过夜
的菌液， 14000rpm 离心 30 秒，弃尽上清。 (2) 用 250µl 已加入 RNase A1 的 Buffer S1 充分悬浮细菌沉淀。 (3) 加入 250µl Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合 4-6 次，此步骤不宜 超过 5min。 *Buffer S2 使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH，降低溶菌效率。 (4) 加入 400µl Buffer S3，温和地上下翻转 8-10 次，室温静置 2min， 14000rpm 离心 10min。
*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g 离心 3min。 (5) 将 DNA-prep Tube 置于 2-ml Microfuge Tube 中，将步⑷中的混合液 移入 DNA-prep Tube 中，5500rpm 离心 1min。 (6) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，加入 500µl Buffer W1，5500rpm 离心 1min。 (7) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，加入 700µl 已加无水乙醇的 Buffer W2，5500rpm 离心 1min，以同样的方法再用 700µl 已加无水乙醇的 Buffer W2 洗涤一次。 (8) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中， 14000rpm 离心 1min。(9) 连滤液一并弃掉收集管，将 DNA-prep Tube 置 于一新的 1.5ml 离心管中，在 silica 膜 中央加入 25-30µl Eluent 或去离子水。 (10) 室温静置 2 min，14000rpm 离心 1min 洗脱 DNA。 (11) 取 5µL 样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。 2. 抽提纯化质粒 DNA 酚、 氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒 DNA 中残留 的蛋白质。 (1) 加 TE 稀释质粒 DNA 溶液至 300µL。 (2) 加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡混匀，静置 3min。 (3) 14000rpm 离心 5min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇 （25:24:1），混匀，静置 3min。 (4) 14000rpm 离心 5min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混 匀，静置 3min。 (5) 14000rpm 离心 5min，吸上清液，加 2.5 倍体积预冷的无水乙醇，混匀 后-20℃放置 15min，沉淀质粒 DNA。 (6) 14000rpm 离心 13min， 弃上清液， 沉淀加入 200µL 70%乙醇洗涤一次， 室温干燥，用 20µL 去离子双蒸水溶解质粒 DNA 沉淀，-20℃保存待用。 (7) 取 5µl 样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。 3. 质粒 PCR (1) PCR 反应体系如下： (2) PCR 扩增反应条件：94℃预变性 3min；然后进行 30 个循环反应，其温 度循环条件为： 94℃变性 1min，57℃退火 1min，72 ℃延伸 1min；循环结束后 72℃再延 伸 5min。 (3) 取 5µl PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。
（一）重组 T 质粒的构建 一．原理 外源 DNA 与载体分子的连接就是 DNA 重组， 这样重新组合的 DNA 叫做重组体 或重组子。重组的 DNA 分子是在 DNA 连接酶的作用下，有 Mg2+、ATP 存在的 连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源 DNA 分子进行连接。DNA 连 接酶有两种
：T4 噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。两种 DNA 连接 酶都有将两个带有相同粘性末端的 DNA 分子连在一起的功能，而且 T4 噬菌体 DNA 连接酶还有一种大肠杆菌 DNA 连接酶没有的特性， 即能使两个平末端的双 链 DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过 提高 T4 噬菌体 DNA 连接酶浓度或增加 DNA 浓度来提高平末端的连接效率。 T4 噬菌体 DNA 连接酶催化 DNA 连接反应分为 3 步： 首先， DNA 连接酶与辅 T4 因子 ATP 形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP 复合物再结合到具有 5’磷酸基和 3’羟基切口的 DNA 上，使 DNA 腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口 封起来。 连接反应通常将两个不同大小的片断相连。 因为 DNA 片断有两个端点， 所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在 基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接 可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高 本底，可对载体进行 5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接 DNA 片断的 3’OH 末端与 5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提 供 5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自 环造成的高本底。 对于双酶切来说， 无论载体与供体同一片段上都有不同的末端， 这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个 特点是能将供体分子定向连接到载体上。 连接反应的温度在 37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢 键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即 12-16℃，连接 12-16h（过夜）， 这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq
DNA 酶扩增的 PCR 产物，其 DNA 双链前后末端都有一个游离的 A 碱基，可以 与 pGEM-T Easy Vector 末端游离的 T 碱基互补形成环状重组 T 质粒。 二．材料与方法 1 材料 外源 DNA 片断 2 仪器、用具 移液枪、碎冰 3 试剂 pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP 4 方法 连接体系如下：
16℃连接过夜。 （二） 重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定 1 材料 E.coli JM109 菌株 2 仪器、用具 超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml 离心管、 电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器 3 试剂 (1) CaCl2、LB 平板（见附录）；SOC 培养基（见附录）；SOB 培养基 (2) RNase A1； Buffer S1； Buffer S2； Buffer S3； Buffer W1； 无水乙醇的 Buffer W2a
(3) 1×电泳缓冲液（TAE）；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心]；琼脂
糖；6×加 样缓冲液 (4) 酚；氯仿；异戊醇 (5) ddH2O；10×PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRa rTaq 酶 4 方法 1. 大肠杆菌感受态细胞的制备 (1) 取大肠杆菌 JM109 保存液 50µl，接种于 4ml LB（或 SOB）液体培养基中， 37℃，300rpm 振荡培养过夜，第二天取 50µl 转接到新的 4ml LB（或 SOB） 液体培养基中扩大培养 3h 至 OD600=0.35～0.4， 在无菌操作台上取 1ml 菌液于 1.5ml 离心管中，冰浴 10min。 (2) 4℃，5000rpm 离心 2min，去上清液。 (3) 加入 750µl 预冷的 0.1M CaCl2 重悬菌体，冰浴 30min。 (4) 4℃，5000rpm 离心 2min，弃上清液。 (5) 加入 100µl 冰冷的 0.1M CaCl2 轻轻重悬菌体，冰浴 2h 后，4℃保存备用。 2. 重组 DNA 的转化 (1) 将含 Amp、X-Gal、IPTG 的 LB 平板 37℃预热。 (2) 于 100µl 感受态细胞中加入 10µl 连接产物，冰浴 30min。 (3) 将离心管转入 42℃水浴，热冲击 90 秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放 在冰上 2min。 (4) 在离心管中加入 SOC 培养基 300µl，枪头混匀，37℃、150rpm 温和摇振 60min。 (5) 将 200µl 转化菌液均匀地涂布于含 50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、 200mg/ml IPTG 的 LB 平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。 注意事项： ① 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止 感受态细胞受杂菌污染。 ② 42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。 ③ 菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，
过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。 3． 重组质粒的鉴定 方案一 菌落 PCR (1) 制备 PCR 混合液：
(2) 用经灭菌的 10µl 枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上 述混合液中。 (3) 盖上离心管得盖子，在沸水上温育 10 min。 (4) 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入 TaKaRa rTaq 酶 0.25ul。 (5) 按以下条件进行 PCR 反应：94℃预变性 3min；然后进行 30 个循环反应， 其温度循环条件为：94℃变性 1min，57℃退火 1min，72 ℃延伸 1min；循环结 束后 72℃再延伸 5min。 (6) 取 5µl PCR 产物在 1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 方案二 质粒 PCR 1. 碱裂解法少量制备质粒 DNA (1) 用离心管收集 4ml 在 LB 培养基（含 Amp）中培养过夜的菌液，14000rpm 离心 30 秒，弃尽上清。 (2) 用 250µl 已加入 RNase A1 的 Buffer S1 充分悬浮细菌沉淀。 (3) 加入 250µl Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合 4-6 次，此步骤不宜超过 5min。 *Buffer S2 使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH，降低溶菌效率。 (4) 加入 400µl Buffer S3， 温和地上下翻转 8-10 次， 室温静置 2min， 14000rpm 离心 10min。 *若离心后凝结块
未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g 离心 3min。 (5) 将 DNA-prep Tube 置于 2-ml Microfuge Tube 中，将步⑷中的混合液移入
DNA-prep Tube 中，5500rpm 离心 1min。 (6) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，加入 500µl Buffer W1，5500rpm 离心 1min。 (7) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，加入 700µl 已加无水乙醇的 Buffer W2，5500rpm 离心 1min，以同样的方法再用 700µl 已 加无水乙醇的 Buffer W2 洗涤一次。 (8) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，14000rpm 离心 1min。 (9) 连滤液一并弃掉收集管，将 DNA-prep Tube 置于一新的 1.5ml 离心管中， 在 silica 膜 中央加入 25-30µl Eluent 或去离子水。 (10) 室温静置 2 min，14000rpm 离心 1min 洗脱 DNA。 (11) 取 5µL 样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。 2. 抽提纯化质粒 DNA 酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒 DNA 中残留 的蛋白质。 (1) 加 TE 稀释质粒 DNA 溶液至 300µL。 ，震荡混匀，静置 3min。 (2) 加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1） (3) 14000rpm 离心 5min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1） ， 混匀，静置 3min。 (4) 14000rpm 离心 5min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1） ，混匀， 静置 3min。 吸上清液， 2.5 倍体积预冷的无水乙醇， 加 混匀后-20℃ (5) 14000rpm 离心 5min， 放置 15min，沉淀质粒 DNA。 (6) 14000rpm 离心 13min，弃上清液，沉淀加入 200µL 70%乙醇洗涤一次，室 温干燥，用 20µL 去离子双蒸水溶解质粒 DNA 沉淀，-20℃保存待用。 (7) 取 5µl 样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。 3. 质粒 PCR (1) PCR 反应体系如下：
(2) PCR 扩增反应条件：94℃预变性 3min；然后进行 30 个循环反应，其温度 循环条件为： 94℃变性 1min， 57℃退火 1min， ℃延伸 1min； 72 循环结束后 72℃再延伸 5min。 (3) 取 5µl PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。